專利名稱：：一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，適用于乙肝核心抗體的定性或半定量檢測。
背景技術：
：乙肝病毒(HBV)是致人乙型肝炎的病原體，是目前世界上傳染最廣泛的致命病毒之一。據統計，全世界有超過35億的人群是慢性乙型肝炎病毒的攜帶者[ZuckermanJN，ZuckermanAJ.CurrenttopicsinhepatitisB.JInfect，2000，41(2)130～136]，其中中國有1.2億；而且每年在全球范圍內約有一百萬人因感染HBV而死亡[Parkin，D.M，PisaniP，MunozNandFerlayJ.Theglobalhealthburdenofinfectionassociatedcancers.CancerSurv，1999，335～33.]。由于目前還沒有治療乙型肝炎的有效手段，因此疫苗接種、早期檢測診斷是預防乙型肝炎的重點。乙型肝炎的病原學診斷，最常用的是乙肝病毒血清標志物(HBVM)的檢測。HBVM主要包括七種血清標志物乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(anti-HBs)、乙肝核心抗體(anti-HBc)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(anti-HBe)、HBV-DNA及DNA多聚酶(DNA-p)。通過檢測HBVM可以間接的多角度了解患者HBV感染、復制以及病情恢復情況。在HBVM中，anti-HBc較為獨特首先，anti-HBc是除HBV感染的最初階段外，其它所有階段均能檢測到的一種血清標志物；這個標志物在HBsAg消失后的急性HBV感染期和慢性HBV攜帶期均存在，甚至可以終身保存。因此它是現在及過去曾感染HBV的指標，對anti-HBc的檢測可以為特定人群的乙肝流行性動態(tài)提供最好的信息。其次，anti-HBc是窗口期(HBsAg不能檢測到而anti-HBs還未出現的時期)僅有的、可檢測到的血清標志物[LeeWM.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed.，1997，337(24)1733～1745.]。因為許多具有感染HBV風險的血制品主要源自處于感染窗口期的HBV攜帶者[SchreiberGB，BuschMP，KleinmanSH，KorelitzJJ.Theriskoftransfusion-transmittedviralinfections.NEnglJMed，1996，334(26)1685～1690.]，所以anti-HBc的篩選對預防輸血后HBV感染有著重要的意義。另外，人們還發(fā)現一些HBV變異株在HBsAg檢測中表現為陰性，但是其anti-HBc卻能被檢測到[CarmanWF，KorulaJ，WallaceL.FulminantreactivationofhepatitisBduetoenvelopeproteinmutantthatescapeddetectionbymonoclonalHBsAgElisa.Lancet，1995，3451406～1407.；JongeriusJM，WesterM，CuypersHTM，vanOostendorpWR，LeliePN，vanderPoelCL，etal.NewhepatitisBvirusmutantforminablooddonorthatisundetectableinseveralhepatitisBsurfaceantigenscreeningassays.Transfusion，1998，38(1)56～59.]。所以，對anti-HBc的檢測可以降低HBV感染者被漏檢的風險。綜上所述anti-HBc的檢測對乙肝的診斷治療、流行病學調查以及對乙肝疫苗安全性鑒定具重要意義。目前，乙肝核心抗體(anti-HBc)的檢測方法主要分為三大類免疫吸附血凝試驗(IAHA)、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)技術和放射免疫檢測(RAI)技術。其中ELISA技術靈敏度高，價格相對較低，國內外應用較為廣泛。[姚楨等，分子乙型肝炎病毒相關病學。中國醫(yī)藥科技出版社，2003，p27～28。]最常采用的ELISA檢測方法是競爭性抑制法。這種檢測方法的優(yōu)點是對包被抗原的純度要求不高，當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。但缺點也是很明顯靈敏度不高，對低水平表達的anti-HBc樣品難以檢出；同時，因為包被抗原的純度不高，所以可能會導致非特異性反應，從而出現假陽性檢測結果。雖然近年來國內外有文獻報道加入某種還原劑可以增加競爭抑制法檢測anti-HBc的特異性[JohnAWeareetal.ImprovementinthespecificityofassaysfordetectionofantibodytoHepatitisBcoreantigen.JClinMicrobiol，1991，29(3)600～604.]