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專利名稱：抗呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞體病毒(RSV)的單克隆IgA抗體及其在治療和診斷上的應用。
RSV以可預見的一年一度的爆發(fā)出現(xiàn)。早在1940年代初，就已注意到嬰幼兒下呼吸道疾病的一年一次的爆發(fā)(Adams，J.Pediatr20405-420，1941)。1956年發(fā)現(xiàn)RSV后，即刻將其與這些疾病爆發(fā)的主要原因相聯(lián)系(Morris et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.92544-549，1956；Chanock et al.，Am.J.Hyg.，66281-290，1957)。RSV感染成人以及未成年人，且主要在嬰幼兒、患有肺或心疾病的兒童、免疫受損者和老人中引起嚴重的下呼吸道疾病(Mac-Intosh et al.，Virology(Fields和Knipe編著)1045-1074，1990)。RSV感染與40％至50％的患細支氣管炎而住院的兒童和25％的患肺炎的兒童有關(guān)(Heilman，J.Infect.Dis.161402-406，1990)。1993需要住院的病例數(shù)目估計為91,000，花費大約300,000,000美元(Heilman，J.Infect.Dis.161402-406，1990)。醫(yī)院中此病毒的蔓延是特別嚴重的問題。當RSV感染在醫(yī)院出現(xiàn)時，20％至45％的嬰兒可能獲得醫(yī)院RSV感染(Graman et al.，Infect.Dis，Clin.N.Amer.3815，1989)。早產(chǎn)嬰兒和因心或肺疾病住院的患者由此處于感染下呼吸道疾病的極度危險中。在一項患先天性心疾病的兒童的研究中，21％的RSV感染是在醫(yī)院獲得的(Graman et al.，In-fect.Dis.Clin.N.Amer.3815，1989)。
目前，尚未研制出抗RSV的有效疫菌。作為保護高?；颊?，特別是未成年人的活性疫苗的替代方法是，在已知的暴發(fā)期被動施用抗體來保護這些孩子。用具有抗RSV活性的免疫球蛋白(IgG)靜脈注射已在臨床上進行測試(Hemming et al.，Antimicrob.AgentsChemother.311882-1886，1987；Groothuis et al.，Antimi-crob.Agents Chemother.351469-1473，1991)。雖然靜脈注射IgG可預防下呼吸道疾病，結(jié)果表明需要大劑量的此物質(zhì)。這種治療不無潛在的不利影響，包括容量過載和循環(huán)問題。
人體中，上氣路感染通常先于下呼吸道感染(McIntosh et al.，in Virology(Fields和Knipe編)，1045-1074，1990)。傳染方式的研究顯示，該病毒是經(jīng)污染物和鼻或眼的自接種而非經(jīng)懸浮物傳播的，表明感染不是于下呼吸道開始的(Hall et al.，J.Pediatr.，99100-103，1981)。病毒感染一般限于呼吸道上皮組織，細胞對細胞擴散或許是經(jīng)分泌和細胞-細胞融合(McIntosh et al.，inVirology(Fields和Knipe編)，1045-1074，1990)進行的。融合的細胞可以從染病患者的肺吸出物中找到(McIntosh et al.，inVirology(Fields和Knipe編)，1045-1074，1990)，但致病或病毒傳播中合胞體形成的重要性尚不知曉。
目前的預防RSV感染的方法沒有一種是將注意力集中于防止上呼吸道感染這一起始階段的。呼吸道這部分中的自然免疫是由鼻分泌物中的IgA抗體介導的。
對RSV感染的免疫應答是短暫的。這使得成年人和兒童出現(xiàn)重復感染。在一項成人激發(fā)試驗研究中，40％的受試者可由相同的激發(fā)菌株在26個月的時期里感染3次(Hall et al.，J.Infect.Dis.163693-698，1991)。多達75％的第一次RSV暴發(fā)期間感染的兒童在其第二次暴發(fā)中再次感染(Glenzen et al.，Am.J.Dis.Child.140543-546，1986)，雖然初次感染后不常出現(xiàn)重病癥。當循環(huán)系統(tǒng)抗RSV抗體有足夠量存在時，可以是保護性的，但確定其重要性仍有因難。在動物中，非腸道施用的人IgG或特異性的單克隆抗體可以不使此病毒在肺中復制(Walsh et al.，Infect.Immun.43756-758，1984；Taylor et al.，Immunology 52131-142，1984；Prince et al，Pediatr.Infect.Dis.5S201-S203 1986；Tempest et al.，Biotechnology 9266-271，1991)。循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)高含量的抗RSV抗體主要保護下呼吸道(Walsh et al.