專利名稱：：一種檢測抗體親和力的方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥生物類，具體地是涉及一種檢測抗體親和力的方法。
背景技術：
：抗體親和力是確定抗體性質的重要參數之一，同時，也是雜交瘤所分泌的單克隆抗體(McAb)穩定性的重要指標。它表示抗體與抗原結合的緊密程度。高親和力的抗體對于定量檢測及導向診治是有用的，而低親和力的抗體用于免疫純化較好。因此，要根據應用的目的選擇具有一定親和力的抗體，就需要先對抗體親和力進行檢測。抗體親和力是指抗體和抗原結合的牢固程度，常用親和常數Ka表示。Ka是iH/逆向反應速率常數的比值，單位為稀釋度單位(L/mo1)，表示需將lmol抗體稀釋至多少升，才能使抗原-抗體結合下降50%;而Ka的倒數為解離常數(Kd)，其單位為濃度單位(mol/L)。為了提高免疫分析的靈敏度、精密度和準確度，選用Ka值高的抗體或抗血清是非常關鍵的。目前對于抗體親和力的檢測一般采用平衡透析法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或放射免疫分析(RIA)的競爭結合試驗等。平衡透析法的全部抗原抗體反應過程在均一液相體系中完成，反應的動力學過程受到的干擾因素較少，基本上完全符合質量作用定律的前提條件要求。但該法僅能測定小分子抗原與相應抗體間的親和常數，同時要求將反應底物進行放射性標記，反應完成后又需將抗原抗體復合物與游離抗原抗體分開，實驗過程繁瑣、復雜，不易廣泛開展。RIA雖然靈敏度高，但會造成放射性污染和危害，且存在常用放射性核素半衰期短、無法自動化分析等諸多不足。理論上采用非競爭性ELISA法測定抗體親和常數還不十分完善。ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。同時，抗原的包被需4'C過夜，并且有多步的洗漆步驟，所需時間比較長。液相芯片系統是生物芯片領域已經發展成熟的一項技術。液相芯片系統包括Luminex儀器和不同熒光編碼的微球等。Luminex儀器是一自動化程度極高的檢測和分析儀器。熒光編碼的微球目前共有IOO種，可檢測IOO種與之相偶聯的不同種類的目標分子。將這些微球懸浮于一個液相體系中，就可以對同一個樣品中的多個不同的檢測對象同時進行檢測，這種檢測技術稱為xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling)技術。在微球的制造過程中，摻入了兩種不同的紅色熒光染料，根據這兩種染料的比例不同，可以把微球分為100種。在液相芯片系統中，為了區分不同的探針，每一種用于標記探針的微球都帶有一個獨特的熒光編碼。不同的微球共價結合了針對不同待檢測物的蛋白(抗體或抗原，用于免疫檢測)作為探針分子，檢測抗體中以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、檢測抗體、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統的讀取。Luminex閱讀系統分別激發紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應物的類型；而綠色激光則檢測樣本中熒光標記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統計分析激光所檢測到微球種類、數量，從而判定待測樣本多種目標測試物的濃度。液相芯片平臺的優勢-(1)高通量，多指標并行檢測液相芯片可對同一樣本中不同分子同時進行分析，在35-60分鐘內可對多達100種不同指標進行檢測；與傳統方法的逐個檢測相比，這是一個質的飛躍。(2)敏感度高，重復性好傳統的酶聯免疫吸附(ELISA)技術和平面芯片技術是對分子集合的光信號進行檢測得到結果，且只實現到半定量檢測；而液相芯片技術則可實現定量檢測，對單個微球熒光信號進行檢測，計算100個微球熒光值，取其中值(Median),所以精確度高，重復性好。早期使用液相蛋白芯片的雙抗體夾心法來進行細胞因子的研究己經證明此類技術的靈敏度及檢測范圍比ELISA高出許多。(3)操作簡單，節約時間，樣品與成本液相芯片反應在懸浮的液相中進行，液相環境可以更好地保持蛋白的天然構象和活性，也更有利于探針和被檢測物的反應，所以反應時間短。反應后通常不用清洗即可以直接檢測，克服了平面固相芯片探針點樣式容易發生點樣錯位、耗時、平行等量加樣困難、加樣頭反復加樣易發生樣本間污染、重復性差等缺點，檢測效率大大高于平面固相芯片。