。但事實表明這種特異性的提高是以犧牲靈敏度為代價的，不能從根本上解決問題。其次，在檢測過程中因先加入標本，再加酶標anti-HBc，所以會導致標本的anti-HBc優(yōu)先結合HBcAg，使樣品anti-HBc與酶標anti-HBc產生“不公平競爭”，在成批樣品測定時，這種時間差異的加大會使得“不公平競爭”加劇，可能會產生前后檢測結果不一的問題[杜青等，加酶時間對競爭ELISA法檢測HBcAb的影響。JangsuMedJ，2005，31(6)466～468.]。此外，傳統的競爭抑制法檢測不易于通過目視來區(qū)別弱陽性樣品與陰性樣品。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，該雙抗原夾心法酶聯免疫診斷試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型酶標比色儀，更重要的是能快速地對乙肝核心抗體進行更為準確的檢測。為了實現上述目的，本發(fā)明要用以下技術措施一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括微孔反應板和酶結合物，微孔反應板是由90％以上純度、效價為5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重組蛋白(rHBcAg)包被而成；酶結合物是由辣根過氧化物酶(HRP)標記乙肝核心抗原重組蛋白獲得。本發(fā)明上述90％以上純度、效價為5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重組蛋白可通過表達含乙肝核心抗原蛋白基因的重組基因工程菌后，經硫酸銨鹽析和免疫親和層析分離純化而獲得的，其中免疫親和層析的洗脫液為0.1mol/mlpH11.5三乙胺。上述包被的乙肝核心抗原重組蛋白的工作濃度為1∶200～2000(體積比)；酶結合物的工作濃度為1∶500～2000(體積比)。上述酶結合物的工作濃度由含10克/升的牛血清白蛋白、體積比為0.05％的Tween-20，0.1克/升的硫柳汞、5克/升的氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋得到。本發(fā)明所述的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒在檢測乙肝核心抗體中應用。本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點和效果1、檢測的特異性高；2、檢測的靈敏度高；3、可消除因操作時間差所產生的誤差；4、檢測結果易于目視判斷；5、可同時對樣品進行半定量檢測。圖1為本發(fā)明試劑盒用于檢測anti-HBc的確證實驗；圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測anti-HBc的動力學曲線圖。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒組成與配制辣根過氧化物酶購自Faizyme；重組基因工程菌E.coliJM105(pKK223-3)[MarcTordjemanetal.Specificdetectionofanti-HBCantibodieswithanenzymeimmunoassayusingrecombinantHBcAgandmonoclonalantibodies.J.Virol.Meth，1993，4321～30]；E.coliJM105(pFS14NSD)[FlorianSchodeletal.StructureofhepatitisBVirusCoreande-Antigenasingleprecoreaminoacidpreventsnucleocapsidassembly.JBiolChem，1993，268(2)1332～1337]；E.coliM15(pQE30)[周福元等，應用pQE30系統表達和純化乙型肝炎病毒核心抗原。ChinJBiologicals，2000，13(1)13～15]；乙肝核心抗原重組蛋白將表達乙肝核心抗原的重組基因工程菌8000rpm離心10分鐘獲得菌體沉淀；將收集的菌體用0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸，冰浴，超聲波破菌3min左右，至懸液澄清；其后10000rpm，離心20min，收集上清；將此上清用40wt％硫酸銨鹽析后上免疫親和層析柱，用0.1MpH11.5三乙胺溶液洗脫，獲得90％以上純度、效價為5×104～5×105u/mg純化的乙肝核心抗原重組蛋白；聚苯乙烯微量反應板購自Greinerbio-one；包被液50mmol/LpH9.5Na2CO3-NaHCO3緩沖液；封閉液含50克/升蔗糖，10克/升牛血清白蛋白，0.1克/升硫柳汞的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液；樣品稀釋液含10克/升牛血清白