檢測針對使用TNFα的生物療法的中和性自體抗體的測定法
【專利摘要】本發明提供用于檢測和測量樣品中針對生物制劑例如抗TNFα藥物治療劑的中和性和非中和性自體抗體的存在或水平的測定法。本發明用于在對象接受生物制劑療法時監測中和性和/或非中和性抗藥物抗體隨時間的形成。本發明也用于預測和/或確定患者樣品中的中和性抗藥物抗體與備選生物制劑治療的交叉反應性。因此，本發明提供用于指導接受使用生物制劑療法的對象的治療決定的信息，并改善對生物療法的優化治療、降低毒性和/或監測治療效力的準確度。
【專利說明】檢測針對使用TNFa的生物療法的中和性自體抗體的測定
法
與相關申請的交叉引用
[0001]本申請要求2011年7月6日提交的美國臨時申請號61/505，031、2011年8月26日提交的美國臨時申請號61/528，072和2011年9月16日提交的美國臨時申請號61/535，884的優先權，所述申請的公開在此處為了各種目的以其整體引入作為參考。
發明背景
[0002]自身免疫疾病是重要的且普遍的醫學問題。例如，在美國，類風濕性關節炎(RA)是影響兩百萬以上人群的自身免疫疾病。RA引起關節的慢性炎癥，并通常是漸進性疾病，其可能造成關節破壞和功能性病廢。盡管遺傳素質、感染物和環境因素都涉及該疾病的病因學，但類風濕性關節炎的原因仍是未知的。在活性RA中，癥狀包括疲乏、缺乏食欲、低熱、肌肉和關節疼痛以及僵硬。并且，在疾病突然發作期間，由于滑膜的炎癥，關節通常變成紅色、腫脹、疼痛和敏感。此外，由于RA是全身疾病，炎癥可能會影響關節外的其他器官和身體部位，包括眼和口的腺體、肺內壁、心包膜和血管。
[0003]RA和其他自身免疫病癥管理的傳統治療包括快速作用的“一線藥物”和較慢作用的“二線藥物”。一線藥物減輕疼痛和炎癥。此類一線藥物的實例包括阿司匹林、甲氧萘丙酸、布洛芬依托度酸和其他非留體抗炎性藥物(NSJAID)，以及皮質留類，通過口服或直接注射到組織和關節內施用。二線藥物促進疾病減輕并防止進行性關節破壞，也稱為疾病改變性抗類風濕藥物或DMARD。二線藥物的實例包括金、hydrochloroquine、柳氮磺胺卩比唳以及免疫抑制劑，例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、環磷酰胺、苯丁酸氮芥和環孢霉素。然而，這些藥物中許多可能具有有害的副作用。因此，一直在尋找類風濕性關節炎和其他自身免疫病癥的額外療法。
[0004]腫瘤壞死因子a (TNF-a )是由眾多細胞類型，包括單核細胞和巨噬細胞產生的細胞因子，其最初基于其能誘導某些小鼠腫瘤壞死的能力而鑒定。隨后，一種稱為惡液質素的因子(與惡病質相關)顯示出與TNF-a相同。TNF-a涉及多種其他人類疾病和病癥的病理生理學，包括休克、敗血病、感染、自身免疫疾病、RA、克羅恩病、移植排斥和移植物抗宿主病。
[0005]由于人TNF-a (hTNF_ a )在多種人類疾病中的有害作用，已經設計了治療策略，以抑制或者抵消hTNF-a活性。具體而言，已經探尋了與hTNF-a結合并中和其的抗體，作為抑制hTNF-a活性的方法。一些最早的此類抗體是小鼠單克隆抗體(mAb)，其由制備自用hTNF-a免疫的小鼠的淋巴細胞的雜交瘤分泌(參見，例如Moeller等人的美國專利號N0.5，231，024)。盡管這些小鼠抗hTNF-a抗體通常對hTNF-a表現出高親和力，并且能中和hTNF- a活性，但由于與將小鼠抗體施用給人相關的問題，其體內用途受到了限制，所述問題例如短的血清半壽期、不能引發某些人效應子功能，以及在人中引起針對小鼠抗體的不想要的免疫應答(“人抗小鼠抗體”(HAMA)反應)。
[0006]最近，已經將生物治療用于自身免疫疾病如類風濕性關節炎的治療。例如，FDA已經批準將4種TNFa抑制劑:REMICADE? (英夫利昔單抗(infliximab))、嵌合的抗Fe融合蛋白、HUMIRA?(阿達木單抗(adalimumab))、人抗-TNF a mAb,和 CTTVTZTA⑧(賽妥珠單抗(certolizumab pegol))、聚乙二醇化Fab片段用于治療類風濕性關節炎。還將GIMZIA?用于治療中度至重度克羅恩病(⑶)。盡管已經顯示，此類生物學治療在治療類風濕性關節炎和其他自身免疫疾病如CD中是成功的，但并非全部經治療的對象都應答或者良好應答此類療法。此外，TNF α抑制劑的施用能誘導對藥物的免疫應答，并導致產生自體抗體如人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(ΗΑΜΑ)。此類HACA、HAHA或HAMA免疫應答能夠與超敏反應和免疫治療性TNF α抑制劑的藥物動力學和生物分布的急劇改變相關，后者阻礙了用藥物的進一步治療。因此，本領域存在對用于檢測患者樣品中針對生物制劑例如抗TNFa藥物的自體抗體的存在的測定法的需求，以監測生物療法并指導治療決定。本發明滿足了該需求，并還提供了相關的優點。
發明概述
[0007]本發明提供用于檢測和測量樣品中針對生物制劑例如抗TNFa藥物治療劑的中和性和非中和性自體抗體的存在或水平的測定法。本發明用于當對象接受生物療法(例如抗TNFa藥物療法)時監測中和性和/或非中和性抗藥物抗體隨時間的形成。本發明也用于預測和/或確定對象樣品中中和性抗藥物抗體與備選生物療法(例如備選抗TNF α療法)的交叉反應性。同樣地，本發明提供用于指導接受使用生物制劑療法的對象的治療決定的信息，以及改善對生物療法的優化療法、降低毒性和/或監測治療效力的準確度。
[0008]在一方面，本發明提供用于檢測樣品中針對生物制劑的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在的方法，所述方法包括:
Ca)將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸，以形成:
(i)經標記的生物制劑和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的生物制劑、經標記的生物制劑結合部分，和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的生物制劑結合部分、游離的經標記的生物制劑，和/或經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如，通過測量只含游離的經標記的生物制劑結合部分的參考樣品在SEC后游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC)，從而確定中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在。
[0009]在某些實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相同或實質上相同時，檢測到中和性形式的自體抗體。在某些其他實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相比降低(例如實質上降低)或不存在(例如不可檢測)時，檢測到非中和性形式的自體抗體。
[0010]另一方面，本發明提供用于測量樣品中針對生物制劑的中和性形式的自體抗體的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸，以形成:
(i)經標記的生物制劑和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的生物制劑、經標記的生物制劑結合部分，和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的生物制劑結合部分、游離的經標記的生物制劑，和/或經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比(例如，通過測量并標準化只含游離的經標記的生物制劑結合部分的參考樣品在SEC后游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC以計算游離的經標記的生物制劑結合部分的水平或百分比)，其中對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比對應于中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0011]在一些實施方式中，對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比與步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平的差異對應于非和中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0012]在另一方面，本發明提供用于確定針對第一生物制劑的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同)生物制劑具有交叉反應性的方法，所述方法包括:
