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專利名稱：朊病毒蛋白結合材料及其使用方法
技術領域：
本發明涉及蛋白結合(binding)領域，更具體地，涉及與朊病毒蛋白結合的材料以及應用朊病毒蛋白結合材料來檢測或者去除生物樣品中的朊病毒的方法。
背景技術：
天然或者細胞朊病毒蛋白“PrPc”廣泛分布于哺乳動物中，并且具有特別的非常保守的氨基酸序列以及蛋白結構。認為傳染性朊病毒是由正常細胞(PrPc)朊病毒蛋白的修飾形式構成，并且稱作“PrPsc”。朊病毒與其它傳染性病原體有一些共同的特性，但是看起來其中并不含有核酸。相反，認為翻譯后的構象變化導致了非傳染性的PrPc轉變為傳染性的PrPsc，其中發生了α-螺旋轉變成β-折疊。PrPc含有三個α-螺旋結構以及很少的β-折疊結構；與之相反，PrPsc富含β-折疊。相信PrPc到PrPsc的轉變導致了可傳播性海綿狀腦病(TSEs)的發展，其中，PrPsc積累于中樞神經系統并且同時伴隨著神經病理學的變化以及神經學上的功能紊亂。PrPsc，通常是指朊病毒蛋白的“騷癢癥”形式，并且認為這對于在動物和人中可傳播的神經退化疾病的傳播和致病機理是必要的，并且很可能是充分的。
TSEs的具體例子包括騷癢癥，該疾病侵襲綿羊和山羊；牛海綿狀腦病(BSE)；可傳播的水貂腦病，貓海綿狀腦病和慢性消耗疾病(CWD)。在人中，TSE疾病可表現為苦魯病，克雅(氏)病(或皮層-基底節-脊髓變性癥候群(CJD))，格-施-沙綜合征(Gerstmann-Straiissler-ScheinKer(GSS))，致命性失眠癥以及CJD病的變異體(vCJD)。最近在人類中出現vCJD，導致BSE在英國很流行，并且其最有可能是由于吃了來源于感染了BSE或者“瘋牛病”的家畜類的食物引起。在英國，20世紀80年代中期到90年代早期，由于攝取了感染了BSE的家畜神經組織潛在感染的食物的人數還不清楚。由于在人類中，口腔感染疾病的潛伏期可能超過20年，vCJD的實際發生率可能很多年都顯現不出來。至今，已知超過150個人感染過該種疾病，主要在英國；然而在加拿大，法國，香港，以色列，意大利以及美國也報導過該種病例。英國在世界范圍內出口被感染牛飼料產品表明，很可能全球都存在BSE，并且由此而帶來了vCJD的可能性。與這些觀察結果相一致的是在大多數歐洲國家、日本、加拿大、美國和以色列檢測到BSE。所以，從包括食品在內的各種不同材料中檢測并且去除傳染性的朊病毒蛋白就變得非常重要。
所有TSEs的特征是對于該類物質，缺乏可以檢測到的宿主免疫應答。所以，到目前還沒有確定對TSCs特異的抗體。此外，缺乏已知的核酸序列排除了應用聚合酶鏈式反應為基礎的診斷方法。這樣就沒有常規的血清學檢測可以用于確定被感染的動物。最近，改良的以免疫學為基礎的技術已經用于確定在屠宰動物的腦中是否有PrPsc。
除了攝取來源于牛的被感染產品外，輸血和器官移植是在人之間傳播vCJD的另一種方式。在人中通過輸血來傳播vCJD的風險目前是未知的，但是，基于實驗動物模型的數據，包括用實驗手段使得口腔感染了BSE后的綿羊以及天然地感染了騷癢癥的綿羊進行傳播，結果它們具有非常可能的幾率，已經最可能解釋人與人之間vCJD的傳播。不象其它的人TSEs，PrPsc存在于vCJD患者的淋巴網狀內皮細胞系統中，因此增加了傳染性物質存在于血液中的幾率，并且可以通過輸血進行傳播。其它涉及的通過輸血來提高傳播風險的因素還不清楚，可以設想會很高，很多暴露于BSE的人群，缺乏對于vCJD潛伏期的診斷測試。此外，vCJD的毒性在靈長類和鼠中隨著種族的適應性似乎有所增加，這意味著人與人之間的傳播比牛對人的傳播更有效。因此，迫切地需要一些方法來阻止vCJD通過輸血傳播。這樣的措施可以包括被感染供體的早期確認以及動物來源的食物或者保健品中TSE物質的延緩、去除和滅活，所述動物來源的食物或者保健品應用于動物或者人的日常消費或應用，人和牛的血液來源制品，器官移植。很可惜，TSE的傳染性對于滅活的化學和物理方法有顯著的抗性，并且難以找到選擇性滅活方法。
已經確定了很多結合于朊病毒蛋白的材料。發現從組合肽庫中篩查結合于八肽重復序列(PHGGGWGQ)(SEQ ID NO1)的配體，存在于所有已知的哺乳動物朊病毒蛋白中，并且還發現了一系列配體，正如在PCT/US01/11150中所描述的。其它的材料包括與淀粉樣蛋白斑如剛果紅(Congo Red)淀粉樣蛋白斑相互作用的配體(Ingrosso，L.，等人，Congo Red Prolongs the Incubation Period in Scrapie-infectedHamsters.J.Virology 69506-508(1995))；4-碘，4-脫氧阿霉素(Tagliavini，F.，等人，Effectiveness of Anthracycline Against Experimental PrionDiseases in Syrian Hamsters.Science 2761119-1122(1997))；兩性霉素B，卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等人，Porphyrin and PhthalocyanineAntiscrapie Compounds，Science 2871503-1506(2000))；金屬(Stockel等人，Biochemistry，37，7185-7193(1998))；與Prp相互作用形成復合體的肽(參見美國專利5,750,361，Prusiner等人和Soto，C.等人，Reversionof Prion Protein Conformational Changes in Synthetic β-sheet BreakerPeptides，Lancet，355192-197(2000))；肝素和其它聚硫酸化聚陰離子(Caughey，B.，等人，Binding of the Protease-sensitive Form of PrionProtein Prp to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red，J.Virology682135-2141(1994))；抗體(Kascsak，R.J.，等人，Immunodiagnosis ofPrion Disease，Immunological Invest.26259-268(1997))；和其它蛋白，例如血纖蛋白溶酶原(Fischer，M.B.等人.，Binding of Disease-associatedPrion Protein to Plasminogen.，Nature 408479-483(2000))。離子交換層析已經被用于純化朊病毒蛋白污染的血液組分，例如血色素(美國專利號5,808,011，Gawryl等人)。然而，Gawryl等人教導的層析材料結合血色素，并且隨后用梯度洗脫收集純化的血色素。目前，還沒有材料已經被完全表征或者發現能結合來自多種介質的朊病毒蛋白。
到目前為止，人TSE疾病是100％致命的。不幸的是，盡管包括兩性霉素、硫酸化聚陰離子、剛果紅染料和蒽環類(anthracycline)抗生素的大量化合物已經被報導為有希望的治療劑，但所有這些化合物已經證明對于阻止朊病毒蛋白繁殖只有適度的潛力，并且沒有一種化合物顯示出對于在受控的臨床研究中從被感染的宿主中去除預先存在的朊病毒蛋白有任何效果。因此，目前仍然迫切需要新型的治療試劑。
從正常的可溶性蛋白到構象改變的、不可溶形式的裝配和去裝配的過程，被認為是很多種其它疾病的病因，這些疾病很多是屬于神經系統方面的疾病。對于疾病的發病與正常蛋白轉變為構象改變蛋白之間的關系，還了解的很少。除了朊病毒蛋白，這些不溶性蛋白的具體例子還包括在阿耳茨海默(氏)病和大腦淀粉樣血管病中的淀粉樣蛋白斑之中的β-淀粉狀肽；在帕金森病中向心性多層圓形小體(盧伊體)中的α-synuclein沉積物，額顳癡呆中神經原纖維纏結中的tau蛋白，以及皮克病；肌萎縮性(脊髓)側索硬化中的超(過)氧化物歧化酶；以及亨延頓(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。這些高度不溶性蛋白通常形成由無分支的原纖維組成的聚集物，其共同的特征是β折疊構象。
需要便于區分或者分辨兩種或者更多種不同構象形式的蛋白，如PrPc和PrPsc的方法學，從而理解這種轉變的過程，并且發現與疾病相關形式發生特異地相互作用的結構。區分或者分辨蛋白的同工型的目前的方法學包括在存在如尿素的離液劑條件下，在聚丙烯酰胺凝膠上的差別遷移率，即橫向尿素梯度(TUG)凝膠；對于蛋白酶處理如蛋白酶K(PK)的差別敏感性，檢測被稱作PrPres的PrPsc的PK-抗性消化產物；差別溫度穩定性；在非離子去垢劑中的相對溶解性；以及纖維結構結合某些化學物質，如剛果紅和異黃酮S的能力。然而，仍需要鑒定另外的朊病毒蛋白結合材料。而且也仍需要鑒定對構象改變的蛋白質，特別是與疾病相關的蛋白質特異的高親合性結合材料。這些試劑將用于開發可能的診斷試劑盒，分離和純化不同形式的蛋白，用于從治療試劑、生物制品、疫苗和食品中去除該疾病的傳染性形式，并且用于治療。

發明內容
本發明提供了結合于朊病毒蛋白的材料以及應用朊病毒蛋白結合材料(此后為“結合材料”)的方法。在一些實施方案中，結合材料是聚合物顆粒，優選的是色譜用樹脂，其可以選擇性地和特異地與朊病毒分析物結合。在其它的實施方案中，結合材料是特異和選擇性地與朊病毒蛋白樣品結合的無機材料。結合材料可以結合朊病毒蛋白的一種或者多種形式，包括細胞朊病毒蛋白(PrPc)、傳染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重組朊病毒蛋白(PrPr)。來自不同物種包括人和倉鼠的朊病毒被結合材料結合。本發明還提供了含有在如層析柱的支持物上存在的結合材料的組合物。
結合材料用于在樣品如生物液體或者環境樣品中或者從樣品中檢測、結合、分離、去除、排除、提取或者分離朊病毒蛋白。結合材料用于去除樣品中所有形式的朊病毒蛋白，或者可以選擇性地選取來檢測或者去除單一形式的朊病毒蛋白。因此結合材料可以用于在來自患者的樣品中區別傳染性和非傳染性朊病毒蛋白，患者包括人TSEs的病人以及有騷癢癥、BSE和CWD的動物。在一個實施方案中，使用在此描述的結合材料從生物液體中去除一種或者多種朊病毒蛋白，隨后將純化的或者去污染的生物液體施用或者返回到人或者動物中。在該實施方案中可以應用血液透析技術。結合材料也可以用于在樣品中檢測一種或者多種朊病毒蛋白。
