專利名稱：過氧化物陰離子用電極及使用該電極的傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物體內的過氧化物陰離子自由基(O2--)等過氧化物陰離子用電極以及使用該濃度測定用電極的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器。更詳細地說，涉及能夠適用于生物體內(in vivo)且不受諸如過氧化氫等存在于測定體系內的致毒性物質的影響的過氧化物陰離子用電極以及過氧化物陰離子的濃度測定用傳感器。
背景技術：
作為活性氧種的過氧化物陰離子自由基(O2--)，在生物體內其是通過黃嘌呤和次黃嘌呤等在黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶(XOD)作用下氧化成尿酸以及氧被血紅蛋白還原等而生成的，其與生物體內的生理活性物質的合成、殺菌作用、老化現象等相關，具有重要的作用。另一方面，認為由過氧化物陰離子自由基派生的各種活性氧種引起癌癥等各種疾病，因此生物體內的含有過氧化物陰離子自由基的活性氧種的濃度測定對于判定上述各種疾病也是重要的。
如式(1)所示，在不存在基質時，該過氧化物陰離子自由基通過歧化反應形成過氧化氫(H2O2)和氧氣分子(O2)。該歧化反應包括質子向過氧化物陰離子自由基加成而生成HO2·；HO2·與氧氣分子反應而生成過氧化氫和氧氣分子；以及HO2·之間碰撞而生成過氧化氫和氧氣分子(式(1)～式(4))。
2H++2O2-·→H2O2+O2……(1)H++O2-·→HO2· ……(2)HO2·+O2-·+H+→H2O2+O2……(3)HO2·+HO2·→H2O2+O2……(4)該反應體系中，過氧化物陰離子自由基以電子受體(氧化劑)、電子供體(還原劑)以及氫離子的受體(堿)的形式發揮作用，利用其中前兩者的性質，嘗試進行過氧化物陰離子自由基的濃度測定。例如，利用鐵細胞色素c(3價)向亞鐵細胞色素c(2價)的轉換反應、由硝基四唑氮藍(NBT)生成甲瓚藍的反應以及四硝基甲烷(TNM)的還原反應，嘗試進行過氧化物陰離子自由基的濃度測定，但是這些都是體外(in vitro)測定方法。
另一方面，也對定量地檢測生物體內(in vivo)的過氧化物陰離子自由基的濃度的方法進行了研究。例如，McNeil等人、Tariov等人、Cooper等人指出，用作為酶的N-乙酰半胱氨酸修飾金或鉑電極的表面，使蛋白質在其上形成S-Au鍵而得以固定，制得酶電極(細胞色素c固定化電極)，所述蛋白質是細胞色素c等被稱作亞鐵血紅素的蛋白質，其是以鐵配位化合物為氧化還原中心的金屬蛋白質，由此可以通過電化學方法檢測過氧化物陰離子自由基的濃度(C.J.McNeil et al.Free Radical Res.Commun.，7，89(1989)；M.J.Tariov et al.J.Am.Chem.Soc.113，1847(1991)；J.M.Cooper，K.R.Greenough and C.J.McNeil，J.Electroanal.Chem.，347，267(1993))。
該檢測方法的測定原理如下即，細胞色素c(3價)(cyt.c(Fe3+))與過氧化物陰離子自由基發生如式(5)所示的反應，還原為細胞色素c(2價)(cyt.c(Fe2+))。然后，如式(6)所示，通過O2-電化學地將還原得到的細胞色素c(2價)再次氧化，測定此時的氧化電流，由此間接地定量檢測過氧化物陰離子自由基的濃度。
cyt.c(Fe3+)+O2-→cyt.c(Fe2+)+O2……(5)cyt.c(Fe2+)→cyt.c(Fe3+)+e-……(6)但是，由于細胞色素c是存在于生物體細胞內的線粒體的膜上的電子轉移蛋白質，所以為了制作固定了足夠上述測定的量的細胞色素c的電極，必需多達105個～106個的大量的細胞，此外，也存在所使用的酶在數日內失活的問題。
此外，本發明人首先發現，如果電極在導電性部件的表面上形成有金屬卟啉配位化合物的聚合膜，則這樣的電極不需要大量的酶，此外，也無失活的問題，可以用于檢測活性氧種的存在或濃度，并提出了專利申請(WO 03/054536)，其中所述金屬卟啉配位化合物在卟啉化合物的中心導入了金屬原子。
但是，由于上述反應所示的過氧化物陰離子自由基的歧化反應中產生過氧化氫，而且其是金屬卟啉配位化合物聚合膜的致毒物質，必須想辦法使得測定過氧化物陰離子時不受其影響。
因此，本發明期待開發出一種電極，其能簡單地測定過氧化物陰離子自由基，并且消除了所產生的過氧化氫等致毒性物質的影響。
發明內容
本發明人對在導電性部件的表面上形成有金屬卟啉配位化合物的聚合膜的電極進一步進行改進性能的精心研究時發現，通過使用特定種類間位取代基的卟啉化合物以及特定的軸向配體，可以防止由于中毒所導致的影響，從而完成了本發明。