發明內容本發明需要解決的技術問題是提供一種穩定可靠，操作簡單的同時檢測多種抗體親和力的方法。解決上述技術問題的技術方案是一種檢測抗體親和力的方法，包括以下步驟(1)抗原包被微球-將50uL的微球活化，活化后的微球離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH=5.0的200-300yL50rnM的MES緩沖液的溶液中，渦漩振蕩10-30s，超聲振蕩10-30S;微球離心；該步驟重復一次；-吸棄上清，將微球重懸于100uL50mM的MES緩沖液(pH5.0)中，渦漩振蕩約10-30s，超聲振蕩約10-30s;-往懸浮的微球中加入0.8-1.2ug抗原，用50mM的MES緩沖液(pH5.0)溶液將總體積補至450-550pL;用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-3hr;-偶聯抗原后的微球離心；-吸棄上清，將微球重懸于500uLPBS-TBN(即PBS中含O.1%BSA，0.02%Tween—20，0.05%NaN，pH7.4)溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;室溫避光振蕩30min;_將偶聯抗原后的微球離心，吸棄上清，將微球重懸于0.8-1.2mLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩10-30s，超聲約10-30s后將微球離心；重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于250-1000PLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通過計數后于2-8'C避光保存；(2)抗體親和力的檢測-取出96微孔濾板，確定和標記位置；將待檢測的抗體進行梯度稀釋，例如稀釋至濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、10—^g/ml;將不同濃度的抗體；分別對應加入到濾板的微孔中，每孔的量為23-28^1;-抗原包被的微球渦漩振蕩，超聲處理后稀釋至35-45個Ail;-在微孔中分別加入抗原包被的微球25^tl，37'C振蕩孵育25-35min;-抽濾，洗板三次。-每孔加入45-55^1的2ng/ml藻紅蛋白標記的抗抗體(PE-Ab)，37'C左右振蕩孵育25-35min;-抽濾，洗板三次；-讀取熒光值；(3)數據處理。抗體親和常數K的計算方法與酶促反應的米-曼氏常數類似。在抗原濃度不變的情況下，將已知濃度的抗體(M)進行梯度稀釋。設抗體濃度高時與酶標抗原的結合率為100%(稱最大結合率，MFI值最高)，則結合率為50%所對應的抗體濃度的倒數值即為親和力。根據這一原理，發明人設計了以下的數據處理方法-將抗體濃度轉換為單位是mol/L:-以10為底取對數，再取相反數；-以上述算出的數據作橫坐標，以對應MFI值作縱坐標，作平滑曲線-擬合出曲線方程-抗體高濃度平臺MFI值減去低濃度平臺MFI值，除以二，代入上述曲線方程，算出的對應橫坐標數值即可作為該抗體與抗原親和力的一個代表值。也可繼續按上述步驟逆向運算得出抗體的親和常數(L/mo1)。優選地，所述微球活化包括以下步驟-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約20s;-取50uL微球離心；-去掉上清夜,將微球重懸于100yL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，離心；-吸棄上清，加入80pL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s;-力口入10"50mg/n￡Sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimidesodiumsalt，N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-力卩入10liL50mg/mLEDC(l-Ethyl-3-(3-ditnethyllaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,卜乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。優選地，所述離心的速度》8000g,時間為1-2min。本發明利用抗原、PE標記抗體在液相芯片平臺上建立一種全新的抗體親和力檢測方法，具有以下優點-1)應用于液相芯片檢測技術平臺的原料質檢和抗體篩選，本發明的檢測方法不需反復洗滌，簡單快捷；2)敏感度高，重復性好，檢測結果更加穩定可靠；3)能同時對多種抗體進行親和力檢測，大大提高檢測效率。圖l是實施例l檢測結果示意圖；圖2是實施例2檢測結果示意圖；圖3是實施例3檢測結果示意圖。具體實施例方式以下結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明。實施例中，所述各種溶液的配方如下1.50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例1以P—HCG(P-subunithumanchorionicgonadotropin,人絨毛膜促性腺激素P亞單位)的三種不同抗體(克隆號分別為M94139.7,220-5011，220-5013)的親和力檢測為例。