本發明的另一方面提供了鑒定另外的結合材料的方法，尤其是對蛋白的構象改變形式具有特異性的結合材料，其中一些蛋白涉及到疾病的發展過程。
通過以下的詳細說明和優選的實施方案，本發明的其它特征和優勢將是顯而易見的。


圖1是Western印跡的照片，顯示了朊病毒蛋白結合材料與人血漿樣品中的內源性PrPc的結合作用以及適當的對照。
圖2是Western印跡的照片，顯示了朊病毒蛋白結合材料與騷癢癥腦組織勻漿中的PrPsc的結合作用以及適當的對照。
圖3是Western印跡的照片，說明了朊病毒蛋白結合材料在含有人血清白蛋白的樣品中捕獲PrPc以及適當的對照。
圖4是Western印跡的照片，說明了采用含有氨基功能團的樹脂對摻入到人血清白蛋白中的PrPres的去除作用。
具體實施例方式
在此描述了朊病毒蛋白結合材料以及應用朊病毒蛋白結合材料的方法。結合材料是聚合材料，如層析用樹脂或者珠子，或者無機材料，如氧化鋁，其可以與朊病毒蛋白特異性地并且親和性地結合。聚合材料含有一個或者多個以下的功能團帶負電的部分；帶正電的部分；不帶電的部分以及疏水部分。優選地，聚合物結合材料具有結合于甲基丙烯酸或者聚甲基丙烯酸基質骨架(matrix backbone)的功能團。
結合材料與樣品中的朊病毒蛋白形成復合物，可以在從樣品或在樣品中檢測、結合、分離、去除、排除、提取或者分離朊病毒蛋白的方法中使用，其中該樣品如人或者動物來源的組織、器官、或者生物液體或者環境樣品。本發明還提供了在人或者動物中，或者其組織、器官或者生物液體中診斷或者監控朊病毒疾病的方法。例如，在此描述的結合材料可以通過測定生物樣品如全血、來源于血液的組合物或者組分、細胞、血清、血漿、血漿衍生物、腦脊液、尿液、眼淚、扁桃體、大腦、闌尾以及其它，從而用于檢測或者診斷諸如CJD、vCJD、GSS、致命性失眠癥、騷癢癥、BSE和CWD和其它TSEs的病理。在血液、組織或者器官移植前，對動物或者個體中的朊病毒蛋白傳染進行測定的重要性是顯而易見的。結合材料可以特別地從樣品或者生物液體如全血、血液組分、血清、血漿、血漿衍生物以及類似物中去除朊病毒蛋白。在生物液體傳播給其它的動物或者人的情況下，如在輸血或者施用如凝血因子的血液制品中，朊病毒蛋白的去除是非常必要的。結合材料可以從樣品中去除或者檢測所有不同形式的朊病毒蛋白，或者可以選擇性地選取來去除或者檢測單一形式的朊病毒蛋白，并且可以因此區分樣品中的傳染性和非傳染性朊病毒蛋白。
定義在此應用的術語“一個”、“一種”和“該”的定義是指“一個或多個”，并且還包括復數，除非在上下文中認為不適當。
術語“3F4抗體”是指對于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或者PrPres，具有特異性的單克隆抗體。該抗體對于變性形式的倉鼠和人PrPc、PrPsc和PrPres有特異性。
正如在此所應用的，術語“來源于血液的組合物”、“血液組分”以及“血液組合物”可以互相交互使用，并意欲包括全血，紅細胞濃縮物，血漿，血清，富集或者缺乏血小板的部分，血小板濃縮物，白血細胞，血漿沉淀物，血漿分級沉淀物以及上清，免疫球蛋白制劑包括IgA、IgE、IgG和IgM，純化的凝結因子濃縮物，纖維蛋白原濃縮物，血漿分級中間物，白蛋白制劑，或者來源于人或者動物血液的其它不同的物質。這些術語也包括通過本技術領域內不同的常用方法如離子交換、親和、凝膠透過、和/或者疏水層析或者通過用乙醇或者聚乙二醇示差沉淀純化的來源于血液的蛋白。
術語“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然并廣泛地表達于哺乳動物的體內。其結構高度保守并且與疾病狀態不相關。
術語“PrPsc”是指PrPc分子的構象改變形式，本技術領域的普通技術人員認為該分子與諸如TSE/朊病毒蛋白的疾病包括vCJD、CJD、庫魯病、致命失眠、GSS、騷癢癥、BSE、CWD以及其它的TSEs相關，包括捕獲和實驗動物中稀有的TSEs。PrPsc具有與正常的、細胞PrPc相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋變成了β折疊，這一轉變與疾病狀態相關。
術語“PrPres”是指分子量為27-30kDa的PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍生物，其在蛋白酶K(PK)部分消化PrPsc后仍然存在。
術語“PrPr”是指通過重組技術表達的朊病毒蛋白。
術語“PrP”是指朊病毒蛋白的總稱。
術語“珠子”是指固相顆粒或者微粒，其可以結合反應基團或者結合成分。珠子具有不規則的形狀，包括有球形、橢圓形、桿狀或者甚至是帶角的形狀，這些都屬于該術語的范圍。
術語“樹脂”是指聚合介質。
在此應用的術語“聚合”描述的是由幾種較小的、重復性化學或者結構單元(單體)組成的化合物或者分子。
樣品在此應用的術語“樣品”是指任何溶液、懸液、提取物、組合物、制劑、產品、組分、組織、器官、細胞、或者其它的實物，它們按照本發明的某些方面和實施方案的方法與朊病毒蛋白結合材料相接觸。按照本發明的某些方面和實施方案，樣品包括但不限于，生物樣品、食品、環境樣品或者水樣品。生物樣品包括但不限于來源于血液的樣品；來源于腦的樣品；體液，例如但不限于，血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、奶、管液、眼淚或者精液；生物提取物，如膠原提取物、腺體提取物、或者組織勻漿物或者提取物。生物樣品來源于人或者動物，包括但不限于牛、綿羊、豬、馬、鼠或者鹿科(Cervidae)動物。來源于血液的樣品包括，但是不限于，血小板濃縮物、血漿蛋白制劑、免疫球蛋白制劑、纖維蛋白原制劑、因子XIII制劑、凝血酶制劑、因子VIII制劑、von Willebrand因子制劑、蛋白C制劑或者活化的蛋白C制劑。按照本發明的某些方面和實施方案的樣品也包括，但不限于藥物組合物、治療劑組合物、化妝品組合物以及產品、食物或者食品、或者營養滋補組合物。食品樣品的例子包括，但不限于明膠、果凍、奶、乳制品、膠原或者嬰兒配方食品。
按照本發明的某些方面和優選的實施方案，樣品也包括含有不同種蛋白的蛋白溶液，包括但不限于，人或者動物血清白蛋白。例如，樣品包括但不限于，含有人血清白蛋白的治療劑產品；人或者動物的血清白蛋白制劑；或者含有人或者動物血清白蛋白作為穩定劑的制劑。按照本發明的某些優選的實施方案，樣品也可以含有濃度高達大約50％(w/v)的人或者動物的血清白蛋白，或者濃度從大約1％到大約50％，或者從大約5％到大約25％。在一個方面，在本發明的優選實施方案中，本發明出人意料地并有利地可以從具有高濃度蛋白的樣品或在其中去除、分離或者結合朊病毒蛋白，特別地從血液蛋白中，如血清白蛋白。
環境樣品包括但不限于土壤、污水或者水，如來自小溪、河流、含水土層、井、水處理設備的水或者休養用水。
樣品包括但不限于，液體樣品、固體樣品或者膠質樣品。固體樣品可以用液相溶劑、有機溶劑或者臨界流體提取得到，并且得到的上清可以與結合材料相互接觸。固體樣品的例子包括，但不限于來源于動物的產品，特別是那些暴露于傳播朊病毒蛋白的試劑的樣品，如來源于牛的骨粉、腦組織、角膜組織、排泄物、骨粉、牛肉副產品、羊、羊副產品、鹿和駝鹿、以及鹿和駝鹿副產品、以及其它動物和來源于其它動物的副產品。
材料在此提供的結合材料結合于來源于朊病毒蛋白的肽或者多肽，或者完整的朊病毒蛋白分子，它們可以用于各種不同的分離程序，包括但不限于層析，例如但不限于，薄層層析、柱層析以及分批層析；固相支持物以及膜分離；反應器分離；磁性分離；免疫分離；以及膠體分離。在一個優選的實施方案中，在如層析柱的柱子中包含結合材料，加入樣品，并且使其通過柱子以便樣品中的朊病毒蛋白結合于結合材料上，并且保留在柱子中。樣品中的其它成分通過柱子，并且可以進行收集。應當認識到在此描述的結合材料的應用并不限于分批層析或者柱層析。預想了用于結合朊病毒蛋白的結合材料的應用的各種不同的構造、修飾以及變化，并且這也屬于本發明的范圍。這樣的變化和修飾包括，但不限于分批過程，連續過程；移動床層析過程；低壓、中壓或高壓過程；或者小、中或大規模過程。在可選擇的實施方案中，結合材料可以位于膜上、纖維上、珠子上，注入非機織篩網中，涂覆纖維，包括在過濾器殼體之中，等等。
無機組分在第一個實施方案中，結合材料含有無機化合物或者組分，例如但不限于，鋁或者氧化硅。優選地，鋁是氧化鋁，氧化硅是熱解法二氧化硅。最優選地，無機化合物是Al2O3；或者SiO2。這些結合材料可以以不同的形式提供，包括但不限于，珠子或者樹脂。結合材料可以用于很多不同的分離過程，并且可能位于或者加入到層析柱中、膜中、或者任何合適的分離儀器和工具中，或者可以用于批量過程，或者在允許形成朊病毒蛋白結合材料和朊病毒蛋白的條件下，使得樣品與材料相接觸而用于任何分離過程。含有無機化合物的結合材料可以包括多個功能團。功能團是親水性的，如帶正電荷、帶負電荷、不帶電荷或者中性、疏水性的、兩性的或者它們的組合。以下詳細說明了特異的功能團。應該理解到，功能團可以是在無機化合物中固有存在的，或者通過修飾使得無機化合物包含了功能團。功能團包括有機和無機功能團。
聚合物組分在第二個實施方案中，結合材料包括聚合材料或者組分，并且優選地包括聚合物基質，同時也稱為聚合物基質骨架。任選地，一個或者多個功能團結合于聚合物基質中。在優選的實施方案中，聚合材料是樹脂，優選地是，層析樹脂。聚合性聚合物基質骨架優選的是甲基丙烯酸骨架，正如以下所述，但不限于，市售的TSKTM，和TOYOPEARLTM或者FRACTOGELTM樹脂(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA)。這些包括，但不限于，帶正電的、帶負電的、不帶電的、疏水功能團或者它們的組合。特別優選的功能團在以下有更詳細的說明。