即，本發明提供過氧化物陰離子用電極，該過氧化物陰離子用電極的特征在于，在導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的電解聚合膜。
此外，本發明提供過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，該過氧化物陰離子濃度測定用傳感器含有活性氧種用電極、反電極和參比電極；所述活性氧種用電極是在導電性部件的表面上形成金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜來形成的。
進一步地，本發明提供樣品中的過氧化物陰離子的檢測方法，該方法中，用上述傳感器測定金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物聚合膜中的金屬和過氧化物陰離子之間的氧化還原反應所產生的電流。
圖1是說明為了制造本發明電極而使用的3電極式電池的一個例子的圖。
圖2是說明為了制造本發明電極而使用的2室型3電極式電池的一個例子的圖。
圖3是說明為了制造本發明電極而使用的針型電極和2室型3電極式電池的一個例子的圖。圖中，(A)說明2室型3電極式電池，(B)說明針型電極整體，(C)說明針型電極的末端部分。
圖4是說明為了制造本發明電極而使用的改進的針型電極的圖，圖中，(A)說明改進的針型電極整體，(B)說明改進的針型電極的末端部分。
圖5是說明用于活性氧種的測定用的測定裝置一個例子的圖。
圖6是說明用于活性氧種的測定用的測定裝置的另一個例子的圖。
圖7是說明[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)]溴化物的紫外-可見光光譜的圖。
圖8是說明[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(咪唑基)]溴化物的紫外-可見光光譜的圖。
圖9是說明5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉的紫外-可見光光譜的圖。
圖10是說明本發明品的電解聚合時的CV曲線的圖。
圖11是說明比較品1的添加XOD時的氧化電流的隨著時間推移而變化的圖。
圖12是說明本發明品1的添加XOD時的氧化電流的隨著時間推移而變化的圖。
具體實施例方式
本發明的過氧化物陰離子用電極(下文稱為“電極”)在導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜。
作為構成本發明的電極的導電性部件，只要是一般作為電極用而使用的部件，則使用可不受不特別限制，例如，可以使用玻璃化炭黑(GlassyCarbonGC)、石墨、熱解石墨(PG)、高定向熱解石墨(HOPG)、活性炭等碳類；鉑、金、銀等貴金屬；或In2O3/SnO2(ITO)等，但是特別是考慮到經濟性、加工性、輕量性等時，優選使用玻璃化炭黑。此外，對于導電性部件的形狀，只要是能夠用作電極的形狀，則沒有特別限制，可以為圓柱狀、棱柱狀、針狀、纖維(fiber)狀等各種形狀，但是，例如，為了測定生物體內的過氧化物陰離子濃度，優選為針狀的形狀。
本發明中，在上述導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜，作為用于形成該金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜的金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的例子，可以舉出下述式(I)所示的化合物。
(式中，M表示II價和III價之間的氧化還原電位比O2-·的氧化電位高而比水的氧化電位低的金屬，4個R中的至少1個表示硫代呋喃基，2個L中的至少1個表示提供絡合形成常數大于等于104M-2且穩定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的軸向配體)上述式(I)所示的金屬硫代呋喃基卟啉配位化合物中，作為M即II價和III價之間的氧化還原電位比O2--的氧化電位高而比水的氧化電位低的金屬，可以舉出鐵(III)或錳(III)等。此外，作為R的硫代呋喃基，可以舉出2-硫代呋喃基、3-硫代呋喃基等。進一步地，L作為提供大于等于絡合形成常數且穩定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的軸向配體，可以舉出咪唑衍生物，例如甲基咪唑、乙基咪唑、丙基咪唑、二甲基咪唑等烷基咪唑；芐基咪唑等芳基烷基咪唑等；或苯并咪唑等。
