專利名稱：：一種重要發熱病原快速篩查系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種蛋白懸浮芯片及其制備方法與應用，尤其涉及同時檢測幾種引起發熱的感染性病原抗體的檢測如結核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體等的蛋白懸浮芯片及其制備方法與應用，屬于免疫技術及臨床檢測技術領咸
背景技術：
：2003年全球SARS流行、亞洲各國頻頻爆發的禽流感、登革熱、中緬邊境的惡性痗疾、此起彼伏的腦炎、流感、又進入活3夭期的鼠疫、美國的西尼羅熱、非洲的埃博拉出血熱等，引起民眾對傳染病的廣泛恐懼。世界衛生組織2002年關于傳染病的分析報告中指出，全世界每小時有1500人死于傳染病。而發熱是傳染病最常見最為突出的臨床癥狀之一。目前已知能引M熱的物質有許多種，但與發熱最相關的是生物源的，如結核分枝桿菌、流感病毒、禽流感病、鼠疫菌、SARS、毒炭疽桿菌、登革病毒、西尼羅病毒、肺炎衣原體、支原體感染等。由于每一個感染者都是一個快速流動、難以控制的傳染源，實施快速檢測，及時、快速鑒別病原是傳染病防控早發現、早預警、早處置的基礎和前提。目前病原的快速檢測技術發展很快，針對不同的生物標識物分別發展了不同的快速檢測方法。如檢測核酸的各類PCR、原位雜交、DNA芯片、NASBA等技術，檢測蛋白質等抗原、抗體物質的ELISA、免疫層析技術、蛋白芯片技術等，都具有各自的特點。針對病原核酸的PCR等快速檢測技術需依賴儀器的基因擴增和電泳過程，也依賴操作人員的技術水平，難以滿足口岸現場簡便快速篩查需要。一般的方法主要檢測單種病原或傳染病，面對一個發熱患者，難以實現多病因的同時篩查。快速篩查是早期識別傳染病的關鍵，傳染病的快速檢測技術水平不僅關系人民的生命健康，也關系著中國的檢疫水平在國際上的可信程度和聲譽影響著我國對外的人員交流活動和國家的國際形象，也影響著能否控制傳染病的傳入傳出避免外事糾紛。因此，快速檢測技術的提高是傳染病防控工作非常重要的環節，加強快速檢測技術應用基礎研究刻不容統具有非常重要的意義既是提高我國衛生檢疫防疫整體工作水平和質量的需要又維護我國公共衛生安全的需要。懸浮芯片(suspensionarray)^稱'液相芯片(liquidarray,liquidchip),是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為沖企測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆樣"求大小約5.5nm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應后，利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通逸每次僅允許一個微球通過檢測通道，檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發微球基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的纟效球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數十種病原。與以往的技術相比，當今發展的生物芯片技術可以實現把幾種發熱病原一次性聯合檢測的目的，目前產生的懸浮芯片技術還是生物芯片的一種，它除了可以檢測多種病原以外，還具有比ELISA反應更加充分的液相環境，且具有省時省力，特異性強，靈敏度高，并且無創傷的優點。因此研制和開發一種重要發熱病原快速篩查系統對我國出入境人員的快速檢測其有無攜帶傳染病原的監測有重要的研究意義
發明內容本發明的目的在于為人們提供一種重要感染病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片檢測方法，實現能在短時間內同時檢測幾種？1M熱的病原抗體，從而得出被檢測人員有沒被相應病原感染，有無疫情的發生，為出入境人員能夠快速通過出有無攜帶外來傳染病原的出入境體檢的需要節約了時間，又能有效保障我國公共衛生安全。本發明涉及一種重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片檢測方法針對一種或多種引M熱的感染性病原制備出相應診斷抗原，分別與不同編號的微球偶聯，制備出可對上述病原抗體檢測的蛋白懸浮芯片，在應用時，加入待檢血清，使血清中的抗體被微球上的抗原捕恭再與生物素標記的二抗(生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應，通過Bio-PlexSystem檢測系統，實現對上述病原抗體一次性;險測。下面對本發明所述的重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片檢測方法進行詳細的描述本發明的重要發熱病原包括，例如結核分枝桿菌、流感病毒、禽流感病毒、鼠疫桿菌、SARS病毒。本發明確定了用于捕獲相應抗體的抗原分別使結核分枝桿菌的38KD蛋白、16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoVN蛋白；所要捕獲的抗體分別是兔抗TBIgG、結核抗體、鼠抗流感NPIgG、兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;相應的生物素化抗體分別是Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG,檢測人血清是所用生物素化抗體為Biotin羊抗人的二抗。