結合材料可以是任何形式，或者可以制造、加工成形、在形式上制成，或者用于任何固體表面的支持物上，包括，但不限于，珠子、膜、筒、濾器、浸量尺、微量滴定板、試管、固體粉末、澆鑄或者擠壓成型模具、篩網、磁珠復合材料、或者任何其它的用如下材料包被的固體材料，如聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚對苯二甲酸乙酯、人造絲、尼龍、聚(乙烯基丁酸鹽)、聚偏乙烯雙氟化物(PVDF)、硅酮、聚甲醛、纖維素、醋酸纖維素、硝化纖維、以及類似物。可選擇地，可以應用形成凝膠的物質，如蛋白(如明膠)、脂多糖、硅酸鹽、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。形成多個水相的聚合物也是適合的，如葡聚糖、聚烷撐乙二醇或者表面活性劑，如磷脂、長鏈(12-24個碳原子)的烷基銨鹽以及類似物。結合材料任選地分布于這些組分中。
結合材料特別優選地，是顆粒、微粒或者珠子形式。微粒結合材料優選地具有大小從大約1μm到500μm的范圍，更優選地是從大約20μm到150μm的顆粒或者珠子。
功能團按照本發明的某些方面和實施方案的朊病毒蛋白結合材料包括功能團。在此應用的術語“功能團”是指化學基團、亞基、或者亞結構，它們對分子或者材料賦予化學、物理或者物理化學特征。在此說明的功能團包括，但不限于，親水性的功能團，如帶正電的、帶負電的或者不帶電的或者中性的、或者疏水的功能團。也預想了兩性分子或者多功能性的功能團，并且它們也屬于本發明的范圍。功能團包括有機的和無機的功能團。優選的功能團含有胺、苯基或者亞硫酸鹽基團。優選的胺基是伯胺、仲胺、叔胺或者季銨離子，如二甲基氨基乙基(DMAE)或者三甲基氨基乙基(TMAE)。其它的例證性功能團包括，但不限于-CH2-CHOH-CH2NH2；-C6H5；-(CH2)3-CH3；-CH2-CH2-N+N(C2H5)2；-SO2-CH2-CF3；-CH2-CH2-N+H(CH3)2；-CH2-CH2-N+(CH3)3；-SO32-。另一些可用的功能團包括磺酰基和2，2，2-三氟乙烷磺酰基(tresyl)。
盡管并不想要受限于本敘述，但應該想到朊病毒蛋白具有三種不同的結合區域，它們分別與帶正電的功能團、帶負電的功能團和疏水的功能團結合。因此，應用一種或者幾種結合材料，每一種包括一個或者多個類型的功能團，用于增加和/或更加特異地鑒定或去除樣品中的朊病毒蛋白。當應用兩個或者更多個結合材料時，樣品與兩種或者多種結合材料同時接觸，或者一個接一個，或者以任意次序相接觸。因此，結合材料優選地由兩種或者更多種結合材料組成，每一種或者含有帶正電的功能團、帶負電的功能團、不帶電的功能團，或者含有疏水的功能團。當結合材料是以微粒形式并且采用柱層析時，每一種不同類型的結合材料可以在同一個柱子中或者分別在不同的柱子中。在更為優選的實施方案中，應用三種結合材料，一種是具有帶正電的功能團，一種是具有帶負電的功能團，一種是具有疏水性的功能團。
正如在此所應用的，術語“帶正電的功能團”是指帶有凈正電荷的化學成分。正電荷功能團的非限定性例子包括，含有氨基的基團，如伯胺、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、三甲基氨基乙基和四級氨基基團。術語“帶負電的功能團”在此是指帶有凈負電荷的化學成分。術語“不帶電荷的功能團”在此是指中性的或者不帶電荷的任何化學成分。帶負電荷的功能團的非限定性實例包括含有亞硫酸鹽的基團。此外，術語“疏水功能團”是指對于用水浸濕有抗性的任何基團，包括烷基、芳香基團、硅氧烷和氟化的基團。疏水功能團的非限定性實例是含有苯基和丁基的基團。術語“兩性的功能團”是指同時疏水和親水的基團。
本發明的某些方面和實施方案中，朊病毒結合材料含有帶正電荷的功能團、帶負電荷的功能團、和無電荷或中性的功能團、疏水的功能團或者兩者都有。帶負電荷的功能團的一個例子是含亞硫酸的基團。帶正電荷的功能團的一個例子是氨基基團。不帶電荷的功能團的一個例子是苯基或丁基基團。疏水功能團的例子是苯基基團或丁基基團。根據本發明的某些方面和實施方案，使用氨基基團，包括結合材料中的伯胺、仲胺、叔胺或季銨基團都是對朊病毒結合有獨特優勢的。然而，使用不同的基團，這依賴于特定的朊病毒蛋白，樣品，以及樣品與結合材料接觸的條件都在本發明的范圍內。
很多種不同的物質可任選地用于結合材料，如薄層，例如，為了賦予結合材料不同的期望特征。例如，蛋白包被，例如，明膠可以用于避免非特異結合并且增強信號的檢測或者其它類似的特性。表面功能化以及間隔基在優選的實施方案中，結合材料在它們的表面具有不同的功能團。應當理解到，這些功能團固有地存在于結合材料的表面，或者可以通過本技術領域熟練技術人員已知的程序加入到結合材料的表面。連接各種不同的基團或者化合物于不同的表面的技術方法是公知的，并且這些方法詳細地描述于參考文獻中。
功能團是用于結合朊病毒蛋白的，按照在此描述的方法，用于連接另外的功能團，或者用于任何物理、化學或者物理化學特性的任何修飾，物質的特性，例如但不限于，其離子特性或者疏水性。存在于優選的結合材料表面的功能團包括，但不限于，羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羥基、巰基、環氧基及其類似基團。
在優選的實施方案中，功能團可以包括間隔基。間隔基是在也被稱作基質或者支持物的材料和功能團之間提供空間和距離的基團。間隔基優選地由碳、氮或氧原子組成。一方面，間隔基被用于更好地改變朊病毒蛋白結合材料的朊病毒蛋白結合屬性。按照某些實施方案，間隔基的長度可以是多至20個原子，或者多至15個原子，或者5個到10個原子。間隔基優選地，但不限于由烷基、聚乙二醇(PEG)、碳水化合物基團、氨基酸、長至20個氨基酸長度的肽或者從1到10個氨基酸長度的肽或者其混合物組成。最優選地，間隔基含有烷基和PEG的組合。
市售層析樹脂優選地，結合材料是一種或者多種以下的市售層析樹脂FRACTOGELTMEMD；TOYOPEARLTMAmino、Butyl、Phenyl、或者AF-Tresyl；或者TSK-GELTMAmino，Phenyl或者DEAE樹脂。更加優選地，結合材料包括，但不限于FRACTOGELTMEMD TMAE，FRACTOGELTMEMD SO32-，FRACTOGELTMEMD DMAE，ToyopearlTMAmino，TSK-GELTMAmino，TSK-GELTMPhenyl，TSK-GELTMDEAE，TOYOPEARLTMButyl，TOYOPEARLTMPhenyl，氧化鋁，TOYOPEARLTMAF-Tresyl，以及硅土樹脂。在最優選的實施方案中，結合材料是TOYOPEARLTMAmino，TSK-GELTMAmino，TSK-GELTMPhenyl或者FRACTOGELTMEMD SO32-。已經預想了應用其它市售層析樹脂以及支持物，包括無機支持物，其也屬于本發明的范圍。
在本發明優選的實施方案中，結合材料包括聚甲基丙烯酸酯，羥基聚甲基丙烯酸酯，或者AMINO 650TM樹脂(Tosoh Biosciences)，以及氨基，如伯胺、仲胺、或者叔胺。按照優選的實施方案的結合材料可以進一步包括如結構式O-R-O-CH2-CHOH-CH2的間隔基，其中R的長度是1-10個碳。結合材料可任選地涂覆到或者圖案化施加到固體支持物上，如珠子、膜或者層析樹脂。
結合材料的鑒定除了以上列出的結合材料外，可以按照如下所述，鑒定另外的結合材料。篩選結合材料結合朊病毒分析物的能力。在此使用的術語“分析物”或“多個分析物”是指多種分子，包括，但不局限于，蛋白質、多糖和它們的任何聚集體或混合物。結合材料用已知含有朊病毒蛋白的樣品孵育，除去未結合的蛋白質，使用常規方法例如對朊病毒蛋白特異的標記抗體檢測結合的蛋白質。分析物已經與其結合的結合材料被鑒定出是合適的結合材料。沒有一抗或二抗的對照組也用于除去非特異結合的材料。
在優選的實施方案中，被鑒定的結合材料與其結合的朊病毒分析物是在來源于人或動物的血或腦樣品中發現的朊病毒蛋白。更優選地，分析物是在血或來源于血的產物中發現的。進一步優選地，分析物與人或動物的TSE或者TSE的誘發因子相關。
使用結合材料除去朊病毒蛋白結合朊病毒蛋白或者朊病毒蛋白片斷的結合材料在多種分析、制備和診斷應用中有用。在一些實施方案中，結合材料含有固相，或者固體表面，以珠子或膜的形式存在，可以用于從樣品中結合和除去朊病毒蛋白或肽。結合材料可以接觸樣品，例如生物液體，在足以導致形成朊病毒蛋白結合材料復合物的條件下，樣品中的朊病毒蛋白結合到結合材料上。然后結合材料從樣品中分離，從而除去與樣品的配體結合的朊病毒蛋白。使用用于結合蛋白的珠子和膜的方法在技術領域是公知的，例如在Baumbach等人的美國專利U.S.5,834,318和PCT/US01/11150中描述的。
在本發明的一些實施方案中，基本上所有朊病毒蛋白都可以從樣品中除去。“基本上所有”的意思是朊病毒蛋白的濃度顯著降低。換句話說，把所有樣品或部分樣品轉移到健康患者身上只能帶來在公眾健康指導方針下可以接受的低的朊病毒傳染的風險。使用單一結合材料或者多種結合材料，基本上所有朊病毒蛋白可以同時或者連續地從樣品中除去。當使用多種結合材料時，優選地，如以上描述的，使用兩種或者更多種結合材料，每種含有正電荷功能團、負電荷功能團或者疏水功能團。在更優選的實施方案中，使用兩種或多種結合材料，每種含負電荷功能團或者疏水功能團。樣品接連地以任何順序與兩種或多種結合材料接觸。在優選實施方案中，使用三種結合材料，每一種含有一種正電荷功能團、負電荷功能團和疏水功能團。
在其他的實施方案中，只有特定的朊病毒材料從樣品中除去。例如，只有傳染性朊病毒(PrPsc)從樣品中除去或者只有非傳染性朊病毒(PrPc)從樣品中除去。在此描述的一個重要發現是多種具有不同朊病毒特異性的結合材料的鑒定。表4所示為幾種結合材料和它們對倉鼠和人，非傳染性和傳染性朊病毒的特異性。選擇性除去人PrPsc的優選結合材料含有氨基基團，例如包括在ToyopearlTMAmino-650M或者TSK-GELTM-Amino 750C色譜柱樹脂或其功能相當物中的氨基基團，或者含有苯基基團，例如在TSK-GELTMPhenyl-5PW或功能相當物中含有的苯基基團。
優選地，結合材料是填充在柱子例如色譜柱中的珠子。然后樣品溶液、勻漿液或懸液或者由于重力或者由于壓力通過柱子，例如高壓液相色譜柱子。樣品中的朊病毒蛋白將如在此描述的結合到柱子中的結合材料上。收集通過柱子的樣品，除去朊病毒污染或者至少減少朊病毒物質的水平。
