專利名稱：一種蛋白質芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質芯片。
背景技術：
生物芯片技術是在20世紀90年代興起的一種高通量分析遺傳信息的生物技術。在人類基因組計劃的帶動下，改進對基因組序列的測定和分析方法就成為生物技術發展的重點。在此基礎上，一種全新的雜交測序技術便應運而生。該技術是將一系列錯落重疊的寡脫氧核苷酸，以點陣排列固定在一塊很小的基片上，形成一個高密度的寡核苷酸微陣列，稱為DNA芯片或基因芯片。基因組DNA標記后與芯片上的寡核苷酸雜交，根據全部雜交斑點的已知序列就可以推導出樣品DNA的全序列。1994年光導寡核苷酸陣列化學合成法問世，為DNA芯片技術奠定了基礎。
DNA芯片包含巨大的信息量，它不僅具有快速測序的能力，而且可以對基因組的信息進行種種分析，因此在生命科學、醫學診斷和生物鑒定等方面得到廣泛應用。芯片上固定的分子檢測器除DNA和寡脫氧核苷酸外，還可以用蛋白質或RNA，以識別待測分子的結構特征。DNA芯片技術獲得巨大成功鼓勵科學家和公司將此技術用于蛋白質信息分析。蛋白質具有最廣泛的生物功能，人們在實踐中需要最多檢測和鑒定的生物分子可能是蛋白質，因此蛋白質芯片有更廣闊的用途。但是蛋白質芯片技術難度遠大于DNA芯片。首先，用于制作芯片的蛋白質必需逐個制備，費時費力，既不能體外擴增，也不能原位合成。其次，蛋白質較不穩定，在制作蛋白質微陣列時易受基片表面作用而失去或降低活性。第三，各蛋白質的物理化學性質很不一樣，難于使陣列各點蛋白質在同一條件下與樣品分子反應。即使存在這些技術上的困難，蛋白質芯片技術還是獲得了長足的發展。
蛋白質芯片在蛋白質組學的研究中是一項關鍵的技術。人類基因組計劃的提前完成，使生命科學進入后基因組時代，研究的核心問題已不是基因組的序列，而是基因組編碼哪些基因產物？基因產物如何起作用？也即開展結構基因組學和功能基因組學的研究。顯然，僅僅研究基因組的結構與功能仍不足以揭示生命的奧秘，因為生物在不同生長、發育和生理條件下都只有一部分基因被表達，而且同一基因在表達過程中經選擇性信息加工可以形成不同蛋白質，蛋白質在合成后還可以發生種種化學修飾而改變其性質和功能。這就是說研究細胞的全部蛋白質組成，它們的相互作用以及在不同狀態下的變化，具有重要的意義，有關研究即稱為蛋白質組學。蛋白質芯片在確定蛋白質組的成分，監測某些蛋白質的變化，找出蛋白質相互識別和作用的關系，是十分有用的工具。
蛋白質芯片通過固定在基片微陣列點上的蛋白質分子檢測器，借其與待測分子間的親和力，捕捉樣品中的待測分子，從而達到高通量、快速、靈敏檢測的目的。迄今蛋白質芯片都是直接將蛋白質分子固定在芯片表面。
蛋白質芯片在醫學診斷、環保監測和法醫鑒定中也有重要作用。例如，將各種病原體的抗體做成抗體芯片，可以迅速確定疾病的感染原，而無需反復進行多重排查試驗。又如，將細胞cDNA構建成表達文庫，然后把全部或與某種疾病相關的部分克隆制作成蛋白質芯片，即可找出疾病過程中蛋白質的變化。蛋白質芯片已在化驗、診斷、檢疫、環保、刑偵等領域用于各種蛋白質的檢測和鑒定。由于制作蛋白質芯片在技術上還存在一些困難，因而限制了它的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型的蛋白質芯片，即噬菌體展示蛋白質芯片。
本發明所提供的蛋白質芯片，是由基片和將用作分子檢測器(檢測探針)的蛋白質展示于表面的重組噬菌體組成，所述重組噬菌體以微陣列固定在基片上(如圖1、3)。
