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專利名稱：一種檢測a組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種基因微陣列的生物芯片，尤其涉及一種檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，屬生物芯片和診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于固相支持物上，然后與待測的標(biāo)記的核酸樣品按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再經(jīng)過一定的檢測系統(tǒng)對雜交信號進(jìn)行檢測，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一雜交信號進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，從而迅速得出所要的信息。與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比，該技術(shù)具有微型化，高靈敏性，高度平行性，和高速性的顯著特點(diǎn)。其發(fā)展速度和其中所運(yùn)用的技術(shù)令人矚目。迄今為止，已在基因表達(dá)檢測，基因突變檢測，單核苷酸多態(tài)性和DNA序列測定等方面展開了廣泛的研究和應(yīng)用。
輪狀病毒(Rotavirus，RV)是全世界人和動(dòng)物急性腹瀉的最主要病原，危害巨大。按其結(jié)構(gòu)蛋白VP6的抗原性差異，輪狀病毒被分成A～G共七個(gè)組，其中A組RV是全世界5歲以下兒童急性腹瀉的最主要病原，危害巨大。在發(fā)展中國家，A組RV每年引起87.3萬童死亡，在兒童死因中居第二位；腹瀉在我國兒童死因中也居第二位，秋冬季兒童腹瀉50％是由RV引起，直接威脅國家的公共安全、社會(huì)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及人口素質(zhì)。
目前對于輪狀病毒的檢測，主要是針對糞便中的病毒抗原或基因，已經(jīng)建立的技術(shù)可歸納為3類一類為病毒分離與形態(tài)觀察法，缺點(diǎn)是靈敏度較低，并且需要電子顯微鏡，不適合基層使用。一類為免疫學(xué)技術(shù)，包括酶免疫技術(shù)(EIA)，乳膠凝集試驗(yàn)(LA)和膠體金試紙等技術(shù)。免疫學(xué)技術(shù)的主要局限就是樣品限制，固體受試物幾乎不可能用這種方法檢測。一類為病毒核酸檢測主要包括RT-PCR、電泳等方法。相比于免疫學(xué)技術(shù)，PCR技術(shù)有著更高的靈敏度。但是由于PCR技術(shù)本身的局限性，僅憑電泳結(jié)果，容易得出假陽性的結(jié)論，不通過雜交反應(yīng)則無法對擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性進(jìn)行驗(yàn)證。
經(jīng)檢索，有關(guān)利用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和玻璃基因芯片雜交來檢測A組人組輪狀病毒的基因芯片，至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，并同時(shí)公開A組人輪狀病毒的特異性檢測探針和陰陽性探針。所述芯片能有效克服現(xiàn)有技術(shù)存在的檢測靈敏度低和受檢樣品受限的缺陷，能滿足食品衛(wèi)生監(jiān)測，疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域的需要。
本實(shí)用新型的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～6個(gè)，每涂層區(qū)的點(diǎn)涂層平行垂直排列成六排六列；所述點(diǎn)涂層包括6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針，1條陽性對照探針，3條陰性對照探針以及空白點(diǎn)樣液對照。
其中，所述的醛基化修飾層是指在未經(jīng)任何化學(xué)修飾的玻璃片裸片上覆蓋有經(jīng)戊二醛水溶液浸泡處理的醛基化層。
其中，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm～77mm×25mm～27mm；厚度為0.6mm～2.0mm。
在上述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片中，所述的A組人輪狀病毒特異性檢測探針與對照樣品的點(diǎn)涂層的大小，可以根據(jù)點(diǎn)直徑、點(diǎn)個(gè)數(shù)和點(diǎn)間距的變化而變化。
其中，優(yōu)選的實(shí)施方式是當(dāng)點(diǎn)直徑為0.15mm，點(diǎn)間距為0.5mm時(shí)，點(diǎn)涂層微陣列的面積為2.7mm×2.7mm(如圖1所示)，且可依據(jù)檢測需要同時(shí)在一張玻璃基片上設(shè)置1～4個(gè)涂層區(qū)。
在上述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片中，所述點(diǎn)涂層中6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針是N-PbA15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′N-PbA25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′N-PbA35′-NH2-(CH2)6-(T)15-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′N-PbA45′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCAAACAATCCACTCACC-3′N-PbA55′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′N-PbA65′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′；1條陽性對照探針是N-PbP即5′-NH2-(CH2)6-(T)15-PbA1-Tamra-3′；3條陰性對照探針是N-PbEC即大腸桿菌特異性探針，N-PbSA即金黃色葡萄球菌特異性探針，N-PbHBV即HBV乙肝病毒特異性探針；空白點(diǎn)樣液對照是3×SSC。
