一種消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法胃蛋白酶原Ⅱ檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及醫學檢驗【技術領域】，特別是一種消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法血清胃蛋白酶原Ⅱ檢測試劑盒。本發明所述試劑盒組成包含：（1）胃蛋白酶原Ⅱ校準品；（2）預置乳糜消除劑的試劑1；（3）含抗人胃蛋白酶原Ⅱ單抗和多抗包被膠乳顆粒的試劑2。本法試劑盒通過膠乳凝集作用放大樣本中待測物質與試劑中特異性抗體的結合反應，在給定的波長下，反應形成的濁度與待測物質的含量成相關，以此計算待測物質的含量。本發明所述試劑盒用于檢測人血清中胃蛋白酶原Ⅱ的含量，靈敏度高、特異性好，可消除樣本中的乳糜干擾，操作簡便快捷，實用性強，適用范圍廣泛。
【專利說明】一種消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法胃蛋白酶原II檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬醫學檢驗【技術領域】，涉及一種消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法的血清胃蛋白酶原II檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體，是胃粘膜分泌的一種門冬氨酸蛋白酶前體，是分子量42000Da的單鏈多肽，在胃內轉變為具有活性的胃蛋白酶。
[0003]根據生化性質、免疫原性、細胞來源及組織內分布，胃蛋白酶原可分成胃蛋白酶原I (PG I )、胃蛋白酶原II (PG II)兩個亞群:其中I?5組分免疫原性近似，稱為PG I (PGA)，主要由胃底腺的主細胞和頸粘液細胞分泌；6?7組分被稱為PG II (PGC)，除由上述兩種細胞分泌外，幽門腺的黏液細胞、賁門腺以及十二指腸上段的Brunner腺也能產生PG II，胃粘膜合成的PG II約為總量的25%。
[0004]正常情況下，胃粘膜產生的胃蛋白酶原大部分進入胃腔，遇酸后肽鏈分解活化為胃蛋白酶，發揮其消化蛋白質的作用；小部分胃蛋白酶原則透過胃粘膜毛細血管進入血循環。血清胃蛋白酶原濃度可反映胃粘膜的分泌水平，不同胃蛋白酶原濃度水平也可反映不同部位胃粘膜的功能和形態變化。
[0005]胃蛋白酶原的檢測已列入日本老年保健法，應用該項目進行大面積的人群普查使得日本胃癌的早診率提高到90%，在日韓被稱為胃底腺粘膜的“血清學活檢”。
[0006]目前檢測血清胃蛋白酶原含量的方法主要有酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、化學發光法和膠乳免疫比濁法等。
[0007]ELISA方法精確、定量，具有很高的敏感性，但操作程序繁瑣，耗時長，不能適應大規模體檢篩查或急診的需要；RIA方法靈敏度高，特異性強，但放射免疫反應是競爭性的反應，測得的值是相對量而非絕對量，且存在輻射和放射性污染；化學發光法精確度高，檢測速度快，但成本高昂，對配套設施要求高，無法應用于廣大中、基層的醫院和醫療衛生機構；膠乳免疫比濁法具有操作簡便快速、自動化、定量準確、敏感度高等優點，可滿足門、急診和大規模體檢篩查等需要。
[0008]現有膠乳免疫比濁試劑，由于其檢測原理是測定反應形成的免疫復合物的濁度，因此極易受到乳糜干擾的影響。目前應對這個問題的方法，主要是使用專門的乳糜消除劑對樣本進行預處理。而在大規模的人群普查、健康體檢篩查和臨床病人檢驗時，經常會遇到大量的乳糜、溶血等渾濁樣本，此時通過購置樣本處理劑，對這些樣本進行單獨處理，將會極大地增加操作人員的工作量，提高運營成本，也為臨床檢驗的組織安排帶來難題。
[0009]因此，研制一種能夠消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法的胃蛋白酶原II檢測試劑盒，顯得十分必要。
【發明內容】
[0010]本發明為了克服上述現有技術缺陷，提供了 一種檢測人體血清中胃蛋白酶原II含量的試劑盒，不需要再對乳糜樣本進行單獨處理，節約了人力、資源，使用簡單、快速，靈敏度高，不僅能夠適應大規模人群普查的需求，也能滿足日常臨床快速、高通量檢查的要求，適合產業化，便于臨床推廣。本發明采取的技術方案是一種膠乳免疫比濁法胃蛋白酶原II檢測試劑盒，其組成包括:
[0011]試劑1，是一種為試劑盒提供適當反應環境、消除乳糜干擾、使抗原保持天然構象、并控制反應達到終點的時間和速率的試劑，包含電解質、乳糜消除劑、促凝劑、穩定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液；