一旦樣品通過柱子，洗脫結合的朊病毒蛋白，并且將其收集用于分析，或者如果需要的話，用于診斷或預示目的。假如期望從結合材料中除去朊病毒蛋白，柱子的流動相可以首先變為除去弱結合雜質的緩沖液，從而洗滌柱子。然后通過煮沸或者通過加入含有強去污劑例如十二烷基肌氨酸鈉去垢劑(十二烷基肌氨酸鈉，Shelton Scientific-IBI，Shelton，CT)或者十二烷基硫酸鈉(SDS)，離液劑例如鹽酸胍，或低pH的試劑例如乙酸，或者通過結合配體的化學修飾例如氨基基團的乙酰化作用從柱子上除去朊病毒蛋白。
從其中除去朊病毒的生物樣品的例子包括，但不局限于，全血、來源于血液的組合物或組分、血清、腦脊液、尿、唾液、奶、腸液、眼淚、精液或者人或動物的腦源組分。別的生物樣品包括那些含有膠原或腺體提取物的生物樣品。在一個實施方案中，朊病毒通過使用含有一種或多種在此描述的結合材料的血液透析環從人或動物的血中除去。在該實施方案中，血液從人或動物中除去，直接注入含有一種或多種在此描述的結合材料的設備中，其中朊病毒蛋白從血液中除去是由于它們結合到結合材料上，然后無朊病毒的血液或朊病毒減少的血液直接導入返回至人或動物體中。
朊病毒蛋白也可以使用在此描述的結合材料從(或者用于動物或者用于人的消耗的)生物樣品例如食品中除去。例如，樣品含有來源于動物的或者從動物獲得的動物材料，包括，但不局限于，牛、羊、豬、馬、鼠、倉鼠或者鹿科動物。可替代地，樣品材料可以是指人；牛科；羊科；豬科；馬科；鼠科，例如來源于鼠和倉鼠；和來源于鹿科的材料，例如鹿和駝鹿。朊病毒蛋白可以根據本發明的某些方面和實施方案所涉及的方法從其中除去的來源于動物的材料包括，但不局限于明膠、果凍、奶、膠原和嬰兒配方食品。朊病毒蛋白根據本發明的某些方面和實施方案所涉及的方法從其中根據除去的樣品也包括，但不局限于，藥品組分、治療組分、營養添加組分、食品或者化妝品組分。
根據優選的實施方案，樣品是蛋白溶液，含有多種蛋白質，包括，但不局限于，人或動物的血清白蛋白。例如，樣品可以是，但不局限于，含有人血清白蛋白作為穩定劑的血漿蛋白制劑、免疫球蛋白制劑、纖維蛋白原制劑、凝血因子XIII制劑、凝血酶制劑、凝血因子VIII制劑、馮·維勒布蘭德凝血因子制劑(von Willebrand factor preparation)、蛋白質C制劑、激活蛋白C制劑或者前述的任何組合制劑或改變；含有人血清白蛋白的治療產品；人或動物血清白蛋白制劑；以及含有人或動物血清白蛋白作為穩定劑的稀釋蛋白制劑。根據優選實施方案，樣品含有人或動物血清白蛋白的濃度高達大約50％(w/v)，或者從大約1％到大約50％，或者從大約5％到大約25％。在一個方面，在優選實施方案中，本發明出乎意料地并且有利地從具有高濃度的蛋白質，特別是血蛋白，例如血清白蛋白的樣品中或在其中除去、分離或結合朊病毒蛋白。
在此描述的結合材料也用于從環境樣品如來源于諸如溪流、河、蓄水池、井、水處理設備或消遣用水的水中除去朊病毒蛋白。
使用結合材料檢測朊病毒在此描述的結合材料也在檢測生物或環境樣品中存在朊病毒蛋白或肽或者量化朊病毒蛋白或肽的方法中使用。在其中檢測朊病毒蛋白的生物樣品包括，但不局限于，全血、來源于血液的組合物或組分、血清、腦脊液、尿液、唾液、奶、腸液、眼淚、精液、來源于腦的組合物、糞便、或膠原的提取物或勻漿、腺體、組織(例如扁桃體或盲腸)或器官。定性和定量的檢測方法都被預想到，并且都在本發明的某些方面和實施方案的范圍內。
如以上描述的關于朊病毒蛋白的去除，結合材料也用于檢測作為食品的來源于動物的材料中朊病毒蛋白的存在。對于檢測目的，術語“來源于動物的材料”是指以上描述的材料和含有動物部件的材料，例如肌肉、結締組織或者器官組織。來源于動物的材料進一步包括，但不局限于，骨粉、牛肉、牛肉副產品、羊、羊副產品、鹿、鹿副產品、豬肉、豬肉副產品、香腸、火腿和嬰幼兒食品。
在此描述的結合材料也用于檢測環境樣品，例如那些以上描述的環境樣品和土壤提取物中的朊病毒蛋白。
由于發現多種具有不同朊病毒結合特性的結合材料，所以結合材料在單一樣品中或樣品之間區別傳染性和非傳染性朊病毒的方法中有用。因此，提供了用于診斷和預測人或動物的朊病毒疾病的方法。朊病毒疾病包括，但不局限于，可傳播的海綿狀腦病(TSEs)，例如騷癢癥，該疾病可以影響綿羊和山羊；牛海綿狀腦病(BSE)，可以影響牛；可傳播的水貂腦病，貓的海綿狀腦病，和長耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和駝鹿的慢性消瘦病(CWD)；苦魯病，皮層-基底節-脊髓變性癥候群(CJD)，格-施-沙綜合征(GSS)，致命性不眠癥和變異的皮層-基底節-脊髓變性癥候群(vCJD)，這些疾病都會影響人類。
在一個實施方案中，使樣品通過對PrPsc比對PrPc有更高特異性的結合材料，使用以下描述的方法檢測結合的PrPsc朊病毒。然后使相同的樣品通過對PrPc比對PrPsc有更高特異性的結合材料，使用以下描述的方法檢測結合的PrPc。表4提供了幾種結合PrPc和PrPsc的結合材料的特異性。優選地，選擇性檢測人PrPsc的結合材料含有類似于TOYOPEARLTMTSK-GELTM-Amino 750C Amino-650M或TSK-GELTM-Amino 750C化合物中含有的氨基基團，或者含有類似于TSK-GELTMPhenyl-5PW(所有樹脂來自Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)中含有的苯基。
當使用在此提供的方法檢測樣品中的朊病毒時，樣品與結合材料在足以造成朊病毒蛋白和結合材料之間形成復合物的條件下接觸。然后用常規方法檢測復合物，從而檢測樣品中朊病毒的存在。例如，結合材料(第一配體)可以用可檢測的標記物進行標記。作為可替代的例子，復合物可以通過標記第二配體，例如抗體或別的蛋白質，把標記的第二配體與樣品在存在結合材料的條件下進行結合，檢測標記了的第二配體-朊病毒-結合材料復合物進行檢測。第二配體可以共價地或者非共價地結合于朊病毒。已知有多種標記物和結合技術，并且廣泛地在科學和專利文獻中被報導。在一個實施方案中，第二配體在生產的過程中被標記。合適的標記物包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光成分、化學發光組分、磁性顆粒以及類似物。
結合于朊病毒蛋白結合材料的朊病毒蛋白，或者朊病毒蛋白-朊病毒結合材料復合物的定性和定量的檢測方法包括在本發明的某些方面和實施方案的范圍內。形成復合物的朊病毒結合材料可以被填充到或在制成柱子、膜或過濾器，或者結合到或制成或固定在固體支持物上。定性和定量地檢測結合的朊病毒蛋白，并且隨后從朊病毒結合材料上釋放的方法也包括在本發明的某些方面和實施方案的范圍內。
檢測可以用任何方法進行，包括免疫印跡、Western分析、凝膠移位分析、放射性或生物發光標記物的示蹤法、核磁共振、電子順磁共振、停流光譜法、柱色譜法、毛細管電泳或者別的基于大小或電荷，或兩者的變化的分子示蹤方法。檢測前，第二配體-朊病毒復合物可以或者可以不與結合材料分離。其它測定分析方法包括，但不局限于，脂質體免疫測定法(LIAs)，這種方法使用設計用于結合特異分子(如第二配體)的脂質體，并且釋放被包被的試劑或標記物。然后釋放的化學藥物根據標準技術進行檢測。
非放射性標記物通常用間接的方法加上。一般地，第二配體分子(如，生物素)共價結合于結合材料(第一配體)上。然后第二配體結合于第三配體(如，鏈菌抗生物素)分子，該第三配體分子或者固有的可檢測，或者共價結合于信號系統，如可檢測的酶、熒光化合物、或者化學發光化合物。可以使用多種第二和第三配體。當第二配體具有天然的第三配體，例如，生物素、甲狀腺素和皮質醇，第二配體可以用于與標記的、天然發生的第三配體結合。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可以與抗體結合。
用于檢測結合材料-朊病毒復合物的特定標記物或可檢測基團并不是關鍵的。可檢測基團可以是具有可檢測的物理或化學特性的任何材料。這樣的可檢測標記物已經得到了很好的發展，一般地，在這些方法中使用的任何標記物可以運用于本方法中。所以，標記物可以是任何可以被分光鏡、光化學的、生化的、免疫化學的、電子的、光學的或者化學的方法檢測的組分。有用的標記物包括熒光染料(如，異硫氰酸熒光素，德克薩斯紅，若丹明等等)，放射性標記物(如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(如，LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT(氯霉素乙酰轉移酶)，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，以及一般在EIA(酶免疫測定)或者ELISA(酶聯免疫吸附分析)中用作可檢測酶的其它酶，和比色標記物如膠體金或有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯，聚丙烯，膠乳，等等)珠子。標記物可以根據本技術領域公知的方法直接或間接連接到想要分析的組分上。如以上所示，許多標記物都可以使用，標記物的選擇取決于所需要的靈敏度，化合物偶聯的容易性，穩定性要求，可以獲得的設備，和垃圾處理規定。
第二配體也可以直接連接到信號產生化合物上，如，通過與酶或熒光基團相連。感興趣的作為標記物的酶首選是水解酶，特別是磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括，但不局限于，螢光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，傘形花內酯，等等。化學發光化合物包括螢光素和2，3-二氫-2，3-二氮雜萘二酮，如魯米諾。
本技術領域的普通技術人員公知檢測標記物的方法。所以，例如，在標記物是放射性標記物的情況下，檢測方法包括，但不局限于，用閃爍計數器或照相膠片作放射自顯影。當標記物是熒光標記物時，可以通過用合適波長的光激發熒光，并且檢測所得到的熒光來檢測，如通過顯微鏡、目測，通過照相膠片，通過使用電子探測器如電荷耦合器件(CCDs)或光電倍增管，以及類似方法。類似地，酶標記物可以通過提供合適的酶的底物，并且檢測得到的反應產物進行檢測。最后，單一比色標記物可以簡單地通過觀察與標記物相關的顏色進行檢測。所以，在多種浸漬分析中，共軛金通常呈紫色，同時多種共軛珠子呈珠子的顏色。