，Infect.Immun.43756-758，1984)。然而，保護免受RSV侵染的分泌抗體的作用尚未搞清，但顯現(xiàn)出它可能是上氣路免疫力的重要介導物。在用RSV進行激發(fā)試驗的成年自愿者中，鼻分泌物中的中和抗體的滴度與病毒排出減少和針對該疾病的保護作用相關(guān)(Mills et al.，J.Immunol.107123-130，1971；Watt et al.，Vaccine 8231-236，1990)。未成人鼻分泌物中病毒排出的減少也與抗RSV分泌IgA(sIgA)的出現(xiàn)有關(guān)(McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978)。然而，并非所用的鼻分泌物的中和活性來源于抗體(McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978)。鼻抗RSV抗體的水平與保護不受感染或沒有重病癥之間的相關(guān)性尚未在嬰兒中得到證實(Hall et al.，J.Infect.Dis.163693-698，1991；McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978；Scott et al.，J.Hyg.(Camb)68581-588，1970；Bruhn et al.，Am.J.Dis.Child.131145-148，1977； Kaul et al.，Am.J.Dis.Child.1351013-1016，1981)，但在動物中，粘膜免疫可保護不受鼻感染(Reuman et al.，J.Med.Virol.3267-72，1990；Kanesaki et al.，J.Virol.65657-63，1991)。
RSV是一種有被膜的負鏈RNA病毒，屬于副粘液病毒(Paramyxo-viridae)科的肺病毒(Pneumovirus)屬(Fenner，Virology 71371-378，1975；Huang et al.，J.Virol.43，1982)。兩個糖蛋白(90 KD和68 KD)暴露于病毒粒子表面。90KD的高度糖基化的G蛋白負責將病毒顆粒結(jié)合到靶細胞上(Walsh et al.，J.Gen.Virol.65761-767，1984)。68 KD F蛋白介導病毒被膜與細胞膜融合和合胞體形成(Walsh et al.，J.Gen.Virol.66409-415，1985)。上面所述的F和G表面糖蛋白好象是主要的保護性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有較小的保護性活性。中和和抑制融合單克隆抗體業(yè)已被確定在F糖蛋白的特定區(qū)域(Walsh et al.，Infect，Immun.43756-758，1984；Trudel et al.，J.Gen.Virol.682273-80，1987；Beeler et al.，J.Virol.632941-50，1989；Lopezet al.，J.Virol.64927-30，1990；Paradiso et al.，Vaccine9231-7，1991)。抗G糖蛋白的單克隆抗體比抗F糖蛋白的單抗隆抗體不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性(Norrby et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846572-6576，1987；Garcia-Barreno et al.，J.Virol.63925-932，1989；Walsh et al.，J.Gen.Virol.702953-2961，1989)。F糖蛋白的氨基酸順序在與人感染有關(guān)的RSV亞組間有大約90％的保守性(Toms，F(xiàn)EMS Micro-biol.Immunol.76243-256，1991)。保守的抗原決定簇包括一些介導中和和融合抑制的抗原決定簇(Tempest et al.，Biotech-nology 9266-271，1991；Toms，F(xiàn)EMS Microbiol.Immunol.76243-256，1991)。主要引起亞組A和B間差別的G糖蛋白在兩亞組間只有53％的保守性(Johnson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845625-5629，1987)。用表達N或M2的重組疫苗病毒免疫在小鼠中誘導出小的保護性應答(King et al.，J.Virol.612885-2890，1987；Connors et al.，J.Virol.651634-7，1991)。此應答主要歸因于CTL活性，因為當被動地給小鼠施用抗N單克隆抗體時不具有保護性(Taylor et al.，Immunology 52137-142，1984)。再則，N業(yè)已顯示在小鼠和人中是CTL的靶標(King et al.，J.Virol.612885-2890，1987)。