蛋白，體積比為0.05％Tween-20，0.1克/升硫柳汞的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液；酶稀釋液含10克/升牛血清白蛋白，體積比為0.05％Tween-20，0.1克/升硫柳汞，5克/升氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液；洗滌液含體積比為0.5％Tween-20的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液；底物緩沖液含0.51g/L檸檬酸，1.46g/LNa2HPO4的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液；底物溶液含0.1g/L四甲基聯苯胺(TMB)，體積比為50％的二甲基甲酰胺(DMF)，體積比為0.3％H2O2的底物緩沖液；終止液2mol/LH2SO4；酶結合物采用過碘酸鹽改良法[WilsonMB，NakanePK.Recentdevelopmentsintheperiodatemethodofconjugatinghorseradishperoxidasetoantibodies.Immunofluorescenceandrelatedstaomomgtechniques.North-HollandBiomedicalPress，Amsterdam，1978，pp215-224.；NanciDonacki，PeroxidaseConjugationbyPeriodateMethod.Protocolonline.2004.]用辣根過氧化物酶(HRP)標記乙肝核心抗原重組蛋白(rHBcAg)；微孔反應板用包被液將乙肝核心抗原按體積比1∶200～2000稀釋后，以100μl/孔包被96孔板，置4℃過夜；其后洗板5次，每次5分鐘；再加150μl/孔封閉液于96孔板中，置37℃溫育2小時，最后洗板3次后烘干，用封口膠封存，于4℃保存?zhèn)溆谩嵤├?用雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒檢測乙肝核心抗體1.在微孔反應板加入待測標本100μl/孔(待測標本用樣品稀釋液作1∶30稀釋)，設置陰性對照、陽性對照各兩孔，并設空白對照一孔；封板，置37℃溫育1h；2.洗板3次，每次5min3.加入1∶1200稀釋后的酶標抗原100μl/孔，空白對照孔只加酶稀釋液；封板，置37℃溫育30min；4.洗板3次，每次5min5.加底物溶液，封板，置37℃溫育15min；6.加50μl/孔終止液終止反應；7.檢測用酶標光度計檢測各孔在450nm、630nm處的光吸收值；其檢測結果為樣品OD450＝0.985，OD630＝0.041；空白對照OD450＝0.065，OD630＝0.047；陰性對照1OD450＝0.084，OD630＝0.045；陰性對照2OD450＝0.088，OD630＝0.045；陽性對照1OD450＝0.794，OD630＝0.045；陽性對照2OD450＝0.820，OD630＝0.052。經計算得樣品OD＝0.926；陰性對照OD1＝0.021，OD2＝0.025；陽性對照OD1＝0.741，OD2＝0.754。8.結果判定樣品OD值/陰性對照平均OD值≥2.1判斷為陽性，否則為陰性；其中陰性對照OD值低于0.05作0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。因此，可以判定該樣品為乙肝核心抗體陽性。實施例3雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒與傳統競爭抑制法酶聯免疫診斷試劑盒檢測乙肝核心抗體的比較1.我們采集了不同HBV狀態(tài)的血清共943例(表1)。每份血清樣品均用雙抗原夾心ELISA法和競爭抑制ELISA法診斷試劑盒(購自上?？迫A生物工程股份有限公司)同時檢測。若樣品的檢測結果處于邊緣狀態(tài)以及兩種檢測結果存在差異，則用兩種檢測程序再檢測一遍。表1被檢測血清樣品分類檢測結果表明有16份血清樣品的檢測結果不一致。以競爭抑制性ELISA法檢測試劑盒的檢測結果為參考值，則雙抗原夾心ELISA法的靈敏度可以達到99.8％，特異性達95.7％，符合率為98.3％(表2)。表2兩種診斷試劑盒檢測乙肝核心抗體結果比較一覽表靈敏度597/598＝99.8％，特異性330/345＝95.7％，符合率927/943＝98.3％；a1份血清HBsAg陽性，b3份血清HBsAg陽性，7份血清HBsAb陽性，5份血清無乙肝標志物2.特異性比較我們對這16份檢測結果不一致的血清樣品進行雙夾心法確證實驗(即中和試驗)的檢測，以確證檢測的特異性。其檢測結果(圖1)為15份血清樣品的中和試驗比對照試驗和加入正常人血清試驗的顯色結果均要淺得多，說明在雙抗原夾心法檢測中，此15份樣品的檢測結果為真陽性，是特異性檢測結果。而另一份編號12.06.61的血清樣品，其中和試驗與對照試驗的顯色幾乎相同，表明此為非特異性反應。