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一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于有毒物質(zhì)快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明通過選取具有穩(wěn)定遺傳且細胞色素P450具有高表達的HepG2/C3A細胞系作為研究對象，選取6種自然界常見酚類化合物，分別使其作用于細胞，對細胞CYP1A線粒體去極化、ROS生成率等指標分別進行測試，結(jié)合統(tǒng)計學分析，最終確立預測模型。其方法簡單快速，其用于預測藥物的肝毒性，結(jié)果穩(wěn)定，準確度提高，具有潛在的應用推廣前景。
【專利說明】一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于有毒物質(zhì)快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日常生活中，人們攝取的許多酚類化合物具有致肝損傷的危害，然而肝損傷后有許多的響應指標，例如肝損傷會導致細胞線粒體電位去極化影響正常功能、造成ROS自由基的過量生成及DNA損傷、細胞色素P450表達異常等等，但這些指標是不全面的。因此，單純的用一種指標來判斷是不準確的。
[0003]本發(fā)明通過前期對酚類化合物致肝損傷響應指標進行篩選，結(jié)合細胞系穩(wěn)定遺傳特性，并對指標進行化學計量學方法進行聚類分析及鑒別，構(gòu)建出了簡單快速的預測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法。該方法用于酚類化合物肝毒性的預測，得到的結(jié)果穩(wěn)定、快速，準確度提高，具有潛在的應用推廣前景。
[0005]本發(fā)明方法涉及檢測體系的建立，多維復雜數(shù)據(jù)指標的化學計量學可視化分析及建模。這種建模方法全面地整合多個細胞指標，結(jié)合化學計量學中的復雜數(shù)據(jù)投影聚類法，能對有毒物質(zhì)進行全面評估。
[0006]本發(fā)明提供的一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法，通過選取具有穩(wěn)定遺傳且細胞色素P450具有高表達的H印G2/C3A細胞系作為研究對象，選取6種以上酚類化合物，分別使其作用于細胞，對細胞CYP1A2線粒體去極化、ROS生成率等指標分別進行測試，結(jié)合統(tǒng)計學分析，最終確立預測模型。具體步驟包括:
[0007](I)檢測體系的建立
[0008]選用!fepG2/C3A細胞系，鋪板后培養(yǎng)24_36h，此時細胞鋪板密度為1000~20000/孔，細胞代數(shù)為4~8代；其在酚類化合物的作用下，經(jīng)步驟①、步驟②和步驟③重復檢測，分別得到酚類化合物的線粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力4個指標的數(shù)據(jù)集；
[0009]①線粒體去極化試驗:細胞經(jīng)酚類化合物刺激2_3h后，加裝探針羅丹明123，共同作用30-40min左右，將孔板內(nèi)液體吸出，HBSS清洗后，加酚類化合物24_36h，后于酶標儀激發(fā)波長490nm，吸收波長535nm進行檢測，得到線粒體去極化指標；
[0010]②ROS生成率試驗:前期加裝探針DCFHDA，30-40min后吸出，HBSS清洗后于細胞中加入酚類化合物作用24-36h，后于酶標儀激發(fā)波長485nm，吸收波長525nm進行檢測，得到ROS生成率指標；
[0011]③細胞色素P450試驗:7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈分別作為底物，酚類化合物作用細胞24-36h后，吸出酚類化合物用HBSS清洗后，加入工作液，然后分別加入以上兩種底物，置于酶標儀激發(fā)波長544nm，吸收波長590nm進行檢測，分別得到CYP1A、CYP2B3A酶活力指標；
[0012](2)多維復雜數(shù)據(jù)指標的化學計量學可視化分析
