表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅ii的方法
【專利摘要】本發明提供了一種表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅II的方法，包括以下步驟：將柑橘連皮一起打細成沫狀或漿狀，采用QuEChERS快速萃取法對其進行凈化，過濾膜得到待測樣品；在進樣瓶中依次加入250～600μL的OTR202增強劑，10～50μL樣品待測液和50～150μLOTR103增強劑混勻，此混合體積需≥0.5mL；設置拉曼光譜儀激光功率為50～200mW，分辨率為2cm-1，信號相對強度范圍為0～60000，積分時間為5～20s，積分1～3次平均，濾波器平滑參數為1；在表面增強拉曼光譜體系下，對食品中常見的非法添加劑柑橘紅II進行拉曼光譜分析，找出其相應的拉曼光譜特征峰，以作為柑橘中非法添加柑橘紅II的定性特征峰，建立一種快速、簡便、靈敏的表面增強拉曼光譜檢測柑橘中柑橘紅II的方法。
【專利說明】表面増強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅11的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品添加劑領域，特別涉及一種應用表面增強拉曼光譜法測定柑橘中 柑橘紅II的方法。
【背景技術】
[0002] 柑橘紅11號染料也叫溶劑紅80 (縮寫：CR2)，分子式為C18H16N2O3，化學名為 1-[(2, 5-二甲氧基苯基）偶氮]-2-萘酚，分子量為308. 331。柑橘紅II為橘紅色粉末， 不溶于水，溶于芳烴類溶劑。合理使用對人體不會構成威脅，經過處理過的果實在整個果 實中（以干重計）的含量不能超過2mg/L。經相應溶劑溶解后的柑橘紅II號色素，只能 用于不經加工的早熟甜橙果皮增色，而且使用后果實表皮不得有揮發性溶劑殘留物。GB/T 2760-2011《食品添加劑使用衛生標準》明確規定在食品中不允許添加柑橘紅II色素。不 法商販為了牟利，違規使用此染料作為染色劑增加甜橙（主要是臍橙）果實的色澤與著色 均勻度，提高果實的市場競爭力。2004年廣東和香港等地水果市場相繼發現染色橙，含禁用 可能致癌的柑橘紅II號色素。
[0003] 目前針對食品中人工合成著色劑和偶氮染料常用的檢測方法主要還是高效液相 色譜法、高效液相色譜質譜聯用儀和分光光度法，雖然這些定檢設備方法精確度高，穩定性 好，但檢測成本高，不易不同場合移動使用且耗時，不利于對大批量的樣品進行實時檢測篩 查，不能滿足現場快速、大批量篩查不合格樣品的需求。
[0004] 因此，建立快速、有效的食品安全檢驗方法已成為迫切需要解決的問題。而表面增 強拉曼光譜檢測技術有樣品處理簡單，檢測時間短，檢測光譜所反映的信息量豐富，適合快 速定性分析，在食品檢測中具有一定優勢。
【發明內容】
[0005] 本發明在表面增強拉曼光譜體系下，對食品中常見的非法添加劑柑橘紅II進行 拉曼光譜分析，找出其相應的拉曼光譜特征峰，以作為柑橘類中非法添加柑橘紅II的定性 特峰，建立一種快速，簡便的表面增強拉曼光譜檢測方法。
[0006] 本發明的技術方案包括以下步驟：
[0007] (1)將柑橘連皮一起打細成沫狀或漿狀，采用QuEChERS快速萃取法對其進行凈 化，過濾膜得到待測樣品；
[0008] (2)在進樣瓶中依次加入250?600μL的0TR202增強劑，10?50μL樣品待測 液和50?150μL0TR103增強劑混勻，此混合體積需彡0. 5mL;
[0009] (3)應用拉曼光譜儀測定所述進樣瓶中的樣品；設置拉曼光譜儀激光功率為50? 200mW，分辨率為2CHT1，信號相對強度范圍為0?60000,積分時間為5?20s，積分1?3次 平均，濾波器平滑參數為1 ;
[0010] 若檢測出柑橘紅II的拉曼定性特征峰，則柑橘中含有柑橘紅II;若沒有出現柑橘 紅II的拉曼定性特征峰，則柑橘中不含有柑橘紅II。
[0011] 其中，所述柑橘紅II的拉曼定性特征峰為578±3〇1^，1282±3〇1^，1589±3011'
[0012] 優選的，步驟⑴中，QuEChERS快速萃取法對柑橘漿液進行凈化的步驟為：將柑橘 漿液加水和乙腈混合均勻，用QuEChERS萃取試劑盒萃取，劇烈震蕩后離心靜置，再取乙腈 層于QuEChERS分散固相萃取試劑盒中，振搖混勻后離心，取上清液過膜。
[0013] 更有選的，稱5.OOg柑橘衆液于離心管中，加入5mL水，漩禍混勾，再加入5.OOmL 乙腈，漩渦混勻lmin，加入到QuEChERS萃取試劑盒中震蕩后離心靜置，再取2mL乙腈層于 QuEChERS分散固相萃取試劑盒中，振搖Imin混勻后離心，取上清液過0. 45μm的有機濾膜。 [0014]柑橘紅II常添加于果蔬汁或者柑橘類水果中，目前沒有特定的國標方法進行檢 測。本研宄采用QuEChERS快速萃取方法對食品中非法添加物的禁用染料柑橘紅II凈化， 其處理方法簡單、快速，樣品處理干凈，回收率為89. 1%?93. 7%。靈敏度高，此方法中表 面增強拉曼光譜對柑橘紅II的檢出限為5mg/kg。經液相色譜定性驗證對比，能滿足對現場 樣品柑橘紅Π含量大于5mg/kg的定性檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 下面結合附圖對本發明作進一步說明：