(a)根據本文說明的測定法檢測或測量樣品中中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，以確定樣品是中和性形式的自體抗體陽性或陰性的；和
如果樣品是中和性形式的自體抗體陽性的，則:
(b)將樣品與經標記的第二生物制劑接觸，以形成經標記的第二生物制劑和中和性形式的自體抗體的經標記的復合物(即其中經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(C)對經標記的復合物進行大小排阻色譜以分離經標記的復合物(即與游離的經標記的第二生物制劑分離)；和
(d)檢測經標記的復合物，從而確定針對第一生物制劑的中和性形式的自體抗體是否與第二生物制劑具有交叉反應性。
[0013]在某些實施方式中，經標記的復合物的存在指示針對第一生物制劑的中和性自體抗體與第二生物制劑具有交叉反應性，即中和性自體抗體將抑制第一和第二生物藥物的活性。
[0014]在某些其他實施方式中，經標記的復合物的不存在指示針對第一生物制劑的中和性自體抗體不與第二生物制劑具有交叉反應性，即中和性自體抗體將不抑制第二生物藥物的活性。[0015]在一些實施方式中，生物制劑包括抗體(例如抗TNFa單克隆抗體)、抗體片段、蛋白質(例如細胞因子諸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多價結合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其改造形式及其組合。
[0016]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受生物制劑療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)、炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(CD)或潰瘍性結腸炎(UC))或癌癥。
[0017]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對生物制劑的自體抗體。在其他實施方式中，生物制劑自體抗體包括，但不限于，人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0018]在某些方面，本發明的測定方法還包括酸解步驟，所述步驟包括在將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸之前、期間和/或之后將樣品與酸接觸。
[0019]在某些其他方面，本發明的測定方法包括檢測樣品中針對生物制劑的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的一種或多種同種型的存在或水平。
[0020]在一個特別的方面，本發明提供檢測樣品中針對抗TNF α藥物的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的抗TNFa藥物和經標記的TNFa接觸，以形成:
(i)經標記的抗TNFa藥物和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的抗TNF α藥物、經標記的TNF a，和自體抗體的第二經標記的復合物(SP免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的TNF a、游離的經標記的抗TNF α藥物，和/或經標記的抗TNF a藥物和經標記的TNF α的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的TNFa的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中游離的經標記的TNF α的水平(例如，通過測量只含游離的經標記的TNF α的參考樣品在SEC后游離的經標記的TNF α峰的AUC)，從而檢測中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在。
[0021]在某些實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中的游離的經標記的TNFa的水平相同或實質上相同時，檢測到中和性形式的自體抗體。在某些其他實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中的游離的經標記的TNFa的水平相比降低(例如實質上降低)或不存在(例如不可檢測)時，檢測到非中和性形式的自體抗體。
[0022]另一方面，本發明提供用于測量樣品中針對抗TNFa藥物的中和性形式的自體抗體的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的抗TNF α藥物和經標記的TNF α接觸，以形成:
(i)經標記的抗TNF α藥物和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或(?)經標記的抗TNF α藥物、經標記的TNF α，和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的TNF α、游離的經標記的抗TNF α藥物，和/或經標記的抗TNF α藥物和經標記的TNFa的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的TNFa的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比(例如，通過測量并標準化只含游離的經標記的TNF α的參考樣品在SEC后游離的經標記的TNF α峰的AUC’以計算游離的經標記的TNF a的水平或百分比)，其中對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比對應于中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0023]在一些實施方式中，對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比與步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平的差異對應于非和中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0024]在另一個特別的方面，本發明提供確定針對第一抗TNFa藥物的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同)抗TNF α藥物具有交叉反應性的方法，所述方法包括:
(a)根據本文說明的測定法檢測或測量樣品中中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，以確定樣品是中和性形式的自體抗體陽性或陰性的；和
如果樣品是中和性形式的自體抗體陽性的，則:
(b)將樣品與經標記的第二抗TNFa藥物接觸，以形成經標記的第二抗TNFα藥物和中和性形式的自體抗體的經標記的復合物(即其中經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(C)對經標記的復合物進行大小排阻色譜以分離經標記的復合物(即與游離的經標記的第二抗TNF α藥物分離)；和
(d)檢測經標記的復合物，從而確定針對第一抗TNF α藥物的中和性形式的自體抗體是否與第二抗TNF α藥物具有交叉反應性。
[0025]在某些實施方式中，經標記的復合物的存在指示針對第一抗TNF α藥物的中和性自體抗體與第二抗TNF α藥物具有交叉反應性，即中和性自體抗體將抑制第一和第二抗TNFa藥物的活性。
[0026]在某些其他實施方式中，經標記的復合物的不存在指示針對第一抗TNF α藥物的中和性自體抗體不與第二抗TNF α藥物具有交叉反應性，即中和性自體抗體將不抑制第二抗TNF α藥物的活性。
[0027]在一些實施方式中，抗 TNF α藥物選自REMICADETM(英夫利昔單抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿達木單抗)、CIMZIA? (賽妥珠單抗)、SIMPONI? (戈利木單抗(golimumab) ；CNT0148)及其組合。