[0013]采用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)的算法,先對步驟(1)中得到的4個指標的數(shù)據(jù)集進行化學計量學可視化分析，得到得分，藉此對藥物樣本進行分類判斷，選擇主成分；再對主成分的載荷進行分析，用于建立適用的參數(shù)化模型；
[0014](3)綜合分析指標的建立
[0015]根據(jù)化學計量學可視化分析的結(jié)果，以主成分分析所得到的貢獻率最大的前兩個主成分的載荷為參量模型，結(jié)合主成分的載荷的對建模的標準品進行全面的聚類情況分析，規(guī)定在一定的主成分載荷范圍內(nèi)的樣本為與相近的此類標準品有類似的毒性及毒理性質(zhì)，以此方法建立綜合分析指標，實現(xiàn)預測模型的建立。
[0016]本發(fā)明中，步驟(1)建立檢測體系時，選取6種酚類化合物作用于H印G2/C3A細胞系，其由沒食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、綠茶、槲皮素和咖啡酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯組成。
[0017]本發(fā)明中，步驟(1)中細胞色素P450試驗采用黑色底部不透明板進行細胞鋪板，線粒體去極化試驗和ROS生成率試驗采用黑色底部透明板進行細胞鋪板。
[0018]本發(fā)明中采用PCA算法進行化學計量學可視化分析。傳統(tǒng)的生物學評價指標作圖方式多為柱狀圖。它在探討單變量評價指標中效果直觀有效，但是在評價指標變多的情況下，圖表個數(shù)增多，因而分析繁雜，難以快速有效地進行分析。而PCA是一種投影方法，其將多元數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)學變換到 一個子空間中，可以盡可能體現(xiàn)各個獨立數(shù)據(jù)樣品間的偏差(variance).投影的結(jié)果稱為得分(score)，可以用一張二維或三維投影圖來表現(xiàn)。它反映了各個樣品間彼此關(guān)聯(lián)度的大小，藉此可以對樣本的分類進行判斷。投影的方向稱為載荷(loading)，可以用線狀圖或柱狀圖來表現(xiàn)，它反映了測量的各個變量的重要程度。主成分分析方法利用線性組合，即一組主成分，對各個樣本計算得分把樣本集合數(shù)據(jù)投影至低維，并且保持了樣本數(shù)據(jù)中有用的信息，可以反映樣品的性質(zhì)等。
[0019]本發(fā)明選取的指標能夠涵蓋肝損傷后常見的響應變化，在!fepG2/C3A細胞系上具有穩(wěn)定的響應值，指標是可靠的和準確的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為R123樣品測定結(jié)果。
[0021]圖2為ROS樣品測定結(jié)果。
[0022]圖3為CYPlA樣品測定結(jié)果。
[0023]圖4為CYP2B/3A樣品測定結(jié)果。
[0024]圖5為主成分分析的得分矢量投影圖。
[0025]圖6為主成分載荷(loading)圖。
[0026]圖7為主成分分析的得分矢量投影圖，單寧酸測試集在圖中用X表示。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明。[0028]實施例1
[0029]1.選用沒食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDCG)、綠茶、槲皮素、咖啡酸，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等6種常見酚類化合物，單體的濃度為10mg/ml，提取物濃度為100mg/ml。配制母液，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，確保DMSO濃度控制在0.5%以下。
[0030]2.細胞鋪板密度在20000/孔，200 μ 1，24小時后，將上清液吸出后，加入200 μ I藥物，作用2.5h后添加終重量體積濃度為Syg/ml羅丹明123，30min后將上清液吸出，HBSS清洗后，再加入200 μ I藥物，24小時后于酶標儀激發(fā)波長490nm，吸收波長535nm檢測。檢測結(jié)果如圖1所示。
[0031]3.ROS生成率實驗:細胞鋪板濃度在20000/孔，200 μ 1，24小時后，將上清液吸出后，加入200 μ IJymDCFHDA探針，30min后將上清液吸出后，用HBSS清洗，然后加入200 μ I藥物，24h后置于酶標儀激發(fā)波長485nm，吸收波長525nm檢測。檢測結(jié)果如圖2所
