專利名稱：一種同時檢測泰樂菌素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的毛細管電泳-納米金敏化電化學發光法的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用毛細管電泳-納米金敏化電化學發光聯用技術對三種大環內 酯類藥物(泰樂菌素、交沙霉素、螺旋霉素)殘留同時進行檢測的方法。屬于 醫藥化工中的電化學分析和儀器分析技術領域。
背景技術：
隨著人們對動物性食品需求量的增加，動物性食品中的獸藥殘留也越來越 成為全社會共同關注的公共衛生問題，而大環內酯類藥物因良好的抗菌消炎作 用被廣泛用于飼料，食品以及獸藥當中。泰樂菌素、交沙霉素、螺旋霉素是獸 藥中常用的三種大環內酯類抗生素，其使用量較大，且應用廣泛。使動物長期 服用后，代謝物會在動物的組織及器官內蓄積或貯存，達到一定濃度可造成動 物前庭和俄耳蝸神經的損害，導致眩暈和聽力減退，嚴重者還將造成肝腎的損 害。大環內酯類抗生素更可通過食物鏈進入到人體，將對人類健康構成嚴重威 脅。因此急需建立大環內酯類抗生素的藥物殘留分析和監測體系，保證食品和 用藥安全。
目前關于大環內酯類檢測分析方法主要為高效液相色譜法(HPLC)、液相 色譜-質譜聯用法(LC-MS)、薄層色譜分析法、微生物效價法等。但它們本身也 存在許多問題。如微生物法比較費時，定量難度大。而由于許多大環內酯類藥 物紫外吸收非常弱，因此采用紫外-可見吸收檢測器的高效液相色譜法很難對大 多數大環內酯類藥物實現靈敏檢測；通用的解決方法是柱前衍生化，這樣會使 得檢測工作相對繁瑣；采用其他檢測器時同樣存在需要衍生化或靈敏度差的缺 陷。液相色譜-質譜聯用技術很好的解決了這些問題，但存在儀器設備昂貴、檢 測成本高等問題。而本發明方法則克服了上述方法的缺點，能實現同時對泰樂 菌素、交沙霉素、螺旋霉素三種大環內酯類藥物的快速靈敏檢測。
發明內容
本發明涉及利用毛細管電泳-納米金敏化電化學發光聯用技術對動物組織中 三種大環內酯類藥物殘留同時進行檢測的方法。較為獨特的是該方法采用毛細 管電泳-納米金敏化電化學發光聯用技術，不但可同時檢測泰樂菌素、交沙霉素、 螺旋霉素三種大環內酯類抗生素，而且快速、簡便，定性、定量準確、靈敏度 高、選擇性好。
本發明方法原理為采用毛細管電泳-電化學發光聯用技術，基于該三種藥 物能顯著增強Ru(bpy) +電化學發光(ECL)信號的現象，結合毛細管電泳(CE) 分離技術，通過對分離檢測條件進行優化，進一步結合納米金敏化該電化學發 光反應信號的現象，實現對該三種藥物的快速靈敏分離檢測。本發明方法泰樂 菌素檢出限為23 ng/mL、交沙霉素檢出限為15 ng/mL、螺旋霉素檢出限為15 ng/mL，且在6分鐘內三種抗生素可實現完全分離，線性關系、重復性良好。經 與權威部門檢測數據對比本發明方法檢測的數據同樣準確可靠。可以對大環內 酯類抗生素的臨床使用和殘留進行定性定量檢測，以彌補目前檢測方法周期長、 不能同時分析、靈敏度低等不足之處。
具體來說，本發明的主要分析步驟如下 1工作電極的制備
檢測池上的工作電極為直徑300,的鉑盤電極。它的制作過程如下將長 度為2.5 cm、直徑為0.5拜的鉑絲焊接上一段金屬導線，并套進聚丙烯塑料管 中(內徑lmm、外徑3mm)，使鉑絲露出塑料管約100 的長度，采用透明 的環氧樹脂分別封住頂端和底端，室溫條件下放置24 h，然后用刀片將露出的 多余鉑絲切去，分別用不同粒徑的八1203研磨粉和砂紙打磨電極拋光，最后超聲 洗滌干凈。然后將工作電極安裝在毛細管電泳出口的相對位置上，通過在光學 顯微鏡下的觀察把鉑絲工作電極和毛細管出口處之間的距離控制在70±5 iim范 圍內。