一種由福爾馬林滅活、明礬吸收的RSV組成的早期的疫苗，在臨床試驗中誘導出中和和固定補體的血清抗體。然而，接種疫苗的兒童并未受到保護，并且在隨后自然感染中患更嚴重的下呼吸道疾病(Kapikian et al.，Am.J.Epidemiol 89405-421，1969)。加重疾病的原因尚未得到完全解釋。用福爾馬林滅活的RSV免疫的棉鼠形成相似的病理應答(Prince et al.，J.Virol，57721-728，1986)，提供了一種測試新疫苗安全性的方法。
過去人們將努力集中在開發(fā)減毒的活病毒疫苗上。目前，發(fā)現(xiàn)這些疫苗沒有效果(Belshe et al.，J.Infect.Dis.145311-319，1982)，未充分減毒(Wright，J.Pediatr.88931-939，1976)，或遺傳上不穩(wěn)定(McIntosh et al.，Pediatr.Res.8689-696，1974；Hodes et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974)。最近人們將努力集中在RSV表面糖蛋白F和G上。用純F糖蛋白免疫在棉鼠中已顯示出有效性，目前已應用于臨床試驗(Walsh，J.Infect.Dis.1551198-1024，1987；Routledge，J.Gen.Virol.69293-303，1988；Murphy，Vaccine 8496-502，1990)。然而，一些F糖蛋白制劑業(yè)已顯示當棉鼠隨后RSV感染時引起加重的肺病(Murphy，Vaccine 8497-502，1990)。將產(chǎn)生于桿狀病毒表達體系中的重組嵌合體FG糖蛋白非腸道給藥時，在棉鼠中誘導出保護性免疫應答(Brideau et al.，J.Virol.702637-44，1989)。與單獨用F糖蛋白一樣，該FG疫苗也顯示引起一些加重的肺病(Wathen et al.，J.Infect.Dis.163477-82，1991；Connors et al.，Vaccine 10475-484，1992)。表達F、G或M2被膜蛋白、或核蛋白N的重組疫苗病毒業(yè)已在幾個動物模型中測試。F和G重組物已顯示最有希望，它們在小鼠(Scott et al.，J.Virol.60607-613，1986；Olmsted et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986)，棉鼠(Elango et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 831906-1910，1986)，和鷹面猴(Olmsted etal.，Vaccine 6519-524，1988)誘導出保護性免疫。然而，在黑猩猩中應答顯著偏低(Collins et al.，Vaccine 8164-8，1990)。將腺病毒用作表達RSV F糖蛋白的載體也作了試驗(Hsu et al.，Vaccines 91，1991)。
由此，需要一種防止RSV疾病的有效方法。本發(fā)明探索滿足此需求。
一方面，本發(fā)明提供了對呼吸道合胞體病毒(RSV)中和的單克隆IgA抗體，例如HNK 20，它針對例如RSV的F糖蛋白。優(yōu)選地，該單克隆抗體是基本上純的形式，不含其它的免疫物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供含有一種或多種單克隆IgA抗體和合適載體或稀釋劑的組合物。
本發(fā)明另外提供一種治療或防止RSV在宿主中感染的方法，該方法包括給宿主施用足以達到治療或防止疾病量的本發(fā)明抗體。該抗體可以非腸道給藥于宿主，例如，靜脈給藥，或可以給藥于宿主的粘膜表面。優(yōu)選的給藥方式是鼻內(nèi)給藥。
在另一方面，本發(fā)明的特點在于，使用對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體，來制備治療或防止呼吸道合胞體病毒在宿主中感染的藥物。
本發(fā)明也提供適合治療或防止RSV感染的含有效量的本發(fā)明抗體和藥物上可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)針對RSV的單克隆IgA抗體(例如HNK 20)的方法，其中培育表達該單克隆抗體(例如HNK20)的雜交瘤細胞系，回收由此產(chǎn)生的抗體。該方法優(yōu)選通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中體外培育細胞系并從培養(yǎng)物上清液中收集抗體來進行。
本發(fā)明也提供診斷RSV抗原在生物試樣中存在的方法，該方法中，將抗原與本發(fā)明的單克隆IgA抗體(例如HNK20)接觸，并且抗原的存在由免疫檢測方法測定，例如，免疫熒光顯微鏡檢查法，免疫電子顯微鏡檢查法，固相輻射測定，或酶連免疫測定(ELISA)。該方法優(yōu)選如下進行將取自人或動物的樣本與結(jié)合到固體支持物上的抗體一起培育，洗滌固體支持物，并將之與作為示蹤物的放射性標記或酶標記抗體一起培育。該試樣可以是，例如，鼻分泌物，血清，鼻洗滌液，咽分泌物，或支氣管分泌物。