展示蛋白質的噬菌體可以是各類細菌噬菌體，最常采用的有絲狀噬菌體f1、fd、M13，長尾噬菌體λ，短尾噬菌體T7等。絲狀噬菌體的次要外殼蛋白pIII(拷貝數少)和主要外殼蛋白pVIII(拷貝數多)可用于N端展示，次要外殼蛋白pVI(拷貝數少)可用于C端展示。λ噬菌體的外殼蛋白pV和T7噬菌體的p10可用于展示cDNA表達的蛋白質。
用于噬菌體展示的載體有兩種類型一種是噬菌體載體，由噬菌體基因組改造而成；另一種是噬菌粒載體，由噬菌質粒改造而成。噬菌體載體的外殼蛋白因與外源蛋白融合而會失去其原有功能，為保持外殼蛋白的功能，需將外殼蛋白基因倍增。其一具野生型功能；另一可與外源蛋白融合。噬菌粒載體刪除了噬菌體各基因，只保留與外源蛋白融合的外殼蛋白基因，以及與復制和組裝有關的序列，其繁殖有賴于輔助噬菌體。上述載體可以從生物技術公司購買后按需要加以改造，或自己構建。
可按照以下方法將所述用作分子檢測器的蛋白質展示于噬菌體表面將用作分子檢測器的蛋白質基因通過編碼柔性鏈的序列與噬菌體載體或噬菌粒載體的外殼蛋白基因融合，使用作分子檢測器的蛋白質表達并展示在噬菌體表面；所述柔性鏈具有序列表中序列1的氨基酸殘基和序列2的核苷酸序列。
所述噬菌體載體或噬菌粒載體的外殼蛋白基因根據蛋白質展示的功能進行優選。用于淘選，主要選擇拷貝數少的外殼蛋白基因；用于檢測，主要選擇拷貝數多的外殼蛋白基因。對于絲狀噬菌體，前者為pIII，后者為pVIII(如圖2中A和B)。
所述制成噬菌體展示蛋白質芯片的蛋白質包括抗原和抗體、酶和作用物、配體和受體、活性多肽、cDNA表達的蛋白質。
所述基片可為濾膜、玻片或硅片，以玻片較為價廉合宜。
本發明是將用于檢測的蛋白質分子與噬菌體外殼蛋白融合，使其展示在噬菌體表面，然后固定在微陣列點上，制成噬菌體展示蛋白質芯片。通過噬菌體展示而使蛋白質得到克隆，任意蛋白質克隆都可借此方便制成噬菌體展示蛋白質芯片。
本發明的蛋白質芯片突出優點是①展示的蛋白質與其基因存在于同一重組噬菌體內，在獲得蛋白質的同時也得到了它的編碼基因。②通過克隆技術可以得到單一展示的蛋白質，無需進行逐個蛋白質的分離純化后處理，并可通過淘選獲得各種特異功能的蛋白質克隆。③蛋白質展示于固定在芯片表面的噬菌體之上，消除了芯片表面對蛋白質的影響。各類特定功能的蛋白質都可以與噬菌體外殼蛋白融合，制成噬菌體展示的蛋白質芯片。本發明的新型噬菌體展示蛋白質芯片必將有更廣泛的應用前景。
圖1為噬菌體展示蛋白質芯片示意2為不同絲狀噬菌體展示系統之間的轉換圖3為重組絲狀噬菌體固定在芯片上的原子力顯微鏡照片圖4為正常人和白血病患者白細胞樣品的熒光圖譜比較圖5為pIII和pVIII展示系統強度的比較具體實施方式
下述實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
用于制備芯片的噬菌體展示庫，最常用的是抗體庫、隨機多肽庫和cDNA展示庫。噬菌體展示載體可由生物工程技術公司購買，或自己構建。絲狀噬菌體展示載體pCANTAB 5E購自Pharmacia，可用于構建噬菌體抗體庫和隨機多肽庫。λ噬菌體載體和體外包裝系統Gigapaka Gold III購自Stratagene；T7噬菌體展示系統購自Novagen，此兩系統可用于構建cDNA展示庫。Novagen公司有已構建好的肝癌、結腸癌、老年癡呆癥、肺癌、乳腺癌和正常組織的噬菌體展示cDNA庫出售。構建cDNA展示庫需要從真核細胞中提取mRNA，以oligo(dT)和隨機六核苷酸引物通過RT-PCR合成cDNA。將cDNA插入適宜的噬菌體展示載體，并轉化大腸桿菌細胞，收集重組噬菌體，即為cDNA展示庫。cDNA編碼的蛋白質與外殼蛋白的C端融合，展示于噬菌體表面。從各種展示庫中淘選出靶蛋白質克隆，并以微陣列固定在芯片上，即獲得各種用途的噬菌體展示蛋白質芯片。
