專利名稱：：人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種醫藥診斷試劑，特別是一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，該診斷試劑采用基因工程重組HIV—I型特異性蛋白gpl60、gpl20、gp41、P66、p24以及HIV—II型特異性蛋白gp36獨立包被的混合纖維素膜、酶結合物及其他組份組成，應用間接法的原理供HIV—I型和HIV—II型抗體確認用。
背景技術：
：人類獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS,艾滋病)傳播的廣泛性和危害性已成為全球關注的公共衛生和社會熱點問題。艾滋病的傳播在我國已經進入了快速增長期，除了在沿海經濟發達的地區HIV感染的人較多外，在一些經濟不發達、醫療衛生較差的部分地區尤其農村地區，由于勞務輸出流動人口不斷增加以及部分由采漿感染HIV的人群，給我國的HIV預防和控制增加了不少的壓力。提高HIV診斷試劑水平顯得尤為重要。目前國內對艾滋病的診斷方法主要采用ELISA方法檢測，該方法有較高的靈敏度和特異性，但其操作方法復雜，測定時間較長，并且需要一定的操作經驗和儀器設備，在一些醫療條件差的部分地區尤其是在邊遠的農村地區限制了該方法的使用，因此丌發一種快速簡便的檢測試劑十分必要。本發明提供一種快速，簡便的人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑。
發明內容本發明提供一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，該試劑由一組產品組成一個試劑盒，其中主要組成成分如下HIV抗體確認條，反應液，洗液，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，BCIP/NBT顯色底物，陽性參考血清，陰性參考血清，另外還有，反應板，對比卡片，結果報告單，產品說明書等。每一試劑盒中包括以下組成-1、HIV抗體確認條(避光，防潮)20條2、反應液(配置完成后為乳白色)l瓶(20毫升)3、洗液(藍色)1瓶(200毫升)4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物(紅色)1瓶(20毫升)5、BCIP/NBT顯色底物(淡黃色)1瓶(20毫升)6、陽性參考血清(生物危險品)1瓶(50微)7、陰性參考血清1瓶(100微升)8、反應板(每板IO個反應槽)9、對比卡片10、結果報告單11、說明書其中的各組成說明如下HIV抗體確認條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液(O.OlMTris-HCl，pH7.4)將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度(gpl60、gpl20、P66、gp41、P24、gp36的包被濃度分別為80Mg/ml、80/ig/ml、50/ig/ml、60Mg/ml、80]Ug/ml和5Mg/ml;兔抗人IgG的濃度分別為4.5Mg/ml和100/ig/ml;人源IgG的濃度為50/xg/ml);B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2^1/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫(16-25°C)吹干2小時的方法進行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處(2-8°C，相對濕度不高于45%)備用。反應液，組成為0.8。/。NaCl、0.02%KC1和0.05%吐溫-20的0.01MTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到7.4;C.使用0.45ptm濾膜過濾除菌；D.密封貯存于2-8'C環境中。洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG，500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到9.8-10.0;C.加入100PPM(質量體積比)的指示劑(溴百里酚藍)，使其在正常狀態下(2-30°C，PH=9.9)呈藍色D.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環境中。堿性磷酸酶—羊抗人IgG結合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物(1:4000)，10mMTris-cl，20%胎牛血清，100PPMPEG,500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調到6.4-6.7;C.加入100PPM(質量體積比)的指示劑(氯酚紅)，使其在正常狀態下(2-30。C，PH=6-7)呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；E.密封C:存于2-8'C環境中。BCIP/NBT顯色底物，BCHVNBTPURPLELIQUIDSUBSTRATEFORMEMBRANES)購自Sigma公司(125K1189)。