本發(fā)明另外提供一種將RSV抗原從生物試樣分離的方法，該方法包括，將試樣與本發(fā)明抗體接觸(該抗體結(jié)合于固體支持物上)，以使RSV抗原結(jié)合到該抗體上，并隨后將該RSV抗原從固體支持物上分離。
本發(fā)明另外提供一種含有兩個容器的試劑盒，第一個容器含有由本發(fā)明抗體涂敷的塑料底物，第二個容器含有已連有放射標記物或酶標記物的本發(fā)明抗體。優(yōu)選，該塑料底物是珠、棒或管形的聚苯乙烯。
另一方面，本發(fā)明提供一種分泌針對RSV抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞系(例如HNK 20)。該細胞系優(yōu)選是基本上純的形式，無其它的細胞物質(zhì)。
在本發(fā)明也提供了含有該細胞系的組合物，該組合物含有該細胞系及能維持該細胞系的營養(yǎng)培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基含有碳源，氮源，且如果需要，還含有維生素和/或有機鹽。
另一方面，本發(fā)明提供了一種繁殖本發(fā)明雜交瘤細胞系(例如HNK20)的方法，包括將此細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育。繁殖方法也代表生產(chǎn)可以從培養(yǎng)基分離的本發(fā)明抗體的方法。優(yōu)選，本發(fā)明雜交瘤細胞系的繁殖是體外進行的，其中該細胞系是在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育的。本發(fā)明細胞的適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源、氮源和如果需要，還含有維生素和/或無機鹽。例如，可以使用補有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。另一種合適的培養(yǎng)基是Sigma無血清和無蛋白雜交瘤培養(yǎng)基。
本發(fā)明抗體的一個重要優(yōu)點是它可以減少上氣路的感染，其中IgA是主要效應抗體同種型。當抗體鼻內(nèi)施用時，獲得的結(jié)果特別好。這是本發(fā)明抗體區(qū)別于其它非腸道給藥(經(jīng)靜脈或粘膜內(nèi)途徑)以減少下呼吸道感染，而讓上呼吸道感染出現(xiàn)的其它單克隆抗體或免疫球蛋白制劑的特點。本發(fā)明的單克隆抗體特別適用于被動治療和保護住院病人，特別是嬰幼兒免受RSV侵染，而與此同時抑制爆發(fā)時期病毒的蔓延。
如前面提到的，鼻內(nèi)途徑給藥優(yōu)于非腸道途徑，因為鼻內(nèi)途徑具有更安全的優(yōu)點。對局部(鼻內(nèi))抗體的敏感性副反應僅位于鼻或上氣路而非全身性的過敏反應，全身性過敏反應對宿主可有嚴重的后果。免疫蛋白(IVIG)或單克隆抗體的非腸道給藥會造成對受藥者潛在不利作用的抗個體基因型抗體應答。保護所需的鼻內(nèi)抗體濃度明顯低(低200倍)于非腸道抗體所需的濃度。嬰幼兒或許不能耐受保護所需的大量(容量)IVIG。最后，局部施用的IgA還可能優(yōu)于IgG，因為它可以是多價的而非單價的，且因此在結(jié)合或中和病毒上更有效。而且，與IgG相比，IgA與補體結(jié)合程度非常有限，其結(jié)果是IgA不大可能參與炎癥反應，該反應可能在被治療的個體中引起副作用。
附圖描述

圖1是來自生長于無蛋白培養(yǎng)基中的雜交瘤細胞的抗RSV HNK單克隆抗體的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
圖2顯示在RSV攻擊前1小時給小鼠鼻內(nèi)施用漸增劑量的HNK 20的效果(由不成對t檢驗求得的顯著性0.1μg，P＝.03；1μg，P＝0.001；10μg，P＝.001；100μg，P＝0.001)。
圖3顯示RSV攻擊前1小時用單克隆IgA(HNK 20和2D6)鼻內(nèi)處理小鼠的結(jié)果(由不成對t檢驗求得的顯著性，肺，P＝.02，鼻甲，P＝.01)。
圖4顯示RSV攻擊前1至3天用HNK 20鼻內(nèi)處理小鼠的結(jié)果(由不成對t檢驗求得的顯著性24小時，P＝.02；48小時，P＝.03；72小時，P＝.03)。
圖5是用由細胞系HNK 18、HNK 20、133/1H(抗F)、和2D6(抗霍亂弧菌)產(chǎn)生的單克隆抗體免疫沉淀的35S-標記RSV-感染溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
圖6是HNK 20IgA在非還原性5-15％梯度SDS-PAGE凝膠(該凝膠是印跡在硝酸纖維素膜上并與堿性磷酸酶標記的兔抗鼠IgA-α鏈特異性抗體反應)上電泳后進行的免疫印跡。
雜交瘤細胞系是通過鼻內(nèi)或胃內(nèi)釋放活RSV來免疫BALB/c小鼠而制備的。為優(yōu)先誘導粘膜IgA應答，進行粘膜免疫。終免疫四天后，將小鼠殺死，分離出肺和派伊爾氏淋巴集結(jié)白細胞，并分別與P3U1骨髓瘤細胞融合。所得的雜交瘤由ELISA篩選抗RSV抗體的產(chǎn)生。肺細胞融合體產(chǎn)生24個分泌抗RSV抗體的雜交瘤細胞。融合是根據(jù)kohler等的方法進行的(Eur.J.Immunol 6292-295，1976)。這些抗體中有8種是IgA亞型。未從派伊爾氏淋巴集結(jié)融合細胞中得到抗RSV雜交瘤細胞。