為了減少鉑電極表面的氧化層，提高分析結果的穩定性和重現性，在每次電泳運行檢測前，使工作電極進行循環伏安處理3min，通過這種電化學清洗， 以減少試劑損耗或者反應中電壓干擾對其形成的影響。 2毛細管的處理
采用長度為45 cm，內徑為50 ^m，外徑為320 ^m的熔融石英硅毛細管。為 了保證實驗儀器的穩定性和測定結果的重現性，新的毛細管首次使用前要用 O.IM氫氧化鈉浸泡過夜，每次分離檢測前，都要用0.1M氫氧化鈉、二次蒸餾水
(簡稱二次水)和運行緩沖溶液分別沖洗毛細管各IO min。 3標準溶液的制備
分別稱取泰樂菌素、交沙霉素、螺旋霉素的標準品各O.l g，用超純水溶解， 并定容于100mL容量瓶中，冰箱低溫保藏以備下次使用，使用時逐級稀釋。 4毛細管電泳分離條件
(1) 分離緩沖液本發明直接采用磷酸鹽作為分離緩沖液
(2) 分離緩沖液pH:研究發現pH值在5.0 7.5范圍時，ECL強度隨pH值增大而 升高；pH大于6時，三種抗生素才能分開。而在7.5之后，ECL強度有所下 降，分離效率明顯降低。在pH值為7.5時，信噪比和分離效率相對較高， 因此將緩沖液的pH值選擇在7.5。
(3) 分離緩沖液濃度當緩沖溶液濃度在5 15mM之間變化時，三種藥物電化 學發光強度均迅速增大，且分離效率逐漸增加。隨著PBS濃度進一步增大， 電化學發光強度在15mM達到最大，然后迅速下降，且基線噪聲增高，分 離效率開始下降。故選擇緩沖液的濃度為15mM。
(4) 分離電壓當分離電壓在11 18 kV時，隨著分離電壓的升高，三種抗生 素的ECL強度迅速上升，遷移時間也在逐漸減少。但是當分離電壓高于15 kV時，ECL強度開始下降，分離效率開始降低，15 kV時樣品分離效率最 高，是實驗的最佳分離電壓。
(5) 進樣電壓研究在6 15kV范圍內變化時對ECL強度的影響。結果表明， 較高的進樣電壓有利于ECL強度的增加，但由于進樣量的增加會導致理論塔板數的降低，不利于分離檢測效率的提高。綜合考慮，選取12 kV為進 樣電壓。
(6)進樣時間考察了進樣時間在5 15s時對分離檢測的影響。結果顯示，隨 著進樣時間的增加，ECL強度逐漸增加，但當進樣時間超過IO s時，ECL 強度增長緩慢并且偏離線性且有拖尾現象，因此選擇IO s作為進樣時間。 5電化學發光檢測條件
(1) 檢測電位本發明采用三種獸藥抗生素的標準溶液，借助循環伏安法，在 0.8 1.4V范圍內，考察檢測電位對樣品電化學發光反應的影響。由圖1 可以看出，檢測電位低于0.8V時，沒有明顯的電化學發光峰信號；電位 高于l.OV時，三種抗生素的電化學發光強度均迅速上升，檢測電位高于 1.2V時，所有抗生素的電化學發光響應均不再增加。綜合考慮靈敏度、背 景電流和基線噪聲等影響因素，本方法將最佳檢測電位選定在1.15V。
(2) 檢測池中緩沖液pH:調節檢測池中磷酸鹽緩沖液的pH值在6.0 9.0變化，
考察了其對ECL強度和分離效率的影響。在6.0 8.0范圍內，ECL強度 隨pH值增大而升高，分離效率影響不大。而當pH大于8.0之后，ECL強 度有所下降。而超過這一數值時，ECL強度減弱，分離效率降低，因此將 緩沖液的pH值選擇在8.0。
(3) 檢測池中緩沖液濃度在20 60mM范圍內改變檢測池中緩沖液濃度，結 果發現隨著PBS濃度的進一步增大，ECL強度快速增長，分離效率增加， 在PBS濃度到達50mM之后，增長速度有所減慢，且分離效率開始下降， 不能達到基線分離。而在PBS濃度為50mM可以獲得最大信噪比，最佳 的分離效率，故選擇ECL池中PBS濃度為50mM。