本發明涉及一種快速篩查重要引起發熱感染性病原的蛋白懸浮芯片，主要由微球，包被抗原，捕獲抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是27,31，32，33，43，44號羧基微球；所述包被抗原是結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV6N蛋白；所述捕獲抗體是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗體是Biotin(即生物素)羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG;所述包被抗原均與對應的抗體特異性的結合，所述捕獲抗體均與對相應生物素化二抗(即生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊羊抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗人IgG、生物素化羊抗兔IgG、)特異性結合；其中結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白與27號羧基微球形成偶聯體，流感NP蛋白與31號羧基微球形成偶聯體，LAM抗原與33號羧基微球形成偶聯體，禽流感H5抗原與32號M微球形成偶聯體，鼠疫菌Fl抗原與43號羧基微球形成偶聯體，SARS-CoVN蛋白與44號羧基微球形成偶聯體，以紅色激光激發其微球基質上的紅色分類熒光依據其微球基質的色彩不同確定類型；所述生物素化抗體于鏈霉親和素-藻紅蛋白結合，以綠色激光激發藻紅蛋白，測定微球基質上結合的報告熒光分子的數量，用于間接確定微球基質上結合的捕獲抗體。在上述的重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片中，所述捕獲抗體是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗體是生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗鼠IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗人IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG;所述適用于人血清的檢測項目分別是結核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體。本發明所述重要發熱病原快速篩查系統蛋白懸浮芯片的制備方法，其步驟是(1)活化編碼微球分取27,31，32，33，43,44號編碼微球到離心管中，10000g14000g離心后小心吸出上清并棄去。加入孩t球洗滌緩沖液懸浮，震蕩30秒，超聲30秒，10000g14000g離心，小心吸出上清并棄去。加入微球活化緩沖液，接著先加入新鮮配置的EDC，緊接著加入新鮮配置的Sulfo-NHS，高速震蕩后用鋁箔包裹，在室溫震搖20min40min。加入PBS，震蕩后，10000g14000g離心，小心吸出上清并棄去(重復此步驟一次)。加入的PBS懸浮編碼微球，中速震蕩后，超聲。(2)抗原包被編碼微球M目應的抗原加入到活化后的編碼微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500pL，鋁箔包裹在室溫震搖30min-2h。10000g~14000g離心后，小心吸出上清，棄去。用500(oL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g離心后，小心吸出上清，棄去。加入封閉緩沖液懸浮編碼微球，中速震蕩，用鋁箔包裹，在室溫震搖10min60min,lOOOOg-14000g離心后，小心吸出上清，棄去。加入儲備緩沖液洗滌編碼微球，10000g~16000g離心后，小心吸出上清，棄去。最后用儲備緩沖液懸浮編碼微球，于4。C避光保存備用。(3)包被微球的計數吸取適量微球，稀釋后，用血球計數板在普通顯微鏡下計數，計算微球數量。本發明所述重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片方法，其所述樣品的懸浮芯片檢測具體步驟如下采用間接法的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板上進行。(1)每孔加入4企測緩沖液預濕孔，用真空泵抽濾；(2)每孔加入含相應編碼孩U求的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；(3)加入稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液洗滌并抽濾三)夂；(4)加入適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化二抗混勻后室溫避光震搖30min60min，洗液洗滌3-6次，并真空泵抽濾；(5)加入SA-PE，混勻后室溫避光震搖10~30min,洗液洗滌3-6次，并真空泵抽濾；(6)加入檢測緩沖液，經振蕩使小球重懸均勻；(7)用Bio-Plex懸浮芯片系統讀耳又FMI數值并分析數據。本發明的方法不但可以快速篩查多種病原的抗體而且，由于多個包被病原菌的抗原的微球在同一體系中，不同的抗原可以和不同的目的分子結合，反應后通過激光檢測微球基質的色彩編號可以對不同的檢測反應加以區分，因而更加省時省力，同時節約了4企測的成本。