在鑒定和克隆后，檢測抗RSV單克隆抗體對RSV亞組A和B的識別。對RSV亞組A(菌株A2和Long)和亞組B(菌株18537)的結(jié)合由ELISA作比較。結(jié)果示于下表1。
表1 單克隆抗體與RSV菌株A2(亞組A)、Long(亞組A)和18537(亞組B)的結(jié)合實驗R0265AOD405單克隆抗體A2(A)Long(A) 18357(B)HNK 40.2140.162 0.009HNK 10 0.0540.044 0.053HNK 11 0.1410.123 0.146HNK 12 0.0310.021 0.056HNK 13 0.0260.004 0.009HNK 16 0.5400.598 0.579HNK 17 0.1760.176 0.066HNK 18 0.3560.423 0.374HNK 19 0.1510.204 0.137
實驗R0298AOD405單克隆抗體A2(A)Long(A) 18357(B)HNK 20 0.1910.227 0.146HNK 21 0.2500.295 0.248HNK 22 0.1220.205 0.062HNK 23 0.0810.186 0.026HNK 24 0.2300.258 0.203發(fā)現(xiàn)八種IgA中有五種(HNK 11，19，20，22和24)與所有三種菌株結(jié)合。這五種單克隆抗體，加上三種亞組交叉反應性IgG2a單克隆抗體(HNK 16，18和21)被選用作進一步研究。將這八種交互反應性雜交瘤在無蛋白培養(yǎng)基中進行適應生長。收集此培養(yǎng)基，濃縮，并作抗體濃度測定。圖1顯示各濃縮抗體制劑的SDS-PAGE分析。為顯現(xiàn)蛋白質(zhì)用考馬斯藍將凝膠著色。
將上述抗RSV單克隆抗體通過采用菌株A2的斑減少測定來測試體外中和作用(參見表2)。兩種抗體，HNK 20和HNK 24，顯示中和活性。HNK 20最有效，在0.1μg/ml濃度或更低時可有50％的斑數(shù)減少。HNK 20的50％效應劑量與亞組B菌株18537的中和作用相同。
表2體外中和RSV單克隆抗體同種型 中和aHNK 11IgA＞100μg/mlHNK 19IgA＞100μg/mlHNK 20IgA 0.1μg/mlHNK 22IgA＞100μg/mlHNK 24IgA 10μg/mlHNK 16IgG2a ＞100μg/mlHNK 18IgG2a ＞100μg/mlHNK 21IgG2a ＞100μg/mla給出50％斑減少的最低抗體濃度表2顯示沒有一種IgG單克隆抗體中和此病毒。
業(yè)已對上述八種抗RSV單克隆抗體在小鼠模型中作了保護免受肺RSV感染的篩選。在小鼠鼻內(nèi)施用抗RSV或非特異性對照單克隆抗體(2D6-一種抗霍亂弧菌的IgA)后24小時，用大約106空斑形成單位(PFU)的病毒進行改擊。四天后，取出肺并勻漿化，測定肺組織的病毒含量。結(jié)果示于表3。
表3體內(nèi)保護實驗RSV攻擊前24小時用單克隆抗體鼻內(nèi)處理后肺病毒滴度的減少實驗編號處理 肺PFU/g(x105)1 2D6 1.8±0.1HNK 16(IgG) 1.4±0.4HNK 18(IgG) 0.3±0.1HNK 21(IgG) 0.7±0.12 2D6 0.9±0.2HNK 11(IgA) 1.0±0.3HNK 19(IgA) 0.6±0.2HNK 22(IgA) 0.7±0.23 2D6 1.1±0.3HNK 20(IgA) 0.02±0.024 2D6 0.7±0.4HNK 24(IgA) 0.3±0.1用單克隆抗體HNK 18(一種IgG抗體)和HNK 20(一種IgA抗體)處理導致肺中病毒滴度減少大約1個對數(shù)值或更多。
對一定濃度范圍的抗體HNK 20作了測試，測試其保護小鼠肺不受感染的能力。結(jié)果示于圖2。HNK 20抗體是在病毒攻擊前1小時鼻內(nèi)施用。在每鼠1和10μg之間的劑量時具有最大的保護性。
HNK 20單克隆抗體使RSV不在鼻粘膜中復制。這由圖3中給出的數(shù)據(jù)證實。如上所述攻擊小鼠，攻擊后四天，測定鼻甲組織的PFU/g值。在病毒攻擊前1小時施用HNK 20或2D6單克隆IgA。HNK 20在鼻組織中產(chǎn)生了大于1個對數(shù)值的病毒PFU減少。
病毒攻擊前1小時或24小時前施用HNK 20抗體對小鼠肺不受感染的保護是相似的。圖4顯示，在攻擊前24、48和72小時鼻內(nèi)施用HNK 20時對小鼠的肺保護作用。在所有三個時間點上均可見到保護性，攻擊前24小時處理小鼠的保護作用比在48和72小時處理的要好。
HNK 20也對棉鼠作了保護性活性測試。棉鼠是一完善建立的呼吸道RSV感染的模型。在RSV攻擊前1小時、3小時和6小時鼻內(nèi)施用HNK 20。感染后4天將棉鼠殺死，并測定肺勻漿和鼻洗滌液中RSV的滴度。在所有三個時間點均觀察到對肺和鼻組織的顯著保護作用(參見表4)。許多HNK 20處理的棉鼠，特別是在1小時時處理的，沒有可回收到的病毒。