陽性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測定效價不低于1:200，HIV抗體全病毒確認試劑檢測結果為全條帶陽性的血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時；C.使用0.45lum濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中。陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經兩種ELISA試劑測定、一種確認試劑檢測、一種核酸檢測試劑同時檢測結果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時；C.使用0.45/im濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中。本發明的試劑盒配套包裝，配套使用，使用方法如下樣品從測試者身上獲得的血清或血漿。儀器微量加樣器，搖床，37"C烘箱。，37"C水浴箱。試劑準備第一次使用時將脫脂奶粉加入到反應液中，溫柔震蕩使其混合均勻。所有試劑在使用前在室溫(16—25"C)平衡半個小時或37°(:水浴IO分鐘。(顯色底物請取所需量分裝入配液瓶中水浴)所有試劑在使用前溫柔震蕩使其混合均勻。使用后盡快將所用試劑放入2—8"C環境中。操作方法快速反應模式(1)將待測樣本及反應液在室溫(16—25"C)平衡半個小時，或放入37。C水浴箱中水浴10分鐘(2)從管中取出所需數量的HIV抗體確認試紙條，放在反應槽中，有數字標記的一面朝上；(3)向每個槽內加入1毫升反應液(乳白色)，置于搖床上室溫搖動5_10分鐘，然后在反應槽的上方加入IO微升待檢樣本；(4)蓋上反應槽，置于搖床上，室溫(16—25"C)孵育45分鐘；(51)完全去除槽中反應液，用1毫升洗液(藍色)洗膜，共進行4次，每次5分鐘；(6)完全去除槽中洗液，向每個槽內加入酶結合物，(紅色)l毫升，蓋上反應槽，置于搖床上，室溫搖動孵育30分鐘；(7)完全去除槽中酶結合物，用l毫升洗液(藍色)將洗膜，共進行4次，每次5分鐘；(8)完全去除槽中洗液，向每個槽內加入l毫升顯色劑(淡黃色)，蓋上反應槽，室溫搖動反應IO分鐘；(9)完全去除槽中顯色劑，用蒸餾水沖2次，之后用蒸餾水浸泡1分鐘終止反應；(10)取出確認條，置于吸水紙上，放入烘箱中，37"C烘烤15分鐘徹底干燥；(11)使用對比卡片讀取結果，在室溫避光條件下，結果可以長期保存。過夜反應模式歩驟(4)的反應時間為過夜反應，其他步驟與快速反應一致。對實驗結果的解釋(1)圖1為膜上相應固相化蛋白的位置。使用對比卡片讀取確認條的實驗結果《曰息。(2)參照以下2個表格計算總得分。表1符號及其對應含義<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>陰性結果不確認結果陽性結果A《0.50.75《A《1.25A禮5(總得分不超過0.5)(總得分介于O.75至1.25之間)(總得分不少于1.5)(4)確認條失效(在確認所有組份均合理使用的情況下，出現下列任意一種情況判定為失效)無任何可辨認的條帶出現。顯色20min后，質控線3+的顯色仍然沒有達到明顯可見的強度。(5)特殊情況及可能原因(質控線±的顯色結果強于質控線+)當樣本使用量比較大以及樣本中抗體含量比較大時有可能出現這種情況。這種情況下以質控線土作為陽性條帶的平均顯色標準，質控線+作為條帶是否存在的判定標準。(6)HIV—2型(滿足以下3個條件可以初步判斷為HIV—2型抗體陽性)滿足陽性判定的條件；gp36的顯色結果強于質控線+;gp41的顯色結果不強于gp36的顯色結果。(異常檢測結果及可能原因)質控線3+未顯色未加入酶結合物未加入顯色底物顯色底物PH值過低酶結合物活性完全喪失質控線+未顯色顯色底物溫度過低未加入人類血清顯色時間過短顯色底物ra值過低背景太高，所有條帶顯色結果均達到質控線3+的水平顯色時間過長未用蒸餾水終止反應未烤干試紙條使用回收的顯色底物背景較臟用手/手套直接拉觸確認條表面確認條潮濕確認條表面被污染(該試驗方法的局限性)本確認試劑盒專供HIV—I型和HIV—II型抗體確認用。(產品性能指標)試驗完成后質控線+，質控線3+的顯色結果必須明顯可辨認；背景顏色不超過質控線土的顏色；否則實驗不成立。本發明的試劑，其反應原理如下固定在混合纖維素膜上的基因工程重組HIV—I/HIV—I1特異性蛋白將與待測人類血清中的相應抗體特異結合，兔抗人IgG多克隆抗體將與人類血清中的IgG結合之后加入羊抗人IgG-堿性磷酸酶結合物，其將與重組抗原結合的HIV特異抗體、與兔抗人IgG結合的抗體以及包被在膜上的人源IgG相結合，加入底物后發生反應導致顯色。如果待測樣本中含有HIV—I/HIV—II特異性抗體，在固定有相應重組蛋白的地方將出現特異性顯色的條帶，反之將不出現。無論待測樣本中是否含有HIV—I/HIV—II特異性抗體，固定兔抗人IgG、人源IgG的條帶均將顯色。本HIV抗體確認條的檢測線共包括6條，從上至下依次為gpl60、gpl20、p66、gp41、p24和gp36，用于檢測人類血清中的HIV特異抗體；其質控線共包括3條，從上至下依次為質控線土、質控線+和質控線3+。質控線±(兔抗人IgG)用于指示樣品中免疫球蛋白IgG的含量；質控線+(兔抗人IgG)用于指示陽性條帶的平均顯色強度；質控線3十(人源IgG)用于指示堿性磷酸酶的活性。