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一種檢測植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測方法，該方法采用一種Hochest33342/PI雙染法，利用熒光熒光顯微鏡檢測，能夠快速、準確、靈敏的區分植物病原真菌及蕓薹根腫菌孢子的死活，孢子萌發法也可以用來進行植物病原真菌及蕓薹根腫菌孢子的活性鑒定，但采用孢子萌發法費時、費力，本方法可以替代傳統的孢子萌發法，適合于農業生產、植物保護等部門使用。
【專利說明】一種檢測植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物活性檢測方法，特別是涉及植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測的方法。
【背景技術】
[0002]真菌的引起的植物病害已達3萬種，占有植物病害的70-80%，危害嚴重又具有毀滅性的病害如馬鈴薯晚疫病，麥類銹病、甘薯黑斑病等。要對病情進行準確的預測及制定切實有效的防治策略，必須快速地檢測植物病原真菌的存在，除檢測到病原菌存在外，還應對病原菌的活性進行檢測，病原菌進行早期快速檢測及活性檢測是制定病害防治策略的有力依據。
[0003]蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae)引起十字花科蔬菜的根腫病,主要寄生于蕓薹屬多種植物的根部。在全世界均有分布，近年來其危害范圍從十字花科蔬菜擴展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100個種(變種)以上。根腫病每年造成的世界范圍內的損失達到10-15%。帶菌土壤是其主要初侵染源，蕓薹根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活多年，對土壤中蕓薹根腫菌孢子活性進行檢測，防治帶菌土壤交叉污染是控制該病害的有效途徑之一(WalIenhammar, 1996)。
[0004]對植物病原真菌和蕓薹根腫菌的檢測，國內外已經建立了分子生物學方法，如PCR、巢式PCR以及熒光定量PCR等能夠準確、靈敏、快速的定性及定量檢測出病菌。該方法雖能快速檢測該病菌的有無，但不能檢測其活性，(BuhariwalIa, 1995 ；Faggian, 1999 ；Ito, 1999 ；ffallenhammar,2001 ;Cao，2007)。因此，無法判斷該有害生物的死活，也難于提出科學合理的檢疫與防治管理措施，況且活性檢測本身對病菌生物學特性和病害發生流行規律等領域的研究也具重要價值，要做出準確的病情預測預報還要對病原菌的生活力進行鑒定。
[0005]對于植物病原真菌及蕓薹根腫菌孢子的活性檢測，國內外采用的方法有孢子萌發CFU (colony forming units)計數法、MTT法(周肇蕙和嚴進1996 ;趙云等2006)和流式細胞儀檢測法(Bergervoet et al.2007)。前者為經典檢測法，比較實用，但檢測時間偏長；MTT比色法簡便和經濟，但重復性和準確性較差，而流式細胞儀檢測法則需要大量的病菌才能進行，不適用于一些難于培養和比較珍貴的病原菌。本研究應用熒光雙染法與熒光顯微鏡相結合，旨在建立快速、準確、靈敏的活性檢測方法，為植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測建立新的方法和技術。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是針對目前植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測時間長、檢測結果不穩定、檢測過程中染料毒性大，對人體有害等問題，提供一種新的檢測時間短、檢測過程毒性小、經濟的植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測方法。為了實現上述目的，本發明采取以下技術方案:[0007]本發明公開了一種植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測方法，所述方法采用Hoechst33342和碘化丙啶為染料對植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子進行染色檢測。
[0008]1、所述方法中染色孢子采用熒光顯微鏡觀察，活孢子發藍色熒光，而死孢子發紅色熒光。
[0009]2、所述突光顯微鏡參數設置包括:紫外激發光塊,突光信號激發光波長為352nm,熒光信號發射光波長為400-500nm。
[0010]3、所述Hoechst33342染色的濃度為I μ g/ml-ΙΟ μ g/ml，優選為染色的工作濃度為I μ g/ml，碘化丙啶染色濃度為I μ g/ml-15 μ g/ml，優選為染色工作濃度為5 μ g/ml。
[0011]4、所述Hoechst33342染色時，37°C孵育10min，4°C 1000r/min離心去染液，碘化丙啶4°C避光染色15min。
[0012]由于采用以上技術方案，本發明的有益效果在于:
[0013]本發明的活性檢測方法用于植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子的活性檢測，能夠有效區分孢子的死活，從制樣到完成檢測僅需40分鐘，可以直接對單個孢子的染色情況進行死活判斷。建立了適合于植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子的活性檢測的工作環境，包括:染色濃度、顯微參數、染色時間、孵育環境等國內外均無報道。本發明具有快速、準確、靈敏、重復性好等特點，有望代替傳統的孢子萌發法及一些結果不穩定或毒性較大的染色方法，適合于農業生產、植物保護等部門使用。
【具體實施方式】
[0014]本發明公開了一種植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性檢測方法，包括如下步驟:
[0015]1、孢子懸浮液配制:用滅菌的無菌水配置孢子懸浮液，收集與1.5ml的離心管中，振蕩混勻，5000rpm離心3min，棄上清收集孢子；再加入Iml滅菌的蒸餾水洗滌孢子，5000rpm離心3min,棄上清,最后加入Iml滅菌的蒸懼水重懸,獲得孢子懸浮液,濃度約為IO5-1O6 個孢子 /ml。