表41. +4天時的鼻洗滌液滴度
0＝未測出(小于最小可測滴度[＜1.3 log10/]0.5ml])HulSG＝人免疫血清球蛋白(Armour Pharmaceuticals)IgA＝OraVax IgA單克隆抗體(Mab)1、+4天時肺中RSV滴度
0＝未測出(小于最小可測滴度[＜1.3 log10/g肺])HulSG＝人免疫血清球蛋白(Armour Pharmaceuticals)IgA-OraVax IgA單克隆抗體(Mab)
HNK 18和HNK 20的蛋白特異性已用來自RSV感染的VERO細胞的放射性標記胞溶物的免疫沉淀進行測定。HNK 20沉淀一對與F糖蛋白的F1和F2亞單位移動率相應的帶。這點顯示于圖5中。與這些帶共遷移的帶有由133/1H沉淀的帶，133/1H是一種已證明可結(jié)合到F糖蛋白上的單克隆抗體。HNK 18沉淀一分子量大約47 KD的蛋白質(zhì)。此帶的身份尚未得到鑒定，但其分子量接近N蛋白(43.5 KD)的分子量。進一步的HNK 20的F糖蛋白特異性的證據(jù)由ELISA提供。在此方法中，顯示出該單克隆抗體結(jié)合到用表達RSV F糖蛋白的重組疫苗病毒感染的VERO細胞。這點顯示于表5中。與未感染的VERO或與用重組病毒感染的表達糖蛋白G或肝炎VP59的VERO細胞的結(jié)合可以忽略不計。
表5單克隆抗體與重組病毒感染的表達RSV F，RSV G，或肝炎VP59的VERO細胞的結(jié)合
*抗RSV單克隆抗體(從Biodesign International獲取)結(jié)構(gòu)上，通過采用輕鏈特異性抗體的ELISA顯示出HNK 20具有k輕鏈。HNK 20的聚合結(jié)構(gòu)是通過在非還原條件下將該單抗隆抗體在5-15％梯度丙烯酰胺凝膠上分級分離，并用免疫印跡將IgA帶顯色來測定的。這點示于圖6中。該抗體顯示出以單體、二聚體和更高的聚合體形式產(chǎn)生。主要的種類是二聚體。
研究表明，HNK 20抗體在各種條件下表現(xiàn)出良好的貯存特性。由此，由結(jié)合RSV的ELISA和還原和非還原條件下的凝膠電脈測定在各種條件下貯存1至2個月的HNK 20抗體。已證實此抗體在4℃、-80℃、或-20℃下的甘油中非常穩(wěn)定。在二個月時間點在-80℃或-20℃貯存的樣本中發(fā)現(xiàn)ELISA反應性略有降低和出現(xiàn)較低分子量帶。
分泌單克隆抗體HNK 20 mAb的細胞系HNK 20已于1993年7月1日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rock-Ville，Maryland 20852，USA)保藏，保藏號ATCC HB 11394。
由雜交瘤HNK 20分泌的單克隆抗體可從小鼠腹水中回收到。繁殖此細胞系和生產(chǎn)此抗體的方法代表本發(fā)明的另一方面。這種得到本發(fā)明抗體的方法具有優(yōu)點，其產(chǎn)率可以(例如)比該細胞的大規(guī)模培養(yǎng)獲得的產(chǎn)率大10倍。進行此方法通常歷時約2至3周。
由HNK 20雜交瘤分泌的單克隆抗體也可以通過在空心纖維生物反應器(如由Endotronics，Inc.生產(chǎn)的Maximizer 1000)中培養(yǎng)該雜交瘤細胞，高濃度和高純度地進行生產(chǎn)。這種獲得本發(fā)明單克隆抗體的方法可比在小鼠腹水中生產(chǎn)抗體有更高的產(chǎn)率(約1mg/ml)和更高的純度。
本發(fā)明的抗體可由上述來源不經(jīng)純化即可使用。然而，優(yōu)選抗體在使用前進行純化。例如，如前所述，IgA單克隆抗體可以通過在Q瓊脂糖上順序陰離子交換層析，接著采用Sephacryl S-300凝膠過濾，從細胞培養(yǎng)液中純化(Soman et al.，J.Immunol.150116A，1993)。
本發(fā)明的單克隆抗體，例如由細胞系HNK 20產(chǎn)生的那些，在患RSV感染或暴露于RSV的患者的被動治療上具有特別的實用性。已知人、黑猩猩和牛是RSV的天然宿主。此外，除人以外的靈長類，包括卷尾候(cebus)和鷹面猴，當被RSV感染時形成臨床疾病。然而，RSV是在成年白鼬的上呼吸道和羊的肺中復制的。最近的研究絕大部分是采用棉鼠或小鼠作模型，研究RSV致病機理和保護不受RSV感染。RSV在這些物種的上和下呼吸道中復制，4或5天后病毒滴度出現(xiàn)峰值。這些嚙齒動物特別適用于證實抗RSV的保護作用的免疫學研究。用IgG被動免疫的研究已顯示，由嚙齒動物得到的結(jié)果可預示IgG在猴和人中的活性。由此人們相信，小鼠和棉鼠模型中得到的本發(fā)明IgA單克隆抗體的結(jié)果可預示在人、包括未成年人中的可能效力。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，該單克隆抗體可以用來被動治療或防止RSV感染宿主，包括人。該方法包括向患者施用有效量的HNK 20。一般來說，該抗體被施于粘膜表面，且可以口服或鼻內(nèi)給藥。施用的抗體量可在50μg/kg至5mg/kg體重的范圍內(nèi)。
