專利名稱：細胞色素c分子自組裝納米有序復合結構組裝體及制備方法
技術領域：
本發明屬于生物納米電化學及電分析領域。涉及一種細胞色素C分子自組裝納米有序復合結構組裝體及制備方法，為研究細胞色素C等生物分子直接電化學提供一種理想的平臺。
背景技術：
細胞色素C在呼吸鏈中起著電子載體的作用，研究其在電極上的直接電化學，對于了解生命體內能量轉換和物質代謝具有重要的意義。然而，細胞色素C在裸固體電極上的電化學活性極差，這是由于細胞色素C的電活性集團深埋在多肽鏈內部，與電極表面距離較遠，很難與電極表面直接交換電子。利用氧化鋁、金納米粒子等電子傳遞促進劑修飾電極表面，可實現細胞色素C與電極之間直接快速的電子傳遞。
目前金納米粒子的制備方法通常先將重量百分含量為0.01％氯金酸水溶液50mL加熱至沸騰，然后加入重量百分含量為1％檸檬酸三鈉溶液0.5mL，繼續煮沸15分鐘后，冷卻至室溫于陰涼處保存備用。
現有技術存在的主要問題是金納米粒子不穩定，易團聚，一般只能保存15天左右，且用于制備金納米粒子的氯金酸試劑價格昂貴。
發明內容
本發明的目的是建立一種結構有序、生物活性好、制備簡單、價格低廉、穩定的細胞色素C分子自組裝納米有序復合結構組裝體及制備方法。
實現本發明目的的技術方案是一種用于修飾玻碳電極促進細胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復合結構組裝體，是利用自組裝技術，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，然后再與細胞色素C組裝成細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，該組裝體制備方法如下述將孔徑為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板浸入重量百分含量為1～2％的納米羥基磷灰石溶液中超聲1分鐘，暗處組裝4小時，取出后用二次蒸餾水清洗干凈，以除去弱吸附的羥基磷灰石，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組合體；再將此組裝體固定在處理好的玻碳電極(Φ＝3mm)表面上，并置于100μmol/L的細胞色素C溶液中暗處繼續組裝8小時，取出后，再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細胞色素C，得到所述的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體。
上述的一種用于修飾玻碳電極促進細胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復合結構組裝體，其所述制得的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，其細胞色素C平均表面含量為4.5×10-10～9.7×10-10mol·cm-2。
上述的γ-氧化鋁模板是用草酸-電解法制得以重量百分含量為99.99％的高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓40～80V，在重量百分含量為4％草酸溶液中電解4小時，利用反向電解法剝離氧化鋁模板，得到孔徑約為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板。
上述的納米羥基磷灰石用沉淀法制得超聲處理氫氧化鈣溶液，然后向其中滴加磷酸，其產物經陳化、過濾、干燥后，得到納米羥基磷灰石晶體。本發明與現有技術相比具有顯著的技術進步和明顯的效果將孔洞分布均勻有序，且大小可控、方便易得的納米γ-氧化鋁模板，與具有良好的生物相容性，無毒，對大部分人體蛋白具有親和性、制備簡單、價格低廉且能長期穩定儲存的納米羥基磷灰石粉末(克服了金納米粒子穩定性差的缺點)，和細胞色素C采用分子自組裝技術組裝成的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，具有生物活性好、制備簡單、價格低廉、穩定不易團聚，可以長期保存，具有良好的生物相容性，無毒，對大部分人體蛋白具有親和性。
圖1是細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體結構示意2是電化學測量裝置簡3是本發明細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾的玻碳電極、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米復合結構組裝體修飾的玻碳電極、細胞色素C修飾的玻碳電極，分別在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時的循環伏安曲線；其中，1-玻碳電極 2-細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體 3-細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾的玻碳電極、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾的玻碳電極或細胞色素C修飾的玻碳電極4-Ag/AgCl(飽和KCl)參比電極 5-對電極6-電解池 7-0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液8-電化學分析儀 9-細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾玻碳電極在0.2mol/LHAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時的循環伏安曲線10-細胞色素C修飾玻碳電極在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時的循環伏安曲線 11-γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾玻碳電極在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時的循環伏安曲線。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施方式
，對本發明作進一步描述實施例1(細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體的制備)(1)γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓40V，在4％草酸溶液中電解4小時，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約50nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，用超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產物經陳化24小時，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩定的標準循環伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約為50nm的微孔γ-氧化鋁模板，浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體；用熔融態石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上(見圖1)，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細胞色素C溶液中暗處繼續組裝8小時，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體2(見圖1)，其細胞色素C平均表面含量約為9.7×10-10mol·cm-2。
