專利名稱：一種檢測微囊藻毒素mc－lr的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法
技術領域：
一種檢測微囊藻毒素MC-LR的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，用于自然環境中水體、飲用水和藻類制品中微囊藻毒素(簡稱MC-LR)含量的檢測。
背景技術：
藻毒素(Microcystins，簡稱MCYST或MC)已成為環境水體中被普遍關注的污染物之一，中國科學院《2002年科學發展報告》中專門論述了淡水中“水華”造成的最大危害是飲用水源受到威脅。藻毒素通過食物鏈影響人類的健康，藍藻“水華”的次生代謝產物MC能損害肝臟，具有促癌效應，直接威脅人類的健康和生存。100多年來，藻毒素引起的人畜中毒事件引起了世界范圍內的關注，加拿大，英國，美國，澳大利亞，南非等國都有報道。我國環境白皮書公布的《環境問題的現狀資料》中資料十達賚湖“禍水”揭秘，指出近30年來達賚湖地區的人畜中毒死亡事件都是“微囊藻毒素”引起的。國內外許多文獻都報道了藻毒素與原發性肝癌的相關性。
由于目前缺乏防止藻類“水華”發生的有效措施，因此要預防和消除藻毒素對人畜的危害，監測和控制藻毒素在飲用水中的限量是行之有效的方法。國家《生活飲用水水質衛生規范》中規定MC-LR的限值為0.001mg/L，而要保證飲用水中藻毒素的限值，建立快速，靈敏的藻毒素分析方法至關重要。
藻毒素是一種七肽，為單環結構，1位是D-丙氨酸，2，4位是可變的左旋氨基酸基團，6位是γ連接的D-氨基酸，3位是特殊的氨基酸β連接的D-紅細胞-β-甲基天門冬氨酸(MeAsp)，5位是(2S，3S，8S，9S)-3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)，7位是N-甲基脫氫丙氨酸(Mdha)，整個結構可寫作(-D-Ala-L-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha-)。不同種類的MC的化學組成主要區別在于2，4位的2種左旋氨基酸的不同和MeAsp、Mdha基團的甲基化或去甲基化。2，4位氨基酸也是不同亞型的藻毒素的命名依據，最常見的是MC-LR，其中L代表亮氨酸、R代表精氨酸，因此，分析方法的研究也主要針對MC-LR來建立的。
目前，國內外檢測MC-LR的方法有以下幾類。(一)化學分析法包括薄層色譜法(TLC)，液相色譜法(LC)，液-質聯用法(HPLC-MS)，毛細管電泳法(CE)以及示差脈沖極譜法。(二)生物法包括生物鑒定法、微毒素檢測法和蛋白磷酸(PP1/PP2)抑制法。(三)免疫化學法，包括放射免疫法(RIA)，間接競爭酶聯免疫法(idc-ELISA)，直接競爭酶聯免疫法(dc-ELISA)，夾心免疫法(Sandwich-ELISA)。在國內應用較廣泛的是高效液相色譜法，最低檢測濃度為0.01μg/mL。酶聯免疫分析法(ELISA)，由于其特異性強，靈敏度高，操作簡便，不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。盡管如此，國內在MC-LR的ELISA方法到試劑盒的轉化中技術不成熟，檢測的靈敏度和試劑的穩定性還無法達到要求，致使無法實際應用，所以目前為止沒有一個國產的MC-LR的ELISA試劑盒面市。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測微囊藻毒素MC-LR的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于自然環境中水體、飲用水和藻類制品中微囊藻毒素(MC-LR)含量的檢測。
本發明的技術方案該檢測MC-LR的試劑盒是由1、96或48孔或24孔包被板，2、微囊藻毒素MC-LR標準品，3、微囊藻毒素MC-LR的抗體凍干品，4、酶標記的羊抗兔抗體凍干品，5、洗滌液，6、顯色液A，7、顯色液B和8、終止液所組成。
包被板包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將微囊藻毒素-牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)稀釋至10mg/L做為包被液，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加200μl含3g/L BSA的上述Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
微囊藻毒素標準品從MC-LR純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，共6瓶，MC-LR濃度分別為0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml。
本發明主要采用酶聯免疫分析法(ELISA)來檢測MC-LR。采用ELISA的技術主要有兩個方面特異性多克隆抗體的制備，利用抗原免疫家兔，獲得含有抗體的血清，經過生化提純分離免疫球蛋白；第二，MC-LR的ELISA試劑盒的制備。
微囊藻毒素的抗體凍干品，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合1mg微囊藻毒素-匙孔血藍蛋白，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μl制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔身上多位點地進行皮下注射，在免疫3～4次后，可進行鑒定，血清合格后稀釋、分裝、凍干備用。
測定方法為測定的基礎是標記免疫反應。取包被有MC-BSA的微孔包被板，加入MC-LR標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入MC-LR抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。
其操作為取包被有MC-BSA的微孔包被板，加入50μl的MC-LR標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μl抗MC-LR抗體，37℃孵育1小時，洗滌液洗三次，加100μl辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔抗體，37℃孵育1小時，用洗滌液洗六次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液，在450nm處測其吸光度值，從標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。