(4) 電化學發光試劑濃度調節Ru(bpy)f濃度在1 9mM中變化，實驗發現， 隨著Ru(bpy)f的濃度從lmM 9mM逐漸增大，三種抗生素ECL強度也 隨之快速增加，這是由于高濃度的Ru(bpy),提高了背景噪聲，增加單位 時間內ECL釋放量。綜合ECL強度以及三種抗生素的分離效率，選擇Ru(bpy)32+濃度為7mM。 6納米金制備方法
(1) 在圓底燒瓶中加入95.8mL超純水，再加入4.2mLiy。的氯金酸溶液，磁力 加熱攪拌，持續煮沸10min。
(2) 加入10mL 1%的檸檬酸三鈉溶液(迅速)，溶液開始有些藍色，然后變淺 藍色，再加熱出現紅色。
(3) 等到出現透明的橙紅色，停止加熱，將熱源除去，繼續攪拌15min。
圖2為所制備納米金透視電鏡(TEM)圖，可以看出納米金形貌為較均一的球
狀，粒徑在15nm左右。 7納米金添加量
研究表明(圖3)隨著納米金添加到體系中，ECL強度明顯增大，并隨著比例 的增加快速增長，但對三者的分離效率影響不大，而在達到與Ru(bpy)^+的體積 比為0.75以后，ECL強度開始快速下降，因此將比例定為0.75。 8分析性能
通過以上對CE-ECL條件的考察，確定最佳的檢測條件為電極電位1.15V， 電動進樣，分離電壓15kV，進樣電壓12kV，進樣時間10s，分離緩沖液為 15mMPBS (pH=7.5)，檢測池溶液7mM Ru(bpy)32+ 50 mM PBS (pH=8)。在6 分鐘內三種抗生素可實現完全分離。圖4為三種抗生素完全分離的典型CE-ECL 譜圖。
本發明所建立的毛細管電泳-電化學發光體系能很好的滿足大環內酯類的分 禽檢測，并通過將納米金引入到檢測體系中，提髙了檢測的分離效率和靈敏度完 成了對泰樂菌素、螺旋霉素、交沙霉素分離檢測，并已成功應用于動物組織中 藥物殘留的檢測。
圖l:檢測電位對三種抗生素電化學發光強度的影響 圖2:所制備納米金的透射電鏡下形貌圖3:添加到Ru(bpy^+溶液中不同體積比的納米金對ECL強度的影響 圖4:最優條件下泰樂菌素、螺旋霉素和交沙霉素的典型CE-ECL圖譜。
具體實施例方式
下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。 實例1動物肝臟組織中三種大環內酯類藥物的加標回收測定 1材料 1.1儀器
MPI—B型毛細管電泳一多參數化學分析測試系統，WH—2微型漩渦混合 儀，HH—4數顯恒溫水浴鍋，Centrifiige 5804R臺式高速冷凍離心機，TecnaiG220 透射電鏡(TEM)，涂層石英毛細管內徑(ID) 50|am,外徑(OD) 320pm。電 化學檢測采用三電極系統工作電極為直徑300|im鉑盤電極，參比電極為 Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑電極。
1.2試劑和樣品
聯吡啶釕(Fluka公司)。泰樂菌素和交沙霉素標準品(Sigma公司)。螺旋 霉素標準品(德國D.R.公司)。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(中國醫藥集團上海化 學試劑公司)。納米金實驗制備。
動物組織樣品為購買自當地4個不同農貿市場的雞和豬肝臟組織樣品。
1.3標準品儲備液
分別精確稱取泰樂菌素、螺旋霉素和交沙霉素標準品0.1 g用超純水溶解， 充分攪拌溶解后定容到100mL容量瓶中，并根據需要稀釋成不同的濃度，放入 冰箱，低溫保存，以備待測時使用。
1.4動物組織樣品處理