質控線土和質控線+為動態質控線，不同待測樣本中的人源IgG含量的差別將導致這兩條質控線顯色強度的差別；質控線3+為標準質控線，其顯色強度與待測樣本無關。用于本試劑盒的抗原均為通過基因工程制備的、體外表達獲取的重組蛋白，這些重組蛋白均不具有生物危險性。反應模式本確認試劑盒的反應模式共有三種間接法、夾心法以及免疫反應。HIV—I/HIV—I1特異性抗體的檢測采用的是間接法。將gpl60gpl20p66gp41p24和gp36重組抗原獨立包被在混合膜上；加入待測樣本，其中的相應抗體將與這些抗原發生特異性的免疫反應；之后加入的羊抗人IgG(堿性磷酸酶標記)將與這些HIV特異抗體相結合；加入顯色底物，在堿性磷酸酶的催化下，結合特異抗體的條帶將出現肉眼可見的顯色。人類血清中的免疫球蛋白IgG的含量檢測采用的是夾心法。將兔抗人IgG多克隆抗體分別以不同的濃度,被在混合膜上作為質控線土和質控線+，加入待測樣本，其中的人類血清免疫球蛋白IgG將與兔抗人IgG多克隆抗體發生免疫反應；之后加入的羊抗人IgG(堿性磷酸酶標記)將與人源IgG相結合；加入顯色底物，在堿性磷酯酶的催化下，結合人源IgG的條帶將出現肉眼可見的顯色。在同一待測樣本中，包被濃度的不同將此兩條質控線導致顯色深度的不同；在不同待檢測樣本中，人源IgG含量的差別將同時導致這兩條質控線顯色強度的差別。堿性磷酸酶活性的檢測采用的是特異性免疫反應。將人源IgG包被在混合膜上作為質控線3+，羊抗人IgG(堿性磷酸酶標記)將與其相結合；加入顯色底物，在堿性磷酸酶的催化下，該位置將出現肉眼可見的顯色。其顯色強度與待測樣本無關，僅用于指示堿性磷酸酶的活性。重組抗原的選擇目前在世界范圍內廣泛應用于診斷HIV感染的確認試驗一般都要求檢測三類抗原(即env基因編碼的外膜蛋白抗原、pol基因編碼的聚合酶抗原和gag基因編碼的核心抗原)。根據廣東省衛生防疫站艾滋病監測檢測中心HIV確認實驗室對1991至1995年間HIV初篩陽性和可疑的103份樣本進行確認試驗的結果以及湖北省疾病預防控制中心對1995至2001年間289例HIV—1確認陽性樣本帶型分析的結果；同時在參照了美國CDC,美國FDA，冊0以及中國衛生部標準的基礎上，確定用于本HIV確認試劑盒的抗原分別為env基因編碼產物gpl60，gpl20,gp41和HIV—2型特異抗原gp36;po1基因編碼產物p66;gag基因編碼產物p24。重組抗原的生產序列的獲得和引物的構建通過信息檢索獲得HIV病毒gpl60,gpl20,gp41和gp36(HIV—II)的核酸編碼序列；p66的核酸編碼序列以及p24的核酸編碼序列。在廣泛査閱國內外相關文獻報道以及與同行業廠家交流的基礎上，選取了各個蛋白的多個免疫優勢表位的核酸編碼序列。根據其序列設計引物(引物含有接頭，正向引物含有EcoIRI位點；反向引物含有Bam.HI位點)用于體外克隆。序列擴增以及檢定以裂解的HIV(病毒為模板，用上述引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術在體外克隆獲得目的片段。使用0.8n/。TBE—瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的長度。連接轉化經檢測確認為正確的克隆子，用E.coIRI,Bam.HI雙酶切處理之。使用T4連接酶，將其分別連接到PUC表達載體中。之后轉化基因工程用大腸桿菌JM109。用含有氨芐青霉素的培養基初篩含有表達載體的工程菌株，用雙酶切檢測出含有目的基因片段的工程菌株，用測序確認含有目的基因片段的菌株。重組蛋白的表達和純化培養至對數生長期，使用IM的IPTG誘導其表達重組蛋白。采用溶菌酶結合超聲波方法破碎菌體，經離心回收后，使用TritonX-IOO洗滌去除膜碎片和膜蛋白，用鹽酸胍(6mo1/1)溶解包涵體蛋白。然后先后使用離子交換層析純化和Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。用SDS—PAGE的方法檢測重組蛋白的純度(圖2)，應用WesternBlot原理檢測重組蛋白的特異性以及抗原性。圖1為測試結果比較使用的對比圖，為膜上相應固相化蛋白的位置具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明。實施例1(1)確認試紙條的制備及檢測用包被緩沖液。按一定的濃度用流試劃膜儀將檢測線和質控線均勻，整齊的固定于混合纖維素膜上。確認試紙條的干燥包被完成后置于超凈工作臺上室溫吹風干燥2小時。保存于室溫干燥環境中(16一25"C，相對溫度不高于45%)。半成品檢定用HIV抗體確認試劑國家參考品進行檢定。HIV抗體陽性參考品符合率10份，要求陽性符合率為10/10。HIV抗體陰性參考品符合率12份，要求陰性符合率為12/12。HIV抗體不確定型樣品符合率5份，檢測結果不能為陰性。無菌試驗液體組分按照<中國生物制品規程〉中<生物制品無菌試驗規程〉第A3.2.3項進行。穩定性試驗試劑各組分37"C放置6天，檢定結果應達到標準。分裝半成品檢定合格后及時分裝，分裝后保存于2—8"C。(相對濕度不高于45%)。