[0028]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受抗TNFa藥物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有TNFa介導的疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)或炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(⑶)或潰瘍性結腸炎(UC))。
[0029]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對抗TNFa藥物的自體抗體。在其他實施方式中，抗TNF α藥物自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0030]在某些方面，本發明的測定方法還包括酸解步驟，所述步驟包括在將樣品與經標記的抗TNF α藥物和經標記的TNF α接觸之前、期間和/或之后將樣品與酸接觸。
[0031]在某些其他方面，本發明的測定方法包括檢測樣品中針對抗TNFa藥物的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的一種或多種同種型的存在或水平。
[0032]在其他方面，本發明提供用于在接受使用生物制劑的療程的對象中對生物制劑進行監測和/或優化療法的方法，所述方法包括:
(a)根據本文所說明的測定法在療程中的多個時間點檢測或測量針對生物制劑的中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比；
(b)檢測中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比隨時間的改變；和
(C)基于中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比隨時間的改變，確定對象的療程隨后的劑量或是否應當向對象施用不同的療程。
[0033]在一個特別的方面，本發明提供用于在接受使用生物制劑的療程的對象中對生物制劑進行監測和/或優化療法的方法，所述方法包括:
(a)在時間點h如本文所述測量來自對象的第一樣品中針對生物制劑的中和性形式的自體抗體的水平或百分比；
(b)在時間At1如本文所述測量來自對象的第二樣品中的中和性形式的自體抗體的水平或百分比；
(c)在時間點tn+1任選地對來自對象的η個額外的樣品重復步驟(b),其中η是從I至約 25 的整數(例如 η 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范圍)；
(d)檢測中和性形式的自體抗體的水平或百分比從時間點h至h或從時間點h至tn+1的改變；和
(e)基于中和性形式的自體抗體的水平或百分比隨時間的改變，確定對象的療程隨后的劑量或是否應當向對象施用不同的療程。
[0034]在額外的方面，本發明提供用于在接受使用第一生物制劑的療程的對象中優化療法和/或降低毒性的方法，所述方法包括:
(a)通過根據本文說明的測定法檢測或測量來自對象的樣品中中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，確定針對第一生物制劑的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同的)生物制劑具有交叉反應性；和
(b)如果中和性形式的自體抗體與第二生物制劑具有交叉反應性，確定應當向對象施用不同的療程。
[0035]在一個特別的方面，本發明提供用于在接受使用抗TNFa藥物的療程的對象中對抗TNF α藥物進行監測和/或優化療法的方法，所述方法包括:
(a)根據本文所說明的測定法在療程中的多個時間點檢測或測量針對抗TNFa藥物的中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比；(b)檢測中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比隨時間的改變；和(C)基于中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比隨時間的改變，確定對象的療程隨后的劑量或是否應當向對象施用不同的療程。
[0036]在另一個特別的方面，本發明提供用于在接受使用抗TNFa藥物的療程的對象中對抗TNF α藥物進行監測和/或優化療法的方法，所述方法包括:
(a)在時間點h如本文所述測量來自對象的第一樣品中針對抗TNFα藥物的中和性形式的自體抗體的水平或百分比； (b)在時間At1如本文所述測量來自對象的第二樣品中的中和性形式的自體抗體的水平或百分比；
(c)在時間點tn+1任選地對來自對象的η個額外的樣品重復步驟(b),其中η是從I至約 25 的整數(例如 η 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范圍)；
(d)檢測中和性形式的自體抗體的水平或百分比從時間點h至h或從時間點h至tn+1的改變；和
(e)基于中和性形式的自體抗體的水平或百分比隨時間的改變，確定對象的療程隨后的劑量或是否應當向對象施用不同的療程。
[0037]在另一個特別的方面，本發明提供用于在接受使用第一抗TNFa藥物的療程的對象中優化療法和/或降低毒性的方法，所述方法包括:
(a)通過根據本文說明的測定檢測或測量來自對象的樣品中的中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，確定針對第一抗TNFa藥物的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同的)抗TNFa藥物具有交叉反應性；和
(b)如果中和性形式的自體抗體與第二抗TNFa藥物具有交叉反應性，確定應當向對象施用不同的療程。
[0038]從以下的詳細說明和附圖中，本發明的其他目的、特征和優勢對本領域技術人員是顯而易見的。
附圖簡述
[0039]圖1說明了 Nab百分比(y軸)和ATI水平之間存在明顯的關系。
[0040]圖2說明了≥60U/ml的ATI濃度預示著Nab+。
[0041 ]圖 3 說明了 ATI 預測 Nab 的 ROC AUC 為 0.931。
[0042]圖4說明了用本發明的液相遷移率變動測定法檢測ATI。
[0043]圖5說明了本發明的示例性ATI/IFX液相遷移率變動測定法。
[0044]圖6說明了本發明的非中和性抗藥物抗體(ADA)測定法。
[0045]圖7說明了本發明的中和性ADA測定法。
[0046]圖8說明了間隔1、2或3個月取自UC患者的5個樣品中IFX和ATI水平隨時間過程的變化。
[0047]圖9顯示了確定UC患者中隨時間的游離TNF α的百分比的峰分析。
[0048]圖10說明了在間隔2或3個月取自UC患者的并摻有IFX的3個樣品中從非中和性自體抗體到中和性自體抗體的存在的轉變。
[0049]圖11顯示了確定取自UC患者的摻有IFX的樣品中隨時間的游離TNF α的百分比的峰分析。
[0050]圖12顯示了使用兔抗人IgGlFc作為非中和性抗體(Ab)對照。
[0051]圖13顯示了使用ATI陽性血清作為混合的中和性抗體(NAb)/非中和性抗體(Ab)對照。
[0052]圖14顯示了從ATI陽性血清純化ATI導致較弱親和性Nab的損失。
[0053]圖15說明了對UC患者案例研究的峰分析，以確定游離TNF α在多種對照中的百分比。
[0054]圖16說明了對CD患者案例研究的峰分析，以確定在30周的期間間隔7或8周取得的4個樣品中隨時間過程的游離TNFa的百分比。
[0055]圖17說明了對另一個CD患者案例研究的峰分析，以確定在50周的期間取得的3個樣品中隨時間過程的游離TNFa的百分比。
[0056]圖18說明了來自4個額外的CD患者案例研究中的峰分析，以確定在誘導或維持療法期間或之后的特別周時的樣品中的游離TNFa的百分比。
[0057]圖19說明了通過遷移率變動測定法檢測非中和性抗體活性。
[0058]圖20描述了 ADA對IFX和ADL的交叉反應性，其中ADA的結合位點模擬TNF α的結合位點，因而可以結合多種抗TNFa藥物。
[0059]圖21說明了 2個患者樣品(患者I和2)，其中確定了應答一種抗TNF藥物產生的Nab對于其他抗TNF藥物的交叉反應性。特別地，針對Humira(ADL)對患者接受Remicade(IFX)治療時產生的Nab進行測試。
[0060]圖22說明了檢測針對藥物例如IFX或ADL的非中和性抗體(非NAb)(頂部)或中和性抗體(NAb)(底部)的存在的本發明的測定法的示例性實施方式。
[0061]圖23說明了 Nab標準曲線的產生和使用。