[0016] 圖1為高效液相色譜柑橘紅II的標準曲線；
[0017] 圖2為樣品中柑橘紅II與標樣的高效液相色譜圖；
[0018] 圖3為柑橘紅II的表面增強拉曼光譜圖；
[0019] 圖4為不同樣品中柑橘紅II拉曼光譜圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面將結合本發明中的實施例和附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、 完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0021] 實施例1 :
[0022] L1儀器設備
[0023] 高效液相色譜儀器：Agilent 1100,配有DAD檢測器，美國安捷倫科技有限公司；
[0024] RamTracerS-200型便攜式拉曼光譜儀，歐普圖斯（蘇州）光學納米科技有限公 司；
[0025] 旋渦混合器：XW_80A，常州諾基儀器有限公司。
[0026]L 2試劑及樣品
[0027] 柑橘紅II標準物質：99%，購于上海安譜科學儀器有限公司；
[0028] 乙腈：色譜純，德國默克公司；
[0029] 0TR202,歐普圖斯（蘇州）光學納米科技有限公司；
[0030] 0TR103,歐普圖斯（蘇州）光學納米科技有限公司；
[0031] QuEChERS萃取試劑盒，包括：
[0032] (l)6g MgSO4，美國安捷倫科技有限公司；
[0033] (2)I.5g乙酸鈉，美國安捷倫科技有限公司；
[0034]QuEChERS分散固相萃取試劑盒，包括：
[0035] (l)50mgPSA，美國安捷倫科技有限公司；
[0036] (2) 150mgMgS04,美國安捷倫科技有限公司；
[0037] 柑橘：購于超市。
[0038] L3實驗方法
[0039] L3. 1標準溶液的配制
[0040] 準確稱取0.OlOOg柑橘紅II標準品于100.OOmL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制 得100. 00μg/mL的柑橘紅II標準儲備液，密封于4°C冰箱中保存，備用。
[0041] 分別準確吸取0. 10、0. 50、I. 00、5. 00、10.OOmL柑橘紅II標準儲備液于IOOmL容 量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得0.l〇、〇. 50、1. 00、5. 00、10. 00μg/mL的柑橘紅II標準工 作溶液，用于液相色譜和拉曼光譜分析的待測標準溶液。
[0042] 1. 3. 2樣品前處理方法
[0043] 將柑橘連皮一起打細成沫狀或漿狀，準確稱5.OOg于15mL塑料離心管中，加入5mL 水，漩渦混勻，再加入5.OOmL乙腈，漩渦混勻lmin，QuEChERS萃取試劑盒（包括6gMgSO4, 1. 5g乙酸鈉，目的是除水），劇烈震蕩后，在離心機上以4000rm/min的速度離心4min。再 取2mL乙腈層于QuEChERS分散固相萃取試劑盒中（目的是去除有機酸、糖及脂類），振搖 Imin混勾后，在離心機上以4000rm/min的速度離心4min，然后取上清液過膜，用高效液相 色譜儀和拉曼光譜儀進行檢測分析。
[0044] I. 3. 3SERS的樣品檢測方法
[0045] (1)標樣檢測：在2mL玻璃進樣瓶依次加入500μL0TR202增強劑、20μL待測標 準溶液、100μL0TR103增強試劑，漩渦混合均勻后，放入樣品池測定。
[0046] (2)樣品檢測：在2mL玻璃進樣瓶中按依次加入500μL0TR202增強劑、20μL樣 品待測液、100μL0TR103增強試劑，漩渦混合均勻后，放入樣品池測定。
[0047] L3. 4HPLC與SERS的儀器檢測條件
[0048] (I)HPLC檢測條件
[0049] 色譜柱：ZORBAXC18150mmX4. 6mmX5μm;流動相：乙腈+1 %甲酸水溶液= 90+10(陳毓芳等，2011) ;DAD檢測器：檢測波長：510nm;柱溫：30°C;進樣量：10. 0μL;流 速：LOmT,/miη〇
[0050] (2)SERS檢測條件
[0051] 光譜儀激光功率為200mW;分辨率為2CHT1;信號相對強度范圍為0?60000 ;積分 時間為IOs;積分2次平均；濾波器平滑參數為1。
[0052] I. 3. 5HPLC回收率和精密度實驗
[0053] 稱取一定質量的含有1.40mg/kg柑橘紅II的柑橘樣品，并在其中分別加入 2. 00mg/kg、4. 00mg/kg和6. 00mg/kg三個不同濃度的柑橘紅II標準溶液，用高效液相色譜 測定，分別進行6次平行實驗，得到方法的回收率和精密度見表1。