本發明的有益效果該試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.25ng/ml。
圖1檢測微囊藻毒素的試劑盒示意圖。1、96或48或24孔包被板，2、微囊藻毒素標準品，3、微囊藻毒素的抗體凍干品，4、酶標記的羊抗兔抗體凍干品，5、洗滌液，6、顯色液A，7、顯色液B，8、終止液。
圖2微囊藻毒素MC-LR標準曲線圖具體實施方式
實施例1制備試劑盒和檢測水樣MC-LR是典型的半抗原，故在免疫反應中具有反應原性，但需與大分子物質結合后才有免疫原性，MC-LR中的羧基為活性基團，可與蛋白質的氨基結合。因此可用碳二亞胺法，使MC-LR與大分子蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)結合，以合成的MC-LR-KLH作為人工合成的免疫抗原進行動物免疫。
MC-LR-KLH抗原的制備1、用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解1-2mg MC-LR；2、用1ml的0.13mol/L NaHCO3偶聯緩沖液溶解1-2mg KLH載體蛋白；3、取0.4-0.8mg MC-LR的溶液加到KLH的溶液中；4、溶解2-4mg碳二亞胺(EDC)于1mL雙蒸水，并取50-100μL加入到上述混合液中，室溫作用2小時(避光)；5、離心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分離，進行紫外掃描檢測。
多克隆微囊藻毒素抗體凍干品的制備1.選取4周大的，體重約1.5Kg的健康新西蘭大白兔。MC-LR是一種半抗原，將MC-LR和KLH相連接作為抗原。
2.油包水抗原乳化劑的制備用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合2mgMC-LR-KLH，用勻漿器混合2小時。將制好的乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，以油滴狀態能完整地停留在水面上，而不擴散，表明是穩定的。
3.免疫兔子及抽血先將兔子背部的毛小心剪去，然后取600μL制備好的油包水抗原乳化劑，多位點地進行皮下注射，使抗原能緩慢擴散，每隔1～2周免疫一次，共需六次，在免疫3～4次后，從兔子的耳緣靜脈抽血約1ml，離心10min后，得血清可進行鑒定。合格后稀釋至適當濃度，按需分裝，凍干備用，即為抗MC-LR抗體凍干品。
包被板固相抗原制備將MC-LR-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，96(或48或24)孔微孔板各孔加100μL，4℃放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加200μl含1g/L卵清蛋白(OVA)的上述Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，4℃放置過夜。棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
試劑的配制(1)標準微囊藻毒素(MC-LR)(0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml，)，從MC-LR純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水。
(2)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體凍干品(HRP-羊抗兔抗體)市售，珠海百奧生物科技有限公司生產。
(3)洗滌液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.4。
(4)顯色液A的配制0.2MNa2HPO425.7ml，0.1M檸檬酸24.3ml，50ml30％H2O2。
(5)顯色液B的配制稱取5mg四甲基聯苯二胺(TMB)加入2.5ml無水乙醇中，可加熱至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
(6)終止液2mol/L的H2SO4以48孔測試盒為例，每一個盒中的試劑足夠進行48個測量，盒中的材料如下(1)1×48孔板(4條×12孔，可以拆分為單孔)包被有MC-LR-BSA。
(2)6×MC-LR標準液，1.0ml/瓶，標準液濃度為0，0.25，0.5，1，2，4ng/ml。
(3)1×MC-LR抗體凍干品，用時3ml去離子水溶解。
(4)1×HRP-羊抗兔抗體凍干品，用時8ml去離子水溶解。
(5)1×洗滌液20ml，用時以去離子水1∶15稀釋。
(6)1×顯色液A4.5ml。
(7)1×顯色液B4.5ml。
(8)1×終止液4.5ml實驗室應自備的試劑蒸餾水或去離子水。
測定之前注意事項1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30℃)。
2.使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3.如果樣品量大建議使用多通道移液器。
4.在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。
5.取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8℃。
具體檢測步驟如下先將樣品進行處理將太湖水樣1000g高速離心20min，取上清為待測樣液。，取MC-LR-BSA板條，加入50μl的MC-LR標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加MC-LR抗體50μl，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37℃孵育1小時，洗滌液洗三次，加HRP-羊抗兔抗體100μl，37℃孵育1小時，用洗滌液洗三次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液，在450nm處測量吸光度，從標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。見表1，該例的樣品中MC-LR的含量為0.31ng/ml。
