專利名稱：一種測定酶法脫毛液中總糖含量的方法
技術領域：
脫毛工續是制革生產中必須進行的一步，但傳統的硫化物脫毛對環境污染嚴重。酶法脫毛可減少污染，但通常應用的蛋白酶，對皮膠原本身造成相當的損傷，所以，酶法脫毛必須嚴格控制其進程。脫毛液中糖含量是研究和控制酶法脫毛的一種重要手段。本發明采用硫酸-苯酚法測定其中羥基糖含量，采用乙酰丙酮法測定其中氨基糖含量，從而計算總糖含量。本發明應用于皮革生產中。
背景技術：
制革工藝中的脫毛是通過物理、化學或者生物處理的方法使毛和表皮脫離真皮的過程。同時，生皮的膠原纖維間含有很多的可溶性蛋白和纖維間質，干燥后，它們把纖維粘在一起，使生皮板硬，不耐彎折，因此，脫毛過程中還要去除這些纖維間質，松散膠原纖維，為后續工藝創造良好條件。傳統的灰堿法脫毛，脫毛干凈、操作簡便、容易控制、質量穩定，且成本較低。但污染嚴重，脫毛是制革準備階段的主要污染源，約占整個準備階段的84% B0D,75% C0D,85%TDS,還有有毒的硫化物產生。為了減少灰堿法的污染，采用了酶法脫毛。酶脫毛作為一種生物法，無疑更符合當今世界環保的理念。早期的“發汗法”可能是最古老的酶脫毛技術。所謂“發汗法”就是利用附著在皮上的微生物菌株，在一定條件下，對動物皮組織進行作用，使毛和真皮的聯結松開，從而脫毛。本質上是附在皮上的腐敗細菌發酵生長，所釋放出的酶產生了脫毛作用。澳大利亞細綿羊皮采用發汗法脫毛，可以保證貴重的羊毛不受損傷。后來的學者從發汗法脫毛的原料皮上分離到多種具有脫毛能力的菌株。如從澳大利亞細綿羊毛中分離出普通變形桿菌、無色桿菌、黃桿菌，具有脫毛能力。英國的原料皮上分離出普通變形桿菌；美國的原料皮分離的則是極毛桿菌。日本的農田春和二見明分離出枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。這些菌株發酵得到的酶制劑對羊皮脫毛能力良好。真正現代酶脫毛技術的創始人則是德國人R5hm，他于1908年發明了軟化酶Oropon, 1910年發明了酶脫毛工藝“Arazym Process”,其使用的酶是以動物胰臟為主的酶制劑，開創了現代酶技術在皮革中應用的先河。該技術在美國用于山羊和小山羊皮的脫毛，直至1930s。二戰以后，隨著工業微生物生產技術的突破，大量來自于細菌、霉菌、放線菌的新型酶制劑出現，取代了來自動植物的酶制劑，酶脫毛再次受到重視。在此期間，Burton、Reed,美國東部地區農業研究中心的Cordon、Bailey、Cooper,意大利的Simoncini,澳大利亞的Yates,德國的SchlSsser、Heidemann,蘇聯的色色金娜，以及印度和日本的學者，運用當時的生物知識、測試手段，對酶脫毛技術從工藝到原理進行了深入的研究，取得重大進展。但由于酶脫毛過程控制難、對皮損傷大、價格高等原因，到1970年后，第二次遭到冷落。值得一提的是，此時，由于特殊的原因，我國的酶脫毛技術曾經紅火一時。
進入90年代，由于世界各國對環境保護的日益重視，生物技術的重大突破，酶脫毛技術第三次受到重視。最早用于皮革工業的酶制劑正是來自動物胰臟的胰酶，它是一種蛋白酶。早期的酶脫毛多用胰酶，德國、美國稱為“Arazym”，蘇聯則稱為“奧羅邦”，在山羊皮上取得一定效果，其它皮張效果不佳，粒面容易產生管皺和松面。也有從植物中提取蛋白酶來脫毛的。最早的是從木瓜(Carica papaya)中提取木瓜蛋白酶，具有一定的脫毛能力，但成本太高。1953年，印度的S. Bose等從Calotropisgigantea(—種巨大牛角瓜)提取植物蛋白酶“馬塔爾”乳液,從Eleusine coracana(—種蟋蟀草屬植物)提取淀粉酶“拉特然”乳液，用于脫毛，適用于印度小公牛皮、山羊皮。據報道，用植物提取液進行酶脫毛在印度至今仍有應用。Rose、Chellan等于2004年在美國申請了相類似的專利。毫無疑問，脫毛用酶制劑的主要來源是微生物。細菌、霉菌、放線菌中都有一些菌株可產生具有脫毛能力的蛋白酶。