[0012]試劑2，是一種含有抗人胃蛋白酶原II抗體包被膠乳顆粒的均一的乳白色液體，包含抗人胃蛋白酶原II抗體包被膠乳顆粒、防腐劑及緩沖液；
[0013]校準品，是添加不同濃度胃蛋白酶原II抗原的人血清基質緩沖液，用來與樣本比較進行結果計算，包含電解質、防腐劑、穩定劑、胃蛋白酶原II抗原、人血清及緩沖液。
[0014]所述電解質選自無機鹽，優選氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或硫酸鎂。
[0015]所述乳糜消除劑，選自脂肪酶或I?5%的聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂試劑。
[0016]所述促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖鈉。
[0017]所述穩定劑選自牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、魚皮明膠蛋白(Fishskingelatin)、山梨醇、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。
[0018]所述表面活性劑選自吐溫系列、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列。
[0019]所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、Proclin系列。
[0020]所述緩沖液選自Tris-HCl緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES-NaOH緩沖液、MOPSO緩沖液。
[0021]所述抗體為單克隆抗體與多克隆抗體的混合，單克隆抗體反應的特異性更強，但靈敏度受限，而添加少量的多克隆抗體則能夠提高反應的靈敏度。抗體種類選自IgG抗體或IgY抗體，抗體來源選自兔抗人、山羊抗人、綿羊抗人、鼠抗人、雞抗人、鴨抗人。
[0022]所述的膠乳顆粒為聚苯乙烯膠乳，直徑范圍為150?250nm。膠乳顆粒的表面修飾有功能團，通過該功能團再與抗體相結合，則可以減輕空間構型對共價鍵形成的阻礙，使得抗體更易交聯到膠乳顆粒上，抗體的活性更高，能夠顯著提高分析靈敏度。修飾的功能團可以選擇羧基、氨基、羥基、酰肼、氯甲基的一種。
[0023]本發明所用的包被抗體到膠乳顆粒表面的方法為化學交聯法，該方法是通過化學交聯劑在交聯緩沖液中進行的，所述的化學交聯劑選擇碳化亞胺(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)、酰肼、異氰酸酯中的一種，所述的交聯緩沖液選自不同氨基的緩沖液，MES、M0PS0、MOPS、HEPES緩沖液，pH在6.0?8.0之間。
[0024]所述胃蛋白酶原II檢測試劑盒試劑I中的緩沖液，要求其緩沖能力為調節pH在
7.0?9.0之間，可以選擇上述緩沖液其中一種，濃度范圍為10?lOOmmol/L。乳糜消除劑要求有較強的乳糜清除能力和一定的反應惰性，可以選擇上述乳糜消除劑其中一種，優選脂肪酶，濃度范圍5?50KU/L。電解質選自無機鹽類，可以維持溶液滲透壓，有利于保持溶液中蛋白質的穩定性，可以選擇上述電解質其中一種，優選氯化鈉，濃度范圍為1%?5%。促凝劑可以加快免疫反應速度，縮短檢測時間，可以選擇上述促凝劑其中一種，優選PEG-6000，濃度范圍為2%?6%。穩定劑可以提供良好穩定反應環境，使抗原保持天然構象，可以選擇上述穩定劑其中一種，優選BSA，濃度范圍是0.5%?5%。表面活性劑能夠在試劑2加入到反應體系時，迅速吸附到膠乳顆粒的表面，降低膠乳顆粒表面張力，使膠乳顆粒不易聚集，有效地提高膠乳顆粒在溶液中的分散性和穩定性，可以選擇上述表面活性劑其中一種，優選吐溫20，濃度范圍為0.1%?1.0%。再選擇添加上述防腐劑其中一種，濃度范圍為0.05% ?0.1%。
[0025]所述胃蛋白酶原II檢測試劑盒試劑2中的緩沖液，要求其緩沖能力為調節pH在
7.0?9.0之間，可以選擇上述緩沖液其中一種，濃度范圍為10?lOOmmol/L。抗人胃蛋白酶原II抗體，其中單抗/多抗的比值范圍在5?10,抗體種類選自IgG、IgY抗體,抗體來源可以選擇上述抗體其中一種，優選鴨抗人IgY抗體。膠乳顆粒表面修飾有功能團，可以選擇上述修飾的功能團其中一種，優選修飾羧基。化學交聯劑選擇上述化學交聯劑其中一種，優選EDAC，交聯緩沖液選擇上述交聯緩沖液其中一種，優選HEPES緩沖液，其致敏的抗體膠乳顆粒濃度范圍為0.5?5mg/ml。再選擇添加上述防腐劑其中一種，濃度范圍為0.05%?