/Jn ο
[0032]4.CYP1A、CYP2B3A酶活力測試:細胞鋪板濃度在20000/孔，200 μ 1，24小時后，將上清液吸出后，加入200 μ I配制好的樣品，24h后將上清液吸出，用HBSS清洗后加入50 μ I工作液(水楊酰胺與雙香豆素的混合物)，后加入50 μ I提前預熱的酶反應底物7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈，后置于酶標儀激發(fā)波長544nm，吸收波長590nm檢測。檢測結(jié)果如圖3、圖4所示。
[0033]5.樣品的化學計量學分析:所有樣品均進行六重復測定。從上面的數(shù)據(jù)可以得出一個初步結(jié)論，不同的指標側(cè)重于測量毒性對細胞不同方面的作用。因而，許多評價的體系得出的結(jié)果不完全一致。比如，NDCG的肝毒性在除羅丹明123的其它3個指標中都表現(xiàn)了明顯的毒性，而綠茶在3個指標中毒性很明顯，除了 ROS指標不同。同樣，其它的樣品在不同的指標中響應不同。因此，對毒性做綜合評估需要更加另外的數(shù)學方法和手段。經(jīng)過空白樣與六個樣品的六重復測定建立了一個42個記錄的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集輸入MATLAB R2013a軟件進行處理。其主成分分析的得分矢量投影圖見圖5。
[0034]圖5中，橫坐標和縱坐標的單位無量綱。主成分I和2的得分(score)分別在x軸和y軸上。A為0.5%DMS0溶液空白，B為沒食子酸，C為NDCG，D為綠茶，E為槲皮素，F(xiàn)為咖啡酸，G為EGCG。每類樣品以不同的顏色標示。從圖中可以看出，樣品聚集為明顯的幾個類別。NDCG和綠茶各自與空白樣的距離比較大，而且它們之間的距離也比較大。結(jié)合前面的單指標結(jié)果判斷，兩者都具有明顯肝毒性，并且兩者的毒性機理也有所不同。單寧酸和沒食子酸與空白溶液也存在距離，可以推斷為中低毒性物質(zhì)。槲皮素，咖啡酸，HGCG三物質(zhì)與空白樣之間的距離很近，接近于無毒性。
[0035]圖6標示了主成分I和2的載荷(loading)。載荷是主成分分析中，各個主成分對于變量的權(quán)重。它是表示模型與變量關(guān)系一個重要指標，可以反映數(shù)據(jù)的各個變量與數(shù)據(jù)區(qū)分度的大小的關(guān)系。它的絕對值越大，則表明該檢測指標的重要性越大。圖6中，ROS對于主成分I的貢獻很大，而R123對于主成分I則貢獻很小。對于主成分2，情況正好相反。CYPlA和CYP2B/3A同屬于酶活力測試，其重要性在兩個主成分中也大致趨同。這種現(xiàn)象反映了綠茶和NDCG對ROS和R123兩個指標有著不同的響應，符合前面的單變量分析結(jié)果，也證明了利用主成分分析可以綜合挖掘各種指標所包含的毒理信息。
[0036]6.綜合分析指標的建立和驗證:進過上述的可視化分析步驟，以主成分I和2作為參量模型，提出了兩個指標作為毒性物質(zhì)的綜合分析指標:
[0037]Pl=-0.029577236噸123+0.925580291*R0S+0.298203392
[0038]*CYPlA+0.231302939*CYP2B/3A
[0039]P2=-0.764237679*R123-0.243863606*R0S+0.266833164*CYPlA+0.534108018*CYP2B/3A [0040]所述指標R123，ROS, CYP1A, CYP2B/3A必須經(jīng)過中心化處理，即原值減去建模時的數(shù)據(jù)集中該指標的平均值。
[0041]選用單寧酸作為一個新的樣品集用已建立的指標進行綜合評價。四個細胞毒理指標測定的步驟和上述步驟一致，得到的指標如下表:
[0042]表1:單寧酸的細胞測定結(jié)果
