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大觀霉素快速時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及大觀霉素快速時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條制備方法及其應(yīng)用。該試紙條由Fusion5膜、硝酸纖維素膜和吸水紙三部分組成，通過競爭法原理，利用時間分辨熒光微球作為免疫標(biāo)記物，對待測抗原進(jìn)行準(zhǔn)確快速的定量檢測。
【專利說明】大觀霉素快速時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是大觀霉素定量檢測的時間分辨熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大觀霉素(英文名Spectinomycin)是一種氨基環(huán)醇類化合物，由鏈霉Streptomyces
spectabilis分離而得，主要存在于動物性產(chǎn)品的組織和肝臟內(nèi)，可損害第八對腦神經(jīng)，有腎臟毒性及對神經(jīng)肌肉的阻斷作用。
[0003]歐盟2002年頒布了關(guān)于大觀霉素在組織中的最大殘留限量(殘留標(biāo)示物均為原形)。所有食品動物的肌肉、脂肪、肝、腎中大觀霉素的最大殘留限量分別為300 ug/kg,500U g/kgU000 iig/kg和1500 Ug/kg我國農(nóng)業(yè)部于2003年也頒布了關(guān)于大觀霉素在組織中的最大殘留限量，大觀霉素在牛/羊/豬/雞的肌肉、脂肪、肝、腎中最大殘留限量分別為500 iig/kg、2000 iig/kg、2000 yg/kg和5000 y g/kg。因此加強(qiáng)對大觀霉素殘留檢測技術(shù)的研究，是有效控制動物組織中藥物殘留的關(guān)鍵措施，也是建立和完善藥物殘留監(jiān)控體系的任務(wù)之一。
[0004]目前的免疫層析(lateral flow immunoassay, LFIA)快速檢測試紙條多以膠體金、彩色乳膠微球或者熒光素作為標(biāo)記物。基于膠體金標(biāo)記技術(shù)開發(fā)的快速檢測產(chǎn)品，存在定性或者半定量， 批間差異較大等問題；彩色乳膠微球雖然批間差有所改進(jìn)，但靈敏度依然較低，也只能定性或半定量；基于熒光素標(biāo)記技術(shù)的免疫層析靈敏度有了較大提高，也能進(jìn)行定量檢測，但是由于樣本中含有較高的熒光本底信號，且stock位移較小，會對檢測產(chǎn)生較大的影響。
[0005]時間分辨突光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一種非同位素突光標(biāo)記物，與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長等特點(diǎn)，可以有效的避免樣品中的本底熒光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。
[0006]本發(fā)明利用Fusion5替代傳統(tǒng)的樣品墊、濾血膜、結(jié)合墊，將原有的四層甚至五層膜系統(tǒng)簡化，開發(fā)出只需要三層膜結(jié)構(gòu)的快速定量免疫層析檢測試紙，不僅使生產(chǎn)工藝得到了簡化，而且有效的降低了產(chǎn)品的批內(nèi)差和批間差，提高了檢測靈敏度，極具實(shí)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了提供新型的、能快速定量檢測大觀霉素的時間分辨熒光免疫層析檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明一方面公開了大觀霉素時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條，該試紙條包括Fusion5膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙三部分。硝酸纖維素膜位于中間，F(xiàn)usion5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端。其中，F(xiàn)usion5膜上設(shè)有加樣區(qū)和微球區(qū)，微球區(qū)上載有時間分辨熒光微球；硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，T線接上包被大觀霉素抗原，C線包被抗兔抗體。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能快速檢測出肌肉、組織中大觀霉素的含量。
[0010]所述大觀霉素時間分辨熒光微球，包括檢測微球和質(zhì)控微球，檢測微球?yàn)楸砻姘挥写笥^霉素單抗的突光微球，質(zhì)控微球?yàn)楸砻姘挥型每箻?biāo)記蛋白的突光微球。
[0011]所述熒光微球中填充了斕系元素化合物；較優(yōu)的，該斕系元索鰲合物為銪鰲合物；最優(yōu)的，該銪鰲合物可為Eu (ΤΤΑ)3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen。
[0012]所述蛋白可以是牛血清Y -球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。