本發明的金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物是軸向配體和金屬原子配位于硫代呋喃基卟啉化合物的配位化合物。該硫代呋喃基卟啉化合物是4個吡咯環在α位置與4個甲基交互鍵合的環狀化合物，且其是4個氮原子朝向中心而形成的，其具有至少一個硫代呋喃基作為次甲基的取代基(式(I)中，R)。其它的次甲基的取代基可以是相同的硫代呋喃基或其它的基團，例如，吡咯基、呋喃基、巰基苯基、氨基苯基、羥基苯基、烷基、芳基(aryl)等或氫原子。
作為本發明中所使用的硫代呋喃基卟啉化合物的例子，可以舉出5，10，15，20-四(2-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉、[5，10，15-三(2-硫代呋喃基)-20-單(苯基)]卟啉、[5，10，15-三(3-硫代呋喃基)-20-單(苯基)]卟啉、[5，10-二(2-硫代呋喃基)-15，20-二(苯基)]卟啉、[5，10-二(3-硫代呋喃基)-15，20-二(苯基)]卟啉、[5，15-二(2-硫代呋喃基)-10，20-二(苯基)]卟啉、[5，15-二(3-硫代呋喃基)-10，20-二(苯基)]卟啉、[5-單(2-硫代呋喃基)-10，15，20-三(苯基)]卟啉、[5-單(3-硫代呋喃基)-10，15，20-三(苯基)]卟啉等。
此外，對于該硫代呋喃基卟啉化合物的軸向配體(式(I)中，L)的至少1個必須為上述咪唑衍生物，作為其它的軸向配體，可以為咪唑衍生物或其它的軸向配體，所述其它的軸向配體例如有吡啶及其衍生物、苯胺及其衍生物、組氨酸及其衍生物、三甲胺及其衍生物等氮類軸向配體；苯硫酚及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、蛋氨酸及其衍生物等硫類軸向配體；苯甲酸及其衍生物、乙酸及其衍生物、苯酚及其衍生物、脂肪族醇及其衍生物、水等氧類軸向配體。
通過在具有上述軸向配體的硫代呋喃基卟啉化合物中導入金屬原子(式(I)中，M)，可以以配位化合物的形式形成金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物。形成該配位化合物時，可以使用通常所使用的金屬配位化合物的形成方法，例如，可以使用金屬化(Metalation)等方法，將金屬原子導入硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的中心。
本發明中，在導電性部件的表面上形成上述金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜時，可以使用電解聚合法、溶液聚合法、非均相聚合法等各種聚合方法。其中，優選使用電解聚合法來形成聚合膜，具體地說，在二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等有機溶劑中，加入高氯酸四丁基銨(TBAPBu4NClO4)、高氯酸四丙基銨(TPAPPr4NClO4)、高氯酸四乙基銨(TEAPEt4NClO4)等適當的支持電解質，以導電性部件為作用電極，以鉑(Pt)電極等貴金屬電極、鈦電極、碳類電極、不銹鋼電極等不溶性電極為反電極，以飽和甘汞電極(SCE)、銀-氯化銀電極等為參比電極，進行2電極(作用電極-反電極)式的電解或3電極(作用電極-反電極-參比電極)式的恒定電位、恒定電流、可逆電位掃描、脈沖式的電解等，進行聚合，由此可以在導電性部件的表面上形成金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物聚合膜。
例如，該電解聚合優選使用如圖1所示的3電極式電池，通過可逆電位掃描電解法等來進行。圖1中，1為電池容器，2為導電性部件，3為反電極，4為參比電極、5為金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物溶液，6為恒電位儀(potentiostat)，7為X-Y記錄器。
此外，使用高濃度的金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物溶液的情況下，例如，也可以使用如圖2所示的2室型3電極式電池。圖2中，1～7的意義與圖1中的相同，8為電解質溶液，9為樣品小瓶。
此外，考慮到生物體內測定、復合化測定、臨床上的診斷、治療等，制造簡化的過氧化物陰離子用電極(針型電極)時，例如，也可以使用圖3(A)和(B)所示的針型電極10和3電極式電池。圖3中，1為電池容器，4為參比電極，5為金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物溶液，6為恒電位儀(potentiostat)，7為X-Y記錄器、8為電解質溶液，9為樣品小瓶、10為針型電極，11為反電極部分，12為導電部件端部(金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物聚合膜形成部分)，13為電絕緣性材料，14為反電極用配線。