分別稱取5g豬肝臟組織樣品，制備勻漿液，置于50mL離心管中，分別加 入系列濃度的所測定三種大環內酯類抗生素標準溶液，于振蕩器振蕩混勻。加 入15 mL乙腈，于振蕩器上劇烈振蕩10 min。以4200 r/min的轉速離心5 min，取上清液于另一離心管中，加入10mL正己烷，于振蕩器上劇烈振蕩10 min。 以4200 r/min的轉速離心10 min，小心吸取中間乙腈層12 mL于另一離心管中， 用氮氣于55'C水浴中吹至近干。準確加入l mL稀鹽酸溶解殘渣。經過0.22Mm 濾膜過濾后，供分析測定。 2實驗方法
2.1檢測條件
(1) 電極電位L15V;
(2) 分離緩沖液15 mM pH7.5PBS，檢測池中，7 mM Ru(bpy)32+配置 于50mM pH8.0PBS;
(3) 進樣時間10 S;
(4) 進樣電壓10kV;
(5) 納米金與Ru(bpy)f溶液體積比0.75。 2.2標準曲線
分別取泰樂菌素、螺旋霉素、交沙霉素單標標準溶液，用超純水稀釋得到 泰樂菌素濃度為7xl0—s lxl0—5，螺旋霉素濃度為2xlO—S-5xl(T6，交沙霉素濃度為 5xlO—s lxlO—s的混合系列標準溶液。在最優的條件下進行CE-ECL測定，以增強 發光強度為縱坐標，標準樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線(或回歸方程)。結果如 表1所示c
表1本發明方法對泰樂菌素、螺旋霉素、交沙霉素的分析參數 線性范圍(g/mL) 回歸方程 相關系數檢測限(ng/mL)
泰樂菌素7xl(T8-1 xlCT5 y = 25.7x + 186.67 0.9942 23
螺旋霉素2xl0-s-5xl0-6 y = 323.6x +402.93 0.9961 6
交沙霉素5xl0-8-lxl0-5y= 102.05x +342.330.9954 15
92.3樣品檢測
按照1.4方法獲得動物組織提取液，利用2.1的條件進行CE-ECL檢測，將 得到的增加發光強度代入相應的回歸方程中，通過計算得出三種大環內酯抗生 素在豬肝臟組織中的加標回收率。
結果表明(表2),豬肝臟組織中標準泰樂菌素的回收率在79 83.3%之間， 螺旋霉素的回收率在74 86.4%之間，交沙霉素的回收率在74.5 84.7%之間。 表2豬肝臟組織中所研究三種藥物加標回收實驗結果
添加濃度(嗎/mL) 檢測到濃度(昭/mL) 回收率(％)
TysSpmJosTysSpmJosTysSpmJ,os
10.005.0010.008.334.328.4783.3086.4084.70
5.002.004.004.061.543.2581.2077.0081.25
2.001.002.001.580.741.4979.0074.0074.50
注Tys，泰樂菌素；Spm,螺旋霉素；Jos，交沙霉素 3結果分析
實例1結果表明，所建立毛細管電泳-電化學發光法可于用于動物肝臟組織 中泰樂菌素、螺旋霉素、交沙霉素的三種大環內酯類抗生素的同時檢測，其結 果準確、選擇性好、檢測數據重復性好,可滿足實際檢測的需要。
實例2雞和豬肝臟組織中所三種大環內酯類抗生素殘留檢測
用CE-ECL方法進行購自4個不同農貿市場的雞和豬肝臟組織中所研究三 種大環內酯類抗生素的殘留檢測，組織液提取方法(省略加入標準溶液步驟)， 毛細管、電化學檢測條件，標準曲線等均參照實例1所述。檢測結果如表3所示。表3不同動物組織樣品中三種大環內酯類抗生素檢出結果樣品類型樣本號檢出濃度(嗎/kg)(平均值±SD， "=3)
泰樂菌素 交沙霉素 螺旋霉素
雞肉組織1 2 3-- _
4-- 124±15
524±22 - -
6460±25- -
7823±37- -
豬肉組織1215±18- -
2242±20- 314士30
3
4-- _
6--
8—— _