[0013]所述時間分辨熒光微球粒徑范圍為100 - 1000 nm。
[0014]所述硝酸纖維素膜上，T線上包被的抗體為大觀霉素單抗，C線上包被的抗兔抗體。
[0015]所述大觀霉素時間分辨熒光免疫定量檢測試紙條底部設(shè)有塑料底板。
[0016]本發(fā)明第二方面公開了大觀霉素時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟:
(1)質(zhì)控微球制備:
①用生物素標(biāo)記蛋白；
②采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球；
(2)檢測微球制備:采用大觀霉素的單抗包被醛基修飾的熒光微球；
(3)空白大卡粘貼:將硝酸纖維素膜粘貼在塑料底板中間，F(xiàn)usion5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端；
(4)噴膜:將兔抗標(biāo)記蛋白的熒光微球和大觀霉素單抗的熒光微球采用釋放緩沖液混合稀釋到一定濃度，噴到Fusion5膜的微球區(qū)；大觀霉素抗原和抗兔抗體稀釋后，分別噴到硝酸纖維素膜的T線和C線位置；
(5)干燥及切條:將上述噴好試劑的大卡烘干、切條。
[0017]步驟⑷中用到的釋放緩沖液含有10 - 20%蔗糖、3 - 10%海藻糖、0.5 - 1%N，
O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.2 — 0.5%慶大霉素。
[0018]步驟(4)稀釋后檢測微球終濃度為0.5 - 2 mg/mL，質(zhì)控微球終濃度0.05 - 0.2mg/mL ;T線抗原終濃度0.5 - 2 mg/mL，C線抗原終濃度0.5 - 2 mg/mL ;C，T線噴膜液量為
0.5 - 1.5 μ L/cm，微球噴膜量為 2 - 8 μ L/cm。
[0019]步驟(5)中所述的烘干可在恒溫烘箱或者烘房中，37°C烘干8 - 12小時。
[0020]本發(fā)明第三方面公開了大觀霉素時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的試紙條可通過競爭法原理測定生物分子，適用于所有的采用競爭法模式的免疫層析檢測。
[0022]本發(fā)明的大觀霉素時間分辨熒光免疫層析試紙條靈敏度高，批內(nèi)精密度可達(dá)10%左右,批間精密度可達(dá)15%，可同時檢測全血、血清、血漿、尿液樣本，250 mg/dL血紅蛋白、500 mg/dL甘油三脂，10 mg/dL膽紅素對本試紙條的檢測無影響,遠(yuǎn)超過市場上大多數(shù)免疫層析快速診斷產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖(1.塑料底板，2.Fusion5膜，3.硝酸纖維素膜，4.吸水紙，5.加樣區(qū)，6.微球區(qū)，7.T線區(qū)，8.C線區(qū))。
[0024]圖2:SPE試紙條檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]【具體實(shí)施方式】
[0026]1.試紙條各成分的制備
1.1質(zhì)控微球的制備生物素標(biāo)記Y -球蛋白(BGG)包被的質(zhì)控微球的制備。
[0027](I)生物素標(biāo)記的BGG的制備
用 0.1 M NaCNBH3 將 BGG(購自 Pel - Freez Biological)配制成 10 mg/mL 溶液，采用DMSO(二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺修飾生物素，生產(chǎn)商:SIGMA，產(chǎn)品號:B3295)溶液至 16.172 mg/mL，按照 I mg BBG 蛋白加入 5.4 y L Biotin-X-X-NHS的量將Biotin-X-X-NHS液加入到BGG溶液中，混合均勻并在4°C下放置過夜。采用透析法除去游離未反應(yīng)的生物素，透析液為生物素標(biāo)記蛋白透析緩沖液(0.1 M Tris,0.3 M NaCl,
0.005 M EDTA-Na-2H20, pH8.0)。透析完畢，BCA法測定蛋白濃度。
[0028](2)采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球
向10 mL醛基修飾的熒光微球中加入6.4 ii L 20%的Tween-20溶液、2 mg上述⑴中透析得到的生物素標(biāo)記蛋白以及16 ii L的NaCNBH3, (25 mg/mL, 0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，補(bǔ)加0.1 M pH6.0 MES至總體積為400 y L，37°C避光孵育48 h。加入40 UL的Gly溶液(75 mg/mL, 0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制)，37°C避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2 h。加250 u L N, 0-雙三甲硅基乙酰胺(200 mg/mL, 0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制)溶液。37°C避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16 h。4°C 13000 rpm離心30分鐘。棄上清，用I mL pH6.0的MES緩沖液再洗兩次。用 I mL 0.05 M pH8.0 的 HEPES 緩沖液(0.05 M HEPES,0.3 M NaCl, 0.025M EDTA-Na-2H20,1.6% N，0 -雙三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.1% Dextran, 0.1% Tween - 20，