[0062]圖24提供了用IFX治療，但失去了對IFX的應答的患者3的案例研究的結果，以確定針對IFX產生的Nab對ADL的交叉反應性。
[0063]圖25提供了用IFX治療，但失去了對IFX的應答的患者4的案例研究的結果，以確定針對IFX產生的Nab對ADL的交叉反應性。
[0064]圖26說明了證明ATI親和性成熟和交叉反應性ATI產生的患者研究的非限制性實例。
發明詳述 I.引目
[0065]本發明部分基于下述發現:使用大小排阻層析和任選地酸解離以使得能夠平衡免疫復合物的同質遷移率變動測定法對于測量針對生物制劑例如抗TNFa藥物產生的中和性和非中和性形式的自身抗體(例如，HACA、HAHA等)的存在或水平是特別有利的。此類自身抗體也被稱為抗藥物抗體或ADA，并且其中和性和非中和性形式也被分別稱為NAb和非NAb。
[0066]在特別的實施方式中，本發明的同質遷移率變動測定法是通過將對象的樣品與(例如熒光)經標記的生物制劑(例如抗TNF α藥物)和(例如熒光)經標記的生物制劑結合部分(例如TNFa )接觸進行的。至少由于以下原因，本文說明的測定法是有優勢的:它們避免了對移除低親和力ADA的洗脫步驟的需求；它們使用不同的標記例如熒光團，所述熒光團允許在可見、IR和/或近IR (NIR)光譜檢測，降低背景和血清干擾問題；它們由于熒光標記檢測的高靈敏度，增加了檢測對象中的低滴度的中和性或非中和性ADA的能力；并且它們以液相反應進行，從而減少通過附著到固體表面例如ELISA板導致表位的任何改變的機會。
[0067]在示例性實施方式中，本發明的測定法是有優勢的，因為它們使得能夠進行接受抗TNFa藥物療法的IBD對象的時間過程案例研究，用于監測不同時間點的多個樣品中的中和性和/或非中和性抗藥物抗體的形成。本發明的測定法也是有優勢的，因為它們使得能夠確定在對象接受抗TNFa藥物療法期間是否存在隨著時間的從非中和性抗藥物抗體至中和性抗藥物抗體的轉變。不限于任何特別理論，中和性抗藥物抗體可具有顯著的負面臨床結果，因為它們干擾抗TNF α藥物與TNF α之間的結合，從而導致效力損失。
[0068]在額外的示例性實施方式中，本發明的測定法用于預測和/或確定對象的樣品中的中和性抗藥物抗體與備選生物藥物例如其他抗TNFa藥物的交叉反應性。僅用于說明目的，如果樣品含有針對一種抗TNF α藥物的中和性ADA，這些中和性ADA將可能與其他抗TNFa藥物交叉反應并中和，使得對象的推薦的治療調整將為轉變為具有不同作用機制的藥物(例如非抗TNF劑)。然而，如果樣品含有針對一種抗TNF α藥物的非中和性ADA，對象的推薦的治療調整可為轉變為另一抗TNF α藥物。
[0069]因此，本發明通過提供用于指導接受抗TNFa藥物療法的對象的治療決定的信息，部分地解決并克服了現有的與抗TNF α藥物，例如英夫利昔單抗和阿達木單抗的施用相關的限制。本發明的方法特別用于監測接受抗TNF α藥物療法的那些對象以檢測或測量中和性ADA的形成和/或發展(例如在抗TNF α藥物療法過程中隨時間)，并且也用于檢測或測量當對象接受抗TNF α藥物療法時中和性ADA的量、百分比或比率與非中和性ADA相比隨時間的改變(例如增加)。
[0070]因此，本發明提供了這樣的方法，所述方法用于確定何時和/或如何(I)根據中和性ADA的存在、水平或百分比調整或修改(例如增加或減少)抗TNF α藥物隨后的劑量以優化治療效力和/或降低毒性，(2)根據中和性ADA的存在、水平或百分比組合抗TNF α藥物(例如以起始、增加的、減少的或相同的劑量)與一種或多種免疫抑制劑例如甲氨蝶呤(MTX)或硫唑嘌呤(AZA)，和/或(3)根據中和性ADA的存在、水平或百分比改變現有療程(例如轉變為不同的抗TNF α藥物或轉變為靶向不同機制的藥物)。此類方法用于確保接受抗TNF a藥物的對象獲得正確的劑量，即他們不發展出針對藥物的免疫應答，以及他們由于起始藥物的失敗(例如發展出針對起始抗TNFa藥物的交叉反應性中和性ADA)應當轉變為不同的藥物。
I1.定義
[0071]如本文所用，除非另有說明，以下術語具有給定的含義。
[0072]如本文所用的術語“生物制劑”或“生物活性劑”或“生物藥物”包含從生物系統(例如活生物體)生產或提取的產品和物質。生物制劑的非限制性實例包括抗體、抗體片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多價結合蛋白(例如DVD Ig),抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其改造形式及其組合。
[0073]術語“生物制劑結合部分”包括(例如特異性地)與生物制劑結合或相互作用的任何分子、活性劑或物質。在某些情況下，中和性形式的自體抗體干擾生物制劑結合部分和生物制劑之間的結合。在某些其他情況下，非中和性形式的自體抗體不干擾生物制劑結合部分和生物制劑之間的結合。作為一個非限制性實例，當生物制劑包含抗TNFa藥物時，生物制劑結合部分包含TNF α。作為另一個非限制性實例，當生物制劑包含白介素例如IL-2時，生物制劑結合部分包含白介素受體(例如白介素受體的可溶性細胞外片段)。
[0074]如本文所用的術語“抗TNFa藥物”或“TNFa抑制劑”意欲包含通過例如抑制TNFa與TNFa的細胞表面受體的相互作用、抑制TNF α蛋白生產、抑制TNFa基因表達、抑制TNFa從細胞分泌、抑制TNF α受體發信號或導致對象中TNF α活性降低的任何其他方法直接或間接抑制TNFa活性的活性劑，包括蛋白、抗體、抗體片段、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多價結合蛋白(例如DVD Ig)、小分子TNFa拮抗劑和類似的天然或非天然存在分子，和/或其重組和/或改造的形式。術語“抗TNFa藥物”或“TNFa抑制劑”優選地包括干擾TNF α活性的活性劑。抗TNF α藥物的實例包括但不限于英夫利昔單抗(REMICADE?, Johnson and Johnson)、人抗TNF單克隆抗體阿達木單抗(D2E7/HUMIRA?, Abbott Laboratories)、依那西普(ENBREL?, Amgen)、CDP571 (Celltech)，⑶P870 (Celltech)，以及其他抑制TNFa活性的化合物，使得當施用于罹患或有風險罹患TNFa活性有害的病癥(例如RA)的對象中時，病癥被治療。
[0075]術語“TNFa ”意欲包括以17kDa分泌形式和26kDa膜締合形式存在的人細胞因子，其生物學活性形式由非共價結合的17kDa分子的三聚體組成。TNFa的結構還描述于，例如Jones 等人，Nature，338:225-228 (1989)中。術語 TNF α 意欲包括人 TNF α、重組人 TNF α(rhTNF- α )或與人TNF α蛋白質具有至少約80%同一性的TNF α。人TNF α由35個氨基酸(aa)的胞質結構域、21個氨基酸的跨膜區段，以及177個氨基酸胞外結構域(ECD)組成(Pennica, D.等人(1984) Nature312:724)。在 ECD 內，人 TNFa 與恒河猴 TNF α 共有 97%的氨基酸序列同一性，并且與牛、犬、棉鼠、馬、貓、小鼠、豬和大鼠TNFa共有71%至92%的氨基酸序列同一性。可以通過標準重組表達方法或商業購買(R&D Systems，貨號210-TA，Minneapolis, Minn.)制備 TNF α。
[0076]在某些實施方式中，“TNFa ”是抗原，其包括能被抗TNF-α藥物結合的分子或者該分子的一部分。TNFa可以具有一個或一個以上的表位。在某些實例中，TNFa將以高選擇性方式與抗TNFa抗體反應。與抗體、抗TNFa抗體的片段和區域結合的優選的抗原包括人TNF α的至少5個氨基酸。在某些實例中，TNF α具有足夠長度以具有TNF α的表位，所述表位能結合抗TNF α抗體、其片段和區域。
[0077]術語“大小排阻色譜”或“SEC”包括其中溶液中的分子基于其大小和/或流體動力學體積分離的色譜方法。它用于大分子或大分子復合物例如蛋白質及其綴合物。通常，當用水性溶液運送樣品通過柱時，技術稱為凝膠過濾色譜。
[0078]術語“復合物”、“免疫復合物”、“綴合物”和“免疫綴合物”包括但不限于，結合于(例如通過非共價方式)抗TNF α藥物的TNF α、結合于(例如通過非共價方式)針對抗TNF a藥物的自體抗體(例如中和性或非中和性抗藥物抗體)的抗TNF α藥物，和結合于(例如通過非共價方式)TNFa和針對抗TNFa藥物的自體抗體(例如中和性或非中和性抗藥物抗體)的抗TNF α藥物。
[0079]如本文中所用，受術語“經標記的”修飾的實體包括與在經驗上可檢測到的另一分子或化學實體綴合的任何實體、分子、蛋白質、酶、抗體、抗體片段、細胞因子或相關種類。適合作為用于經標記的實體的標記的化學種類包括但不限于，熒光染料，例如Alexa Fluor?