0.1%。
[0026]所述胃蛋白酶原II檢測試劑盒校準品，包括含量在O?100ng/ml之間的PG II，其中PG II校準品水平I為不含PG II的人血清基質緩沖液，PG II校準品水平2、3、4為添加不同PG II含量的人血清基質緩沖液。緩沖液可以選擇上述緩沖液其中一種，濃度范圍為10?100mmol/L, pH為6.5?8.5，人血清比例為5%。所添加的PG II選擇來源于自人體體液提取、純化而得的天然PG II，或自十二指腸癌細胞株培養、純化而得的PG II，其純度>95% ；所添加的電解質選擇上述電解質其中一種，優選氯化鈉，濃度范圍為1%?5% ;所添加的穩定劑選擇上述穩定劑其中一種，濃度范圍為0.5?5% ;再選擇添加上述防腐劑其中一種，濃度范圍為0.01%?0.1%。
[0027]本發明中所述的百分比濃度，如未進行特殊說明，均為質量體積百分比濃度，SPIOOml溶液中所含溶質的克數。
[0028]本發明試劑盒，采用膠乳增強免疫比濁法定量檢測人血清中胃蛋白酶原II含量。其原理是:被測樣本中的胃蛋白酶原II與包被在膠乳顆粒上的抗人胃蛋白酶原II單克隆和多克隆抗體發生抗原抗體反應，形成的抗原-抗體-膠乳顆粒的復合物交織成網狀并發生凝集，導致濁度上升，保持反應體系中抗體過量時，檢測此濁度在700nm波長處的吸光度，對照校準曲線即可求出樣本中胃蛋白酶原II的含量。
[0029]與現有技術相比，本發明具有如下優點和效果:1、抗乳糜干擾能力強，不需要對樣本進行預處理，節約了人力、資源，能夠應用于大規模的體檢篩查和人群普查，有利于項目的廣泛開展；2、本發明試劑盒的靈敏度更高，檢測低濃度樣本的測值更加準確；3、本發明試劑盒與酶聯免疫法(ELISA)對臨床樣本進行對比檢測的數據分析，相關性良好，臨床意義顯著；4、檢測手段簡單，對醫療設施要求不高，能應用于各種全自動、半自動生化分析儀。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為采用本發明實施例1制備的4個不同梯度，濃度分別為0、20、40、80ng/ml的胃蛋白酶原II校準品，在日立7080全自動生化分析儀上，繪制出本發明PG II校準品的標準曲線。其中X軸表示胃蛋白酶原II的含量(ng/ml) ;￥軸表示吸光度。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]一、消除乳糜干擾的胃蛋白酶原II檢測試劑盒的制備
[0033]試劑I的制備:在50mmol/L、pH7.5的甘氨酸-NaOH緩沖液中，添加20KU/L的脂肪酶、1.2%氯化鈉、0.3%吐溫 20,5% PEG-6000,0.5% BSA,0.05% Proclin300，攪拌均勻調節pH至8.0,即得到消除乳糜干擾的胃蛋白酶原II檢測試劑盒試劑I。
[0034]試劑2的制備:
[0035](I)抗體交聯:將0.5mg單抗/多抗比值為5:1的混合鴨抗人胃蛋白酶原II IgY抗體用5ml20mmol/L的HEPES-NaOH緩沖液稀釋后，加入表面修飾羧基、直徑150nm的聚苯乙烯膠乳溶液，再加入1.5mg EDAC，在37°C條件下反應8h，加入0.5mll00mmol/L的Tris-HCl緩沖液攪拌Ih后終止反應；
[0036](2)膠乳清洗:離心去除上清以清除多余的抗體、交聯劑及交聯反應的副產物等， 底部沉淀即為包被好的膠乳。用20ml50mmol/L、pH8.0的甘氨酸-NaOH緩沖液洗滌3
次；
[0037](3)膠乳懸浮:將20ml同樣的甘氨酸-NaOH緩沖液加入到上述沉淀，超聲波處理5min，混勻得均一的乳白色膠乳懸浮液，使致敏的抗體膠乳顆粒濃度為2mg/ml，再添加0.05%的Proclin300，即得到消除乳糜干擾的胃蛋白酶原II檢測試劑盒試劑2。