所述抗體親和力檢測方法的步驟如下抗原包被微球_用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球(美國Luminex公司)，大約20s;-取50uL微球于1.5ml的離心管中，》8，000g的速度離心l-2min;-去掉上清夜，將微球重懸于100uL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，>8000g的速度離心l一2min;-吸棄上清，加入80yL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s;-加入10uL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-加入10uL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻；—活化后的微球，》8000g，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于250uL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，微球》8000g，離心l-2min;重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于100txL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;-往懸浮的微球中加入1ygP—HCG抗原，用50mM的MES(pH5.O)溶液將總體積補至500nL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩2hr;-偶聯抗原后的微球以》8000g的速度，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于500uLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;-室溫避光振蕩30min;—微球》8000g，離心1-2min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，微球于》8000g，離心1-2min;重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于250-1000yLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通過luminex儀器計數；-包被好的微球置于2-8'C避光保存。抗體親和力的檢測-取出96微孔濾板，確定和標記位置；-將e—HCG抗體(克隆號分別為M94139.7,220-5011，220-5013)分別進行梯度稀釋，稀釋至濃度分別為20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002ng/ml，按標記位置分別加入到濾板微孔中；-抗原包被的微球渦漩振蕩(vortex)30s，超聲處理lmin，將抗原包被的微球稀釋至40-濾板微孔中分別加入抗原包被的微球25pl(即1，000個/孔)和抗體25pl，37。C震蕩孵育30min。-抽濾，洗板三次。_分別加入相應的50pl的2叫/mlPE-Ab(藻紅蛋白標記的抗抗體)，37'C避光振蕩孵育30min。-抽濾，洗板三次。-上機讀熒光值。-數據處理-將抗體濃度轉換為單位是mol/L;-以10為底取對數，再取相反數；-以上述算出的數據作橫坐標，以對應MFI值作縱坐標，作平滑曲線-擬合出曲線方程；_抗體高濃度平臺MFI值減去低濃度平臺MFI值，除以二，代入上述曲線方程，算出的對應橫坐標數值即可作為該抗體與抗原親和力的一個代表值。也可繼續按上述步驟逆向運算得出抗體的親和常數(L/mo1)。實驗結果以e—HCG為例表中MFI值即熒光值，M94139.7，220-5011，220-5013分別為P—HCG的三種不同抗體。表l嗎/ralmol/L濃度的負對數M94139.7(MFI值)220-5011(MFI值)220-5013(MFI200.0001253.90308998727734.54327.52723420.00001254.90308998727391395.524628.50.20.000001255.90308998725055.529.552960.020.0000001256.9030899872714.514.52250.0021.25E-087.903089987119.57220.00021.25E-098.903089987201210結果計算如下M94139.7抗體親和常數的計算y=(27734.5-20)/2=13857代入公式y=-22341x+156936解得x=6.404312699親和常數1(=1/(10-"薩柳)=2.50E+06同理，可計算220-5011和220-5013兩種抗體的親和常數，分別為2.85E+04,2.97E+05實施例2PSA(ProstateSpecificAntigen,前列腺特異性抗原)的三種抗體(克隆號分別為M701042,PS5，BM215)親和力檢測。所用方法與實施例1的步驟相同。結果如下，表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結果計算如下M701042抗體親和常數的計算y=(6323.5-438.5)/2=2942.5，代入公式y=-4447.5x+38174，解得x3.92164親和常數K-1/(10—792164)=8.35E+07同理，可計算PS5和BM215兩種抗體的親和常數，分別為9.70E+07,7.66E+07。