實施例1、噬菌體展示抗體芯片的制作和檢測(1)噬菌體展示抗體庫的構建將諸多外源抗體基因分別插入噬菌體展示載體即獲得噬菌體展示抗體庫。具體方法如下從人外周血分離白細胞，提取總RNA，利用整套抗體引物通過RT-PCR合成抗體cDNA。每個抗體重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)之間以柔性鏈(序列表中序列1)連接，構成單鏈抗體(scFv)基因，兩端引入Sfi I和Not I限制性內切酶識別位點，經雙酶切后分別插入pIII展示載體pCANTAB 5E的Sfi I和Not I限制性內切酶識別位點之間，得到重組噬菌體pCANTAB 5E-scFv(圖2中A)，用以電擊轉化大腸桿菌TG1細胞。轉化細胞加入輔助噬菌體M13K07，室溫靜置30分鐘，離心沉淀菌體，懸浮于培養基，培養過夜。重組噬菌體繁殖并以出芽方式釋放到培養基中。離心除去菌體，上清液加入1/5體積的由20％PEG和2.5M NaCl組成的溶液，冰上放置1小時，再離心即得到噬菌體沉淀。沉淀的噬菌體溶于PBS溶液，經0.45μm濾膜過濾除菌，測定滴度，冰箱保存。
(2)從噬菌體展示庫中淘選特異的展示蛋白質克隆構建的噬菌體展示庫一般都比較大，通常庫容量在108克隆形成單位(cfu)以上，用于制備芯片需要從庫中選出用于檢測的靶克隆，此過程稱為淘選(panning)。從庫中挑選出所需要的特異展示蛋白質克隆稱為正淘選，從庫中淘汰不需要的克隆稱為負淘選。
從步驟(1)構建的噬菌體抗體庫中淘選識別白細胞表面蛋白的噬菌體抗體克隆，具體方法如下用正常人白細胞對噬菌體抗體庫進行五輪細胞淘選。每輪淘選取一定量白細胞加入噬菌體抗體庫溶液中，室溫放置30分鐘，離心沉淀白細胞，洗脫被細胞吸附的重組噬菌體，測定滴度。將洗脫的重組噬菌體再感染大腸桿菌宿主，用輔助噬菌體M13K07感染后回收擴增的重組噬菌體，測定滴度，重復淘選。在五輪淘選過程中對白細胞表面具有特異吸附能力的噬菌體抗體逐步被富集，得到針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體克隆，其過程如表1所示。
表1正常人白細胞對噬菌體抗體庫的細胞淘選
注5份正常人白細胞來自不同人再用白血病患者白細胞對經過正常人白細胞扣除過的噬菌體抗體庫進行三輪淘選，即用正常白細胞對噬菌體抗體庫進行負淘選，然后用白血病白細胞對噬菌體抗體庫進行正淘選，前后進行三輪，獲得對白血病白細胞表面抗原特異的噬菌體抗體克隆。白血病白細胞特異噬菌體抗體的富集過程如表2所示。
表2白血病患者白細胞對噬菌體抗體庫的淘選過程
注三份白血病患者白細胞來自不同的個體。
(3)噬菌體展示蛋白質芯片的制作和檢測絲狀噬菌體pIII展示系統的表面展示蛋白拷貝數少，適于淘選高親和力的展示蛋白；pVIII展示系統的表面展示蛋白拷貝數多，檢測能力強，適于制作芯片。由pIII系統淘選到的克隆需按圖2所示轉變為pVIII系統。