表1
實施例2，試劑盒提供的試劑與實施例1相同，用于檢測藻制品。
具體檢測步驟如下先將藻制品進行處理將藻制品樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入25ml 0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取1ml濾液用9ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。
取MC-LR-BSA板條，加入50μl的MC-LR標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加MC-LR抗體50μl，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37℃孵育1小時，洗滌液洗三次，加HRP-羊抗兔抗體100μl，37℃孵育1小時，用洗滌液洗三次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液，在450nm處測量吸光度，從標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。見表2，該例的樣品中MC-LR的含量為190ng/g。
表2
權利要求
1.一種檢測微囊藻毒素MC-LR的酶聯免疫分析試劑盒，其特征是由96或48或24孔包被板(1)，微囊藻毒素標準品(2)，抗微囊藻毒素的抗體凍干品(3)，酶標記的羊抗兔抗體凍干品(4)，洗滌液(5)，顯色液A(6)，顯色液B(7)和終止液(8)所組成；所述的酶標記的羊抗兔抗體凍干品為辣根過氧化物酶-羊抗兔抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫和NaN3的磷酸鹽緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，終止液為硫酸溶液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將微囊藻毒素-牛血清白蛋白稀釋至10mg/L做為包被液，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加200μl含3g/L牛血清白蛋白的上述Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的微囊藻毒素標準品(2)，從MC-LR純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，共6瓶，MC-LR濃度分別為0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的微囊藻毒素的抗體凍干品(3)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合1mg微囊藻毒素-匙孔血藍蛋白，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μl制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔身上多位點地進行皮下注射，在免疫3～4次后，可進行鑒定，血清合格后稀釋、分裝、凍干備用。
5.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測微囊藻毒素的方法，其特征是取包被有微囊藻毒素-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入MC-LR標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入MC-LR抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。
6.根據權利要求5所述的檢測微囊藻毒素的方法，其操作為取包被有微囊藻毒素-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入50μl的MC-LR標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μl抗MC-LR抗體，37℃孵育1小時，洗滌液洗三次，加100μl辣根過氧化物酶-羊抗兔抗體，37℃孵育1小時，用洗滌液洗六次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，暗處靜置15分鐘后加終止液，在450nm處測其吸光度值，從標準曲線計算樣品中的MC-LR含量。
7.根據權利要求6所述的檢測微囊藻毒素的方法，其中的樣品水樣處理10000g高速離心30min，取上清液為待測樣品；或者用0.22um超濾膜過濾，濾液為待測樣液。
全文摘要
一種檢測微囊藻毒素MC－LR的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，用于對水體、飲用水和藻類制品中微囊藻毒素(MC－LR)含量的檢測。本試劑盒測定的基礎是標記免疫反應，微孔板包被有MC－LR－BSA，加入MC－LR標準或樣品，再加入MC－LR抗體。游離的MC－LR與微孔板上的MC－LR－BSA競爭MC－LR抗體，沒有連接的MC－LR抗體被洗滌除去，加入HRP－羊抗兔抗體，標記免疫反應后沒有連接的HRP－羊抗兔抗體被洗滌除去。加顯色液、終止液后，用酶標儀測定其吸光度，吸光度的值與樣品中的MC－LR濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中MC－LR的含量。本試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.25ng/ml。
文檔編號G01N21/25GK1932519SQ20061004145
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月5日 優先權日2006年9月5日
發明者趙曉聯, 孫蔚榕, 陸茂林, 趙春城, 龔燕, 蔡建榮, 張東升, 蔡正森, 時瑾, 沈雯琰 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