綜上所述本發(fā)明在檢測anti-HBc的特異性方面比現行競爭抑制性ELISA診斷試劑盒高。3.靈敏度的比較選取7份不同的陽性血清樣品進行倍比稀釋，記錄到達終點滴度時血清樣品的最大稀釋度，從而比較兩種檢測方法的靈敏度，結果表明雙抗原夾心ELISA法靈敏度是競爭法的32到256倍(表3)。表3競爭抑制性ELISA法與雙夾心ELISA法靈敏度比較此外，經研究[袁紅、熊燕等，四種乙肝標志物ELISA試劑盒的動力學比較研究。MedJWestChina，2003，1(1)18～20.]發(fā)現許多國產試劑盒，其anti-HBc的CO值接近于動力學曲線圖形的平臺區(qū)與線性區(qū)交界處，因此很容易在該區(qū)域造成結果誤判。但是，從本發(fā)明試劑盒用于檢測anti-HBc的S/CO動力學曲線圖(圖2)看一方面，其anti-HBc的CO值處于動力學曲線圖形的線性變化區(qū)內，有利于對血清樣品檢測結果的定性判讀；另一方面，其線性范圍較寬，不同樣品的稀釋曲線幾乎平行，有利于對血清樣品中乙肝核心抗體進行半定量的檢測，這種半定量的檢測在臨床檢測與診斷中具有重要的意義。4.雙夾心ELISA法重復性分析選取低、中、高3份不同的陽性血清樣品，用同一批雙夾心法診斷試劑盒進行檢測，每份樣品分別平行測8孔，進行試劑盒批內重復性檢測；同理選取低、中、高3份不同的陽性血清樣品，用6份不同批次的雙抗原夾心法診斷試劑盒進行檢測，每份樣品平行測2孔，進行試劑盒批間重復性檢測。檢測結果為本試劑盒的批內平均變異系數為5.39％(表4-1)；批間平均變異系數為6.99％(表4-2)。由此可以確定雙夾心測定法中所用的試劑都比較穩(wěn)定，該試劑盒的重復性比較滿意。表4-1雙夾心法檢測試劑盒批內重復性檢測結果表4-2雙夾心法檢測試劑盒批間重復性檢測結果5.雙夾心ELISA法穩(wěn)定性分析將試劑存放于37℃環(huán)境中保存，定期檢測，直到其質量指標開始下降為止。通常認為在37℃每穩(wěn)定一天，可相當于4～10℃保存一個半月。根據測定結果(表5)表明該試劑盒37℃放置5天，其S/CO值變化屬非顯著性差異；但在第5天，樣品于4℃和37℃所測定的兩組數據的變異系數(CV％)超過了15％。故推測此雙抗原夾心法檢測試劑盒至少在4℃可保存6個月，其試劑盒的穩(wěn)定性較好?？偵纤鲭p夾心法酶聯免疫診斷試劑盒靈敏度高、特異性好、檢測結果準確可靠，其穩(wěn)定性和重復性符合臨床檢測要求。表5雙夾心法診斷試劑盒的穩(wěn)定性檢測結果t檢驗結果第三、四、五天4℃和37℃所測得的兩組數據間的差異均為非顯著性差異權利要求1.一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括微孔反應板和酶結合物；其特征是微孔反應板是由90％以上純度、效價為5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重組蛋白包被而成；酶結合物是由辣根過氧化物酶標記乙肝核心抗原重組蛋白獲得。2.根據權利要求1所述的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，其特征是90％以上純度、效價為5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重組蛋白是通過表達含乙肝核心抗原蛋白基因的重組基因工程菌后，經硫酸銨鹽析和免疫親和層析分離純化而獲得的，其中免疫親和層析的洗脫液為0.1mol/mlpH11.5三乙胺。3.根據權利要求1或2所述雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，其特征是包被的乙肝核心抗原重組蛋白的工作濃度體積比為1∶200～2000；酶結合物的工作濃度體積比為1∶500～2000。4.根據權利要求3所述的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，其特征是酶結合物的工作濃度由含10克/升的牛血清白蛋白、體積比為0.05％的Tween-20，0.1克/升的硫柳汞、5克/升的氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋得到。5.權利要求1所述的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒在檢測乙肝核心抗體中應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測乙肝核心抗體的雙夾心法酶聯免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括微孔反應板和酶結合物；微孔反應板是由90％以上純度、效價為5×10文檔編號G01N33/544GK1908666SQ20061001998公開日2007年2月7日申請日期2006年8月14日優(yōu)先權日2006年8月14日發(fā)明者黃健,鄧麗娟,嚴兵申請人:武漢大學
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