對于該電極，如圖3(C)所示，在經電絕緣材料13調制的細管中加入導電性部件，進一步用成為反電極的金屬等材料覆蓋該細管的外側，制得反電極部分11。然后，通過在導電性部件端面12上形成金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物聚合膜，可以用作針型電極。
而且，對于金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜的厚度，雖然根據電極和金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的種類等來適當地決定，但是從電極活性、修飾穩定性等方面考慮，優選小于等于10μm。此外，優選其導電率大于等于10-3S/cm。
進一步地，基于去除不必要的生物體內電流、電流噪聲等以及提高靈敏度、信號/噪聲比(S/N比)等目的，對圖3的簡化過氧化物陰離子用電極(針型電極)進行改進而制造過氧化物陰離子用電極(改進的針型電極)時，也可以使用如圖4(A)所示的改進的針型電極15和圖3(A)所示的3電極式電池。圖4中，11為反電極部分，12為導電部件端部(金屬卟啉聚合膜形成部分)，13為電絕緣性材料，14為反電極用配線，15為改進的針型電極，16為接地部分，17為接地用配線。
對于該電極，如圖4(B)所示，將導電性部件加入電絕緣性材料13中(2層結構)，將它們加入反電極用材料11中(3層結構)，進一步將它們加入電絕緣性材料13中(4層結構)，最后用成為接地的金屬等材料覆蓋該細管的外側(5層結構)，制得接地部分16。通過在導電性部件端面12上形成金屬卟啉聚合膜，可以用作改進后的簡化的過氧化物陰離子用電極(改進的針型電極)。
而且，對于金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜的厚度，雖然根據電極和金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的種類來適當地決定，但是從電極活性、修飾穩定性等方面考慮，優選小于等于10μm。此外，其導電率優選大于等于10-3S/cm。而且，由于該改進的針型電極也用于復合化測定等，所以可以為直至10多層左右的多層結構。而且，作為接地的構成材料，雖然可以使用鉑、金、銀等貴金屬；鈦、不銹鋼、鐵-鉻合金等耐腐蝕性合金；碳類等材料，但是由于接地大都進入生物體內，優選由安全性較高的材料(例如，鉑、金、銀等貴金屬；鈦；不銹鋼；碳類等)等構成。
將本發明的電極用于過氧化物陰離子的測定，特別是其濃度的測定時，優選在該電極上組合①反電極和參比電極(3電極式)或②反電極(2電極式)。作為該反電極的構成材料，雖然可以使用鉑、金、銀等貴金屬；鈦、不銹鋼、鐵-鉻合金等耐腐蝕性合金；碳類等材料，但是由于反電極大都進入生物體內，優選由安全性較高的材料(例如，鉑、金、銀等貴金屬；鈦；不銹鋼；碳類等)等構成。
此外，作為參比電極，通?？梢允褂勉y/氯化銀電極、汞/氯化汞等各種參比電極，此外，也可以使用固體的標準電極。進一步地，可以使用鉑、金、銀等貴金屬；鈦、不銹鋼、鐵-鉻合金等耐腐蝕性合金；碳類等材料。
具體地說，能夠用于過氧化物陰離子的測定用的測定裝置的一個例子如圖5所示。圖5中的1、3、4、6和7的意義與圖1中的相同，18為測定電極(作用電極)、19為微量注射器、20為測定溶液、21為磁力攪拌機、22為攪拌子。
此外，能夠用于過氧化物陰離子測定用的測定裝置的另一個例子如圖6所示。圖6中的1、6、7、19～22的意義與圖4中的相同，10為針型電極。
本發明的過氧化物陰離子用電極可以在上述裝置中用作用于檢測過氧化物陰離子的電極，通過與①反電極和參比電極(3電極式)或②反電極(2電極式)一起使用，可以形成過氧化物陰離子濃度測定用的傳感器。若在存在過氧化物陰離子自由基的測定體系中使用上述結構的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，則形成聚合膜的金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物中的金屬被過氧化物陰離子自由基還原。例如，若該金屬為鐵，則被過氧化物陰離子自由基從Fe3+還原成Fe2+(式(7))。