染料如Alexa Fluor? 647、量子點(quantum dot)、光學染料、發光染料和放射性核素如
12510
[0080]短語“熒光標記檢測”包括檢測熒光標記的工具。用于檢測的工具包括但不限于分光光度計、熒光光度計、光度計以及通常與色譜設備，例如但不限于大小排阻高效液相色譜，例如但不限于Agilent-1200HPLC系統整合的檢測裝置。
[0081]短語“優化療法”包括優化特定療法的劑量(例如有效量或水平)和/或類型。例如，優化抗TNFa藥物的劑量包括增加或減少隨后施用給對象的抗TNF α藥物的量。在某些情況下，優化抗TNF α藥物的類型包括將施用的抗TNF α藥物從一種藥物改為不同的藥物(例如，不同的抗TNFa藥物或靶向不同機制的藥物)。在其他情況下，優化療法包括將一定劑量的抗TNFa藥物(例如，以增加的、減少的或者與以前的劑量相同的劑量)與一種或多種免疫抑制藥物組合共同施用。
[0082]術語“共同施用”包括施用一種以上的活性劑，以使一種活性劑的生理作用的持續時間與第二種活性劑的生理作用重疊。
[0083]術語“對象”、“患者”或“個體”通常指人，但也指其他動物，包括例如其他靈長類、
嚙齒類、犬、貓、馬、綿羊、豬等。
[0084]術語“療程”包括用于緩解或預防與疾病或病癥相關的一種或多種癥狀的治療方法。該術語包括施用用于改善患疾病或病癥的個體的健康的任何化合物、藥物、方法和/或方案，并包括本文中所述的任意治療劑。作為非限制性的實例，基于TNFa、抗TNF α藥物和/或抗藥物抗體的存在或濃度水平(例如，使用本發明方法確定的中和性和/或非中和性抗藥物抗體的存在、水平，或百分比)，可以改變(例如，增加或減少)療程或者當前療程的劑量。
[0085]術語“免疫抑制藥物”或“免疫抑制劑”包括能產生免疫抑制作用(例如防止或減少免疫應答)的任何物質，例如通過輻射或者通過施用藥物，如抗代謝物、抗淋巴細胞血清、抗體等。免疫抑制藥物的實例包括但不限于，巰基嘌呤藥物如硫唑嘌呤(AZA)及其代謝物；抗代謝物如甲氨蝶呤(MTX);西羅莫司(納巴霉素)；坦羅莫司；依維莫司；他克莫司(FK-506)；FK-778 ;抗淋巴細胞球蛋白抗體、抗胸腺細胞球蛋白抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體和抗體-毒素綴合物；環孢霉素；麥考酹酯(mycophenolate);咪唑立賓單磷酸(mizoribinemonophosphate);蒿屬香豆素；格拉默醋酸鹽(glatiramer acetate);其代謝物；其制藥學上可接受的鹽；其衍生物；其前體藥物；及其組合。
[0086]術語“巰基嘌呤藥物”包括硫唑嘌呤(AZA)、6_巰基嘌呤(6-MP)或者具有治療作用的其任意代謝物，并且包括但不限于，6-硫代鳥嘌呤(6-TG)、6-甲基巰基嘌呤核苷、6-硫代肌苷核苷酸(例如，6-硫代肌苷單磷酸(thioinosine monophosphate )>6-硫代肌苷二磷酸(6-thioinosine diphosphate)、6_ 硫代肌苷三憐酸(6_thioinosine triphosphate))、6-硫鳥嘌呤核苷酸(例如，6-硫代鳥嘌呤單磷酸、6-硫鳥嘌呤二磷酸、6-硫鳥嘌呤三磷酸)、6-硫代黃苷(thioxanthosine)核苷酸(例如,6-硫代黃苷單磷酸、6-硫黃苷二磷酸、6-硫黃苷三磷酸)，其衍生物、其類似物及其組合。
[0087]術語“樣品”包括獲自個體的任何生物樣本。樣品包括但不限于，全血、血漿、血清、紅血細胞、白血細胞(例如，外周血單核細胞(PBMC)、多形核(PMN)細胞)、導管灌洗液、乳頭吸出物、淋巴(例如，淋巴結的彌散性腫瘤細胞)、骨髓吸出物、唾液、尿液、糞便(即，大便)、痰、支氣管灌洗液、淚液、細針吸出物(例如，通過隨機的乳暈細針吸出獲取)、任意其他體液、組織樣品如炎癥位點的活檢(例如，穿刺活檢)、其細胞提取物，以及來源于一種或多種這些體液或組織的免疫球蛋白富集級分。在一些實施方式中，樣品是全血、其分級組分，如血漿、血清或細胞沉淀，或者其免疫球蛋白富集級分。本領域技術人員應當理解，可以在分析前稀釋樣品，如血清樣品。在某些實施方式中，使用本領域已知的任何技術，可以通過分離PBMC和/或PMN細胞獲得樣品。在某些其他實施方式中，樣品是例如來自炎癥位點(如胃腸道或滑膜組織的一部分)的組織活檢。
[0088]本發明方法的步驟不需要必須以它們所顯示的特定順序進行。本領域技術人員應當理解，本發明方法的步驟的其他順序包括在本發明范圍內。
[0089]括號，“[]”表示括號內的種類以其濃度提及。
II1.實施方式說明
[0090]本發明提供用于檢測和測量樣品中針對生物制劑例如抗TNFa藥物治療劑的中和性和非中和性自體抗體的存在或水平的測定。本發明用于當對象接受生物制劑療法(例如抗TNFa藥物療法)時監測中和性和/或非中和性抗藥物抗體的形成。本發明也用于預測和/或確定對象樣品中的中和性抗藥物抗體與備選生物制劑療法(例如備選抗TNFa療法)的交叉反應性。因此，本發明提供用于指導接受使用生物活性劑療法的對象的治療決定的信息，以及改善對生物療法的優化療法、降低毒性和/或監測治療效力的準確度。
[0091]在一方面，本發明提供用于檢測樣品中針對生物制劑的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸，以形成:
(i)經標記的生物制劑和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的生物制劑、經標記的生物制劑結合部分，和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的生物制劑結合部分、游離的經標記的生物制劑，和/或經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如，通過測量只含游離的經標記的生物制劑結合部分的參考樣品在SEC后游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC)，從而檢測中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在。
[0092]在一些實施方式中，中和性形式的自體抗體干擾生物制劑和生物制劑結合部分之間的結合。在其他實施方式中，非中和性形式的自體抗體不干擾生物制劑和生物制劑結合部分之間的結合。
[0093]在一些情況下，游離的經標記的生物制劑結合部分由實質上不含結合的生物制劑(例如經標記的和/或未標記的生物制劑)的經標記的生物制劑結合部分組成。
[0094]在某些實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相同或實質上相同時，檢測到中和性形式的自體抗體。在某些其他實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相比降低(例如實質上降低)或不存在(例如不可檢測)時，檢測到非中和性形式的自體抗體。
[0095]在特別的實施方式中，當步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平是對照樣品中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平的至少約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%時，它被認為與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平實質上相同。在特別的實施方式中，當步驟(c)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平比對照樣品中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平的低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%時，它被認為與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相比實質上降低。
[0096]在一些實施方式中，游離的經標記的生物制劑結合部分的水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC)進行積分測量的。
[0097]在一些實施方式中，生物制劑包括抗體(例如抗TNFa單克隆抗體)、抗體片段、蛋白質(例如細胞因子諸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多價結合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其改造形式及其組合。
[0098]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受生物制劑療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)、炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(CD)或潰瘍性結腸炎(UC))或癌癥。
