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棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法

時間:2023-10-31    作者: 管理員

專利名稱:棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法
技術領域
本發明涉及一種棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法。
背景技術
棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的一種維管束萎焉病害,該病菌的寄主范圍很廣,能浸染40個科600多種植物。棉子帶菌是遠距離傳病的主要方式。棉花黃萎病最先在美國發現,二十世紀30年代隨美國棉種傳入我國,后擴散到河南、山東、新疆等20多個省(區、市),1995年再一次被列為全國植物檢疫對象。自上世紀90年代后期,我國棉花黃萎病的危害逐年加重,原因除了缺乏較強的抗耐性棉花品種、適宜的氣候條件之外,其中一個重要原因是棉子帶菌。由于棉花黃萎病菌在病田中存活時間長,一旦擴散,將給棉花生產帶來毀滅性災害。目前,對棉花黃萎病菌的檢測除常規的平板培養檢測外,主要采用PCR方法及免疫技術,但多是針對培養好的黃萎病菌,而對棉子帶菌的檢測還遠未實現。
棉花黃萎病菌的常規檢測方法操作復雜、費時,特異性也不高。直接利用菌體作抗原,制備抗血清進行免疫檢測,又可能會出現抗血清效價偏低以及與其他具有相同抗原成分的病原菌引起交叉反應的缺陷。棉花黃萎病菌產生的毒素蛋白是感病棉花品種致萎的主要原因,因此利用毒素制備抗血清就可以檢測出棉花黃萎病菌。劉鳳權等用毒素抗血清在病菌培養濾液、人工接種幼苗和大田病株中已能成功檢測出黃萎病菌,另外,齊俊生等的研究表明,毒素抗血清具備一定生理型特異性,用強致病力菌系V991毒素制備的抗血清對強致病力菌系毒素具有更強的結合力,能夠檢測出強致病力落葉型菌系,但還沒有利用毒素抗血清檢測棉子攜帶黃萎病菌的報道。
目前市場上流通的棉花種子大多是包衣子,而所用的包衣劑大多是針對苗病,而不是黃萎病,包衣還不能完全殺死黃萎病菌,包衣子并不是無菌子。當前急需一套行之有效的棉子檢測技術尤其是對“藥物包衣”棉子的檢測技術來檢測棉子是否攜帶黃萎病菌。只有通過該檢測技術才能做到既堅決保護無病區,嚴防病菌傳播,又能保證良種的合理推廣流動。