其中，所述陽性對照探針優(yōu)選分布位于點(diǎn)涂層陣列的四角。
本實(shí)用新型所述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片具有如下優(yōu)點(diǎn)與效果(1)本實(shí)用新型所采用的Tamra熒光標(biāo)記的上游引物對待檢病毒核酸實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和標(biāo)記，并結(jié)合玻璃載片，可以通過使用特定的儀器和軟件對雜交信號進(jìn)行定量分析，提供精確而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)。
(2)本實(shí)用新型的檢測探針選用多條基因序列不同的寡核苷酸探針，對A組人輪狀病毒的基因檢測不是僅靠一種探針就能判定，而是看產(chǎn)生陽性雜交信號的探針的條數(shù)與均值相比較，這同傳統(tǒng)的PCR分型方法相比，是一個(gè)很大的進(jìn)步。
(3)本實(shí)用新型所采用的人輪狀病毒組特異性檢測探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對A組人輪狀病毒的高度靈敏性檢測和A組組別鑒定。
總之，本實(shí)用新型涉及的芯片可用于對A組人輪狀病毒的基因檢測和組別鑒定，具有廣闊的應(yīng)用前景，有望滿足食品衛(wèi)生監(jiān)測，疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域?qū)θ溯啝畈《緳z測的需要。


圖1本實(shí)用新型所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的直觀圖，其中，1為玻璃基片；2為探針涂層區(qū)。
圖2本實(shí)用新型所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的探針排布圖，其中，所述探針排布為A1，A6，B1，B6，E6，F(xiàn)1，F(xiàn)6為陽性對照N-PbP(10μmol/L)；A2，A3，A4，A5為檢測探針N-PbA1(10μmol/L)；B2，B3，B4，B5為檢測探針N-PbA2(10μmol/L)；C2，C3，C4，C5為檢測探針N-PbA3(10μmol/L)；D2，D3，D4，D5為檢測探針N-PbA4(10μmol/L)；E2，E3，E4，E5為檢測探針N-PbA5(10μmol/L)；F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5為檢測探針N-PbA6(10μmol/L)；C1為陰性探針N-PbEC(10μmol/L)；C6為陰性探針N-PbSA(10μmol/L)；E1為陰性探針N-PbHBV(10μmol/L)；D1，D6為空白對照3×SSC。
圖3瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述各泳道是泳道M為核酸分子marker DL2000；泳道1為實(shí)施例3中所述對A組人輪狀病毒的PCR擴(kuò)增。
圖4A組人輪狀病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同基因芯片的雜交掃描結(jié)果結(jié)果顯示，A組人輪狀病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上檢測A組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現(xiàn)陽性結(jié)果。陽性對照點(diǎn)的位置上也出現(xiàn)了陽性信號，陰性對照和空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1下面結(jié)合圖1所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的直觀圖以及圖2所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的探針排布圖對本實(shí)用新型的內(nèi)容作進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其中，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片，形狀是長方形，面積是25.4mm×76.2mm，厚度為1.2mm；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1個(gè)，所述涂層區(qū)的點(diǎn)涂層平行垂直排列成六排六列；所述點(diǎn)涂層包括6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針，1條陽性對照探針，3條陰性對照探針以及空白點(diǎn)樣液對照；具體為6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針是N-PbA15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′N-PbA25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′N-PbA35′-NH2-(CH2)6-(T)15-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′N-PbA45′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCAAACAATCCACTCACC-3′N-PbA55′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′N-PbA65′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′；1條陽性對照探針是N-PbP即5′-NH2-(CH2)6-(T)15-PbA1-Tamra-3′；3條陰性對照探針是N-PbEC即大腸桿菌特異性探針，N-PbSA即金黃色葡萄球菌特異性探針，N-PbHBV即HBV乙肝病毒特異性探針；空白點(diǎn)樣液對照是3×SSC。
上述圓形點(diǎn)涂層直徑為0.15mm，點(diǎn)間距為0.5mm，點(diǎn)涂層微陣列的面積為2.7mm×2.7mm。且所述陽性對照探針分布位于點(diǎn)涂層陣列的四角。