然后，在將濃度測定電極電位(①3電極式時)或電壓(②2電極式時)保持于能夠氧化Fe2+的程度的狀態下，將被過氧化物陰離子自由基還原的Fe2+再次電化學氧化(式(8))，若測定此時的所流的電流(氧化電流)，則由于該電流值與過氧化物陰離子自由基濃度相對應，所以可以由該氧化電流定量地檢測溶解于樣品溶液中的過氧化物陰離子自由基的濃度。即，通過與上式(5)和式(6)相同的原理，本發明的過氧化物陰離子用電極可以進行過氧化物陰離子自由基的濃度測定。
Por(Fe3+)+O2-·→Por(Fe2+)+O2……(7)Por(Fe2+)→Por(Fe3+)+e-……(8)(式(7)和式(8)中，“Por”指的是卟啉)本發明的過氧化物陰離子用電極，由于在導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜，所以與使用以往的金屬卟啉聚合膜的電極相比，不易受到過氧化氫等致毒物質的影響，金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體的聚合膜的強度也大，能夠耐受重復的使用。此外，由于使用電解聚合法等來進行成膜，所以與以往的電極相比，其調制也極其容易，可以得到特別是在生物體內易使用的形狀諸如針狀等。
如此，本發明的過氧化物陰離子用電極不必說在生物體外(in vitro)，即使在生物體內(in vivo)的環境下，也可以檢測過氧化物陰離子自由基，通過與反電極或參比電極組合，可以定量地測定這些過氧化物陰離子，所以可以廣泛用于各種領域。
即，在生物體內(in vivo)，例如，通過測定血液中的過氧化物陰離子的濃度，可以進行癌癥等疾病的判定。
另一方面，即使在生物體外(in vitro)，通過測定食品內的過氧化物陰離子或其濃度，可以觀察該食品的腐敗狀態。此外，通過測定自來水或廢水等水中的過氧化物陰離子或其濃度，可以觀察水質污染的狀態。
進一步地，作為具有消除過氧化物陰離子自由基和該陰離子作用的酶，過氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase下文稱為“SOD”)的濃度也可以通過測定加入含有SOD的樣品時的過氧化物陰離子自由基的消除程度來測定。
通過本發明的過氧化物陰離子用電極，可以防止由于過氧化氫等致毒物質所導致中毒理由可能如下。
即，可能是由于，例如過氧化氫配位于作為活性中心的諸如鐵等金屬而使其中毒。與此相對地，作為軸向配體的咪唑類預先配位于鐵的第五、六配齒處，將其占有，從而過氧化氫不能配位于鐵上(鐵的第一～第四配齒已被卟啉的吡咯配位)。如此，由于咪唑類等軸向配體配位于作為活性中心的鐵上，抑制了過氧化氫的致毒，所以即使在過氧化氫的存在下，也能夠穩定地測定過氧化物陰離子自由基。
實施例雖然下文舉出參考例、實施例、比較例和試驗例來對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不限于此。
參考例1金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的合成(1)
將0.036g的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物和200μl的1-甲基咪唑溶解于1ml蒸餾二氯甲烷中，在室溫下攪拌5小時。使用蒸發裝置來將其蒸發干燥，得到[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物(收率為92％)。
UV(CHCl3，nm，λmax)419。
由于與無咪唑的配位化合物的吸收波長(λmax＝424nm)不同，所以可以確認到咪唑配位。此外，在磁圓偏振二色性光譜中，由于咪唑的配位，減小了580nm和600nm附近的偏振角，由此確認為六配位結構。
所使用的原料5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物的UV(紫外)光譜如圖7所示。此外，產物[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物的UV光譜如圖8所示。
參考例2金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的合成(2)將0.041g的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物和0.08g的1-芐基咪唑溶解于3ml蒸餾氯仿中，在室溫下攪拌5小時。使用蒸發裝置來將其蒸發干燥，得到[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(1-芐基咪唑基)]溴化物(收率為90％)。
UV(CHCl3，nm，λmax)418。
由于與無咪唑的配位化合物的吸收波長(λmax＝424nm)不同，可以確認到咪唑配位。