圖1、本發明的多重體系微^M企測兔抗TB的標準曲線；圖2、本發明的多重體系微^M企測鼠抗流感NP的標準曲線；圖3、本發明的多重體系微球檢測鼠抗禽流感H5N1的標準曲線，靈敏度為69.4ng/ml;圖4、本發明的多重體系微珎驗測兔抗鼠疫F1的標準曲線，靈壽丈度為6.29475ng/ml;圖5、本發明的多重體系微球檢測兔抗SarsN13的標準曲線，靈敏度為15.5265ng/ml。上述附圖為抗體濃度一一編碼微球表面的焚光強度劑量反應曲線。編碼微球表面焚光強度與加入的抗體量在一定的范圍內成正相羌其中橫坐標為多重微球體系中加入的抗體的量，縱坐標代表相應編碼《效球表面的焚光強度。可以通過擬合的標準曲線實現對檢測抗體的半定量分析。AE分別為兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、結核抗體兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG熒光強度劑量反應曲線。具體實施例方式實施例l:包被抗原與已知編號微球的偶聯1.分別取27，31,32,33,43，44號編碼微球，用凝渦振蕩器振蕩微球懸液，時間30s，超聲30秒，使微球混合均勻；2.分別取上述各編碼微球1.25x106個到1.5mL離心管中，10000g~14000g離心4min，小心吸出上清并棄去；3.加入100joL的珠球洗滌緩沖液(PBS，pH7.4,0.05%TWEEN-20)9懸浮微球，震蕩30秒，超聲30秒，lOOOOg—14000g離心4min,小心吸出上清并棄去；4.加入80jiL的珠球活化緩沖液(3gNaH2P04，5NNaOH40drops/250mLH20)，用旋渦振蕩器振蕩微球懸氣5.加入10pL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，緊接著加入10|aL新鮮配置的Sulfo-NHS(50mg/mL)，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20min;6.加入150^L的PBS(pH7.4)，震蕩10秒后，10000g-14000g離心4min,小心吸出上清并棄去；7.重復上步驟一次；8.加入100^iL的PBS(pH7.4)懸浮編碼」微球，中速震蕩30秒后，超聲15秒；9.分別取抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoVN蛋白l-10嗎加入到活化后的編碼微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500^L;10.鋁箔包裹在室溫震搖2h，lOOOOg-14000g離心4min，小心吸出上清，棄去；11.用500jiL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g離心4min,小心吸出上清，棄去；12.加入250jjL的封閉緩沖液(PBS(pH7.4),1%BSA,0.05%Azide)懸浮編碼微球，中速震蕩15秒，用鋁箔包裹，在室溫震搖30min，10000g~14000g離心4min，小心吸出上清，棄去；13.加入500|iiL的儲備緩沖液(PBS(pH7.4),0.1%BSA，0.02%TWEEN，0.05%疊氮化物)洗滌編碼微球，lOOOOg-16000g離心6min,小心吸出上清，棄去；14.最后用1501iL的儲備緩沖液懸浮編碼微球，即得結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白與27號J^微球形成偶聯體，流感NP蛋白與31號羧基微球形成偶聯體，LAM抗原與33號羧基微球形成偶聯體，禽流感H5抗原與32號羧基微球形成偶聯體，鼠疫菌Fl抗原與43號羧基微球形成偶聯體，SARS-CoVN蛋白與44號羧基微球形成偶聯體；15.吸取適量微球，稀釋后，用血球計數板在熒光顯微鏡下計數，換算出每種微球的濃度；16.把偶聯號得微球放在4'C避光保存，一般每種抗原偶聯體的微球單獨保存，使用時，依據檢測項目選擇混合。實施例2:樣品的懸浮芯片檢測采用間接法的免疫學檢測模式檢測過程中全部反應均在96孔濾板上進行。1.每孔加入150(iL檢測緩沖液預濕孔，用真空泵抽濾；2.每孔加入50jiL含相應編碼孩t球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；3.加入50(iL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min,洗液洗滌并抽濾三次；4.加入50(iL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化二4^混勻后室溫避光震搖30min，洗液100pL洗滌3次，并真空泵抽濾；5.加入50(iL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖10min。洗液100|aL洗滌3次，并真空泵抽濾；6.加入125jiL的檢測緩沖泉經振蕩使小球重懸均勻；7.用Bio-Plex懸浮芯片系統讀取FMI數值并分析數據。