實(shí)施例2本實(shí)用新型所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備(1)玻片處理取未經(jīng)任何化學(xué)修飾的常規(guī)玻璃片裸片以體積百分比濃度為10％戊二醛水溶液浸泡1hr，得到醛基化的玻璃片作為芯片的基片；(2)確定探針根據(jù)A組人輪狀病毒基因序列，選擇確定了6條A組人輪狀病毒組特異性檢測探針，其基因序列是ProbeA15′-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′ProbeA25′-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′ProbeA35′-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′ProbeA45′-TTCAAACAATCCACTCACC-3′ProbeA55′-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′ProbeA65′-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′1條陽性對照探針，其基因序列是PbP5′-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′3條陰性對照探針，其基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′(3)芯片制備為了減少雜交時(shí)的空間位阻，將上述選擇的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針，以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團(tuán)；得人輪狀病毒組特異性檢測探針如下N-PbA15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′N-PbA25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′N-PbA35′-NH2-(CH2)6-(T)15-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′N-PbA45′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCAAACAATCCACTCACC-3′N-PbA55′-NH2-(CH2)6-(T)15-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′N-PbA65′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′以3×SSC作為稀釋液將上述檢測探針分別稀釋為10μM，以3×SSC為空白對照，以5′-NH2-(CH2)6-(T)15-PbA1-Tamra-3′作為陽性對照(記為N-PbP)，以大腸桿菌特異性探針(記為N-PbEC)，金黃色葡萄球菌特異性探針(記為N-PbSA)，HBV乙肝病毒特異性探針(記為N-PbHBV)作為陰性對照，以生物芯片點(diǎn)樣儀Pixsys5500配以SMP3點(diǎn)樣針接觸式點(diǎn)制在所述醛基化玻璃基片上，取樣板中液面高度是5mm，針在取樣孔中停留時(shí)間是20ms，點(diǎn)樣時(shí)，針在玻片上的停留時(shí)間是50ms。其中，陽性對照探針以常規(guī)方法在其3′端帶上熒光標(biāo)記，且所述陽性對照探針分布位于點(diǎn)涂層陣列的四角，各點(diǎn)的直徑為0.15mm，點(diǎn)間距為0.5mm，點(diǎn)涂層微陣列的大小為2.7mm×2.7mm(詳見圖1，圖2所示)；將點(diǎn)制后的芯片平放于紫外交聯(lián)儀內(nèi)，4500J/cm2下交聯(lián)3min，即得所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片。
實(shí)施例3利用本實(shí)用新型所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測A組人輪狀病毒(1)對人A組人輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株RV5和Wa株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，提取培養(yǎng)液上清中的病毒RNA，用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1試劑盒說明書操作對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后建立PCR體系25μl反應(yīng)體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，17μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.5μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd各10μmol/L)，0.5μl RT產(chǎn)物。
(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取PCR產(chǎn)物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后觀察結(jié)果，見圖3。
(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進(jìn)行變性65℃ 30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約5mm×5mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點(diǎn)制的陣列上。于雜交盒內(nèi)50℃水浴雜交1hr。
(4)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機(jī)內(nèi)將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數(shù)選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像(見圖4)。
結(jié)果顯示，A組人輪狀病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上檢測A組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現(xiàn)陽性結(jié)果。陽性對照點(diǎn)的位置上也出現(xiàn)了陽性信號，陰性對照和空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。