參考例3(1)將含有50ml丙酸、2.0ml的3-噻吩甲醛和1.4ml吡咯的溶液在不斷攪拌下，在90℃下回流1小時。放冷至室溫后，用冰冷卻，將其滴入200ml的甲醇中。過濾沉淀物，用甲醇洗滌后，用硅膠柱色譜(展開溶劑氯仿)精制。從而以19％的收率得到產物5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉。
1H NMR(CDCl3，ppm)δ-2.7(s，2H)，7.7(t，4H)，8.0(m，8H)，8.9(s，8H)。
5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉的UV光譜如圖9所示。
(2)然后，在10mL保持于嚴密的氮氣氛圍氣下的氫溴酸(48％)中加入100mg還原鐵，100℃下進行攪拌。將溶液蒸發干燥后，添加250mg的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉和200mL的二甲基甲酰胺，在氮氣下攪拌4小時。在其中加入200mL氯仿，用離子交換水洗滌，進行脫水、蒸發干燥后，用氧化鋁柱色譜(展開溶劑氯仿/甲醇＝20/1)精制。在洗脫液中加入48％的氫溴酸，進行脫水、蒸發干燥后進行重結晶，以54％的收率得到5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物。
UV(CHCl3，nm，λmax)424。
參考例4參考例3所示的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物合成法的改進在300ml圓底燒瓶中，取150ml丙酸，8.0ml的3-噻吩甲醛和5.6ml吡咯，攪拌該溶液的同時在160℃下回流1小時。放冷至室溫后，添加200ml冷卻至0℃的甲醇，通過抽濾回收生成的沉淀后，進行減壓干燥(120℃，6小時)。將所得到的黑色粉末結晶溶解于氯仿中，過濾不溶部分后，通過硅膠柱色譜(展開溶劑氯仿)和重結晶進行精制。進行減壓干燥后，以20％的收率得到黑紫色微晶形式的產物5，10，1 5，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉。
1H NMR(CDCl3，ppm)8-2.7(s，2H)，7.7(t，4H)，8.0(m，8H)，8.9(s，8H)。
然后，在保持于純氬氣氛圍氣下的500ml四口燒瓶中，導入6ml氫溴酸(48％)，加入200mg還原鐵，攪拌的同時在90℃下使其反應。將溶液蒸發干燥后，純氬氣下在所得到的FeBr2中添加150ml二甲基甲酰胺，進一步加入150mg的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉，純氬氣下回流6小時(140℃)。蒸餾除去DMF后，添加200ml氯仿來進行溶解，用離子交換水洗滌，然后添加2滴氫溴酸，蒸餾除去溶劑后進行減壓干燥(100℃，6小時)。以74％的收率得到產物5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物。
實施例1
過氧化物陰離子用電極的制造(1)用氧化鋁拋光劑(0.05μm)對玻璃化炭黑(GC)電極(直徑為1.0mm)進行拋光，將其用水洗滌后，進一步用甲醇洗滌。對于該電極的表面，使用下述電解溶液和操作順序，通過電解聚合法制造在表面上形成有2分子咪唑配位于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)的聚合膜的玻璃化炭黑電極(本發明品1)。
(樣品溶液)作為金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物，以0.001M的濃度使用由參考例1合成的[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物。溶劑使用含有0.1M的高氯酸四丁基銨(Bu4NClO4/TBAP)為支持電解質的二氯甲烷(無水)。而且，通過氬氣除去溶劑中的溶解氧。
(操作順序)電解聚合通過圖1所示結構的3電極式電池(作用電極GC，反電極Pt線，參比電極SCE)用可逆電位掃描電解法來進行。調制使用2分子咪唑配合于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)的聚合膜的過氧化物陰離子用電極時，掃描范圍對于SCE為0V～2.0V，調制使用2分子1-芐基咪唑配合于參考例2的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)的聚合膜的過氧化物陰離子用電極時，掃描范圍對于SCE為-0.2V～1.8V。此外，掃描速度都為0.05V/s，掃描次數在任意情況下都掃描15次。而且，該電解操作中所得到的循環伏安圖(CV曲線)如圖9和圖10所示。