[0099]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對生物制劑的自體抗體。在其他實施方式中，生物制劑自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)，和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0100]另一方面，本發明提供用于測量樣品中針對生物制劑的中和性形式的自體抗體的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸，以形成:
(i)經標記的生物制劑和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的生物制劑、經標記的生物制劑結合部分和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)； (b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的生物制劑結合部分、游離的經標記的生物制劑，和/或經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的生物制劑結合部分的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC));和 (d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平與對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比(例如，通過測量并標準化只含游離的經標記的生物制劑結合部分的參考樣品在SEC后游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC，以計算游離的經標記的生物制劑結合部分的水平或百分比)，其中對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比對應于中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0101]在一些實施方式中，對照樣品中游離的經標記的生物制劑結合部分的經標準化的水平或百分比與步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平之間的差異對應于非和中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0102]在一些情況下，游離的經標記的生物制劑結合部分由實質上不含結合的生物制劑(例如經標記的和/或未標記的生物制劑)的經標記的生物制劑結合部分組成。
[0103]在特別的實施方式中，對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平或百分比是通過測量經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分之間形成的復合物(例如“經標記的復合物”)的峰面積(例如通過測量AUC)，并然后從游離的經標記的生物制劑結合部分的峰面積(例如通過測量游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC)減去經標記的復合物的測量的峰面積而標準化的。
[0104]在某些實施方式中，游離的經標記的生物制劑結合部分的水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的生物制劑結合部分峰的曲線下面積(AUC)進行積分測量的。在其他實施方式中，在經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分之間形成的復合物的水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的生物制劑結合部分峰的AUC進行積分測量的。
[0105]在某些實施方式中，針對生物制劑(例如ADA)的自體抗體的亞群是中和性形式的自體抗體(例如NAb)。在一些實施方式中，樣品中針對生物制劑的自體抗體的總水平可通過將根據本發明的方法測量的中和性和非中和性形式的自體抗體的水平相加而計算。
[0106]在一些實施方式中，步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平還與陰性對照、陽性對照或其組合比較。在其他實施方式中，步驟(d)中確定的中和性形式的自體抗體(例如NAb)的百分比與從健康對照(例如正常人血清)建立的截斷值或參考范圍相比較。在一些實施方式中，截斷值或參考范圍表示為樣品為了被認為是NAb陽性所必須具有的NAb的閾值百分比。在此類實施方式中，當步驟(d)中確定的NAb的百分比大于或等于從健康對照建立的截斷值或參考范圍時，樣品被認為是NAb陽性。在其他實施方式中，當步驟(d)中確定的NAb的百分比小于從健康對照建立的截斷值或參考范圍時，樣品被認為是NAb陰性。截斷值或參考范圍的非限制性的實例包括例如至少約0.25%,0.50%,0.75%、
1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、2.60%、2.70%、2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、
3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、
4.50%,5.00%,5.50%,6.00%,6.50%,7.00%,7.50%,8.00%,8.50%,9.00%,9.50%、10.00%NAb,或其中任何范圍。
[0107]在一些實施方式中，所有的針對生物制劑的自體抗體都是中和性抗體，且樣品被定義為含有100%的中和性抗藥物抗體(NAb)和/或0%非中和性抗藥物抗體(非NAb)。在此類實施方式中，步驟(C)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平大體上與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相同，并且自體抗體被預測完全阻斷或干擾生物制劑和生物制劑結合部分之間的結合。
[0108]在其他實施方式中，沒有自體抗體是中和性自體抗體，且樣品被定義為含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此類實施方式中，與對照樣品中的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平相比，步驟(c)中測量的游離的經標記的生物制劑結合部分的水平通常為不存在，并且自體抗體被預測不完全阻斷或干擾生物制劑和生物制劑結合部分之間的結合。
[0109]在其他實施方式中，當中和性和非中和性形式的自體抗體均存在于樣品中時，兩類抗體的百分比可以它們本身表示(例如50%NAb或50%非NAb被定義為樣品中相等比例的NAb和非NAb)或以比例表示。在某些情況下，比例是通過NAb的百分比除以非NAb的百分比計算的，或者反之亦然。在其他情況下，比例是通過NAb的水平除以非NAb的水平計算的，或者反之亦然。
[0110]在一些實施方式中，生物制劑包括抗體(例如抗TNFa單克隆抗體)、抗體片段、蛋白質(例如細胞因子諸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多價結合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其改造形式及其組合。
[0111]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受生物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)、炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(CD)或潰瘍性結腸炎(UC))或癌癥。
[0112]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對生物制劑的自體抗體。在其他實施方式中，生物制劑自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0113]在另一方面，本發明提供用于確定針對第一生物制劑的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同)生物制劑具有交叉反應性的方法，所述方法包括:
(a)根據本文說明的測定法檢測或測量樣品中的中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，以確定樣品是中和性形式的自體抗體陽性或陰性的；和
如果樣品是中和性形式的自體抗體陽性的，則:
(b)將樣品與經標記的第二生物制劑接觸，以形成經標記的第二生物制劑和中和性形式的自體抗體的經標記的復合物(即其中經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；
(C)對經標記的復合物進行大小排阻色譜以分離經標記的復合物(即與游離的經標記的第二生物制劑分離)；和