實(shí)施例4利用本實(shí)用新型所述檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測92例臨床疑似A組RV感染的嬰幼兒腹瀉標(biāo)本(1)嬰幼兒腹瀉標(biāo)本中RNA的提取以1×PBS將糞便樣本稀釋10倍，10000rpm離心2min；取300μl上清，加入30μl 10％SDS，56℃保溫30min；加入800μl Trizol試劑，室溫放置5min；加入200μl氯仿，渦旋震蕩15sec后，室溫靜置10min；4℃離心，12000rpm離心10min；小心吸取上層液至1.5ml離心管中，加500μl異丙醇，室溫下放置10min；4℃離心，12000rpm離心10min；小心吸棄上清，加1ml 75％乙醇(高壓滅菌后的0.5‰DEPC水配制)，4℃離心，7500rpm離心5min；棄乙醇，干燥后加20μl 0.5‰DEPC水(已高壓滅菌)溶解，-80℃貯存。
(2)PCR擴(kuò)增用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1試劑盒說明書操作對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后建立PCR體系25μl反應(yīng)體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.5μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd各10μmol/L)，0.5μl RT產(chǎn)物。
PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃ 1min為一個(gè)循環(huán)，30個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸5min。
(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取PCR產(chǎn)物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后觀察結(jié)果。
(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進(jìn)行變性65℃ 30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約5mm×5mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點(diǎn)制的陣列上。于雜交盒內(nèi)50℃水浴雜交1hr。
(5)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機(jī)內(nèi)將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數(shù)選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像。
經(jīng)上述本實(shí)用新型所建立的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交后，檢測結(jié)果顯示A組人輪狀病毒檢測陽性的有88例，陰性的有4例。
(6)同時(shí)對相同的92例臨床疑似A組RV感染的嬰幼兒腹瀉標(biāo)本進(jìn)行ELISA試劑盒(深圳安群生物工程公司，生產(chǎn)批號20050115)抗原檢測。
檢測結(jié)果顯示78例為ELISA試劑盒抗原檢測陽性，14例為陰性。
證明我們所建立的檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的檢測靈敏度高于現(xiàn)在臨床上普遍使用的輪狀病毒抗原檢測試劑盒。
權(quán)利要求1.一種檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～6個(gè)，每涂層區(qū)的點(diǎn)涂層平行垂直排列成六排六列；所述點(diǎn)涂層包括6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針，1條陽性對照探針，3條陰性對照探針以及空白點(diǎn)樣液對照。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的醛基化修飾層是指在未經(jīng)任何化學(xué)修飾的玻璃片裸片上覆蓋有經(jīng)戊二醛水溶液浸泡處理的醛基化層。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm～77mm×25mm～27mm；厚度為0.6mm～2.0mm。
4.如權(quán)利要求1或3所述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，點(diǎn)直徑為0.15mm，點(diǎn)間距為0.5mm，點(diǎn)涂層微陣列的面積為2.7mm×2.7mm，且在一張玻璃基片上同時(shí)設(shè)置1～4個(gè)涂層區(qū)。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述陽性對照探針分布位于點(diǎn)涂層陣列的四角。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測A組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其中，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～6個(gè)，每涂層區(qū)的點(diǎn)涂層平行垂直排列成六排六列；所述點(diǎn)涂層包括6條A組人輪狀病毒特異性檢測探針，1條陽性對照探針，3條陰性對照探針以及空白點(diǎn)樣液對照。本實(shí)用新型的芯片可用于對A組人輪狀病毒的基因檢測和組別鑒定，具有廣闊的應(yīng)用前景，有望滿足食品衛(wèi)生監(jiān)測，疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域?qū)θ溯啝畈《緳z測的需要。
文檔編號G01N33/50GK2876779SQ200520124568
公開日2007年3月7日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者黃海燕, 韓金祥, 王健偉 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心