[0038]胃蛋白酶原II校準品的制備:在pH6.8、含有20mmol/L Tris-HCl緩沖物的預處理人血清基質緩沖液中，人血清比例為5%，加入濃度分別為0、20、40、80ng/ml自人體體液提取、純化而得的，純度>95%的胃蛋白酶原II抗原，攪拌均勻，作為胃蛋白酶原II多點校準品。此外，預處理的人血清基質緩沖液中還包含2.5%氯化鈉、0.8% EDTA、0.02%Proclin300o
[0039]二、消除乳糜干擾的胃蛋白酶原II檢測試劑盒檢測樣本的方法
[0040]檢測方法及實驗參數如下:
[0041]分析方法:兩點終點法；
[0042]試劑的用量:試劑I和試劑2用量分別為160 μ I和30 μ I ;
[0043]樣本的用量:6μ1;
[0044]檢測波長:700nm。
[0045]檢測步驟:160 μ I試劑I加入6 μ I樣本，于37。。5min后加入30 μ I試劑2后開始讀點，反應5min后讀取另一點，得到吸光度的差值。
[0046]繪制本實施例制備的胃蛋白酶原II檢測試劑盒校準品的標準曲線:
[0047]采用本實施例制備的4種不同含量，分別為0、20、40、80ng/ml的胃蛋白酶原II校準品，在日立7080全自動生化分析儀上，按照上述檢測步驟測得本發明PG II校準品的標準曲線(如圖1所示)。圖1中曲線上的每個點代表一個含量的校準品。其中X軸表示胃蛋白酶原II的含量(ng/ml) ;￥軸表示吸光度。
[0048]取待測樣本，同樣按照上述檢測步驟檢測樣本的吸光度差值，代入校準曲線，即可計算出待測樣本中胃蛋白酶原II的含量。如果樣本中胃蛋白酶原II的濃度超出校準曲線范圍，為了保證檢測的準確性，需要對樣本進行適當稀釋后再進行檢測。
[0049]三、消除乳糜干擾的胃蛋白酶原II檢測試劑盒的抗乳糜干擾能力
[0050]按照如下的操作方法檢測胃蛋白酶原II檢測試劑盒的抗乳糜干擾性能:
[0051](I)收集較低范圍的測值相近的無溶血、黃疸、乳糜、渾濁現象的人血清樣本，進行混合，對該混合人血清樣本進行測定，得到其胃蛋白酶原II的值為8.6ng/ml ；
[0052](2)按照下表1、表2所示，在混合人血清中添加不同濃度梯度的乳糜干擾物；
[0053]( 3 )分別使用某廠家免疫比濁法胃蛋白酶原II檢測試劑盒(本試驗中，簡稱試劑盒A)和本實施例制備的PG II檢測試劑盒(本試驗中，簡稱試劑盒B)，對添加了不同乳糜單位濃度的血清樣本進行對照測定，重復3遍，計算均值、CV和偏差，偏差范圍在土 10%以內視為無干擾，偏差范圍超過±10%視為干擾。
[0054]表1試劑盒A檢測添加不同濃度乳糜干擾物血清樣本的結果
【權利要求】
1.一種膠乳免疫比濁法檢測血清胃蛋白酶原II的檢測試劑盒，其特征在于，包含試劑1、試劑2和校準品； 所述試劑I包括電解質、乳糜消除劑、促凝劑、穩定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液； 所述試劑2包含抗人胃蛋白酶原II抗體包被的膠乳顆粒、防腐劑及緩沖液； 所述校準品包含電解質、防腐劑、穩定劑、胃蛋白酶原II抗原、人血清及緩沖液； 所述電解質選自無機鹽； 所述乳糜消除劑，選自脂肪酶或I~5%的聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂試劑； 所述促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖鈉； 所述穩定劑選自牛血清白蛋白、酪蛋白、魚皮明膠蛋白、山梨醇或乙二胺四乙酸二鈉；所述表面活性劑選自吐溫系列、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列； 所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、Proclin系列；所述緩沖液選自Tris-HCl緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES-NaOH緩沖液、MOPSO緩沖液； 所述抗人胃蛋白酶原II抗體為單克隆抗體與多克隆抗體的混合，其中單抗/多抗的比值范圍為5~10，抗體種類選自IgG抗體或IgY抗體； 所述的膠乳顆粒為聚苯乙烯膠乳，直徑范圍為150~250nm，膠乳顆粒的表面修飾有功能團，修飾的功能團選自羧基·、氨基、羥基、酰肼或氯甲基；抗人胃蛋白酶原II抗體通過化學交聯法包被到膠乳顆粒表面，化學交聯劑選擇碳化亞胺(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)、酰肼、異氰酸酯中的一種；交聯緩沖液選自MES、MOPSO, MOPS、HEPES 緩沖液，pH 在 6.0 ~8.0 之間。