(d)檢測經標記的復合物，從而確定針對第一生物制劑的中和性形式的自體抗體是否與第二生物制劑具有交叉反應性。
[0114]在某些實施方式中，經標記的復合物的存在指示針對第一生物制劑的中和性自體抗體與第二生物制劑具有交叉反應性，即中和性自體抗體將抑制第一和第二生物藥物的活性。
[0115]在某些其他實施方式中，經標記的復合物的不存在指示針對第一生物制劑的中和性自體抗體不與第二生物制劑具有交叉反應性，即中和性自體抗體將不會抑制第二生物藥物的活性。[0116]在一些實施方式中，第一和第二生物制劑獨立地選自抗體(例如抗TNFa單克隆抗體)、抗體片段、蛋白質(例如細胞因子諸如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多價結合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其改造形式及其組合。
[0117]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受生物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)、炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(CD)或潰瘍性結腸炎(UC))或癌癥。
[0118]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對生物制劑的自體抗體。在其他實施方式中，生物制劑自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0119]在某些方面，本發明的測定方法還包括酸解步驟，所述步驟包括在將樣品與經標記的生物制劑和經標記的生物制劑結合部分接觸之前、期間和/或之后將樣品與酸接觸。
[0120]在某些其他方面，本發明的測定方法包括檢測樣品中針對生物制劑的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的一種或多種同種型的存在或水平。
[0121]在一個特別的方面，本發明提供用于檢測樣品中針對抗TNFa藥物的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的抗TNFa藥物和經標記的TNFα接觸，以形成:
(i)經標記的抗TNF α藥物和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的抗TNFa藥物、經標記的TNFa和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的TNF a、游離的經標記的抗TNF α藥物，和/或經標記的抗TNF a藥物和經標記的TNF α的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的TNFa的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中游離的經標記的TNF α的水平(例如，通過測量只含游離的經標記的TNF α的參考樣品在SEC后游離的經標記的TNF α峰的AUC)，從而檢測中和性和/或非中和性形式的自體抗體的存在。
[0122]在一些實施方式中，中和性形式的自體抗體干擾抗TNFa藥物和TNFa之間的結合。在其他實施方式中，非中和性形式的自體抗體不干擾抗TNFa藥物和TNFa之間的結
合ο
[0123]在一些情況下，游離的經標記的TNF α由實質上不含結合的抗TNF α藥物(例如經標記的和/或未標記的抗TNF α藥物)的經標記的TNF α組成。
[0124]在某些實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中的游離的經標記的TNFa的水平相同或實質上相同時，檢測到中和性形式的自體抗體。在某些其他實施方式中，當在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中的游離的經標記的TNFa的水平相比降低(例如實質上降低)或不存在(例如不可檢測)時，檢測到非中和性形式的自體抗體。[0125]在特別的實施方式中，當步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平是對照樣品中測量的游離的經標記的TNFa的水平的至少約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 時，它被認為與對照樣品中游離的經標記的TNFa的水平實質上相同。在特別的實施方式中，當步驟(C)中測量的游離的經標記的TNF α的水平比對照樣品中測量的游離的經標記的TNF α水平低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%時，它被認為與對照樣品中游離的經標記的TNFa的水平相比實質上降低。
[0126]在某些實施方式中，游離的經標記的TNFa水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC)進行積分測量的。
[0127]在一些實施方式中，抗TNF α藥物選自REMICADETM(英夫利昔單抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA? (阿達木單抗)、CIMZIA? (賽妥珠單抗)、SIMPONI? (戈利木單抗；CNT0148)及其組合。
[0128]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受抗TNFa藥物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有TNFa介導的疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)或炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(⑶)或潰瘍性結腸炎(UC))。
[0129]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對抗TNFa藥物的自體抗體。在其他實施方式中，抗TNF α藥物自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)，和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0130]在另一方面，本發明提供用于測量樣品中針對抗TNF α藥物的中和性形式的自體抗體的水平或百分比的方法，所述方法包括:
(a)將樣品與經標記的抗TNFα藥物和經標記的TNF α接觸，以形成:
(i)經標記的抗TNF α藥物和自體抗體的第一經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第一經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著)；和/或
(?)經標記的抗TNFa藥物、經標記的TNFa和自體抗體的第二經標記的復合物(即免疫復合物或綴合物)(即其中第二經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(b)對第一經標記的復合物和/或第二經標記的復合物進行大小排阻色譜以將它們與游離(即未結合)的經標記的TNF α、游離的經標記的抗TNF α藥物和/或經標記的抗TNF a藥物和經標記的TNF α的復合物分離；
(c)在大小排阻色譜后測量游離的經標記的TNFa的水平(例如通過在大小排阻色譜(SEC)后測量游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC));和
(d)比較在步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平與對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比(例如，通過測量并標準化只含游離的經標記的TNF α的參考樣品在SEC后游離的經標記的TNF α峰的AUC’以計算游離的經標記的TNF a的水平或百分比)，其中對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比對應于中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0131]在一些實施方式中，對照樣品中游離的經標記的TNFa的經標準化的水平或百分比與步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平的差異對應于非和中和性形式的自體抗體的水平或百分比。
[0132]在一些情況下，游離的經標記的TNFa由實質上不含結合的抗TNF α藥物(例如經標記的和/或未標記的抗TNF α藥物)的經標記的TNF α組成。
[0133]在特別的實施方式中，對照樣品中游離的經標記的TNFa水平或百分比是通過測量經標記的抗TNF α藥物和經標記的TNF α之間形成的復合物(例如“經標記的復合物”)的峰面積(例如通過測量AUC)，然后從游離的經標記的TNF α的峰面積(例如通過測量游離的經標記的TNF α峰的AUC)減去經標記的復合物的測量的峰面積而標準化的。