(2)其他組分的制備HIV抗體確認條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液(0.01MTris-HCl，pH7.4)將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度(gpl60、gpl20、P66、gp41、P24、gp36的包被濃度分別為80/Ag/mI、80/_ig/ml、50jLtg/ml、60jng/ml、80/ig/ml和5jUg/ml;兔抗人IgG的濃度分別為4.5/xg/ml和100|Ug/ml;人源IgG的濃度為50pig/ml);B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2/xl/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫(16-25°C)吹干2小時的方法進行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處(2-8°C，相對濕度不高于45%)備用。反應液，組成為0.8。/。NaCl、0.02Q/。KC1和0.05%吐溫-20的O.OlMTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到7.4;C.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；D.密封貯存于2-8'C環境中。洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將ra值調到9.8-10.0;C.加入100PPM(質量體積比)的指示劑(溴百里酚藍)，使其在正常狀態下(2-30°C，PH=9.9)呈藍色D.使用0.45jum濾膜過濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環境中。堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物(1:4000)，10mMTris-cl，20%胎牛血清，100PPMPEG,500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調到6.4-6.7;C.加入100PPM(質量體積比)的指示劑(氯酚紅)，使其在正常狀態下(2-30。C，PH=6-7)呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；F.密封貯存于2-8'C環境中。BCIP/NBT顯色底物，BCIP/NBTPURPLELIQUIDSUBSTRATEFORMEMBRANES)購自Sigma公司(125K1189)。陽性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測定效價不低于1:200，HIV抗體全病毒確認試劑檢測結果為全條帶陽性的血清10份；B.混合血清，采用60'C處理1小時；C.使用0.45ium濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8i:環境中。陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經兩種ELISA試劑測定、一種確認試劑檢測、一種核酸檢測試劑同時檢測結果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時；C.使用0.45nmi濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8"C環境中。分裝半成品檢定合格后及時分裝。分裝后保存于2-8°C。(相對濕度不高于45%)。組裝按試劑盒組成成份進行組裝。每一試劑盒中包括以下組成1、HIV抗體確認條(避光，防潮)20條2、反應液(配置完成后為乳白色)1瓶(20毫升)3、洗液(藍色)1瓶(200毫升)4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物(紅色)l瓶(20毫升)5、BCTP/NBT顯色底物(淡黃色)1瓶(20毫升)6、陽性參考血清(生物危險品)1瓶(50微)7、陰性參考血清1瓶(100微升)8、反應板(每板io個反應槽)2個9、對比卡片l個10、結果報告單l張11、說明書l份最后進行成品檢定。權利要求1、一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，其特征在于，包括HIV抗體確認條，反應液，洗液，堿性磷酸酶-羊抗人IgG結合物，BCIP/NBT顯色底物，陽性參考血清，陰性參考血清，所述試劑采用HIV-I型特異性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特異性蛋白gp36與待測人類血清中的相應抗體特異結合，兔抗人IgG多克隆抗體與人類血清中的IgG結合，之后加入羊抗人IgG-堿性磷酸酶結合物，其將與重組抗原結合的HIV特異抗體、與兔抗人IgG結合的抗體以及包被在膜上的人源IgG相結合，加入底物后發生反應導致顯色反應的原理制備而成。2、權利要求1的確認試劑，所述試劑由一組產品組成一個試劑盒，其中主要組成成分如下HIV抗體確認條，反應液，洗液，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，BCIP/NBT顯色底物，陽性參考血清，陰性參考血清，另外還有，反應板，對比卡片，結果報告單，產品說明書。