實施例3TNF-a(Tumornecrosisfactor-alpha,腫瘤壞死因子a)的三種抗體(克隆號分別為TNF-aF6，D2，28401.111)親和力檢測。所用方法與實施例l的步驟相同。結果如下，表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結果計算如下TNF-aF6抗體親和常數的計算y=(10233.5-2)/2=5116.75，代入公式y=-4981.5x+26157，解得x=4.2237親和常數K-1/(10—42237)=1.67E+04同理，可計算D2和28401.Ill兩種抗體的親和常數，分別為5.86E+04,6.97E+0L權利要求1.一種檢測抗體親和力的方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)抗原包被微球-將50μL的微球活化，活化后的微球離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH＝5.0的200-300μL50mM的MES緩沖液的溶液中，渦漩振蕩10-30s，超聲振蕩10-30s；微球離心；該步驟重復一次；-吸棄上清，將微球重懸于100μL50mM的MES緩沖液(pH5.0)中，渦漩振蕩約10-30s，超聲處理約10-30s；-往懸浮的微球中加入0.8-1.2μg抗原，用50mM的MES緩沖液(pH5.0)溶液將總體積補至450-550μL；用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-3hr；-將偶聯了抗原后的微球離心；-吸棄上清，將微球重懸于500μLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；室溫避光振蕩30min；-將偶聯了抗原的微球離心，吸棄上清，將微球重懸于0.8-1.2mLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩10-30s，超聲約10-30s后將微球離心；重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于250-1000μLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通過計數后于2-8℃避光保存；(2)抗體親和力的檢測-取出微孔濾板，確定和標記位置；將待檢測的抗體進行梯度稀釋；將不同濃度的抗體，分別對應加入到濾板的微孔中，每孔的量為23-28μl；-抗原包被的微球渦漩振蕩，超聲處理后稀釋至35-45個/μl；-在微孔中分別加入抗原包被的微球25μl，37℃左右震蕩孵育25-35min；-抽濾，洗板三至五次；-每孔分別加入45-55μl的2μg/ml藻紅蛋白標記的抗抗體，37℃左右避光振蕩孵育25-40min；-抽濾，洗板三至五次；-讀取熒光值；(3)數據處理。2.根據權利要求1所述的檢測抗體親和力的方法，其特征是所述微球活化包括以下步驟-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約20S;-取50uL微球離心；_去掉上清夜,將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，離心；-吸棄上清，加入80uL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s;-加入10μL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-加入10uL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；'-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。3.根據權利要求1或2所述的檢測抗體親和力的方法，其特征是，所述離心的速度≥8000g，時間為1-2min。4.根據權利要求1或2所述的檢測抗體親和力的方法，其特征是，所述數據處理包括以下步驟-將抗體濃度轉換為單位是mol/L_以10為底取對數，再取相反數-以上述算出的數據作橫坐標，以對應MFI值作縱坐標，作平滑曲線圖-擬合出曲線方程-抗體高濃度平臺MFI值減去低濃度平臺MFI值，除以二，代入上述曲線方程，算出的對應橫坐標數值即可作為該抗體與抗原親和力的一個代表值。也可繼續按上述步驟逆向運算得出抗體的親和常數。全文摘要本發明公開了一種檢測抗體親和力的方法，該檢測方法主要包括步驟(1)抗原包被微球，(2)抗體親和力的檢測和(3)數據處理。所述檢測抗體親和力的方法具有簡單快捷、敏感度高、重復性好、檢測結果更加穩定可靠等優點。文檔編號G01N33/543GK101173923SQ20071003056公開日2008年5月7日申請日期2007年9月27日優先權日2007年9月27日發明者彭臻菲,楊惠夷,許嘉森申請人:廣州益善生物技術有限公司
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