[0134]在某些實施方式中，游離的經標記的TNFa的水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的TNFa峰的曲線下面積(AUC)進行積分測量的。在其他實施方式中，在經標記的抗TNFa藥物和經標記的TNFa之間形成的復合物的水平是通過對來自大小排阻色譜(例如SEC-HPLC)的作為洗脫時間的函數的信號強度圖的游離的經標記的TNFa峰的AUC積分測量的。
[0135]在某些實施方式中，針對抗TNFa藥物(例如ADA)的自體抗體的亞群是中和性形式的自體抗體(例如NAb)。在一些實施方式中，樣品中針對抗TNFa藥物的自體抗體的總水平可通過將根據本發明的方法測量的中和性和非中和性形式的自體抗體的水平相加而計笪
[0136]在一些實施方式中，步驟(C)中測量的游離的經標記的TNFa的水平還與陰性對照、陽性對照或其組合比較。陰性對照的非限制性實例包括小鼠單克隆抗人IgG1Fc樣品和/或兔單克隆抗人IgG1Fc樣品。陽性對照的非限制性實例包括混合的ADA陽性患者血清樣品和/或針對抗TNFa藥物的F(ab’)2片段的兔多克隆抗體的樣品。
[0137]在其他實施方式中，步驟(d)中確定的中和性形式的自體抗體(例如NAb)的百分比與從健康對照(例如正常人血清)建立的截斷值或參考范圍相比較。在特別的實施方式中，截斷值或參考范圍表示為樣品為了被認為是NAb陽性所必須具有的NAb的閾值百分比。在此類實施方式中，當步驟(d)中確定的NAb的百分比大于或等于從健康對照建立的截斷值或參考范圍時，樣品是NAb陽性。在其他實施方式中，當步驟(d)中確定的NAb的百分比小于從健康對照建立的截斷值或參考范圍時，樣品是NAb陰性。截斷值或參考范圍的非限制性的實例包括例如至少約 0.25%,0.50%,0.75%、1.00%、1.50%,2.00%,2.50%,2.60%,2.70%、
2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、
3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%、6.00%、6.50%、7.00%、
7.50%、8.00%、8.50%、9.00%、9.50%、10.00%NAb,或其中任何范圍。在一些情況下,截斷值或參考范圍是約3.00%NAb 或約3.06%NAb或在3.00%-3.10%NAb之間。
[0138]在一些實施方式中，所有的針對抗TNFa藥物的自體抗體都是中和性抗體，并且樣品被定義為含有100%中和性抗藥物抗體(NAb)和/或0%非中和性抗藥物抗體(非NAb)。在此類實施方式中，步驟(c)中測量的游離的經標記的TNFa的水平大體上與對照樣品中的游離的經標記的TNFa水平的相同，并且自體抗體被預測完全阻斷或干擾抗TNFa藥物和TNF α之間的結合。
[0139]在某些實施方式中，沒有針對抗TNF α藥物的自體抗體是中和性抗體，并且樣品被定義為含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此類實施方式中，步驟(C)中測量的游離的經標記的TNF α的水平大體上與對照樣品中的游離的經標記的TNF α水平相比是不存在(例如不可檢測)，并且自體抗體被預測不完全阻斷或干擾抗TNFa藥物和TNFa之間的結
口 O
[0140]在其他實施方式中，當中和性和非中和性形式的自體抗體均存在于樣品中時，兩類抗體的百分比可以其本身表示(例如50%NAb或50%非NAb被定義為樣品中相等比例的NAb和非NAb)或以比例表示。在某些情況下，比例是通過NAb的百分比除以非NAb的百分比計算的，或者反之亦然。在其他情況下，比例是通過NAb的水平除以非NAb的水平計算的，或者反之亦然。
[0141]在一些實施方式中，抗TNFa藥物選自REMICADE?(英夫利昔單抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿達木單抗)、CIMZIA? (賽妥珠單抗)、SIMPONI? (戈利木單抗；CNT0148)及其組合。
[0142]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受抗TNFa藥物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在特別的實施方式中，對象患有TNFa介導的疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)或炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(⑶)或潰瘍性結腸炎(UC))。
[0143]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對抗TNFa藥物的自體抗體。在其他實施方式中，抗TNF α藥物自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0144]在另一個特別的方面，本發明提供用于確定針對第一抗TNFa藥物的中和性形式的自體抗體是否與第二(即不同)抗TNFa藥物具有交叉反應性的方法，所述方法包括:
(a)根據本文說明的測定法檢測或測量樣品中的中和性形式的自體抗體的存在、水平或百分比，以確定樣品是中和性形式的自體抗體陽性或陰性的；和
如果樣品是中和性形式的自體抗體陽性的，則:
(b)將樣品與經標記的第二抗TNFa藥物接觸，以形成經標記的第二抗TNFα藥物和中和性形式的自體抗體的經標記的復合物(即其中經標記的復合物的組分不是彼此共價地附著);
(C)對經標記的復合物進行大小排阻色譜以分離經標記的復合物(即與游離的經標記的第二抗TNF α藥物分離)；和
(d)檢測經標記的復合物，從而確定針對第一抗TNF α藥物的中和性形式的自體抗體是否與第二抗TNF α藥物具有交叉反應性。
[0145]在某些實施方式中，經標記的復合物的存在指示針對第一抗TNFa藥物的中和性自體抗體與第二抗TNF α藥物具有交叉反應性，即中和性自體抗體將抑制第一和第二抗TNFa藥物的活性。
[0146]在某些其他實施方式中，經標記的復合物的不存在指示針對第一抗TNFa藥物的中和性自體抗體不與第二抗TNFa藥物具有交叉反應性，即中和性自體抗體將不抑制第二抗TNF α藥物的活性。
[0147]在特別的實施方式中，第一和第二抗TNFa藥物獨立地選自REMICADE?(英夫利昔單抗)、ENBREL?(依那西普)、HUMIRA?(阿達木單抗)、CIMZIA? (賽妥珠單抗)、
SIMPONI? (戈利木單抗；CNT0148)及其組合。[0148]在其他實施方式中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如來自接受抗TNFa藥物療法的對象。在優選的實施方式中，樣品是血清。在【具體實施方式】中，對象患有TNF α介導的疾病或病癥，例如自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)或炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)例如克羅恩病(⑶)或潰瘍性結腸炎(UC))。
[0149]在某些實施方式中，樣品含有或被懷疑含有針對抗TNFa藥物的自體抗體。在其他實施方式中，抗TNF α藥物自體抗體包括但不限于人抗嵌合抗體(HACA)、人抗人源化抗體(HAHA)和人抗小鼠抗體(HAMA)及其組合。
[0150]在某些方面，本發明的測定方法還包括酸解步驟，所述步驟包括在將樣品與經標記的抗TNF α藥物和經標記的TNF α接觸之前、期間和/或之后將樣品與酸接觸。
[0151]使用酸解檢測抗藥物抗體的方法在本文和2012年2月16日提交的PCT申請號PCT/US2012/025437中說明，出于全部目的將其公開內容在此以整體并入作為參考。
[0152]在某些其他方面，本發明的測定方法包括檢測樣品中針對抗TNFa藥物的中和性和/或非中和性形式的自體抗體的一種或多種同種型的存在或水平。作為非限制性實例，本發明的測定法能夠用于確定來自接受抗TNF α藥物例如REMICADE? (英夫利昔單抗)或HUMIRA?(阿達木單抗)的ADA陽性患者的樣品中不同的中和性和/或非中和性ADA同種型。在某些實施方式中，所述一種或多種同種型包含至少兩種、三種、四種、五種或更多的同種型。在其他實施方式中，所述一種或多種同種型選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同種型、其亞類及其組合。在某些實施方式中，每個自體抗體同種型通過其保留時間表征、鑒定，和/或檢測。在其他實施方式中，每個自體抗體同種型是根據信號表征、鑒定，和/或檢測的，所述信號由檢測器部分例如經標記的抗TNFa藥物和不同抗體同種型特異性的經標記的抗Ig抗體的臨近結合產生。在一些情況下，信號包含熒光信號，所述熒光信號可用熒光共振能量轉移(FRET)檢測。
[0153]檢測抗藥物抗體(ADA)同種型的方法在PCT
【發明者】S·豪恩施泰因, L·奧爾穆德, S·辛格, S·L·王 申請人:雀巢產品技術援助有限公司
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