3、權利要求2的確認試劑，每一試劑盒中包括以下組成1、HIV抗體確認條20條2、反應液l瓶3、洗液l瓶4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物1瓶5、BCIP/NBT顯色底物l瓶6、陽性參考血清l瓶7、陰性參考血清l瓶8、反應板2個9、對比卡片l個10、結果報告單l張11、說明書l份。4、權利要求3的確認試劑，其中HIV抗體確認條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下.-A.使用包被緩沖液將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度；B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2/xl/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫吹干2小時的方法進行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處備用；反應液，組成為0.8。/。NaCl、0.02。/。KC1和0.05%吐溫-20的O.OlMTris-HCl，其制備方法如下A.按照上述配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到7.4;C.使用0.45]um濾膜過濾除菌；D.密封貯存于2-8匸環境中，洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上述配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到9.8-10.0;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態下呈藍色D.使用0.45pm濾膜過濾除菌；E.密封fc存于2-8'C環境中，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，10mMTris-cl，20%胎牛血清，IOOPPMPEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調到6.4-6.7;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態下呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；E.密封貯存于2-『C環境中，BCIP/NBT顯色底物，陽性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測定效價不低于1:200，HIV抗體全病毒確認試劑檢測結果為全條帶陽性的血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時；C.使用0.45Mm濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中，陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經兩種ELISA試劑測定、一種確認試劑檢測、一種核酸檢測試劑同時檢測結果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時；C.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中。5、權利要求3的確認試劑的使用方法，包括以下步驟樣品從測試者身上獲得的血清或血漿，儀器微量加樣器，搖床，37"C烘箱，，37"C水浴箱，試劑準備第一次使用時將脫脂奶粉加入到反應液中，溫柔震蕩使其混合均勻，所有試劑在使用前在室溫平衡半個小時或37"C水浴10分鐘，所有試劑在使用前溫柔震蕩使其混合均勻，使用后盡快將所用試劑放入2—8"C環境中，操作方法快速反應模式(1)將待測樣本及反應液在室溫平衡半個小時，或放入37°C水浴箱中水浴10分鐘(2)從管中取出所需數量的HIV抗體確認試紙條，放在反應槽中，有數字標記的一面朝上；(3)向每個槽內加入l毫升反應液，置于搖床上室溫搖動5—IO分鐘，然后在反應槽的上方加入10微升待檢樣本；(4)蓋上反應槽，置于搖床上，室溫孵育45分鐘；(5)完全去除槽中反應液，用l毫升洗液洗膜，共進行4次，每次5分鐘；(6)完全去除槽中洗液，向每個槽內加入酶結合物，1毫升，蓋上反應槽，置于搖床上，室溫搖動孵育30分鐘；(7)完全去除槽中酶結合物，用l毫升洗液將洗膜，共進行4次，每次5分鐘；(8)完全去除槽中洗液，向每個槽內加入1毫升顯色劑，蓋上反應槽，室溫搖動反應IO分鐘；(9)完全去除槽中顯色劑，用蒸餾水沖2次，之后用蒸餾水浸泡1分鐘終止反應；(10)取出確認條，置于吸水紙上，放入烘箱中，37"C烘烤15分鐘徹底干燥；(11)使用對比卡片讀取結果，在室溫避光條件下，結果可以長期保存，過夜反應模式步驟(4)的反應時間為過夜反應，其他步驟與快速反應一致，對實驗結果的解釋(1)右圖為膜上相應固相化蛋白的位置，使用對比卡片讀取確認條的實驗結果{曰息，(2)計算總得分，HIV—2型滿足以下3個條件可以初步判斷為HIV—2型抗體陽性滿足陽性判定的條件；gp36的顯色結果強于質控線+;gp41的顯色結果不強于gp36的顯色結果。