0.3745% Triton X- 405，0.01% 慶大霉素，0.05 % Proclin)懸浮(其終濃度為 10 mg/mL)。
[0029](3)質(zhì)控微球工作液配制
根據(jù)工作需要，采用0.05M pH 8.0的HEPES緩沖液將⑵中懸液稀釋到相應(yīng)濃度，分裝保存。
[0030]1.2檢測微球的制備
向10 mg醛基修飾的熒光微球中加入6.4 ii L 20%的Tween-20溶液、2 mg大觀霉素單克隆抗體以及16 y L的NaCNBH3 (25 mg/mL,0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，補(bǔ)加0.1 M pH6.0 MES至總體積為400 u L，37°C避光孵育48 h。加入40 y L的Gly溶液(75 mg/mL, 0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制)，37°C避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2 h。加250 u LBSA (200 mg/mL, 0.05 M pH6.0的MES緩沖液配制)溶液。37°C避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16 h。4°C13000 rpm離心30分鐘。棄上清，用I mL pH6.0的MES緩沖液再洗兩次。用I mL 0.05 MpH8.0 的 HEPES 緩沖液(0.05 M HEPES,0.3 M NaCl,0.25 M EDTA_Na_2H20，1.6% BSA,0.1%Dextran, 0.1% Tween - 20,0.3745% Triton X-405，0.01% 慶大霉素，0.05% Proclin)懸浮(其終濃度為10 mg/mL)。
[0031]1.3微球溶液的配置
用釋放緩沖液(含有20%蔗糖、5%海藻糖、0.5% BSA, 0.2%慶大霉素)將質(zhì)控微球和檢測微球配制成時間分辨熒光微球混合液，質(zhì)控微球終濃度為0.2 mg/mL，檢測微球終濃度為Img/mL。[0032]1.4檢測線(T線)溶液的配制
用0.01 M PB溶液將大觀霉素抗原復(fù)合物稀釋成0.5 mg/mL。
[0033]1.5質(zhì)控線(C線)溶液的配制
用0.01 M PB溶液將鏈霉親和素稀釋成0.5 mg/mL。
[0034]2.試紙條的制備。
[0035]2.1空白大卡粘貼
按照附圖1的膜組合方式，硝酸纖維素膜3位于中間，F(xiàn)usion5膜2與吸水紙4分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端，粘貼在帶有背膠的塑料底板上。
[0036]2.2 噴膜
分別在圖1中T線7，C線8位置噴上T，C線溶液，C，T線噴膜液量為0.8 μ L/cm，在圖1中6位置噴上微球溶液，微球溶液噴膜量為4 μ L/cm。
[0037]2.3 烘干
將步驟(2.2)中噴好試劑的大觀霉素大卡在恒溫烘箱中37°C烘干12小時。
[0038]2.4 切條
將烘干的大觀霉素大卡切割·成4 mm寬度的紙條，即得到大觀霉素試紙條。
[0039]3.檢測儀器原理及應(yīng)用
3.1測量儀原理:聚焦透鏡位于與激發(fā)光成90。的方向，使樣品檢測池中的樣品產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)聚焦透鏡聚焦，再經(jīng)光柵分光后到達(dá)光電倍增管，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺詈髠魉椭罙/D轉(zhuǎn)換器進(jìn)行處理。所述激光光源采用半導(dǎo)體泵浦固體激光器，輸出功率為20 mW，發(fā)射波長為375±5 nm。激發(fā)光經(jīng)傳導(dǎo)光纖耦合后的出纖功率為5 mW以上。樣品檢測池選用紫外石英玻璃。光柵設(shè)置為可分光獲得波長為440±5 nm的光。
[0040]3.1檢測儀應(yīng)用:將含有大觀霉素的食用動物肌肉、組織經(jīng)預(yù)處理后的提取物裝入樣品檢測池中，激光光源發(fā)出波長為375±5 nm的激光，經(jīng)傳導(dǎo)光纖耦合后傳導(dǎo)至樣品檢測池，并穿過待測樣品，樣品檢測池中的樣品吸收激發(fā)光后產(chǎn)生熒光，產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)聚焦透鏡聚焦，再經(jīng)光柵分光，得到波長為440 土 5 nm的光，到達(dá)光電倍增管，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺瑫r將電信號放大后輸入A/D轉(zhuǎn)換器，最后輸出給讀數(shù)裝置處理，通過讀數(shù)裝置即可直接讀出結(jié)果。
[0041]4.試紙條的定量檢測