圖10說明使用[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(咪唑基)]溴化物作為金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物來制造的電極(本發明品1)的電解聚合時的CV曲線。由該結果可知，在GC電極的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物(2分子咪唑配位于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)而形成的配位化合物)的聚合膜。
比較例1比較過氧化物陰離子用電極的制造
使用參考例3的不具有軸向配體的金屬硫代呋喃基卟啉[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)溴化物]，以下，與參考例3同樣地操作來調制金屬硫代呋喃基卟啉聚合膜覆蓋玻璃化炭黑電極(比較品1)。
試驗例1過氧化物陰離子自由基量的測定試驗使用本發明品1和比較品1的電極來進行過氧化物陰離子自由基量的測定。
首先，在電池容器中設置本發明品1或比較品1的電極作為作用電極，設置Pt線為反電極，使用銀/氯化銀電極(Ag/AgCl)作為參比電極，從而構成試驗用3電極式電池。以該試驗用3電極式電池為中心，準備如圖5所示的裝置。試驗中，對于比較品1的電極，電位掃描范圍設定為-0.2V～0.25V(對于Ag/AgCl)，對于本發明品1的電極，設定為-0.5V～0.5V(對于Ag/AgCl)。此外，在數種掃描速度下進行測定。
另一方面，調制含有14.4mM黃嘌呤的2mM氫氧化鉀水溶液和含有10mM氯化鉀的10mM的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(pH為7.5)，分別取前者0.365ml，后者14.635ml，將它們混合，調制0.35mM黃嘌呤溶液作為測定溶液。用高純度氬氣除去該測定溶液中的溶解氧。
然后，將上述測定溶液加入各個試驗用3電極式電池，施加充分高于各電極的氧化還原電位的電位，例如0.2V(對于Ag/AgCl)。在該測定溶液中，添加黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidaseXOD)至最后濃度為0mU/ml～100mU/ml，記錄此時的氧化電流的隨著時間推移的變化。本發明品1的結果如圖12所示，比較品1的結果如圖11所示。而且，XOD在使用前用10ml磷酸緩沖溶液(pH＝7.0)透析。此外，測定都在室溫下進行。
由該結果可知，對于比較品的電極，受到過氧化氫的阻礙電流的影響，過氧化物陰離子的檢測電流迅速衰減，而對于聚合作為咪唑配位的配位化合物的[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合鐵(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物而得到的電極，觀測到恒定的檢測電流。
產業上的可利用性本發明的過氧化物陰離子用電極由于不僅具有金屬卟啉配位化合物的聚合膜的電極所具有的優異性能，還可以防止由于過氧化氫等致毒性物質所導致的中毒，所以即使在生物體外(in vitro)和生物體內(in vivo)的任意一種環境下，也可以不受過氧化氫等致毒物質的影響而檢測過氧化物陰離子自由基。此外，由于通過與反電極或參比電極組合，可以定量地測定這些過氧化物陰離子，所以可以廣泛用于各種領域。
因此，例如，通過在生物體內(in vivo)的使用，可以由生物體內的活性酶種或其它的自由基活性種判定各種疾病。
另一方面，通過在生物體外(in vitro)的使用，例如，通過測定食品內的過氧化物陰離子或其濃度，可以判斷該食品的腐敗狀態。此外，通過測定自來水或廢水等水中的過氧化物陰離子或其濃度，可以觀察水質污染的狀態。
權利要求
1.過氧化物陰離子用電極，其特征在于，在導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的電解聚合膜。
2.如權利要求1所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物是下式(I)所示的化合物； 式中，M表示II價和III價之間的氧化還原電位比O2-·的氧化電位高而比水的氧化電位低的金屬，4個R中的至少1個表示硫代呋喃基，2個L中的至少1個表示提供絡合形成常數大于等于104M-2且穩定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的軸向配體。