將步驟2中用正常人白細胞對噬菌體抗體進行五輪淘選得到的針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體克隆，和用白血病患者白細胞對經過正常白細胞扣除后的噬菌體抗體庫進行三輪淘選得到的針對白血病白細胞特異抗原的噬菌體抗體克隆(存在于pIII展示載體中)，提取重組載體DNA，用Sfi I/Not I雙酶切，分離出抗體基因，插入pVIII展示載體中，使噬菌體抗體轉換成適于制作芯片的展示系統(圖5)。具體方法如下用Sfi I和Not I對pCANTAB 5E-scFv進行雙酶切，得到scFv，插入用Sfi I和Not I雙酶切的pVIII展示載體pCAU-8，得到pVIII展示載pCAU-8-scFv(如圖2所示)。由此得到用于制作芯片的針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體庫，和針對白血病白細胞特異抗原的噬菌體抗體庫。
其他噬菌體展示系統也可同樣在淘選時用表面展示蛋白拷貝數少的系統，但在制作芯片時轉變成拷貝數多的系統。為了簡化操作，有時可以用拷貝數適中的系統進行淘選和制作芯片，而無需進行兩者的轉換。
制作芯片是將淘選到或特殊制備的重組噬菌體，通過偶聯劑以微陣列固定在基片上。手工點樣效率低，而且規格不易一致；通常都用點樣儀或自動化機械臂來制作芯片。
從用于制作芯片的針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體庫，和針對白血病白細胞特異抗原的噬菌體抗體庫中各隨機挑取48個克隆，用作芯片的檢測探針。重組噬菌體溶液滴度分別調整至1012cfu/μL，并在點樣前添加十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度0.2％(0.2g/100mL)。將作為檢測探針的96份重組噬菌體溶液，和作為陰性對照的2份輔助噬菌體M13K07溶液及2份2％牛血清清蛋白(BSA)溶液，置于384孔板中，固定在操作裝置上。使用微陣點樣儀ArrayItTMSpotBotRPersonal Microarray Robot(TeleChem International Inc.)，將噬菌體抗體克隆點到環氧基玻片CapitalBioREpoxySlideTM(CapitalBio Corporation)上。每個微陣列由300個點組成，即每個檢測探針點三個樣，將芯片于37℃固定過夜。利用原子力顯微鏡(AFM)觀察噬菌體與環氧基玻片的偶聯情況，掃描采用單晶硅針尖，Tapping模式，以減少由于針尖與表面接觸而導致形貌的破壞。結果如圖3所示，照片顯示重組絲狀噬菌體平鋪在芯片4μm2表面，表明共價連接的噬菌體能保持其正常生理條件下的細絲狀形態，噬菌體呈致密排布，并具有基本相同的取向，這樣的固定有利于保持噬菌體的生物活性。
取3名正常人和3名白血病(急性粒細胞白血病)患者白細胞，在100μL含1％(1ml/100mL)Triton-100的磷酸鹽緩沖液(PBST)中裂解。將裂解物離心，上清液用Cy3熒光染料(Amersham Biosciences)標記，并用凝膠過濾(FluoroLinkTM-Ab Cy3 labelling kit，Amersham Biosciences)純化。
