專利名稱：一種基于集成化微流控芯片的分析系統(tǒng)和分析方法
技術領域：
本發(fā)明屬微全分析技術領域，具體涉及一種樣品富集、衍生、分離的集成化微流控芯片分析系統(tǒng)和分析方法。
背景技術：
微全分析系統(tǒng)(micro-total analysis system)是90年代以來發(fā)展起來的一門跨學科技術，它通過化學分析設備的微型化與集成化，最大限度地把分析實驗室的功能轉移到便攜的分析設備(如各種芯片)中，以實現(xiàn)高通量、低成本的化學分析。在基于微流控芯片的微全分析系統(tǒng)中，樣品預處理、分離分析和檢測被集成到數(shù)平方厘米大小的芯片上，不但簡化了實驗裝置和操作步驟，降低了樣品的消耗量，縮短了分析時間，還可實現(xiàn)樣品的現(xiàn)場實時分析以及多通道陣列的并行分析。經過十年來的長足發(fā)展，各種基于微流控芯片的樣品預處理、分離分析以及檢測新方法不斷涌現(xiàn)。但是將這些操作單元集成起來，發(fā)展集成化功能的芯片并使其應用于實際樣品的分析還有待發(fā)展。本發(fā)明將基于微流控芯片的樣品固相萃取-固相衍生技術與芯片電泳分離技術相結合，配合高靈敏度的激光誘導熒光檢測技術，建立了集樣品預處理、分離和檢測為一體的集成化微流控芯片分析系統(tǒng)，進行生物體液的分析。該芯片具有集成化、快速、靈敏的優(yōu)點，可發(fā)展成為高通量的陣列分析系統(tǒng)，十分適合于生物體液中興奮劑或其他藥物的初篩。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提出一種基于集成化微流控芯片的分析系統(tǒng)和分析方法，將樣品預處理(包括富集和衍生)、電泳分離和激光誘導熒光檢測集成到單個微流控芯片上，可實現(xiàn)對實際樣品如生物體液中的興奮劑等物質的快速、高通量檢測。
本發(fā)明提出的基于集成化微流控芯片的分析系統(tǒng)，其微流控芯片由樣品預處理通道1、電泳分離通道2、電泳進樣通道3和儲液孔6-10組成；其樣品預處理通道1填充有用于固相萃取和固相衍生的固相載體4和5，進樣通道3與樣品預處理道1成丁字形連接，進樣通道3與電泳通道2成十字形連接；儲液孔6、9位于樣品預處理通道1的兩端，可以與外部氣壓或電壓裝置相連，以驅動樣品和洗脫劑流過預處理通道；儲液孔7、8和10分別位于進樣通道3和電泳分離通道2的端部，與高壓電源相連，提供電進樣和電泳分離所需電壓；微流控芯片置于激光誘導熒光檢測器中，檢測點位于分離通道的末端c。
本發(fā)明中，集成化微流控芯片材料可以是石英、玻璃，也可以是高分子聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯，聚二甲基硅烷、聚碳酸酯等。尺寸為50～150mm×20～50mm×0.5～2mm，底板厚度0.5～1.5mm，蓋板厚度0.2～0.5mm。通道具有雙十字交叉結構，通道截面為倒置近似梯形。預處理通道1長度為5.0-50.0mm，寬度為10-300μm，深度為10-300μm，其中固相載體的長度為1.0-40.0mm；分離通道2長度為20.0-100.0mm，寬度為10-100μm，深度為10-150μm；丁字交叉口a與儲液孔5的距離，以及十字交叉口b與儲液孔7、8的距離為20.0-50.0mm；進樣通道3長度為50.0-80.0mm；各儲液孔內徑為2.0-6.0mm。