本發明的結合材料也可以用于除去或檢測從固體樣品材料提取到溶液中的朊病毒蛋白或肽。例如，固體樣品可以用含水溶液、有機溶劑或臨界液體提取，得到的上清可以與結合材料接觸。固體樣品的例子包括，但不局限于，動物來源的產品，特別是那些暴露于傳染朊病毒的產品，如，來源于牛的骨粉。在一些實施方案中，結合材料可以用于檢測土壤中存在的朊病毒蛋白。其它的固體樣品包括，但不局限于，腦組織、角膜組織、糞便物、骨粉、牛副產品、羊、羊副產品、鹿和駝鹿、鹿和駝鹿的副產品、以及別的動物或動物來源的產品。
可替代地，朊病毒或朊病毒結合材料復合物可以用蛋白酶K(PK)處理。PrPc對PK高度敏感，同時PrPsc被部分消化形成PrPres。PrPres分子本身對蛋白水解作用具有高度抗性，所以，PK處理將消化PrPc，并且將把PK敏感的PrPsc轉化為PrPres。除去PK后，PrPres可以變性，被抗體如3F4檢測出來。
在另一個實施方案中，根據本發明，結合材料可以用于把PrPc中的PrPsc選擇濃縮。
結合材料用于朊病毒定量結合材料-朊病毒復合物或可替代地，朊病毒或結合材料-朊病毒復合物的抗體可以通過本技術領域的普通技術人員已知的多種方法中的任何一種方法進行檢測和定量。這些方法包括但不局限于，分析生物化學方法如分光光度法、放射照相術、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、高擴散色譜法(hyperdiffusionchromatography)和類似方法，以及多種免疫方法，如但不局限于，液體或凝膠沉淀反應、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫分析(RIAs)、酶聯免疫吸收分析(ELISAs)、免疫熒光分析和類似方法。
降低非特異性結合當使用固體支持物作為分析組分來檢測樣品中的朊病毒蛋白時，本技術領域的普通技術人員應該意識到，通常期望降低對固體支持物的非特異結合。本技術領域的普通技術人員熟悉降低這樣的非特異結合的方法。一般地，這涉及用蛋白質組分把固體支持物進行包被。特別地，蛋白質組分，如牛和人的血清白蛋白(BSA)，和明膠可以被廣泛使用。
本發明將通過具體的實施例進行更詳細的描述。以下實施例用于舉例說明，并非以任何方式對發明進行限制或限定。
實施例1朊病毒結合材料的確認采用正常的倉鼠腦勻漿液，如以下描述的，使用NBT/BCIP發色團(氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸-p-甲苯胺鹽)，運用朊病毒珠上結合實驗，檢驗80種聚合物或無機粒子。結合結果見表1，其中“-”表示沒有結合，“+”表示陽性結合。粒子等級中的“+”越多，觀察到的結合就越強。具有至少“++”的12種粒子需要進一步評估。表2總結了12種粒子結合正常倉鼠朊病毒蛋白的能力。越高的分值表示朊病毒結合的量有所增加。
表1篩選用于朊病毒蛋白結合的聚合材料或無機粒子






1DAP二氨基丙烷2DAB二氨基丁烷3TETA三亞乙基四胺4AmberchomTM是Rohm and Haas Company(Philadelphia，PA)的注冊商標*Nonspecific指沒有抗體3F4的陰性對照，具有與用抗體3F4檢測的信號相同的信號。
表2聚合結合材料結合一般倉鼠朊病毒(HaPrPc)的能力


**PMMA聚合的甲基丙烯酸酯如下進行使用NBT/BCIP的朊病毒珠上結合實驗(prion bindingon-beads test)。從10％的侖鼠腦組織勻漿中獲得正常PrP，樣品于室溫在攪拌器中溶于0.5％十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)(200μL的10％到4ml腦組織)中30分鐘。樣品以14,000rpm離心5分鐘。棄上清，并且將其用所需的培養基稀釋。將96孔微量滴定平板(Cat.No.3075，Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore MultiScreen-DV板(Cat.No.MADV N65 10，Millipore公司，Bedford，MA)，首先用購自Pierce(Rockford，IL)的1％(W/V)酪蛋白以200μL/孔于65℃封閉1小時。10毫克(10mg)干珠子在1ml的10mM PBS pH7.4中溶脹，洗滌2次。倒空微量滴定板，每孔加入20-30μl溶漲珠子的懸液。懸液沉降，棄去多余的水分。
將正常侖鼠腦勻漿物予以稀釋，是以1∶10稀釋在5％的人血清白蛋白(Alpha Therapeutic Corp.Los Angeles，CA)中，其中5％的人血清白蛋白已經在60℃下被熱處理10小時。每孔加入150μL體積的懸液，與珠子室溫孵育1.5小時。棄去未結合的蛋白溶液，往每孔中加入100μL的、以1∶4000稀釋在1％酪蛋白中的3F4單克隆抗體(SignetLaboratories，Inc.，Dedham，MA)。對照孔含有100μl的1％酪蛋白。珠子用3F4孵育，于4℃輕微搖晃過夜。
然后珠子用10mM pH7.4的PBS+10μM CuCl2洗滌2次。將第二抗體，即結合了堿性磷酸酶的抗鼠IgG偶聯物(#A3688，Sigma，St.Louis，MO)，以1∶1000在1％酪蛋白中稀釋，并以100μl/孔的體積加入孔中。樣品室溫振蕩孵育1小時。將所有的珠子轉移到Millipore(Bedford，MA)MultiScreen-DV板進行洗滌。樣品用pH7.4的PBS+Cu2++Tween 20(0.05％)洗滌3次，用PBS+Cu2+洗滌3次，用1M NaCl洗滌2次，用pH9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗滌2次。
將1步驟NBT/BCIP底物混勻，將100μl直接加入每一孔中，直到得到理想的顯色(亮紫)。一般孵育5-15分鐘。濾紙(#1703932，BioRad，Hercules，CA)裁成合適形狀，用蒸餾水濕潤。珠子懸液真空下加入到S&S Minifold I Dot-Blot系統(Schleicher-Schuell Bioscience，Keene，NH)的印跡孔中。孔用水漂洗，將結果掃描到計算機中。
實施例2朊病毒結合材料的確定使用兩種不同的檢測系統，用侖鼠腦勻漿物以成批模式進行朊病毒結合材料的鑒定。首先，用靶材料孵育后對珠子進行染色檢測朊病毒結合到材料的量。第二種方法檢測流出液中含有的未結合成分中存在的朊病毒量，并且用SDS-PAGE和western印跡洗滌樣品。每種方法的詳細描述如下。
如以下表3所示，ToyopearlTMAmino-650M，TSK-GELTMAmino750C和TSK-GELTMPhenyl-5PW提供了侖鼠腦PrPc的最特異的結合。
表3第二次篩選的結果

對于珠上檢測方法，將96孔微粒滴定板(Cat.no.3075，Falcon，Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore Multiscreen-DV板(Cat.no.MADV N65 10，Millipore，Bedford，MA)用1％(w/v)酪蛋白以200μL/孔于65℃封閉1小時。將每份10毫克的每種聚合物浸泡于1mL的pH7.4的10mM PBS中，洗滌2次。排空96孔板，每孔加入20-30μL的樹脂懸液。樹脂沉降，棄去多余溶液。往樹脂中加入150μl以1∶10溶于5％人血清白蛋白中的正常倉鼠腦勻漿溶液。混合物室溫孵育1.5小時。排空孔，往每孔中加入處于1％酪蛋白中的100μl 3F4抗體(1∶4000)，冰箱中輕微振蕩過夜孵育。然后珠子用100mM pH7.4的PBS+10μM CuCl2洗滌2次，然后以100μl/孔加入結合了堿性磷酸酶的第二抗體(Cat no.A3688，Sigma，St.Louis，MO)，輕微振蕩，室溫孵育1小時。
排空所有的孔，將珠子轉移到Multi-Screen板中，在該板上用pH7.4的10mM PBS+10μM CuCl2+0.05％ Tween 20將珠子洗滌3次，然后用10mM PBS+10μM CuCl2洗滌，用1M NaCl洗滌2次，用pH9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗滌2次。
然后已經洗滌的珠子與100μL NBT/BCIP底物反應5-15分鐘以顯色。使用S&S Minifold I Dot-Blot系統將珠子轉移到濾紙上，進行所形成顏色的測定。
對于未結合部分的測定，100μL的每種珠子樣品預先用pH7.4的10mM PBS于4℃過夜濕潤，置于微量離心管中。用PBS至少洗滌4次后，轉移珠子至Ultrafree-MC 0.45μm過濾單元(UFC30HVNB，Millipore，Bedford，MA)中，用PBS再次洗滌。用0.5％十二烷基肌氨酸鈉處理10％的倉鼠腦勻漿液(HBH)，用PBS以1∶10和1∶20稀釋。將其往每種珠子樣品中加入200μl，振蕩孵育8分鐘，然后以10,000rpm離心2分鐘，回收未結合部分。將26-μL的流出液置于0.7mL微量離心管中，-20℃儲存，進行Western印跡分析。
進行Western印跡前解凍樣品，加入10μL樣品緩沖液(NuPAGE，SDS樣品緩沖液，NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA)和4μL還原劑(NuPAGE樣品還原劑，NP0004，Invitrogen)(DTT，1M，溶于H2O中)。溶液90-100℃孵育10分鐘。將樣品加到15孔的NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝膠(NP0323，Invitrogen)上。對于每孔凝膠，western印跡分析使用17μL樣品，蛋白質染色凝膠使用14μL樣品。分子量標記物的體積(MultiMark Multi-Colored Standard，LC5725，Invitrogen)是5μL。Western印跡使用PVDF膜，1％酪蛋白作為封閉劑，1∶10,000的3F4作為一抗，1∶3000的連接有辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗鼠抗體作為二抗，ECL+作為底物。膠片曝光6分鐘。