將噬菌體抗體芯片用含2％(2g/100mL)BSA的PBS溶液37℃封閉30mim，然后用2％乙酰化BSA的PBS溶液37℃再封閉30min。向每個樣品池中加入40μL Cy3標記的白細胞裂解物樣品，于37℃保溫1h。將芯片用0.1％PBST清洗三次，用PBS清洗一次，最后用微陣共聚焦掃描儀ScanArray Express Microarray Scanner(Perking Elmer)檢測微陣點Cy3熒光強度。實驗結果如圖4所示。在圖4中，左上角(A1)和右上角(A20)各3個點均為BSA，左下角(E1)和右下角(E20)各3個點均為M13K07，分別作為蛋白質和噬菌體的空白對照。每一芯片右半邊各點為針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體克??；左半邊各點為針對白血病患者白細胞表面特異抗原的噬菌體抗體單克隆。芯片與正常人和白血病人白細胞提取物反應，結果表明針對白細胞表面共同抗原的噬菌體抗體單克隆(即右半邊各陣列點)，對白血病患者樣品和正常人樣品反應的結果基本相同；然而針對白血病患者白細胞表面特異抗原的噬菌體抗體單克隆(左半邊陣列點)，對白血病患者樣品和正常人樣品反應的結果差異較大。特別是在A6、A9、B1、B7、B8、C2、D6和D9位的熒光探針(重組噬菌體)對白血病樣品是特異的，這些斑點在白血病患者樣品的檢測圖譜中具有很強的信號(高出正常人3倍)。也就是說該處的噬菌體抗體對白血病白細胞表面抗原具有特異性，可用于白血病的診斷，還可以進一步找出白血病白細胞表面的特異抗原。
實例2、噬菌體展示多肽庫、展示cDNA庫和展示多肽芯片(1)噬菌體展示多肽庫的構建噬菌體展示多肽庫可以參照如下方法進行構建編碼隨機十五肽的模板序列為5’TTCCGATGCTAAGCTTCGCT(NNK)15GGTGGTGGCTCGGATCCATTC 3’，其中N為等量的A、G、C或T，K為等量的G或T。用5’引物5’TTCCGATGCTAAGCTTCGCT 3’和3’引物5’GAATGGATCCGA GCCACCAC 3’進行PCR，擴增得到雙鏈片段用Hind III和BamH I雙酶切，插入絲狀噬菌體展示載體，得到含有十五肽編碼序列的重組噬菌體。按實施例1的方法轉化大腸桿菌TG1，用輔助噬菌體M13K07感染，在SOC-AK培養基內培養過夜。上清液加入1/5體積的由20％PEG和2.5M NaCl組成的溶液沉淀噬菌體，沉淀溶于PBS即為噬菌體展示多肽庫，測定滴度并置冰箱保存。
(2)噬菌體展示cDNA庫的構建可以參照如下方法進行構建構建cDNA展示庫需要從真核細胞中提取mRNA，以oligo(dT)和隨機六核苷酸引物通過RT-PCR合成cDNA。將cDNA插入適宜的噬菌體展示載體，并按上述步驟轉化大腸桿菌細胞，收集重組噬菌體，即為cDNA展示庫。cDNA編碼的蛋白質與外殼蛋白的C端融合，展示于噬菌體表面。
(3)噬菌體展示葡激酶突變體庫的構建葡激酶是人體纖溶酶原的激活劑，可作為有效的溶栓藥物用于血栓病治療，但它的毒副反應較大，限制了其臨床的應用。通過基因突變和重組，獲得突變體庫，可從中挑選出毒副反應小的突變體。突變體庫可以參照如下方法進行構建將葡激酶基因通過DNA改組(DNA shuffling)技術，即將基因切碎并用PCR重新連接，由此得到一系列大大小小改組的葡激酶基因突變體。所有突變體基因插入T7噬菌體展示載體，與外殼蛋白p10基因融合。按照實施例1的方法將該重組噬菌體制成芯片，與人纖溶酶原進行雜交，結果從200多個突變體中得到3個分子量變小并有高親和力的突變葡激酶，將有助于研制低毒或無毒的新型葡激酶。