對于治療和/或預防應用，本發(fā)明抗體組合物可以是帶有適合的藥物載體和/或本領(lǐng)域已知的稀釋劑的固體或液體形式。該組合物用常規(guī)方式制備且包含有效量的抗體，典型地是50μg/kg至5mg/kg體重。
該組合物可以是可注射用溶液，或是溶液、懸浮劑、或粉劑形式。優(yōu)選，該組合物被配制成提供上呼吸道保護的鼻釋放劑，或提供下呼吸道保護的氣霧釋放劑。
由本發(fā)明的細胞系(例如HNK 20)產(chǎn)生的抗體，在篩選被RSV感染的患者的試驗中也具有實用性。該抗體可以用在采用(例如)免疫螢光顯微鏡檢查法或免疫電子顯微鏡檢查法以測定細胞物質(zhì)或細胞分泌物中RSV存在的測定體系中。定量測定可以通過固相輻射測量測定(Solid phase radiometric assay)或ELISA進行。
根據(jù)本發(fā)明的診斷生物樣本中RSV抗原存在的方法包括將抗原與抗RSV的單克隆IgA抗體(例如，由雜交瘤細胞系HNK 20分泌的那些)接觸，并通過免疫螢光顯微鏡檢測法，免疫電子顯微鏡檢測法，固相輻射測量測定系統(tǒng)，或在酶連免疫測定中，檢測RSV抗原的存在。優(yōu)選，將來源于人或動物的樣本用IgA抗體(例如HNK 20)在固相中培育，接著洗滌和用放射標記的或酶標記的IgA抗體作示蹤劑進行培育。在測定體系中，優(yōu)選的固相包含抗體涂敷于其上的塑料或玻璃底物。特別優(yōu)選的底物是由例如聚苯乙烯制作的珠、棒、管或板。
本發(fā)明在診斷試劑盒中也提供這些涂敷底物，例如珠。該試劑盒包含兩個容器，第一個容器含有涂敷有抗RSV的IgA抗體(例如HNK20)的塑料或玻璃底物(如珠、棒、板、或管)，第二個容器含有連有放射標記物的抗RSV的IgA抗體(例如HNK 20)。
在根據(jù)本發(fā)明的另外的測定方法中，可以采用通常要與抗RSV的IgA抗體相連的(例如)酶標記物或生物素標記物，來代替采用放射標記物。RSV感染的診斷是通過將臨床樣品(含RSV)與涂敷有針對RSV的IgA抗體的底物反應來進行的。合適的培養(yǎng)期后，加入第二(放射或酶標記抗體)抗體(在酶標記抗體的情況下接著加底物)。反應測定在臨床樣品中RSV抗原的存在量。
當偶聯(lián)于固相如溴化物活化的葡聚糖時，本發(fā)明的單克隆抗體也可用來將RSV從人或動物生物材料中除出，或是為了制備純化的RSV用于制備疫苗，或是為了將RSV從將被施用于患者的生物材料中除出。因此本發(fā)明提供了一種將RSV抗原用結(jié)合于固相的針對RSV的IgA抗體從生物材料中分離出來的方法，將該抗原與抗體結(jié)合，然后將所需的已純化的材料從固相中分離出來。
HNK 20雜交瘤可以用來構(gòu)建含有小鼠和人序列的新抗體。將來自抗RSV IgA抗體(例如HNK 20)的IgA重和輕鏈可變區(qū)，采用重組DNA技術(shù)，與人免疫球蛋白重和輕鏈恒定區(qū)組合，以產(chǎn)生主要為人序列并具有針對RSV的小鼠單克隆IgA抗體(例如HNK 20)的結(jié)合特異性的抗體。這類抗體，稱作嵌合或人化抗體，特別適用于人的非腸道治療，因為它們不大可能激起針對此抗體的免疫或過敏應答。
本發(fā)明的單克隆IgA抗體可以結(jié)合到分泌組分上，以產(chǎn)生對蛋白酶消化的抗性增強了的復合物。分泌組分以幾種方式之一與聚合IgA結(jié)合。在一種方法中，IgA抗體和分泌組分在溶液中混合，并讓其締合。在另一方法中，將分泌IgA的雜交瘤細胞用含有分泌組分的cDNA的表達載體轉(zhuǎn)染。所得細胞產(chǎn)生IgA分泌組分復合物。在第三種方法中，將一種培養(yǎng)的上皮細胞系(如MDCK)用含有聚合免疫球蛋白受體的cDNA的表達載體轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的上皮細胞在一個小室中生長于一個透性濾膜上，其中浸泡細胞頂部和底部的培養(yǎng)基是分開的。聚合免疫球蛋白受體使IgA從底面培養(yǎng)基向頂部培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。將聚合IgA加入底面培養(yǎng)基，而IgA被釋放入頂部培養(yǎng)基，從而與分泌組分(聚合免疫球蛋白受體的裂解片段)結(jié)合。
實施例本發(fā)明由下列非限定性實施例作進一步的說明。
實施例1在異氟烷麻醉下，將三只小鼠用25μl體積的106PFU RSV鼻內(nèi)感染。四天后，取出鼻甲，并制備在組織培養(yǎng)基中合并的10％鼻組織勻漿。該樣本用空斑測定滴定，稀釋至106PFU/25μl，并接種于另一組3只小鼠。繼續(xù)進行病原體培養(yǎng)。小鼠適應性變化后，觀察到肺中病毒滴度明顯增高。接種后3，4，5和6天測試病毒量以確定病毒復制的峰值。將這些實驗確定的最佳條件用于所有隨后的小鼠激發(fā)實驗。
實施例2病毒激發(fā)前一或幾小時，通過鼻內(nèi)施用不同量的單克隆抗體，測試保護所需的抗RSV抗體(例如HNK 20)的量。在異氟烷麻醉下，以25μl的容量鼻內(nèi)給予每只鼠0.1至100μg范圍量的該抗體。