發明內容
本發明的目的在于針對目前棉子攜帶黃萎病菌檢測中存在的實際問題,提供一種新的棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法。
本發明的目的是這樣實現的一種棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法,其特征在于
a、所述的棉子樣品應取1000粒以上置于網袋中,沒有經過藥物包衣的棉子,用流水搓洗,而經藥物包衣的棉子反復搓洗至藥物包衣完全洗盡,然后將棉子于陰涼處晾干。
b、將晾干的棉子樣品加入含有適量抑制細菌生長的抗生素的查彼克培養液中,25℃振蕩培養3d后取培養液5000r·min-1,離心30min后的上清液,作為待測棉子樣品的培養液,進行后序測試。
c、將待測棉子樣品的培養液用包被液1∶1稀釋后,取100μL加至酶標板的反應孔中4℃過夜或37℃下孵育2h;并以標準抗原為陽性對照,空白培養液為陰性對照。
d、取出酶標板,棄去包被液,用PBST洗板3次,甩干,并在每孔中加入300μL封閉液,37℃保溫1h;e、取出酶標板,棄去封閉液,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL用封閉液稀釋的抗血清,37℃下保溫1h;f、取出酶標板,棄去用封閉液稀釋的抗血清,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗(IgG-AP),于37℃下保溫1h;g、取出酶標板,棄去用封閉液稀釋的二抗,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色;h、每孔加入50μL終止液終止反應。終止反應后,用吸水紙吸干酶標板底部,將酶標板置于酶標儀上,在405nm波長下,測定各孔的OD值。
i、按公式P/N=樣品平均OD405值/陰性對照平均OD405值,計算ELISA檢測的P/N值。
j、以P/N≥2判為陽性,認定該棉子樣品攜帶有黃萎病菌。
k、所述的標準抗原是用棉花黃萎病菌培養后獲得的毒素蛋白。
l、所述的抗血清是用標準抗原免疫小鼠或新西蘭兔制成的多克隆抗血清或單克隆抗血清。
本發明的優點在于是以棉花黃萎病菌培養液中的毒素蛋白作為抗原制備抗血清,建立的可特異性檢測棉花黃萎病菌的間接ELISA方法。具有樣品前處理簡單,操作簡便、快速、靈敏、準確、廉價的優點。采用堿性磷酸酶標記的二抗,有效避免了植物體內過氧化物酶及酚類的干擾。本發明適合于各種子公司、檢疫機構、科研單位等進行種子攜帶黃萎病菌的檢測。
具體實施例方式下面用實施例來進一步詳述本發明,但本發明的內容并不局限于此。
實施例1 毒素抗血清的制備將活化后的棉花黃萎病菌菌株Bp2接種于查彼克培養液中,25℃振蕩培養16d后,5000r·min-1,離心30min,取上清,0.45μm微孔濾膜過濾后,裝入超濾離心管(Millipore公司,截留分子量為10000Da)中,反復離心直到毒素蛋白濃縮達0.1mg·L-1以上,用生理鹽水4℃透析后作為標準抗原。將標準抗原與福氏不完全佐劑以1∶1混合充分乳化后,按腹腔注射法共4次免疫BALB/C小白鼠,每次免疫間隔3周。眼球采血法采血,獲得毒素的抗血清。
實施例2 毒素抗血清的鑒定將標準抗原用包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋后,取100μL加至酶標板的反應孔中37℃下孵育2h或4℃過夜后,用PBST洗板3次,然后加入300μL封閉緩沖液(含1%脫脂奶粉的PBST)37℃保溫1h,PBST洗板3次,每孔加入100μL用封閉緩沖液稀釋的抗血清于37℃下保溫1h,再用PBST洗板3次后,每孔加入100μL用封閉緩沖液稀釋6000倍的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗血清(IgG-AP)于37℃下保溫1h,再用PBST洗板3次后,每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色,最后加入50μL終止液(0.2mol·L-1EDTA)終止反應。在酶標儀上測出405nm處的OD值。按公式P/N=樣品平均OD405值/陰性對照平均OD405值計算ELISA檢測P/N值(positive/negative)。以P/N≥2判為陽性。
將毒素抗血清從1∶6400開始倍比稀釋至1∶819200,以免疫前的健康血清為陰性對照,按上述間接ELISA程序測定抗血清的效價。當毒素抗血清稀釋至1∶204800時,測定的OD405值與陰性對照OD值之比(P/N)>2,而當抗血清稀釋至1∶409600時,P/N<2,表明制備的毒素抗血清的效價為1∶204800。
將毒素抗原從2mg·L-1開始逐步稀釋至0.0039mg·L-1,按上述間接ELISA程序檢測靈敏度。以判為陽性的最大抗原稀釋倍數作為檢測靈敏度。當毒素抗原稀釋至7.81μg·L-1時,測定的OD405值與陰性對照OD值之比(P/N)>2,而當毒素抗原稀釋至3.91μg·L-1時,P/N<2。因此,建立的間接ELISA方法對毒素抗原的最低檢測量達7.81μg·L-1。
以建立的間接ELISA方法測定抗血清與棉花黃萎病菌菌株T9、02SY3、02XZH3、02GY3、02YD5、VD8、02NJ2、V151、02FN8、02DT6、02XY3和02CS3以及棉花立枯病菌、棉花紅腐病菌、小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌培養液的反應,以確定抗血清的特異性。結果如表1所示,棉花黃萎病菌的美國標準菌株T9以及從江蘇省各地采集的棉花黃萎病菌菌株的培養液均可與毒素抗血清發生陽性反應,而抗血清與非黃萎病菌的培養液的反應呈陰性。由此認為該抗血清對棉花黃萎病菌的培養液有較高的特異性,可用于毒素的檢測。
表1毒素抗血清特異性的測定