(4)從噬菌體展示庫中淘選特異的展示多肽或蛋白質克隆可以參照如下方法淘選特異的展示多肽克隆細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)的主要功能是介導細胞間的粘附作用，在炎癥時大量表達于有關細胞表面，與多種機體功能紊亂和疾病有關。尋找ICAM-1的配體，可作為抗炎癥的侯選藥物。利用絲狀噬菌體展示載體構建隨機十五肽庫，以ICAM-1為靶分子，從隨機多肽庫中淘選出與它特異結合的十五肽。具體方法如下將ICAM-1溶于0.1mol/L PBS，包被于96孔酶標板孔穴中，用4％脫脂奶粉的PBS溶液(PBSM)封閉后加入噬菌體展示十五肽庫溶液，吸附過夜。多次洗滌，除去未吸附的重組噬菌體，回收特異吸附于ICAM-1上的噬菌體十五肽克隆。擴增重組噬菌體，重復上述淘選過程，共淘選四輪，然后檢測各配體克隆的親和力，選出五個親力最強的克隆。其結果如表3所示。
表3噬菌體展示十五肽克隆的性質
(5)噬菌體展示多肽或蛋白質芯片的制備從噬菌體展示隨機多肽庫、展示cDNA庫和突變體庫中，按需要用適當的選擇劑進行淘選，可以獲得各種特異功能的克隆。將這些克隆參照實施例1的操作步驟，以微陣列固定在芯片上，即制備得到不同用途的噬菌體展示蛋白質芯片。它們或用于檢測、或用于診斷、或用于篩選藥物。
序列表<160>2<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 4權利要求
1.一種蛋白質芯片，是由基片和將用作分子檢測器的蛋白質展示于表面的重組噬菌體組成，所述重組噬菌體以微陣列固定在基片上。
2.根據權利要求1所述的蛋白質芯片，其中，用于制作噬菌體展示蛋白質芯片的噬菌體包括絲狀噬菌體f1、fd、M13，長尾噬菌體λ和短尾噬菌體T7。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白質芯片，其制作特征在于按照以下方法將所述用作分子檢測器的蛋白質展示于噬菌體表面，即將用作分子檢測器的蛋白質編碼基因通過柔性鏈的編碼序列與噬菌體載體或噬菌粒載體的外殼蛋白基因融合，使用作分子檢測器的蛋白質表達在噬菌體表面；所述柔性鏈具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列。
4.根據權利要求3所述的蛋白質芯片，其制作特征在于所述噬菌體載體或噬菌粒載體以次要外殼蛋白或主要外殼蛋白基因與外源蛋白基因融合。
5.根據權利要求3所述的蛋白質芯片，其制作特征在于用作分子檢測器的蛋白質包括抗原和抗體、酶和作用物、配體和受體、活性多肽、cDNA表達的蛋白質。
6.根據權利要求3所述的蛋白質芯片，其制作特征在于所述基片為濾膜、玻片或硅片。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質芯片。該蛋白質芯片，是由基片和表面展示有用作分子檢測器的蛋白質的重組噬菌體組成，所述表面展示有用作分子檢測器的蛋白質的重組噬菌體以微陣列固定在基片上。本發明將制作芯片的蛋白質展示于噬菌體上，使蛋白質得以克隆免除了分離純化后處理，并可通過淘選獲得各種特異功能的蛋白質克隆，而且還消除了芯片的表面影響，克服了當前蛋白質芯片技術的主要困難。本發明的新型噬菌體展示蛋白質芯片必將有更廣泛的應用前景。
文檔編號G01N33/68GK101086501SQ20061001219
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者朱圣庚, 趙新生, 畢群, 黃儀秀, 洪龍, 廖瑋, 岑曉東, 譚濤超 申請人:北京大學
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