為進行動物實驗，生產(chǎn)大約50mg的單克隆IgA抗體。這些抗體被部分地純化并加工產(chǎn)生抗RSV IgA抗體(例如HNK 20)的單體和多聚體成分。將此雜交瘤(例如HNK 20)克隆3次，并在無蛋白培養(yǎng)基(Sigma Chemical Company)中適應生長。該雜交瘤是在四個500ml的旋轉(zhuǎn)(Spinner)燒瓶中生長的，每2天收集2L用過的培養(yǎng)基。收集總量為8L。用截止在100 KD的膜在攪拌的容器中將此培養(yǎng)基濃縮約200倍。所得的粗濃縮物含有約50％即約2-5mg/ml純單克隆抗體。
單克隆抗體IgA(例如HNK 20)流經(jīng)DEAE瓊脂糖柱，并用0.3M氯化鈉洗脫。此材料IgA含量大于90％，并用Sephacryl S300篩分排阻色譜分離成單、聚合和聚集組分。分子量由HPLC分析和采用5至15％梯度凝膠的SDS-PAGE來測定。實施例3當對RSV的單克隆IgA抗體(例如HNK 20)釋放入粘膜或生物粘合載體時，測定該抗體所提供的保護期間。被測試的載體包括甲基纖維素和中和的聚丙烯酸。制備出0.25％甲基纖維素中50μg/ml抗體的溶液，或1.5％聚丙烯酸中5μg/ml抗體的溶液。用鼻內(nèi)滴注10μl抗體載體混合物來處理小鼠。對照小鼠接受鹽水中的非特異性單克隆IgA 2D6，與載體混合的2D6，或鹽水中的抗RSV單克隆IgA抗體(例如HNK 20)。不同組的小鼠在處理后1小時、5小時、10小時或15小時用RSV鼻內(nèi)攻擊。攻擊四天后，將小鼠殺死，并測定鼻內(nèi)的RSV滴度。將保護時間長的載體進一步檢測其保護作用的劑量效應和負作用。
權(quán)利要求
1.一種針對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體。
2.一種組合物，包含權(quán)利要求1的單克隆IgA抗體和一種載體或稀釋劑。
3.針對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體的應用，用于制備一種治療或預防呼吸道合胞體病毒在宿主中感染的藥物。
4.一種檢測呼吸道合胞體病毒抗原在生物試樣中存在的方法，所述方法包含下列步驟(a)將所述樣品與針對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體接觸；和(b)通過免疫測定檢測所述試樣中所述抗原的存在。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的免疫測定是免疫螢光顯微鏡檢查法、免疫電子顯微鏡檢查法、固相放射測量測定、或酶連免疫測定。
6.一種將呼吸道合胞體病毒抗原從生物試樣中分離的方法，包含下列步驟(a)將所述試樣與針對呼吸道合胞體病毒的抗體接觸，所述抗體結(jié)合于固體支持物上；和(b)將所述抗原從所述固相分離出來。
7.一種試劑盒，包含(a)第一個容器，含有用針對呼吸道合胞體病毒的抗體涂敷的塑料底物；和(b)第二個容器，含有針對呼吸道合胞體病毒的抗體，此抗體已連接放射標記物或酶標記物。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中該塑料底物是珠、棒、管或板形的聚苯乙烯。
9.一種產(chǎn)生針對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體的雜交瘤細胞系。
10.一種組合物，包含產(chǎn)生針對呼吸道合胞體病毒的單克隆IgA抗體的雜交瘤細胞系和能維持此細胞系的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述的抗體由雜交瘤細胞系HNK 20產(chǎn)生。
12.權(quán)利要求3的應用，其中所述的單克隆IgA抗體由雜交瘤細胞系HNK 20產(chǎn)生。
13.權(quán)利要求4的方法，其中所述的單克隆IgA抗體由雜交瘤細胞系HNK 20產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求6的方法，其中所述的單克隆IgA抗體由雜交瘤細胞系HNK 20產(chǎn)生。
15.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的單克隆IgA抗體由雜交瘤細胞系HNK 20產(chǎn)生。
16.權(quán)利要求9的雜交瘤細胞系，其中所述的雜交瘤細胞系是HNK 20。
17.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的雜交瘤細胞系是HNK 20。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對呼吸道合胞體病毒(RSV)的抗體，和產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系(例如HNK20)。該抗體可用來預防或治療RSV感染和疾病，以及用于診斷RSV感染的方法。
文檔編號G01N33/569GK1132516SQ94193595
公開日1996年10月2日 申請日期1994年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月30日
發(fā)明者理查德·A·韋爾 申請人:奧拉維克斯公司