實施例3:多重微球體系對不同濃度兔抗TBIgG的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1,得到不同抗原與編碼微:昧的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯體，鼠疫菌F1抗原的43號羧基微球偶聯體,SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50pL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將兔抗TBIgG用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗TBIgG的濃度分別是0.147ng/ml、0.588ng/ml、2.354ng/ml、9.418ng/ml、37.672ng/ml、150.687ng/ml、602.75ng/ml、2.411jig/ml;4.具體的檢測操作步驟如實施例2;5.各微球檢測兔抗TB的得到的MFI值見下表1,多重體系微球檢測兔抗TB的標準曲線FI=2.32671+(5582.99-2.32671)/((l+(Conc/331.934)A-1.42723))A0.78545檢測靈敏度為1.5815ng/ml。表1多重體系微^^r測兔抗TB的MFI值兔抗TBIgGMFI值濃度(ng/ml)N13(44)TB(27)FlAg(43)H5(32)048.75127.584.30.1476514.5101100.5885620101032.3545538.591079.41858107810737.672635119105150.6878118468,5103602.75118.542338992411.321535511117實施例4:多重W體系對不同濃度鼠抗流感NP抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，流感NP蛋白的31號羧基微球偶聯體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯體，12各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50(xL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將鼠抗流感NP抗體用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，鼠抗流感NP抗體的濃度分別是3.052ng/ml、12.207ng/ml、48.828ng/ml、195.312ng/ml、781.25ng/ml、3125ng/ml、12500ng/ml、50000ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實施例2;5.各微球4企測鼠抗流感NP抗體得到的MFI值見下表2,多重體系微J^險測鼠抗禽流感NP的標準曲線FI-20.3844+(583.981-20.3844)/((1+(Conc/6113.06)A-2.38124))A0.349701靈敏度為968.8ng/ml。表2多重體系微^M^r測鼠抗禽流感NP的MFI值鼠抗流感MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例5:多重微球體系對不同濃度鼠抗禽流感H5N1抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50nL作為多重微球體系的檢測工作溶液；3.將鼠抗禽流感H5N1抗體用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，鼠抗禽流感H5N1抗體的濃度分別是0.305ng/ml、1.2nng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實施例2;5.各微^J險測檢測鼠抗禽流感H5N1抗體的MFI值見下表3，多重體系微Jl^r測鼠抗禽流感H5Nl的標準曲線FI=11.2281+(1516.12-11.2281)/((1+(Conc/628.306)A—1.0296))A1.06526靈敏度為69.4ng/ml。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例6:多重微球體系對不同濃度兔抗鼠疫F1抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯體，鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基樣t球偶聯體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50/aL作為多重微J求體系的4全測工作溶液；3.將兔抗鼠疫F1抗體的用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗鼠疫Fl抗體的濃度分別是0.305ng/ml、1.221ng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000.Ong/ml、80000.Ong/ml;4.具體的檢測才喿作步驟如實施例2;5.各微球檢測檢測兔抗鼠疫F1抗體的MFI值見下表4，多重體系微球檢測兔抗鼠疫F1抗體濃度的標準曲線FI=4.423+(4130.55-4.423)〃1+(Conc/1853.93)八-0.986615)靈敏度為6.29475ng/ml。