結合到結合材料上的、具有高PrP的樣品在流出物中不產生信號，值為“5+”。沒有結合的樣品的值為“-”。其它樣品的值介于這兩個值之間。
實施例3確定朊病毒蛋白結合特異性一般來說，將由不同結合材料組成的潮濕珠子定量地置于單獨的一次性使用的柱子中。含有玻璃材料的柱子小得只能保留珠子，但大到足以讓活化溶液(challenge solution)流過。活化溶液是含有朊病毒蛋白的腦勻漿液，溶于十二烷基肌氨酸鈉(Sigma)中；摻入到紅細胞濃縮共混物中。更具體而言，活化溶液含有TSE傳染性人腦勻漿液、傳染性倉鼠腦勻漿液、非傳染性人腦勻漿液或者非傳染性倉鼠腦勻漿液。允許活化溶液在確定的時間期間內通過靶結合材料，同時收集流出液。然后沖洗珠子，從裝珠子的柱子定量轉移到收集瓶中，這樣為了隨后確定特異朊病毒蛋白結合和非特異的蛋白結合的處理，從收集瓶中除去已知量的珠子。儲存流出液和剩余的反應珠子，以便以后可能的分析。
使用以下描述更為詳細的方法，確定七種朊病毒蛋白結合材料的結合活性，如表4中描述。結合材料以結合正常的或者傳染性人或者倉鼠朊病毒蛋白的結合能力來分級(表現出結合最大量朊病毒蛋白的結合材料的級別是1)。例如，FractogelTMEMD TMAE 650(S)結合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能團-CH2-CH2-N+(CH3)3)結合最大量的倉鼠和人傳染性朊病毒蛋白(PrPsc)，FractogelTMEMD SO32-650(S)結合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能團-SO32-)結合最大量的倉鼠和人正常朊病毒蛋白。這些數量是通過如下方法確定的，將結合的蛋白從朊病毒結合材料上釋放下來，電泳分離釋放的蛋白質，使用Western印跡分析從結合材料上釋放而來的蛋白質的免疫活性，采用朊病毒特異的單克隆抗體進行。抗體對朊病毒蛋白的結合通過化學發光檢測。通過比較膠片上的電泳條帶的暗度進行定量(指示與已經結合到結合材料上的朊病毒蛋白相結合的抗體)，對照條帶是2ng，10ng和50ng鼠IgG，從而對結合材料確定分值。通過互相直接地比較樣品帶，確定具有相同分數的結合材料的等級。
表411種聚合化合物的分級二次篩選后，基于它們與正常倉鼠朊病毒(HaPrPc)，正常人朊病毒(HuPrPc)，傳染性倉鼠朊病毒(HaPrPsc)和傳染性人朊病毒(HuPrPsc)的結合能力進行分級。


制備無水珠子通過把珠子用水配制的20％甲醇溶液濕潤，大量制備無水珠子。使用前將珠子靜置至少24小時。當無水珠子的最初量在0.5g到2.5g之間時，預濕的珠子漿液轉移到50ml塑料錐形管中。棄去多余液體，加入25ml 20％的甲醇。然后樣品輕微振蕩或者顛倒30秒。當最初的珠子重量超出前述范圍時，調節甲醇的體積，少于0.5g的樹脂使用10ml甲醇，2.5到4.0g樹脂使用40ml甲醇。珠子通過重力沉降大約12-15分鐘，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心地提取并且棄去上清溶液(包括細碎物)。將甲醇洗滌一次以上，然后加入20％甲醇，成為1∶1(v/v)的珠子漿液。珠子于4℃儲存。
制備珠子漿液轉移440微升(440μl)珠子漿液至15ml塑料錐形管中(每個柱子使用220μl濕珠子)，加入10ml工作緩沖液(20mM檸檬酸緩沖液/140mM NaCl，pH7.0)。樣品輕微振蕩或者顛倒30秒。珠子通過重力沉降大約12-15分鐘，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心吸除并且棄去上清溶液(包括細碎物)。將工作緩沖液重復沖洗2次以上，加入足量的工作緩沖液，使體積比為1∶1。樣品再次輕微振蕩或者顛倒30秒，沉降，室溫靜置過夜。通過加入必要的工作緩沖液保持工作緩沖液的體積為1∶1，將水合珠子于4℃保持在緩沖液中，直到使用。
制備預先水合的珠子AminoToyopearlTM和別的珠子以20％乙醇中的濕漿液的形式獲得，不需要進行額外的水合步驟。然而，要如下平衡至工作緩沖液。生產商估計商品化漿液含有體積百分比為大約72％的樹脂，并且每柱子使用300μL漿液。轉移珠子至15毫升塑料管(例如Falcon)中，加入10ml工作緩沖液。樣品輕微振蕩或者顛倒30秒。珠子通過重力沉降大約12-15分鐘，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心提取并且棄去上清溶液(包括細碎物質)。將工作緩沖液重復沖洗至少2次，加入足量的工作緩沖液，使體積比為1∶1。樣品再次輕微振蕩或者顛倒30秒，沉降，室溫靜置過夜。通過加入必要的工作緩沖液保持工作緩沖液的體積為1∶1，將水合珠子于4℃保持在緩沖液中，直到使用。
紅細胞的制備和處理將一袋110ml的AdsolTM(Baxter，Bloomington，IN)加到大約250ml一袋的含有大約250-300ml RBC和殘留白細胞和血小板的紅細胞濃縮液(RBC)中。得到的血細胞比容(紅細胞(RBC)體積/總體積)大約為50-55％。AdsolTMCPD(檸檬酸磷酸右旋糖)和RBCs顛倒混合。然后將來自收集的混合物室溫下八小時內通過Pall leukoreduction濾器(Pall Corporation，East Hills，NY)，置于新的袋中。此過程減少了RBC混合物中白細胞的量。過濾掉白細胞的RBC于4℃在新袋中可以保存長達42天。此制劑中緩沖液混合物的最終組分是30.6％ Adsol/8.5％ CPDv∶v。使用前，檢測RBC制劑的溶血百分率，通過測量離心后的上清在415nm處的吸光度來進行。相對于制備后立即獲得的溶血值，溶血值的增量大于2％的RBC制劑不被使用。
腦勻漿液的制備和處理正常的倉鼠腦勻漿液(10％w/v)由馬里蘭大學(the University ofMaryland)的Dr.Robert Rohwer和同事根據他們建立的方法制備。以1.8ml體積制備等份溶液，于-80C冷凍保存或者液氮保存，直到使用。可選擇地，勻漿液融化一次進行分裝。每次實驗每柱子使用60微升的腦勻漿液。
腦勻漿液樣品融化后，樣品置于濕冰上。然后向每60μl融化的腦勻漿液的等份溶液中加入6.6μl的5％十二烷基肌氨酸鈉試劑(將0.5g十二烷基肌氨酸鈉溶于9.5ml的CPD∶Adsol緩沖液中(8.5％CPD，30.6％Adsol和60.9％PBS v∶v∶v))。樣品輕微地在濕冰上旋渦振蕩30分鐘，進行變性。然后樣品在微型離心機中4℃，14,000rpm離心5分鐘。轉移上清至新管中，棄去沉淀物。然后上清置于濕冰上，最長1小時。得到的上清是含有0.5％十二烷基肌氨酸鈉試劑的10％腦勻漿液。將得到的分裝物于制備后1小時內加到柱子上，處理過程中置于濕冰上。
水合珠子定量轉移到柱子上往每個空柱子上加入750μL 0.1％TweenTM20溶液。然后往每個柱子上加入1毫升20％的乙醇(v∶v)，使其在重力下流過。再往每柱子上加入2×1ml除氣的去離子水，以洗掉乙醇溶液，除去任何捕獲在玻璃料中的空氣。使用定量吸移管管理器，把400μl的水合珠子懸液轉移到柱子中。多余的工作緩沖液依靠重力流過經轉移的濕珠子，然后在導入樣品前，用1ml工作緩沖液將柱子洗滌3次。
制備RBC共混物(活化溶液)用注射器和18號(或者更大號的)針頭，把540μl的RBC/柱子置于聚丙烯圓錐管中。為了把AdsolTM層分離于上部，將管子以3,000rpm離心10分鐘。然后往上部AdsolTM層上加上60μl的10％處理過的腦勻漿液，從而減少RBC制劑和高濃度摻入材料，即腦勻漿液和十二烷基肌氨酸鈉去垢劑之間的直接接觸。共混物顛倒混合，置于濕冰上，在制備的4小時內使用。在柱分析使用前，使混合物恢復到室溫，保持10分鐘。
將活化溶液加到柱子中當所有的柱子都填充了水合珠子后，混合活化溶液，將其非常仔細地以0.5ml/柱的體積分層加到珠子上。使溶液靠重力通過柱子。總的流經時間在大約5到20分鐘之間。
將最初0.5ml的流出活化溶液收集入2ml冷凍管中。往每個柱中再加入0.5ml工作緩沖液，流出液再收集入相同的冷凍管中。將裝有珠子的柱子用1毫升工作緩沖液洗滌5次，其中珠子通過移液操作連續地重懸，以確保徹底和均勻的洗滌。然后，按照如下所述將珠子從柱中回收。
定量回收結合的珠子往每柱中加入0.75ml工作緩沖液。用移液管沖洗柱子以懸浮珠子，將懸液快速轉移到刻度管中。珠子懸液在管中沉降，盡量除去上清而不擾動珠子層。然后上清加回到相同的柱子中，將以上步驟重復2次，以便把柱子中剩下的任何珠子轉移到管中。然后允許珠子通過重力沉降10分鐘，記錄帶刻度的管子中的珠子層體積。
制備用于分析的結合珠子首先，將每管中的工作緩沖液水平調節到1ml，然后通過輕微旋渦管子制得珠子懸液。使用移液管移出500μl的懸液，轉移到小的EppendorfTM(Brinkmann instruments，Westbury，NY)微量離心管中。讓懸液沉降10分鐘，將沉降的珠子的體積調節到100μL。然后離心轉移后的珠子，除去上清。立即制備珠子等份溶液，進行電泳和western印跡分析。
無水珠子與水合珠子的定量比較以沉降珠子的體積為基礎計算干重，膨脹率如下珠子干重＝沉降體積/膨脹率膨脹率＝水合珠子體積(μL)/干重(mg)對于ToyopearlTM，42.5mg干重＝在20％甲醇中的200μL濕珠子膨脹率(在20％甲醇中)＝200/42.5＝4.71實施例4Western印跡分析以下的Western印跡程序，設計用于評估來自摻入紅細胞濃縮液(RBC)的腦勻漿液溶液中回收或去掉傳染性或非傳染性朊病毒蛋白。這些程序用于從以上實施例3中描述的柱子朊病毒結合分析中獲得的樣品，包括暴露于活化溶液的珠子樣品和流過柱子的活化溶液樣品，并且收集這些樣品。
一般地，靶向結合材料的珠子與含有朊病毒的溶液反應，樣品來源于這樣的珠子的柱子結合分析，或者來源于這些反應的流出液。然后通過Western印跡來分析制備的樣品中朊病毒蛋白質的存在。使用對朊病毒蛋白特異的鼠單克隆抗體作為一抗進行朊病毒蛋白的熒光檢測。然后用結合有堿性磷酸酶的二抗檢測這些朊病毒的免疫復合物，用X光片對化學發光反應進行顯影。