本發(fā)明中，集成化微流控芯片的樣品預處理通道1里固定有固相材料，作為固相萃取和固相衍生的載體。固相載體可以是各種色譜填料(包括氣相色譜和液相色譜的填料)，也可以是一切具有萃取能力的固體材料，包括多孔高分子聚合物顆粒或高分子聚合物整體多孔床材料，以及有機-無機材料雜和的顆?；蛘w多孔床材料。固相載體可以是單一均相的，也可以是多相的。
使用本發(fā)明的分析系統(tǒng)，進行分析檢測的方法如下將含有被測物的樣品和熒光衍生試劑，在儲液孔6、9處氣壓或電壓驅動下，從儲液孔9依次進入預處理通道1，流經固相載體，被測物和熒光衍生試劑被吸附在固相載體4、5上，并在該固相載體上進行衍生反應；或者先用熒光試劑標記固相載體4、5，然后將含有被測物的樣品在氣壓或電壓驅動下，從儲液孔9進入預處理通道1，流經固相載體，在固相載體上進行衍生反應。反應結束后，通過調節(jié)各儲液孔處氣壓和電壓，驅動洗脫液將衍生產物從固相載體上洗脫、稀釋，并引入到進樣通道3，通過十字交叉口b進行電進樣，進而實現(xiàn)電泳分離和激光誘導熒光檢測。
上述方法中，被測物樣品可以是尿液、血液和汗液等生物液體，或者是環(huán)境水樣。樣品中被測物的濃度控制為1ng/mL-100μg/mL，一次分析所用樣品量為10-200μL。
上述方法中，樣品流經固相載體的速度為2.0-20.0μL/min，熒光衍生試劑用量為5-15μL，濃度為0.01-0.5mM，流經固相載體的速度為1.0-2.0μL/min。
上述方法中，被熒光衍生試劑標記的被測物可以為庚胺醇、美芬丁胺、安非它命、甲基安非它命、甲烯二氧苯丙胺、甲烯二氧甲苯丙胺、麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿、氯丙苯丙胺、乙苯丙胺、對羥基苯丙胺、苯丁胺、苯丙羥胺、甲羥苯丙胺、生物胺等之一種。
上述方法中，所用的洗脫劑可以是有機溶劑與緩沖溶液的混合液，也可以是針對固相載體吸附-洗脫特性的任何無機緩沖溶液。洗脫液中，可以根據(jù)需要加入添加劑，如表面活性劑和手性選擇試劑等。
上述方法中，電泳分離可以采用區(qū)帶電泳模式，也可以采用其他電泳模式，如膠束電動色譜、電色譜、等電聚焦和凝膠電泳。
本發(fā)明中，進行電泳分離的通道2，可以是芯片材料本身，也可以是經過涂層修飾。
本發(fā)明提出的樣品富集、衍生、分離的集成化微流控芯片分析系統(tǒng)，適用于能夠被適當?shù)臒晒庠噭┧鶚擞浀谋粶y物的分析檢測，如興奮劑中的安非它命類、麻黃堿類刺激劑，生物體液中的多胺等。
本發(fā)明提出的基于集成化微流控芯片的分析系統(tǒng)，具有操作簡便、樣品消耗量小、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，在此基礎上進行可實現(xiàn)多通道并行分析，樣品通量可以得到大幅度的提高，分析成本也較一般的色譜方法低。該系統(tǒng)為實現(xiàn)芯片上的全化學分析提供了重要基礎。
圖1為本發(fā)明的集成化微流控芯片示意圖。
圖中(1)為樣品預處理通道，(2)為電泳分離通道，(3)為電泳進樣通道，(4)、(5)為固相填充物，(6)-(10)為儲液孔，(a)為預處理通道與電泳進樣通道的丁字交叉口，(b)為電泳分離通道與電泳進樣通道的十字交叉口，(c)為檢測點。
具體實施例方式
下面通過一實施例來進一步說明本發(fā)明，但并不局限于該實施例。