3.如權利要求2所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述式(I)中，所述M為鐵(III)或錳(III)。
4.如權利要求2或3所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述式(I)中，所述R為2-硫代呋喃基或3-硫代呋喃基。
5.如權利要求2所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述式(I)中，所述L為咪唑衍生物。
6.如權利要求5所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述咪唑衍生物是烷基咪唑或芳基烷基咪唑。
7.如權利要求1～6任意一項所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的電解聚合膜的導電率大于等于10-3S/cm。
8.如權利要求1～7任意一項所述的過氧化物陰離子用電極，其中，所述電極的抗中毒性優異。
9.過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其含有由在導電性部件的表面上形成金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的聚合膜來形成的活性氧種用電極、反電極和參比電極。
10.如權利要求1所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物是下式(I)所示的化合物； 式中，M表示II價和III價之間的氧化還原電位比O2-·的氧化電位高而比水的氧化電位低的金屬，4個R中的至少1個表示硫代呋喃基，2個L中的至少1個表示提供絡合形成常數大于等于104M-2且穩定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的軸向配體。
11.如權利要求10所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述式(I)中，所述M為鐵(III)或錳(III)。
12.如權利要求10或11所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述式(I)中，所述R為2-硫代呋喃基或3-硫代呋喃基。
13.如權利要求11所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述式(I)中，所述L為咪唑衍生物。
14.如權利要求13所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述咪唑衍生物是烷基咪唑或芳基烷基咪唑。
15.如權利要求9～14任意一項所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物的電解聚合膜的導電率大于等于10-3S/cm。
16.如權利要求9～15任意一項所述的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，其中，所述傳感器的抗中毒性優異。
17.樣品中的過氧化物陰離子的檢測方法，其特征在于，用權利要求9～16任意一項所述的傳感器測定金屬硫代呋喃基卟啉-軸向配體配位化合物聚合膜中的金屬和過氧化物陰離子之間的氧化還原反應所產生的電流。
全文摘要
本發明提供過氧化物陰離子用電極和使用該電極的過氧化物陰離子濃度測定用傳感器，所述過氧化物陰離子用電極的特征在于，在導電性部件的表面上形成有金屬硫代呋喃基卟啉－軸向配體配位化合物的電解聚合膜。本發明的過氧化物陰離子用電極由于不僅具有金屬卟啉配位化合物的聚合膜的電極所具有的優異性能，而且由于軸向配體的存在，還可以防止由于過氧化氫等致毒性物質所導致的中毒，所以即使在生物體外(in vitro)和生物體內(in vivo)的任意一種環境下，也可以不受過氧化氫等致毒物質的影響而檢測過氧化物陰離子自由基。此外，通過與反電極或參比電極組合，可以定量地測定這些過氧化物陰離子，所以可以廣泛用于各種領域。
文檔編號G01N27/333GK1954206SQ20048004295
公開日2007年4月25日 申請日期2004年3月12日 優先權日2004年3月12日
發明者湯淺真, 小柳津研一, 山口有朋, 石川滿壽英, 江口勝哉, 小林朋廣, 筒井曉, 豐田裕次郎 申請人:湯淺真
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