樣品制劑的凝膠電泳在實施例3中描述的柱子分析之后，優選地立即進行以下步驟。
對每個制備的柱子珠子樣品，通過渦流把100μL的懸浮好的珠子與100μL的Invitrogen 2X樣品緩沖液進行混合。同樣通過把柱分析中得到的未使用的腦勻漿液(正常的人腦，散發性CJD腦，正常的倉鼠腦，羊騷癢癥倉鼠腦，等等)與Invitrogen 2X樣品緩沖液混合制備對照組。更特異地，往40μL的2X樣品緩沖液中加入20μL腦勻漿液。
同樣如下制備鼠IgG對照。通過把20μl的2.5mg/ml的鼠IgG與480μl的PBS混合，制備每泳道50ng的標準物，相當于100μl/ml。把25的這種混合物加到475的2X Invitrogen樣品緩沖液中，得到5ng/ml溶液。對于高濃度的直接上樣凝膠標準物，以每泳道10μl使用該標準物，給出50ng/泳道。將5微升100μg/mL的鼠IgG溶液與495μl 2X Invitrogen還原樣品緩沖液混合。這產生了1ng/μL的鼠IgG；每泳道使用10μl這種混合物，得到10ng/泳道(高濃度直接上樣凝膠標準物)(10ng/泳道)。也通過稀釋前述步驟的中濃度標準物制備鼠IgG低濃度直接上樣凝膠標準物(2ng/泳道)，前述步驟的中濃度標準物即通過將溶于上樣緩沖液的50μL的1ng/μL鼠IgG與200μL的Invitrogen 2X樣品緩沖液混合來得到(產生0.2ng/μL)。每孔上樣10μL即2ng/泳道。也可以如生產商指導的制備Invitrogen SeeBlue Plus2 Pre-Stained分子量標準物。
所有樣品在Invitrogen緩沖液中90℃加熱10分鐘。然后短暫離心樣品，-20℃存儲過夜。第二天上午在將樣品應用于SDS-PAGE凝膠前重復加熱程序。
免疫反應程序當12％ Bis Tris NuPAGE SDS-PAGE凝膠用如以上描述的樣品上樣后，凝膠以恒壓200V電泳45分鐘，進行電印跡轉移程序。將蛋白質轉移到其上的膜置于Fisher方形皿中，在搖床上用25ml Western Breeze封閉劑(12.5ml水，5ml稀釋劑A和7.5ml稀釋劑B)室溫孵育1小時。棄去封閉溶液。
膜在以1∶5,000稀釋于20ml新鮮的Western Breeze一抗稀釋液(14ml水，4ml稀釋液A，2ml稀釋液B)中的Signet 3F4一抗溶液中孵育。一抗預先以1∶1稀釋于甘油中，所以，工作稀釋度是1∶10,000。膜在冷凍條件下在搖床上孵育。
棄去一抗溶液，將膜洗滌3次，每次用20ml Western BreezeTM抗體洗滌溶液(將1.25ml抗體洗滌溶液(16×)溶于18.75ml水中)于室溫在搖床上洗滌10分鐘。然后膜用AP3(KPL，Gaithersburg，MD)二抗孵育，二抗是以1∶10,000稀釋于20ml Western Breeze一抗稀釋液中得到的溶液，室溫在搖床上孵育60分鐘。棄去二抗溶液，用如上描述的WesternBreeze Antibody Wash洗滌膜。然后用20ml pH9.8的20mM Tris-HCl，1mM MgCl2室溫將膜洗滌10分鐘。
化學發光產生程序轉移膜至干燥的托盤中，浸泡于5ml Western Breeze預混的化學發光底物(CDP StarTMsubstrate，Applied Biosystems，Foster City，CA)中輕輕攪動5分鐘。用紙巾輕輕吸干膜，然后置于保護紙中。接著將膜從保護紙中轉移到暗盒中(沒有增感屏)，室溫保持30分鐘，室溫暴露于放射顯影5分鐘。
實施例5從人血漿中結合內源PrPc為了表現朊病毒結合樹脂從人血漿中除去PrPc的能力，進行以下實驗，所述人血漿是內源的、未穿入PrPc的人血漿。
對于通過朊病毒結合材料結合內源PrPc的作用，使用的是未稀釋的、新鮮的、匯合的人血漿。冷凍混合的人血漿37℃解凍，通過0.45μm濾器過濾，加入十二烷基肌氨酸鈉至終濃度為0.05％。如本說明書中其它地方描述的，進行血漿與柱子的結合，以及朊病毒的檢測。
從人血漿中結合內源PrPc的實驗結果在圖1中描述。組A描述在沒有十二烷基肌氨酸鈉時，珠子洗脫液中朊病毒蛋白的Western印跡檢測結果(第1道是分子量標記物；第2道-低濃度鼠IgG；第3道-中濃度鼠IgG；第4道-高濃度鼠IgG；第5道-正常的人血小板；第6-7道-樹脂a；第8-9道-樹脂b；第10-11道-Amino 650-M；第12-13道-乙酰化Amino 650)。組B描述組A中樣品的未結合部分的Western印跡檢測結果(第1道-分子量標記物；第2道-低濃度鼠IgG；第3道-中濃度鼠IgG；第4道-高濃度鼠IgG；第5道-正常的倉鼠腦(nHB)；第6道-正常的人血小板，第7-8道-樹脂a；第9-10道-樹脂b；第11-12道-Amino 650-M；第13-14道-乙酰化Amino 650)。組C表示在存在十二烷基肌氨酸鈉時，朊病毒蛋白的Western印跡檢測結果(第1道是分子量標記物；第2道-低濃度鼠IgG；第3道-中濃度鼠IgG；第4道-高濃度鼠IgG；第5道-正常的倉鼠腦；第6道-人血小板，第7道-正常人血漿+十二烷基肌氨酸鈉，1∶10；第8道-樹脂a；第9道-樹脂a；第10道-樹脂b；第11道-樹脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。組D表示在存在十二烷基肌氨酸鈉時，通過朊病毒蛋白的Western印跡，檢測組C樣品中的未結合部分的結果(第1道是分子量標記物；第2道-低濃度鼠IgG；第3道-中濃度鼠IgG；第4道-高濃度鼠IgG；第5道-正常的倉鼠腦；第6道-人血小板，第7道-正常人血漿+十二烷基肌氨酸鈉；第8道-樹脂a；第9道-樹脂a；第10道-樹脂b；第11道-樹脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。
參考圖1，組A，第10和11道，和組C，第12和13道，檢測PrPc結合到ToyopearlTMAmino 650-M樹脂上的結合作用；假如通過乙酰化作用除去氨基上的電荷，那么就不能進行結合(結果如組A，第12和13道所示)。
實驗結果表明了樹脂從人血漿中結合內源性PrPc的能力，從而提供樹脂可以用于從人或動物中除去PrP樣品的證據。
實施例6從血成分中結合PrPsc的間隔物要求如圖1所示，ToyopearlTMAmino 650-M樹脂從人血漿中結合內源PrPc。至少此樹脂的一部分含有間隔臂或者基團，為TosohTM所專有。研究間隔物對PrPsc結合的重要性。
如下填充四個(4)用于確定吸收劑的蛋白質分離試劑盒(PIKSITM)柱子(0.5ml/每個)每個實驗樣品兩個柱子，一個是缺少間隔物的ToyopearlTMAmino 650M，一個是商品化的有間隔物的ToyopearlTMAmino 650M樹脂。同時也檢測沒有間隔物的ToyopearlTMAmino 650C樹脂。
用0.5％十二烷基肌氨酸鈉處理2毫升(2ml)10％羊騷癢癥腦勻漿液(SBH)。通過把3ml SBH加到297ml工作緩沖液中，對十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用工作緩沖液稀釋(1∶100)，柱子用這樣的十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清進行活化。柱子用10ml稀釋于緩沖液的SBH，通過以0.5ml/min的流速上樣，活化2次。收集流出液，從每個柱子中除去樹脂等份物，用10ml工作緩沖液洗滌。
用每種樹脂和緩沖液中的活化溶液對每種樣品的其中一半用蛋白酶K消化。樣品，如在本文其它地方描述的那樣，進行Western印跡檢測。得到的結果如圖2所示(第1道是分子量標記物；第2道是用緩沖液配制的用0.1％十二烷基肌氨酸鈉處理的SBH-PK；第3道是用緩沖液配制的用0.1％十二烷基肌氨酸鈉處理的SBH+PK；第4道是MWM；第5道是Amino 650M(商品化的)-PK(1)；第6道是Amino 650M(商品化的)-PK(2)；第7道是Amino 650M(商品化的)+PK(1)；第8道是Amino650M(商品化的)+PK(2)；第9道是Amino 650M(試驗的)+PK(1)；第10道是Amino 650M(實驗的)+PK(2)；第11道是Amino 650M(實驗的)+PK(1)；第12道是Amino 650M(實驗的)+PK(2)；第13道是Amino650C-PK(1)；第14道是Amino 650C-PK(2)；第15道是Amino650C+PK(1)；第16道是Amino 650C+PK(2))。如圖2所示的實驗結果清楚地表明，間隔臂的存在對于Amino 650-M樹脂的PrPsc結合作用是必要的。
實施例7在存在高濃度的人血清白蛋白(HSA)下捕獲PrPc為了舉例說明樹脂從含有多種蛋白質的治療產品中除去PrP的能力，研究了存在人血清白蛋白時，從中結合PrPc的作用。
將四根Bio-RadTM柱子，用ToyopearlTMAmino 650M氨基樹脂填充。樹脂床高1cm，體積為0.5ml。樹脂用工作緩沖液充分沖洗。柱子上加載的樣品如下柱子I-工作緩沖液中的1％nHaBH(正常倉鼠腦勻漿液)；柱子II-1％HaBH，用工作緩沖液配制的25％HSA(Sigma)；柱子III-1％HaBH，用工作緩沖液配制的25％HSA(Sigma)和20mM N-Ac-Trp(Acros Organics，Belgium)；柱子IV-1％HaBH，American Red Cross制劑(ARC制劑)。
將20mM N-Ac-Trp溶于用工作緩沖液配制的25％HSA中，振蕩，37℃加熱45分鐘。如以上描述的制備10％nHaBH上清，以1∶10稀釋于選擇的材料中(步驟2)，得到1％的nHaBH。
每個柱子的底部與4通道的蠕動泵相連。以上步驟制備的5毫升(5ml)1％nHaBH以0.5ml/min的流速通過柱子I-IV。柱子被洗滌，以10ml工作緩沖液/柱子、以0.5ml/min的流速洗滌。回收樹脂，如以上描述制備樣品，跑12％ Bis-Tris SDS-PAGE凝膠。