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種酚類化合物肝毒性快速預測模型的構(gòu)建方法，其特征在于，選取6種以上酚類化合物，分別使其作用于H印G2/C3A細胞，對細胞CYP1A2線粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力指標分別進行測試，結(jié)合統(tǒng)計學分析，最終確立預測模型；具體步驟包括: (1)檢測體系的建立 選用!fepG2/C3A細胞系，鋪板后培養(yǎng)24-36h，此時細胞鋪板密度為10000~20000/孔，細胞代數(shù)為4~8代；其在酚類化合物的作用下，經(jīng)步驟①、步驟②和步驟③重復檢測，分別得到酚類化合物的線粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力4個指標的數(shù)據(jù)集； ①線粒體去極化試驗:細胞經(jīng)酚類化合物刺激2-3h后，加裝探針羅丹明123，共同作用30-40min左右，將孔板內(nèi)液體吸出，HBSS清洗后，加酚類化合物24_36h，后于酶標儀激發(fā)波長490nm，吸收波長535nm進行檢測，得到線粒體去極化指標； ②ROS生成率試驗:前期加裝探針DCFHDA，30-40min后吸出，HBSS清洗后于細胞中加入酚類化合物作用24-36h，后于酶標儀激發(fā)波長485nm，吸收波長525nm進行檢測，得到ROS生成率指標； ③細胞色素P450試驗:7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈分別作為底物，酚類化合物作用細胞24-36h后，吸出酚類化合物用HBSS清洗后，加入工作液，然后分別加入以上兩種底物，置于酶標儀激發(fā)波長544nm，吸收波長590nm進行檢測，分別得到CYP1A、CYP2B3A酶活力指標；` (2)多維復雜數(shù)據(jù)指標的化學計量學可視化分析 采用主成分分析的算法，先對步驟(1)中得到的4個指標的數(shù)據(jù)集進行化學計量學可視化分析，得到得分，藉此對藥物樣本進行分類判斷，選擇主成分；再對主成分的載荷進行分析，用于建立適用的參數(shù)化模型； (3)綜合分析指標的建立 根據(jù)步驟(2)中化學計量學可視化分析的結(jié)果，以主成分分析所得到的貢獻率最大的前兩個主成分的載荷為參量模型，結(jié)合主成分的載荷，對建模的標準品進行全面的聚類情況分析，規(guī)定在一定的主成分載荷范圍內(nèi)的樣本與相近的此類標準品有類似的毒性及毒理性質(zhì)，以此方法建立綜合分析指標，實現(xiàn)預測模型的建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述酚類化合物為6種，其由沒食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、綠茶、槲皮素和咖啡酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中細胞色素P450試驗采用黑色底部不透明板進行細胞鋪板，線粒體去極化試驗和ROS生成率試驗采用黑色底部透明板進行細胞鋪板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中所述工作液為水楊酰胺與雙香豆素的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中，4個指標重復6次檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述指標R123，R0S，CYP1A，CYP2B/3A經(jīng)過中心化處理，即為原值減去建模時的數(shù)據(jù)集中該指標的平均值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中，以綠茶和去甲二氫愈創(chuàng)木酸為參量模型，以Pl和P2兩個指標作為毒性物質(zhì)的綜合分析指標，具體公式如下: Pl=-0.029577236噸123+0.925580291*R0S+0.298203392 *CYPlA+0.23130293腫CYP2B/3A ； P2=-0.764237679*R123-0.243863606*R0S+0.266833164*CYPlA+0.534108018*CYP2B/3A ； 其中:R123表示線粒體去極化指標；ROS表示ROS生成率指標；CYP1A表示CYPlA酶活力指標；CY P2B/3A表示P2B/3A酶活力指標。
【文檔編號】G01N21/63GK103487412SQ201310461025
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】陸維盈, 劉潔, 史海明, 俞良莉 申請人:上海交通大學