實施例3 培養濾液中毒素的測定將活化的菌株Bp2和T9分別接種于查彼克培養液中,25℃振蕩培養,分別在1、3、5、7、9、11d后取培養液,按上述間接ELISA程序測定培養液中的毒素,以未接菌的培養液為陰性對照。菌株Bp2、T9在培養1d后就可從培養液中檢測到毒素。在培養至3d后,OD405值已分別達到1.407、1.371,P/N值分別為9.05、8.82,并且在11d內,OD405值都保持較高的數值。表明所建立的間接ELISA方法能夠快速檢測棉花黃萎病菌培養液中的毒素。
實施例4 在棉子檢測上的應用對江蘇省植保站送檢的81份懷疑帶菌的棉子樣品進行測定。其程序為每份棉子樣品分別取100g置于網兜中,分開浸泡清洗。毛子用流水搓洗兩至三遍,藥物包衣的棉子反復搓洗至藥物包衣完全洗盡,然后將種子于陰涼處晾干。將晾干的每份棉子樣品平均分成五份分別加入150mL含有適量氯霉素的查彼克培養液中,25℃振蕩培養3d后取培養液5000r·min-1,離心30min后的上清液,按上述間接ELISA方法進行檢測,以菌株Bp2的毒素抗原為陽性對照,未接菌的培養液為陰性對照。結果表明62份包衣子中4份帶菌,17份毛子中8份帶菌,2份光子中沒有檢查出帶菌。在帶菌的棉子中,也并不是每個三角瓶中(含20g棉子)的培養液中都呈反應陽性,結果如表2所示。根據陳吉棣等的研究,病鈴內成熟種子的帶菌率為0.025%,本發明對于棉子攜帶黃萎病菌的檢測,采取每個樣品隨機取棉子100g,即1200粒左右,培養時平均置于5個三角瓶中培養,可能并不是每個三角瓶中都裝有攜帶有黃萎病菌的棉子,因此,間接ELISA檢測結果表現出有的三角瓶培養液呈陽性,有的呈陰性。目前棉子所用的包衣劑大多是針對苗病,而不是黃萎病,本發明從包衣子中檢測到棉花黃萎病菌,說明包衣還不能完全殺死黃萎病菌,包衣子并不是無菌子。但檢測結果也顯示出,經硫酸脫絨后的光子和包衣子,其黃萎病菌的帶菌率已經明顯低于毛子。
將間接ELISA檢測為陽性的棉子按照上述方法洗凈晾干后,每份各稱100g,分別裝入600mL含有適量氯霉素的PDB培養基中,陽性對照選用棉花黃萎病菌Bp2,25℃,150r·min-1,培養6d后,2000r·min-1離心10min取上清,用針刺接種的方法接種于2片真葉期的泗棉3號棉苗的莖基部。20d后劈桿調查發病率。本發明采用100g棉子置于同1個三角瓶中培養,用其培養液針刺接種棉苗,以驗證間接ELISA檢測結果的可靠性。結果表明12份間接ELISA檢測為陽性的棉子培養液針刺棉苗,都可使棉苗發病,表明本發明的研究結果可靠。
表2檢測出的帶菌棉子舉例

權利要求
1.一種棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法,其特征在于a、所述的棉子樣品應取1000粒以上置于網袋中,沒有經過藥物包衣的棉子,用流水搓洗,而經藥物包衣的棉子反復搓洗至藥物包衣完全洗盡,然后將棉子于陰涼處晾干。b、將晾干的棉子樣品加入含有適量抑制細菌生長的抗生素的查彼克培養液中,振蕩培養3d后取培養液5000r·min-1,離心30min后的上清液,作為待測棉子樣品的培養液,進行后序測試。
2.根據權利要求1所述的棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法,其特征在于a、將待測棉子樣品的培養液用包被液1∶1稀釋后,取100μL加至酶標板的反應孔中4℃過夜或37℃下孵育2h;并以標準抗原為陽性對照,空白培養液為陰性對照。b、取出酶標板,棄去包被液,用PBST洗板3次,甩干,并在每孔中加入300μL封閉液,37℃保溫1h;c、取出酶標板,棄去封閉液,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL用封閉液稀釋的抗血清,37℃下保溫1h;d、取出酶標板,棄去用封閉液稀釋的抗血清,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗(IgG-AP),于37℃下保溫1h;e、取出酶標板,棄去用封閉液稀釋的二抗,用PBST洗板3次,甩干,每孔加入100μL新配制的含1g·L-1對硝基苯磷酸鹽底物顯色液37℃下顯色;f、每孔加入50μL終止液終止反應。終止反應后,用吸水紙吸干酶標板底部,將酶標板置于酶標儀上,在405nm波長下,測定各孔的OD值。g、按公式P/N=樣品平均OD405值/陰性對照平均OD405值,計算ELISA檢測的P/N值。h、以P/N≥2判為陽性,認定該棉子樣品攜帶有黃萎病菌。
3.根據權利要求1或2所述的棉子攜帶黃萎病菌的檢測方法,其特征在于所述的標準抗原是用棉花黃萎病菌培養后獲得的毒素蛋白。所述的抗血清是用標準抗原免疫小鼠或新西蘭兔制成的多克隆抗體或單克隆抗體。
全文摘要
本發明涉及一種棉子攜帶黃萎病菌的免疫檢測方法,其特征在于取種子樣品1000粒以上置于網袋中,沒有經過藥物包衣的種子,用流水搓洗,而經藥物包衣的種子反復搓洗至藥物包衣完全洗盡后,將種子于陰涼處晾干。然后將晾干的種子樣品加入含有適量抑制細菌生長的抗生素的查彼克培養液中培養。將預先處理的種子樣品培養液與包被液等體積混合,溫育處理;洗板,加入封閉液,溫育;洗板,加入抗血清,溫育;洗板,加入堿性磷酸酶標記的二抗,溫育;洗板,加入底物液,溫育;加入終止液終止反應。在405nm波長下,測定各孔的OD值,并計算樣品平均OD
文檔編號G01N33/577GK1869634SQ200610085398
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月13日 優先權日2006年6月13日
發明者林玲, 周益軍, 顧本康 申請人:江蘇省農業科學院

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