表4多重體系微^M企測兔抗鼠疫Fl抗體的MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6420000.015.510338356180000.018984137.570實施例7:多重微球體系對不同濃度兔抗SarsN13抗體的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到不同抗原與編碼微球的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯體，鼠疫菌Fl抗原的43號^4微球偶聯體，SARS-CoVN蛋白的44號羧基微球偶聯體，各3500個，加入同一離心管中，加微球稀釋液至總體積50|uL作為多重微球體系的檢測工作溶氣3.將兔抗SarsN13抗體的用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品，兔抗SarsN13抗體的濃度分別是0.034ng/ml、0.137ng/ml、0.549ng/ml、2.197ng/ml、8.789ng/ml、35.156ng/ml、140.625ng/ml、562.5ng/ml、2250.0ng/ml;4.具體的檢測操作步驟如實施例2;5.各微^M企測檢測兔抗SarsN13抗體的MFI值見下表5，多重體系微球4企測兔抗SarsNl3抗體濃度的標準曲線FI=8.9686+(2204.42—8.9686)/((1+(Conc/287.286)A-1.2352))Al.10117靈敏度為15.5265ng/ml。表5多重體系微球檢測兔抗SarsN13的MFI值兔抗SarsN13MFI值抗體濃度(ng/ml)TB(27)H5(32)FlAg(43)N13(44)012.884.2512.25450.0341388.51350.50.137161001455160.5491811317562.19716110.513.5598.78915941472.535.156138012169140.625169614627562.518821215182250.02967112079.5實施例8:本發明所述重要發熱病原快速篩查系統的蛋白,辯芯片在檢測人血清中結核抗體的應用。1.取結核LAM抗原與33號編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到LAM抗原與33號編碼微球的偶聯體；2.將被診斷為結核病人的35份血清和53份正常健康人血清分別用樣品稀釋液估支l:io倍梯稀釋；3.取96孔濾板，在每孔加入150iiiL檢測緩沖液預濕孔，用真空泵抽濾；4.每孔加入50jaL含3500個包被有LAM抗原的33號編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；5.加入50jliL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液洗滌并抽濾三次；6.加入50(iL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人IgG,混勻后室溫避光震搖30min，洗液100|iL洗滌3次，并真空泵抽濾；7.加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10min。洗液100jaL洗滌3次，并真空泵抽濾；8.加入125jiL的檢測緩沖液,經振蕩使小球重懸均勻；9.用Bio-Plex懸浮芯片系統進行檢測；10.同樣的血清樣本用于市售ELISA試劑盒;f企測。檢測結果見表6、7，由此可見由lam抗原檢測的結核抗體的檢測靈敏度為68.57%、特異度為83.02%、準確度為77.27%;ELISA試劑盒^r17測血清中結核抗體的檢測靈敏度為62.86%、特異度為94.34%、準確度為81.82%,lam抗原包被的微球用懸浮芯片檢測結核抗體的靈敏度比市售ELISA法的靈敏度高，檢測率也較高。表6lam抗原檢測人樣本中結核抗體的檢測結果血清類型例數陽性陰性陽性檢出率結核病人35241168.57%正常人5394416.98%合計88335537.50%表7EILSA試劑盒檢測人血清中結核抗體的檢測結果血清類型例數陽性陰性陽性檢出率結核病人35221362.86%正常人533505.66%合計88256328.41%實施例9:本發明所述重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片在檢測人血清中結核抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體的應用。1.各抗原與不同編碼微球偶聯，具體操作方法如實施例1;得到不同抗原與編碼微5求的偶聯體；2.取包被有抗原結核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯體，禽流感H5抗原的32號羧基微球偶聯體，鼠疫菌Fl抗原的43號M^微球偶聯體，SARS-CoVN蛋白的44號氣基微球偶聯體，各3500個，加入同一離心管中，加孩O求稀釋液至總體積50iuL作為多重微球體系的檢測工作溶泉3.將94份人血清分別用樣品稀釋液做1:1G倍梯稀釋；4.取96孔濾板，在每孔加入150jiL檢測緩沖液預濕孔，用真空泵抽濾；5.每孔加入50uL上述步驟2中的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次；6.加入50mL稀釋的檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30min，洗液18洗滌并抽濾三次；7.加入50iaL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人IgG,混勻后室溫避光震搖30min,洗液100nL洗滌3次，并真空泵抽濾；8.