實例2表明所建立毛細管電泳-電化學發光法可于用于動物肝臟組織中泰樂 菌素、螺旋霉素、交沙霉素的殘留檢測，其結果準確、檢測數據重復性好,可滿 足實際檢測的需要。
1權利要求
1.一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于(1)采用毛細管電泳對泰樂菌素、交沙霉素和螺旋霉素進行分離；(2)利用泰樂菌素、交沙霉素和螺旋霉素能顯著增強Ru(bpy)32+電化學發光信號的現象，進行檢測；(3)將納米金引入檢測體系，大大提升了分離效果和靈敏度。
2. 如權利要求1所述一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌 素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于可以同時對泰樂菌素、交 沙霉素和螺旋霉素三種大環內酯類抗生素殘留進行檢測。
3. 如權利要求1所述一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌 素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于采用毛細管電泳-電化學發 光聯用技術同時加入納米金作為活性劑。
4. 如權利要求1所述一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌 素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于最佳毛細管電泳條件為15 mM磷酸鹽(pH7.5)作為分離緩沖液，電動進樣，分離電壓15kV，進樣電 壓12kV，進樣時間10s，在6分鐘內三種抗生素可實現完全分離。
5. 如權利要求1所述一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌 素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于最佳電化學發光條件為 電極電位1.15V，檢測池溶液7mMRu(bpy) +50mMPBS (pH=8)。泰樂菌素 檢出限為23 ng/mL、交沙霉素檢出限為15ng/mL、螺旋霉素檢出限為15 ng/mL。
6. 如權利要求1所述一種毛細管電泳-納米金敏化電化學發光同時檢測泰樂菌 素、交沙霉素和螺旋霉素殘留的方法，其特征在于納米金添加到體系比例定 為0.75: 1 (v/v)。
全文摘要
本發明涉及利用毛細管電泳-納米金敏化電化學發光聯用技術對三種大環內酯類藥物(泰樂菌素、交沙霉素、螺旋霉素)殘留同時進行檢測的方法。尤為獨特的是該方法采用毛細管電泳-電化學發光聯用技術，同時加入納米金作為活性劑大大增強了三種抗生素與Ru(bpy)<sub>3</sub><sup>2+</sup>電化學發光體系的信號強度。在六分鐘內三種抗生素完全分離，泰樂菌素檢出限為23ng/ml、交沙霉素檢出限為15ng/ml、螺旋霉素檢出限為15ng/ml。該發明不但可以同時檢測三種大環內酯類藥物而且線性關系良好，靈敏度高，重現性好，在檢測時間上也具有明顯優勢。
文檔編號G01N27/48GK101672822SQ20091003533
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月25日 優先權日2009年9月25日
發明者吳世嘉, 雙 李, 震 楊, 諾 段, 王周平 申請人:江南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