實施例通過該系統(tǒng)檢測尿液中的刺激劑安非它命。如圖1所示，微流控芯片采用玻璃加工而成，長5.0cm，寬2.5cm，底板厚1.0mm，蓋板厚0.5mm。預處理通道1的長3cm，深100μm，半高寬180μm。分離通道2長4.2cm，深100μm，半高寬125μm。進樣通道在十字交叉口b的兩側分別長5mm，所有儲液孔內徑均為2mm。丁字交叉口a到儲液孔6，十字交叉口b到儲液孔7的距離分別為3mm。預處理通道1中填有雙相固相載體采用紫外光照引發(fā)-原位聚合法在距離通道末端25mm-15mm的一段區(qū)域制備多孔聚合物整體柱4(乙烯基二甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸丁酯的共聚物)，再在距離通道末端15mm-5mm的一段區(qū)域用勻漿法填充氣相色譜填料5(天津試劑二廠，GDX-502，100-120目)。儲液孔6、9通過移液管尖端與外部毛細管(15cm長，內徑250μm，外徑380μm)相連，用環(huán)氧樹脂密封接口，通過毛細管和注射泵對預處理通道施加氣壓。儲液孔7、8、10中插入鉑電極，分別與高壓電源相連。激光誘導熒光檢測點c位于分離通道上距十字交叉口b 35mm處。
將含有安非它命的尿液(100ng/mL)用1M氫氧化鈉堿化(pH11)，0.45μm微孔濾膜過濾后，取100μL加入到儲液孔9中，在儲液孔6施加負壓，使尿樣以5μL/min的速度通過預處理通道，再用10μL 5mM的硼沙緩沖溶液洗滌預處理通道(5μL/min)。將熒光試劑FITC(熒光素苯異硫酸氰酯)用5mM的硼沙緩沖溶液配制成0.1mM的溶液，取10μL流過預處理通道(5μL/min)，吹干。將芯片置于微波爐中(海爾MK-2270M1)，在540W輻射功率下反應5min。取出芯片，用電泳緩沖溶液(20mM硼沙，pH9.5)充滿分離通道以及進樣通道。用50μL洗脫液(5mM硼沙∶乙腈＝60∶40)沖洗預處理柱(5μL/min)，同時在儲液孔6施加微小正壓，儲液孔8施加電壓-500V，儲液孔7、10接地，使洗脫產物流入進樣通道而不擴散到分離通道。待衍生產物在十字交叉口b處濃度達到最大時，切換電壓，使儲液孔7、10分別為+500V和-2000V，儲液孔8浮空。各操作階段儲液孔的施壓情況見表1。采用20mM的硼酸鹽為電泳緩沖溶液進行電泳分離，從譜圖上即可獲得FITC標記的安非它命的定性定量信息。
表1實施例1中各儲液孔在不同操作階段的壓力控制情況
權利要求
1.一種基于集成化微流控芯片的分析系統(tǒng)，其特征在于該微流控芯片由樣品預處理通道(1)、電泳分離通道(2)、電泳進樣通道(3)和儲液孔(6)-(10)組成；其中，產品預處理通道(1)填充有用于固相萃取和固相衍生的固相載體(4)和(5)，進樣通道(3)與樣品預處理道(1)成丁字形連接，進樣通道(3)與電泳通道(2)成十字形連接；儲液孔(6)、(9)位于樣品預處理通道(1)的兩端，可以與外部氣壓或電壓裝置相連，以驅動樣品和洗脫劑流過預處理通道；儲液孔(7)、(8)和(10)分別位于進樣通道(3)和電泳分離通道(2)的端部，與高壓電源相連，提供電進樣和電泳分離所需電壓；微流控芯片置于激光誘導熒光檢測器中，檢測點位于分離通道的末端c。
2.根據(jù)權利要求1所述的分析系統(tǒng)，其特征在于所述預處理通道(1)長度為5.0-50.0mm，寬度為10-300μm，深度為10-300μm，其中固相載體的長度為1.0-40.0mm；分離通道(2)長度為20.0-100.0mm，寬度為10-100μm，深度為10-150μm；丁字交叉口(a)與儲液孔(5)的距離，以及十字交叉口(b)與儲液孔(7)、(8)的距離為20.0-50.0mm；進樣通道(3)長度為50.0-80.0mm；各儲液孔內徑為2.0-6.0mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的分析系統(tǒng)，其特征在于所述固相載體為各種色譜填料，或者為多孔高分子聚合物顆?；蚋叻肿泳酆衔镎w床材料，或者為有機-無機材料雜和的顆粒或整體多孔床材料。