[0016]2、孢子染色處理:采用Hoechst33342和碘化丙啶對孢子懸浮液進行染色，Hoechst33342染色時,37 °C孵育lOmin, 4 °C 1000r/min離心去染液，加入Iml的碘化丙啶4°C避光染色15min，終止染色，用滅菌的蒸餾水洗滌兩次，重懸孢子，制片。所用Hoechst33342染液與孢子懸浮液混合后,Hoechst33342染色的濃度為I μ g/ml-10 μ g/ml,優選為染色的工作濃度為I μ g/ml，加入的碘化丙啶染液濃度為I μ g/ml-15 μ g/ml，優選為染色工作濃度為5 μ g/ml。
[0017]3、熒光顯微鏡觀察:采用熒光顯微鏡對染色制片的孢子進行觀察，為確保觀察結果的準確性，顯微鏡參數設置如下:物鏡為100倍油鏡，紫外激發光塊，熒光信號激發光波長為352nm，熒光信號發射光波長為400-500nm。
[0018]4、結果判定:根據熒光顯微鏡對孢子染色情況觀察結果進行判定，活孢子染色后孢子發藍色熒光，而死孢子發紅色熒光。為確保檢測的準確性，每個樣本隨機觀察觀察20個視野。其中，Hoechst33342和碘化丙啶通常應用于植物和動物細胞染色，由于病原菌孢子的外壁及膜組成成分與動植物細胞不同，研究對象的不同，會造成結果的差異，適合植物和動物細胞活性染色的染料不一定適合病原菌孢子染色，因此需要進行詳細的實驗論證才能篩選出適合病原菌活性染色檢測的染料和染色條件。
[0019]下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。
[0020]實施例1:植物病原真菌及蕓薹根腫菌孢子活性檢測
[0021]1、材料與儀器
[0022]Hoechst33342 (SIGMA)，碘化丙啶(SIGMA)，奧林巴斯熒光顯微鏡(DP72)。
[0023]2、實驗方法
[0024]以部分植物病原真菌孢子為材料(表1)采用HoeChst33342/碘化丙啶雙染的方法鑒定植物病原真菌孢子死活。最初濃度為100 μ g/ml的H0echst33342 (溶解于PBS) I μ I加入99 μ I孢子懸浮液，混勻，終濃度為I μ g/ml，37°C孵育lOmin，4°C 1000r/min離心去染液，加入100 μ I滅菌的蒸餾水洗滌一次，離心去上清，加100 μ I的滅菌的蒸餾水重懸，然后加入500 μ g/ml的碘化丙啶染液(PBS溶解)與孢子懸浮液混勻，終濃度為5 μ g/ml，4°C避光染色15min，終止染色，采用熒光顯微鏡對染色制片的孢子進行觀察，顯微鏡參數設置如下:物鏡為100倍油鏡，紫外激發光塊，熒光信號激發光波長為352nm，熒光信號發射光波長為 400-500nm。
[0025]3、實驗結果
[0026]根據熒光顯微鏡觀察結果，活孢子經過染色后發藍色熒光，而死孢子則發紅色熒光(表1)。
[0027]表lH0eChst33342/碘化丙啶雙染鑒定植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子死活
[0028]
【權利要求】
1.一種檢測植物病原真菌及蕓薹根腫菌孢子活性的方法，其特征在于:采用Hochest33342/PI (碘化丙啶)作為染料對植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子進行染色。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于:孢子染色后采用熒光顯微鏡觀察，活的孢子發藍色熒光，死的孢子發紅色熒光。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于:熒光顯微鏡參數包括如下設置:紫外激發光塊，激發光波長為352nm，發射光波長為400_500nm。
4.如權利要求1-3所述方法，其特征在于:Hochest33342染色的工作濃度為Iμ g/ml,PI染液的工作濃度為5 μ g/ml。
5.如權利要求1-3所述方法，其特征在于:Hochest33342染色時，37°C孵育lOmin，4°C 1000r/min離心去染液，PI 4°C避光染色15min。
6.如權利要求1-3所述方法，其特征在于:H0echst33342/PI雙染法檢測植物病原真菌和蕓薹根腫菌孢子活性時，可以檢測到植物病原真菌和蕓薹根腫菌的I個孢子的活性，具有很高的靈敏度。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的植物病原真菌包括:白銹屬(Albugo)、鏈格孢屬(Alternaria)、殼 二胞屬(Ascochyta)、葡萄孢屬(Botrytis)、尾抱屬(Cercospora)、芽枝霉屬(Cladosporium)、刺盤抱屬(Colletotrichum)、棒抱屬(Corynespora)、白粉菌屬(Erysiphe)、褐孢霉屬(Fulvia)、鐮孢屬(Fusarium)、殼球孢屬(Macrophomina)、菌絨抱屬(Mycovellosiella)、漆斑菌屬(Myrothecium)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、霜霉屬(Peronospora)、莖點霉屬(Phoma)、擬莖點霉屬(Phomopsis)、葉點霉屬(Phyllosticta)、疫霉屬(Phytophthora)、腐霉屬(Pythium)、青霉屬(Penicillium)、殼針孢屬(Septoria)、匍柄霉屬(Stemphylium)、單胞銹菌屬(Uromyces)、黑粉菌屬(Ustilago)、輪枝孢屬(Verticillium)、蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)。
【文檔編號】G01N21/64GK103674906SQ201210358486
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月24日 優先權日:2012年9月24日
【發明者】李寶聚, 李金萍, 謝學文, 石延霞 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所