[0054] I. 3. 6HPLC的方法檢出限
[0055] 根據式（1)計算方法的檢出限。
[0056] LOD= 3CVf/(S/N)m(l)
[0057]式中：C-為進樣濃度（單位：μg/mL);
[0058] V一為定容體積（單位：mL);
[0059] f-稀釋倍數；
[0060] S/N-為信噪比（可通過工作站對圖譜進行自動分析獲得）；
[0061] m一質量（單位：g)。
[0062] I. 3. 7SERS的檢出限
[0063] 取1. 3. 1中配制的不同濃度柑橘紅II拉曼標準溶液添加于柑橘漿液中，混勻，用 拉曼光譜進行檢測，其最小檢出濃度即為本方法的檢出限。
[0064] 2結果與分析
[0065] 2. 1標準曲線的繪制及色譜圖
[0066] 將配制的柑橘紅II標準溶液從低濃度到高濃度分別取10μL，用高效液相色譜測 定，根據保留時間定性，峰面積定量，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制柑橘紅II的 標準曲線，見圖1。從圖1中可看出：柑橘紅II的標準工作濃度在0. 10?10. 00μg/mL范 圍內具有很好的線性關系，相關系數為〇. 9998。
[0067] 標樣色譜圖和樣品圖見圖2。在圖2中，從上至下依次為：第一張圖為乙腈空白， 第二張圖為含有I. 4mg/kg非法添加柑橘紅II的樣品色譜圖，第三張圖為在非法添加柑橘 紅II的空白樣品中加入6. 4mg/kg柑橘紅II標準溶液的色譜圖，第四張圖為5. 0μg/mL柑 橘紅II標準溶液色譜圖。從圖中可以看出：柑橘紅II在3.Omin左右出峰，樣品的前處理 較好，無雜峰對目標物的干擾，第三張與第二張圖對比，添加了柑橘紅II標準溶液（第三張 圖）之后，峰高明顯高于樣品（第二張圖），表明添加柑橘紅II標樣后的含量明顯高于空白 樣品，實際與理論相符，通過此可判斷出柑橘中是否非法添加了柑橘紅II色素，因此，可作 為拉曼光譜對柑橘紅II的定性檢測樣品。
[0068] 2. 2回收率和精密度實驗
[0069] 柑橘紅II的加標回收率及精密度的結果如下表。
[0070] 表4. 1回收率和精密度實驗（η= 6) %
[0071]
【權利要求】
1. 表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅II的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將柑橘連皮一起打細成沫狀或漿狀，采用QuEChERS快速萃取法對其進行凈化，過 濾膜得到待測樣品； (2) 在進樣瓶中依次加入250?600 y L的0TR202增強劑，10?50 y L樣品待測液和 50?150 y L0TR103增強劑混勻，此混合體積需彡0. 5mL ; (3) 應用拉曼光譜儀測定所述進樣瓶中的樣品； 若檢測出柑橘紅II的拉曼定性特征峰，則柑橘中含有柑橘紅II ;若沒有出現柑橘紅II 的拉曼定性特征峰，則柑橘中不含有柑橘紅II ; 其中所述柑橘紅II的拉曼定性特征峰為578±3〇1^，1282±3〇1^和1589±3〇11'
2. 根據權利要求1所述的表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅II的方法，其特征在 于，步驟（1)中，QuEChERS快速萃取法對柑橘漿液進行凈化的步驟為：將柑橘漿液加水和乙 腈混合均勻，用QuEChERS萃取試劑盒萃取，劇烈震蕩后離心靜置，再取乙腈層于QuEChERS 分散固相萃取試劑盒中，振搖混勻后離心，取上清液過膜。
3. 根據權利要求2所述的表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅II的方法，其特征 在于，稱5. 00g柑橘衆液于離心管中，加入5mL水，漩禍混勾，再加入5. OOmL乙腈，漩禍混勾 lmin，加入到QuEChERS萃取試劑盒中震蕩后離心靜置，再取2mL乙腈層于QuEChERS分散固 相萃取試劑盒中，振搖lmin混勻后離心，取上清液過0. 45 y m的有機濾膜。
4. 根據權利要求1所述的表面增強拉曼光譜法測定柑橘中柑橘紅II的方法，其特征在 于，步驟⑶中，設置拉曼光譜儀激光功率為50?200mW，分辨率為2CIIT1，信號相對強度范 圍為0?60000,積分時間為5?20s，積分1?3次平均，濾波器平滑參數為1。
【文檔編號】G01N21/65GK104483303SQ201510003116
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月5日 優先權日:2015年1月5日
【發明者】楊昌彪, 李占彬, 李榮華, 周紅, 譚紅, 包娜, 冉艷, 羅明, 張運依, 陸洋, 謝鋒, 安莎, 昝宏強, 孫海達, 粟欽 申請人:貴州省流通環節食品安全檢驗中心
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