實施例2(細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體的制備)(1)納米γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備納米γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓80V，在4％草酸溶液中電解4小時，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約為200nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產物經陳化24小時，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩定的標準循環伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約為200nm的微孔γ-氧化鋁模板浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體；用熔融態石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細胞色素C溶液中暗處繼續組裝8小時，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體2(見圖1)，其細胞色素C平均表面含量為4.5×10-10mol·cm-2。
實施例3(細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體及其制備)(1)納米γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓60V，在4％草酸溶液中電解4小時，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約150nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產物經陳化24小時，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩定的標準循環伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約150nm的微孔γ-氧化鋁模板浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1.5wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體；用熔融態石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細胞色素C溶液中暗處繼續組裝8小時，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體2(見圖1)，其細胞色素C平均表面含量為7.8×10-10mol·cm-2。
實施例4(本發明細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合組裝體電化學性質研究)見圖2，采用傳統的三電極系統，以上述制得的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合組裝體修飾的玻碳電極為工作電極3，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極4，鉑絲為對電極5。將前述的各電極置于電解池6內的0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液7中，并分別與上海辰華儀器公司生產的CHI 660B電化學分析儀8的工作電極接口、參比電極接口、對電極接口連接。在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液7中，掃描速度為0.2Vs-1時測得各組裝體的循環伏安曲線。其實驗結果表明細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾玻碳電極3有一對穩定、對稱的氧化還原峰9，其氧化還原式電位[E0′＝(Epa+Epc)/2]為0.22V，為細胞色素C血紅素輔基中氧化還原活性中心Fe(III)/Fe(II)的氧化還原特征峰，而同樣條件下，細胞色素C修飾玻碳電極(即將玻碳電極浸入細胞色素C溶液中直接組裝)、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體修飾玻碳電極未發現任何氧化還原峰10、11(以上參見圖3)，表明γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體不僅保持細胞色素C生物活性不變，且對細胞色素C電子傳遞具有促進作用。
權利要求
1.一種用于修飾玻碳電極促進細胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復合結構組裝體，是利用自組裝技術，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，然后再與細胞色素C組裝成細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，該組裝體制備方法如下述將孔徑為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板浸入重量百分含量為1～2％的納米羥基磷灰石溶液中超聲1分鐘，暗處組裝4小時，取出后用二次蒸餾水清洗干凈，以除去弱吸附的羥基磷灰石，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組合體；再將此組裝體固定在處理好的玻碳電極(Φ＝3mm)表面上，并置于100μmol/L的細胞色素C溶液中暗處繼續組裝8小時，取出后，再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細胞色素C，得到所述的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體。
2.根據權利要求1所述的一種用于修飾玻碳電極促進細胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復合結構組裝體，其所述制得的細胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，其細胞色素C平均表面含量為4.5×10-10～9.7×10-10mol·cm-2。
全文摘要
本發明涉及細胞色素C分子自組裝納米有序復合結構組裝體及制法，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ－氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體(組裝體1)，然后與細胞色素C組裝，得到細胞色素C/γ－氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復合結構組裝體，其細胞色素C平均表面含量為4.5×10
文檔編號G01N27/36GK1940548SQ20061001722
公開日2007年4月4日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者秦玉華, 關曉輝, 孫墨杰, 楊迎軍, 魯敏 申請人:東北電力大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