使用3F4一抗的Western印跡被用于檢測已經被樹脂俘獲的PrPc。印跡的照片如圖3所示(第1道-低濃度鼠對照組；第2道-中濃度鼠IgG對照組；第3道-nHaBH對照組；第4道-1％HaBH柱子；第5道-1％HaBH，25％HSA柱子；第6道-1％HaBH，25％HSA，20mM N-AC-Trp柱子；第7道-1％HaBH，ARC制劑柱子)。在每道中可以見到大約相同密度的條帶，這表明ToyopearlTM650-M氨基樹脂，在從多種途徑獲得的25％人血清白蛋白存在的條件下，俘獲了倉鼠腦勻漿液中的PrPc。
如圖3所示的實驗結果表明樹脂從含有HAS的樣品中結合朊病毒蛋白的能力，從而提供了樹脂可以用于在多種治療產品中結合朊病毒蛋白，并且確保使用血蛋白的治療產品，例如作為穩定劑或治療劑，以及可以受到PrP污染的治療產品的安全性的證據。
實施例8在人血清白蛋白中，PrPsc結合到氨基樹脂上在以下描述的實驗中，說明了在摻入在白蛋白中的傳染性PrPsc的結合作用。將12個PIKSI柱子用ToyopearlTMAmino 650M樹脂進行填充，每個0.5ml。將2ml 10％SBH(羊騷癢癥腦勻漿液)用0.5％十二烷基肌氨酸鈉處理。
按照如下概述，制備以下六種活化物。
1.用緩沖液配制的SBH活化物用工作緩沖液稀釋(1∶100)經過十二烷基肌氨酸鈉處理的上清；將0.22ml SBH加到22ml工作緩沖液中。
2.用HSA(American Red Cross(ARC)制劑)配制的SBH活化物將十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用25％HAS稀釋(1∶100)；將0.22mlSBH加到22ml HSA(American Red Cross制劑)中。
3.用含有N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物把十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用含有20mM N-乙酰-色氨酸和20mM辛酸酯的25％HSA稀釋(1∶100)；白蛋白從sigma購買，不含添加劑；將0.22ml的SBH加到22ml的HSA溶液中。
4.用含有N-乙酰-色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH活化物把十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用25％HSA稀釋(1∶100)；將0.22ml的SBH加到22ml含有N-乙酰-色氨酸的HSA中。
5.用含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物把十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用25％HSA稀釋(1∶100)；將0.22ml的SBH加到22ml含有20mM辛酸酯的HSA溶液中。
6.用單獨的HSA(Sigma)配制的SBH活化物把十二烷基肌氨酸鈉處理過的上清用25％HSA稀釋(1∶100)；將0.22ml SBH加到22ml的HSA溶液(Sigma)中。
每種樹脂用10ml溶液重復活化2次。柱子以0.5ml/min的流速上樣，以蠕動泵控制流速。收集流出溶液，以及收集來自每個柱子的樹脂。對每種樹脂和緩沖液中的活化物導入蛋白酶K消化液。根據在此描述的方法，樣品進行Western印跡。印跡在圖4中描述(組A第1道-分子量標準物；第2道-緩沖液配制的0.1％十二烷基肌氨酸鈉處理的SBH-PK；第3道-緩沖液配制的0.1％十二烷基肌氨酸鈉處理的SBH+PK；第四道-緩沖液配制的SBH-PK(1)；第5道-緩沖液配制的SBH-PK(2)；第6道-緩沖液配制的SBH+PK(1)；第7道-緩沖液配制的SBH+PK(2)；第8道-HSA(ARC組成)配制的SBH-PK(1)；第9道-HSA(ARC組成)配制的SBH-PK(2)；第10道-HSA(ARC組成)配制的SBH+PK(1)；第11道-HSA(ARC組成)配制的SBH+PK(2)；第12道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第14道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；列；組B第1道-分子量標準物；第2道-緩沖液配制的0.1％十二烷基肌氨酸鈉處理的SBH-PK；第3道-緩沖液配制的0.1％Sark處理的SBH+PK；第4道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第5道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第6道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第7道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第8道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第9道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第10道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第11道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第12道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第14道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)。
圖4中所示的結果表明，當與人血清白蛋白混合時，傳染性PrPres可以結合到氨基樹脂上，并且多種添加劑不會干擾結合。
雖然本發明的實踐或檢驗中可以使用與在此描述的方法和材料相似或相當的方法和材料，但是以上描述的是合適的方法和材料。所有的出版物、專利申請、專利和在此提及的其它引述的參考資料被完整地引用于此，作為參考。另外，材料、方法和實施例僅僅是例證性的，其目的不在于限制。
上述的描述用于描述與發明有關的幾個實施方案。可以對實施方案和結構進行多處修正、添加和刪除，只要不脫離發明的范圍和精神。
序列表<110>美國紅十字會北卡羅萊納州立大學普洛麥提生命科學有限公司<120>朊病毒蛋白結合材料及其使用方法<130>51821-0111 WP(51821-299536)<150>US 60/460,474<151>2003-04-04<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>1Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln1 權利要求
1.一種用于在樣品中的朊病毒蛋白和朊病毒蛋白結合材料之間形成復合物的方法，所述方法包括在使朊病毒蛋白和所述朊病毒蛋白結合材料之間形成復合物的條件下，用該朊病毒蛋白結合材料接觸所述樣品，其中該朊病毒蛋白結合材料包括功能團，其中所述功能團是親水基團、疏水基團、或兩性功能團。
2.如權利要求1所述的方法，進一步包括從該樣品中分離所述復合物。
3.如權利要求1或2所述的方法，進一步包括檢測該復合物。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中該功能團是伯胺基團、仲胺基團、叔胺基團、季銨基團、胺基、亞硫酸鹽基團、磺酰基、2，2，2-三氟乙烷磺酰基、烷基、芳香基團、苯基、丁基、硅氧烷基或氟化基團。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中該功能團選自a)-OCH2-CHOH-CH2NH2；b)-C6H5；c)-(CH2)3-CH3；d)-CH2-CH2-N+H(C2H5)2；e)-SO2-CH2-CF3；f)-CH2-CH2-N+H(CH3)2；g)-CH2-CH2-N+(CH3)3；h)-SO32-；i)二乙基氨基乙基基團；j)二甲基氨基乙基基團；和k)三甲基氨基乙基基團。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述結合材料包括鋁或氧化硅。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述結合材料包括聚合物基質。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述聚合物基質是聚甲基丙烯酸、甲基丙烯酸、FRACTOGELTMEMD、TOYOPEARLTM或者TSK-GELTM聚合物基質。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述樣品是生物樣品、食品、環境樣品或水樣品。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述樣品包括高達大約50wt％的血清白蛋白。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述朊病毒蛋白結合材料包括連接到功能團上的間隔基。
全文摘要
朊病毒蛋白結合材料以及應用結合材料來檢測或者去除樣品中朊病毒蛋白的方法，樣品如生物液體或者環境樣品。結合材料可以結合一種或多種形式的朊病毒蛋白，包括細胞朊病毒蛋白(PrPc)，傳染性朊病毒蛋白(PrPsc)，重組朊病毒蛋白(PrPr)，以及蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPres)。來自包括人和倉鼠的多種不同物種的朊病毒被結合材料結合。
文檔編號G01N33/68GK1842707SQ200480015676
公開日2006年10月4日 申請日期2004年4月2日 優先權日2003年4月4日
發明者S·J·波頓, D·J·哈蒙德, R·G·卡波耐爾, 申洪略, P·V·古爾格爾, V·威爾特希爾-萊爾利 申請人:病毒去除和診斷科技公司, 北卡羅萊納州立大學