4.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
在制備好的大觀霉素試紙條(批號:20120620)加樣區(qū)中加入不同濃度的大觀霉素抗原
標(biāo)準(zhǔn)品(取五個不同的濃度，分別為0，125，250，500，750 ng/mL,每個濃度設(shè)5個重復(fù))，滴加
上樣緩沖液(PBS，含有1.6% BSA, 0.1% Tween - 20，防腐劑)，膜層析10分鐘以后，檢測儀
器讀取C，T線信號，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表1:
表1大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果
SPE 標(biāo)準(zhǔn)品(ng/mL) |θIl25 |250|500|750 ~
1— 18.25~2.29 8.523.721.35~
2~ 18.92~3.07 9.063.661.58~
3~ 19.6~2.55 8.24.011.22~
4~ 19.18Tl.81 8.473.471.46~
5— 18.64~2.63 8.383.631.54~
mean |?8.918|?2.47 丨8.526 丨3.698|?.43~
【權(quán)利要求】
1.大觀霉素快速時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:包括Fusion5膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙三部分，硝酸纖維素膜位于中間，F(xiàn)usion5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端，F(xiàn)usion5膜上有加樣區(qū)和微球區(qū)，微球區(qū)上載有大觀霉素單克隆抗體時間分辨熒光微球；硝酸纖維素膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上包被大觀霉素抗原，質(zhì)控線上包被抗兔抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述時間分辨熒光微球包括檢測微球和質(zhì)控微球，檢測微球?yàn)楸砻姘挥写笥^霉素單抗的突光微球，質(zhì)控微球?yàn)楸砻姘挥型每箻?biāo)記蛋白的熒光微球。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征在于:所述時間分辨熒光微球的粒徑范圍為 100 - 1000 nm 。
4.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述檢測線上包被大觀霉素檢測用抗原為大觀霉素與載體物質(zhì)形成的偶合物；檢測線上包被二抗-抗兔抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的試紙條的制備方法，其制備步驟如下: (1)質(zhì)控微球制備: ①用生物素標(biāo)記蛋白； ②采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的熒光微球； (2)檢測微球制備:采用大觀霉素的單抗包被醛基修飾的熒光微球； (3)空白大卡粘貼:將硝酸纖維素膜粘貼在塑料底板中間，F(xiàn)usion5膜與吸水紙分別搭接于硝酸纖維素膜左右兩端； (4)噴膜:將兔抗標(biāo)記蛋白的熒光微球和大觀霉素單抗的熒光微球采用釋放緩沖液混合稀釋到一定濃度，噴到Fusion5膜的微球區(qū)；大觀霉素抗原和抗兔抗體稀釋后，分別噴到硝酸纖維素膜的T線和C線位置； (6)干燥及切條:將上述噴好試劑的大卡烘干、切條。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟⑷中釋放緩沖液組成為10- 20%蔗糖、3 - 10%海藻糖、0.5 - 1% N，O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)、0.2 - 0.5%慶大霉素。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟⑷稀釋后檢測微球終濃度為0.5 -2 11^/1^，質(zhì)控微球終濃度0.05 - 0.2 mg/mL ;T線抗原終濃度0.5 - 2 mg/mL，C線抗原終濃度0.5-2 mg/mL ;C，T線噴膜液量為0.5 -1.5 μ L/cm，微球噴膜量為2 - 8 μ L/cm。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟(5)中烘干條件為37°C烘干8- 12小時。
9.如權(quán)利要求5權(quán)利要求所述的大觀霉素快速時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:試紙條底部設(shè)有塑料底板。
10.如權(quán)利要求1所述的試紙條的應(yīng)用，其特征在于:該試紙條用于采用競爭法模式的免疫層析的定量檢測
【文檔編號】G01N33/577GK103792357SQ201210434957
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月5日
【發(fā)明者】杜道林, 張勇 申請人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司