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述電解質選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或硫酸鎂； 所述抗人胃蛋白酶原II抗體選自兔抗人、山羊抗人、綿羊抗人、鼠抗人、雞抗人、鴨抗人。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑I中，緩沖液緩沖能力為調節pH在7.0~9.0之間，濃度范圍為10~lOOmmol/L ;乳糜消除劑為脂肪酶，濃度范圍5~50KU/L;電解質為氯化鈉，濃度范圍為;促凝劑為PEG-6000，濃度范圍為2%~6% ;穩定劑為牛血清蛋白，濃度范圍是0.5%~5% ;表面活性劑為吐溫20，濃度范圍為0.1%~1.0% ;防腐劑濃度范圍為0.05%~0.1%。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑2中，緩沖液緩沖能力為調節pH在7.0~9.0之間，濃度范圍為10~lOOmmol/L ;抗人胃蛋白酶原II抗體為鴨抗人IgY抗體；膠乳顆粒表面修飾羧基，化學交聯劑為碳化亞胺，交聯緩沖液為HEPES緩沖液，其致敏的抗體膠乳顆粒濃度范圍為0.5~5mg/ml ;防腐劑濃度范圍為0.05%~0.1%。
5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述校準品中，胃蛋白酶原II抗原來源于自人體體液提取、純化而得的天然胃蛋白酶原II抗原，或自十二指腸癌細胞株培養、純化而得的胃蛋白酶原II抗原，其純度> 95%，含量為O~100ng/ml ;人血清比例為5% ;緩沖液的濃度范圍為10~lOOmmol/L，pH為6.5~8.5 ;電解質為氯化鈉，濃度范圍為1%~5% ;穩定劑的濃度范圍為0.5~5% ;防腐劑的濃度范圍為0.01%~0.1%。
6.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑2中，緩沖液緩沖能力為調節pH在7.0~9.0之間，濃度范圍為10~lOOmmol/L ;抗人胃蛋白酶原II抗體為鴨抗人IgY抗體；膠乳顆粒表面修飾羧基，化學交聯劑為碳化亞胺，交聯緩沖液為HEPES緩沖液，其致敏的抗體膠乳顆粒濃度范圍為0.5~5mg/ml ;防腐劑濃度范圍為0.05%~0.1%。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述校準品中，胃蛋白酶原II抗原來源于自人體體液提取、純化而得的天然胃蛋白酶原II抗原，或自十二指腸癌細胞株培養、純化而得的胃蛋白酶原II抗原，其純度> 95%，含量為O~100ng/ml ;人血清比例為5% ;緩沖液的濃度范圍為10~lOOmmol/L，pH為6.5~8.5 ;電解質為氯化鈉，濃度范圍為1%~5% ；穩定劑的濃度范圍為0.5~5% ;防腐劑的濃度范圍為0.01%~0.1%。
【文檔編號】G01N33/68GK103713140SQ201410010900
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】李雪, 白春洋, 歐陽卓君 申請人:北京萬泰德瑞診斷技術有限公司
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