6、權利要求3的確認試劑的制備方法，包括以下步驟(1)重組抗原的生產序列的獲得和引物的構建通過信息檢索獲得HIV病毒gpl60，gpl20，gp41和gp36的核酸編碼序列；p66的核酸編碼序列以及p24的核酸編碼序列，在廣泛査閱國內外相關文獻報道以及與同行業廠家交流的基礎上，選取了各個蛋白的多個免疫優勢表位的核酸編碼序列，根據其序列設計引物用于體外克隆，序列擴增以及檢定以裂解的HIV病毒為模板，用上述引物通過聚合酶鏈式反應技術在體外克隆獲得目的片段，使用0.8y。TBE—瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的長度，連接轉化經檢測確認為正確的克隆子，用E.coIRI，Bam.HI雙酶切處理之，使用T4連接酶，將其分別連接到PUC表達載體中，之后轉化基因工程用大腸桿菌JM109，用含有氨芐青霉素的培養基初篩含有表達載體的工程菌株，用雙酶切檢測出含有目的基因片段的工程菌株，用測序確認含有目的基因片段的菌株，重組蛋白的表達和純化培養至對數生長期，使用IM的IPTG誘導其表達重組蛋白，采用溶菌酶結合超聲波方法破碎菌體，經離心回收后，使用TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白，用鹽酸胍溶解包涵體蛋白，然后先后使用離子交換層析純化和Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，用SDS—PAGE的方法檢測重組蛋白的純度，應用WesternBlot原理檢測重組蛋白的特異性以及抗原性，(2)其他組分的制備HIV抗體確認條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度；B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2pd/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫吹干2小時的方法進行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處備用，反應液，組成為0.8。/。NaCl、0.02。/。KC1和0.05%吐溫-20的0.01MTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用Na0H顆粒將PH值調到7.4;C.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；D.密封!C存于2-8'C環境中，洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調到9.8-10.0;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態下呈藍色D.使用0.45/im濾膜過濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環境中，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結合物，10mMTris-cl，20。/。胎牛血清，IOOPPMPEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調到6.4-6.7;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態下呈紅色D.使用0.45/xm濾膜過濾除菌；F.密封貯存于2-8'C環境中，BCIP/NBT顯色底物，陽性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測定效價不低于1:200，HIV抗體全病毒確認試劑檢測結果為全條帶陽性的血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時；C.使用0.45/mi濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中，陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經兩種ELISAi^式劑測定、一種確認試劑檢測、一種核酸檢測試劑同時檢測結果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時；C.使用0.45Mm濾膜過濾除菌；D.除菌過濾后密封貯存于2-8'C環境中，分裝半成品檢定合格后及時分裝，分裝后保存于2-8X:，組裝按試劑盒組成成份進行組裝。全文摘要本發明涉及一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，該診斷試劑采用基因工程重組HIV-I型特異性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特異性蛋白gp36獨立包被的混合纖維素膜、酶結合物及其他組份組成，應用間接法的原理供HIV-I型和HIV-II型抗體確認用。文檔編號G01N21/78GK101097216SQ20071011140公開日2008年1月2日申請日期2007年6月18日優先權日2007年6月18日發明者誌張,張海燕,曹健榮,王宇帆,王建麗申請人:曹健榮;張誌
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