加入50jaL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10min。洗液100jaL洗滌3次，并真空泵抽濾；9.加入125juL的檢測緩沖液，經振蕩使小球重懸均勻；10.用Bio-Plex懸浮芯片系統進行4企測。結果判定單個檢測項目中94個人檢測熒光值MFI的平均值與3倍的94個Ai企測焚光值MFI的標準差的和作為該;險測項目的cutoff值，如果檢測的MFI值>cutoff值為陽性，反之為陰性。檢測結果見下表8。表8多重微球體系4企測人血清結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權利要求1.一種重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片，其特征是，由編碼微球，包被抗原，檢測抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成。2.如權利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述包被抗原選自下列的一種或多種結核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，結核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白。3.如權利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述檢測抗體選自兔抗TBIgG，鼠抗流感NPIgG，兔抗H5N1血清，結核抗體，兔抗鼠疫IgG，兔抗SARSIgG中的一種或多種。4.如權利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，所述生物素化抗體選自Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗鼠IgG，Biotin羊抗兔IgG，Biotin羊抗人IgG,Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗兔IgG中的一種或多種。5.如權利要求l所述的蛋白懸浮芯片，其特征是，可以檢測結核抗體，流感抗體，禽流感抗體，鼠疫抗體，SARS抗體中的一種或多種。6.—種采用蛋白懸浮芯片快速篩查重要發熱病原抗體的檢測方法，其特征是針對一種或多種重要發熱病原制備出相應抗原，分別與不同編號的微球偶聯，制備出可對上述病原抗體檢測的蛋白懸浮芯片，在應用時，加入待檢血清，使血清中的抗體被微球上的抗原捕獲，再與生物素標記的二抗(即生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應，通過Bio-PlexSystem檢測系統，實現對上述病原抗體一次性檢測。7.如權利要求6所述的蛋白懸浮芯片檢測方法，其特征是選取27，31,,33，43,44號羧基微球作為編碼微球，洗滌；活化g微球；分別對應27,31，32，33，43，44號羧基微球順序加入結核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，結核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白抗原；混勻；在室溫下。以300-900rpm的轉速放在搖床上孵育30120分鐘；用封閉緩沖液封閉；用儲備緩沖液洗滌；得結核16KD和38KD蛋白與27號微球得偶聯體，流感NP蛋白與31號微球得偶聯體，禽流感H5抗與32號微球得偶聯體，結核LAM抗原與33號微球得偶聯體，鼠疫菌F1抗原與43號微球得偶聯體，SARS-CoVN蛋白抗原與44號微球得偶聯體；計數每種微球偶聯體的單位體積數，確定濃度，分別于4。C條件下避光保存；使用時，依據檢測項目選擇混合。8.如權利要求l-5任一項所述的重要發熱病原快速篩查系統的蛋白懸浮芯片檢測在檢測人血清樣本中的應用。全文摘要本發明公開了一種用于重要發熱病原快速篩查系統的檢測方法，主要涉及檢測血清中結核抗體、流感抗體、禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體。芯片主要由編碼微球，包被抗原，檢測抗體，生物素化抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，該方法包括包被抗原與編碼微球的偶聯，檢測抗體將分別特異性的與相應的各號微球偶聯，以紅色激光激發其球形基質上的分類熒光，依據其球形基質色彩不同確定類型；其中的生物素化抗體將與檢測抗體結合；所述的鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲檢測抗體的生物素結合，以綠色激光激發藻紅蛋白，測定球形基質上結合的報告熒光分子的數量，用于間接確定球形基質上結合的檢測抗體的含量，從而來確定是否被病原感染，達到快速篩查發熱病原的目的。文檔編號G01N33/546GK101504414SQ20091008025公開日2009年8月12日申請日期2009年3月17日優先權日2009年3月17日發明者孫肖紅,宇楊,楊永莉,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學研究院
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