4.根據(jù)權利要求1所述的分析系統(tǒng)，其特征在于所述固相載體為單一均相，或者為多相。
5.根據(jù)權利要求1所述的分析系統(tǒng)，其特征在于所述電泳分離通道有涂層修飾。
6.一種使用權利要求1所述的分析系統(tǒng)進行分析檢測的方法，其特征在于具體步驟如下將含有被測物的樣品和熒光衍生試劑，在儲液孔(6)、(9)處氣壓或電壓驅動下，從儲液孔(9)依次進入預處理通道(1)，流經固相載體，被測物和熒光衍生試劑被吸附在固相載體(4)、(5)上，并在該固相載體上進行衍生反應；或者先用熒光試劑標記固體載體(4)、(5)，然后將含有被測物的樣品在氣壓或電壓驅動下，從儲液孔(9)進入預處理通道(1)，流經固相載體，在固相載體上進行衍生反應；反應結束后，通過調節(jié)各儲液孔處氣壓和電壓，驅動洗脫液將衍生產物從固相載體上洗脫、稀釋，并引入到進樣通道(3)，通過十字交叉口(b)進行電進樣，進而實現(xiàn)電泳分離和激光誘導熒光檢測。
7.根據(jù)權利要求6所述的分析檢測方法，其特征在于樣品中被測物的濃度控制為1ng/mL-100μg/mL，一次分析所用樣品量為10-200μL。
8.根據(jù)權利要求6所述的分析檢測方法，其特征在于樣品流經固相載體的速度為2.0-20.0μL/min，熒光衍生試劑用量為5-15μL，濃度為0.01-0.5mM，流經固相載體的速度為1.0-2.0μL/min。
9.根據(jù)權利要求6所述的分析檢測方法，其特征在于所述被測物為庚胺醇、美芬丁胺、安非它命、甲基安非它命、甲烯二氧苯丙胺、甲烯二氧甲苯丙胺、麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿、氯丙苯丙胺、乙苯丙胺、對羥基苯丙胺、苯丁胺、苯丙羥胺、甲羥苯丙胺、生物胺之一種。
10.根據(jù)權利要求9所述的分析檢測方法，其特征在于所用的洗脫劑是有機溶劑與緩沖溶液的混合液，或者是針對固相載體吸附-洗脫特性的任何無機緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬微全分析技術領域，具體為一種集成樣品富集、衍生、分離的微流控芯片分析系統(tǒng)和分析方法。其中微流控芯片上集成了樣品預處理通道、電泳分離通道和電泳進樣通道、樣品預處理通道里固定有固相載體。含有被分析物的實際樣品在預處理通道里進行純化、富集以及熒光衍生反應，熒光標記產物從固相載體洗脫后被引入分離通道，進行芯片電泳分離和激光誘導熒光檢測。本發(fā)明具有集成化的特點，在同一個微流控芯片上實現(xiàn)了樣品預處理，分離和檢測，不僅減少了生物樣品的消耗量，避免了樣品損失，而且提高了分析速度和檢測靈敏度，降低了操作成本。本發(fā)明十分適合于高通量的興奮劑或其它各種藥物等被分析物的初篩。
文檔編號G01N27/447GK1740779SQ20051002987
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權日2005年9月22日
發(fā)明者張祥民, 楊秀晗, 王小川 申請人:復旦大學
專業(yè)數(shù)控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