早期報道的細菌有覃狀芽抱桿菌(Bacillus mycodies)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megatherium)、馬鈴薯芽抱桿菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)等。放線菌有白色鏈霉菌(St. albus)、抗生素鏈霉菌(St. antibioticus)、金色鏈霉菌(St. aureus)、灰色鏈霉菌(St. grseus)等。霉菌有黑曲霉(Asp. niger)、米曲霉(Asp. oryzae)、黃曲霉(Asp. f lavus)等。但是，蛋白酶脫毛的同時，不可避免會損傷真皮的結構，影響皮制品的使用性能，這嚴重影響了酶脫毛的應用。必須對酶脫毛的機理和過程進行深入的研究和嚴格的控制。自從酶用于皮的脫毛，人 們就開始研究酶脫毛的機理。從開始的組織切片、光學顯微鏡觀察，到后來的化學水平、電子顯微鏡觀察、生物技術的運用等，不斷深入，取得許多成果。但由于原皮結構的復雜性、脫毛用酶的復雜性，所得結論比較分散，甚至相互矛盾。由于評判、測試困難，許多理論證據不夠充分，還有待進一步研究。酶脫毛達到的主要目的倒是基本公認的，S卩①毛和皮分離，從而去毛。②除去纖維間質，松散真皮中膠原結構，為后續工藝中各種試劑的滲透創造良好條件。整個酶脫毛過程涉及的幾個主要問題，如①酶作用于皮的哪一部分？作用于什么成份？②什么酶有作用？③用何種底物測定酶活，可以表征酶的脫毛能力？④酶是如何滲透到脫毛作用點的？⑤酶對皮的損傷是如何產生的？不同研究者存在著一定的分歧。芭芭金娜通過組織切片法，研究發現在酶脫毛過程中，毛囊中的毛根、馬氏層、乳頭層的肥大細胞等處的類粘蛋白逐漸被水解，致使毛、皮分離，牛羊皮的表皮層被溶解；同時，整個原皮中的類粘蛋白也被水解，膠原纖維得以松散[79]。Yates認為酶通過水解粘蛋白、類粘蛋白，破壞了真皮和表皮的連接,破壞了毛根和基膜的連接。透射電鏡研究表明，酶破壞了毛根、毛球和毛乳頭細胞之間的“橋粒”聯接，隨著“橋粒”被打開，細胞相互分離，毛根鞘失去對毛根的包裹作用，毛球失去對毛乳頭的緊鉗作用，毛可以從毛囊中脫落出來。李志強教授最近研究發現，基膜及其周圍組織的蛋白提取物被廣泛水解，與脫毛有關。總之，酶脫毛過程中，有大量粘蛋白、類粘蛋白或者其它蛋白質被水解，導致脫毛，酶溶液中總蛋白質濃度增加，總蛋白質濃度和脫毛進程直接相關。另一方面，由于粘蛋白有蛋白部分和粘多糖部分組成，粘蛋白被水解，除了蛋白質脫落外，多糖部分也溶入酶液。所以，脫毛液中糖含量增加。芭芭金娜認為脫毛液中的還原糖含量和脫毛能力有關，糖含量越高，即脫毛能力越強[79]。Cordon則認為糖含量和脫毛進程不相適應，證據不夠充分[83]。金寶仲等則認為兩者有聯系，但關系不很明確。而且，粘蛋白中粘多糖的水解，使膠原結構得以松散，這一點是普遍承認的。Alexander認為糖含量可以作為反映膠原松散程度的指標。總之，一般情況下，脫毛溶液中的糖含量可以表征皮的松散程度指標，同時，也部分反映了整個脫毛進程。過去，主要是通過研究脫毛液中的蛋白質變化情況，來研究脫毛機理，對脫毛液中糖的分析不夠重視，近年來對糖的分析逐漸多起來。糖和糖胺多糖的分析方法很多，包括光譜法、共振光散射法、圓二色性法、熒光法、高壓液相法、毛細管電泳法、質譜法、電化學法等。無疑，光譜法是簡單而最常用的方法，在皮革研究中，正是采用分光光度法來分析脫毛液中的糖含量。常用的比色法包括硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、硫酸-咔唑法、鄰甲苯胺法、3，5-二硝基水楊酸法等。但是，這些方法僅僅分析了其中的羥基糖部分，而對氨基糖部分均忽略了。其計算出來的總糖含量是不全面的，有偏差的。本發明采用新的方法來計算總糖含量。本研究綜合考慮了各個方面，認為分光光度法應用于脫毛液中，切實可行、方便快捷。選擇了硫酸-苯酚法 和3，5-二硝基水楊酸法進行了研究。闡述了分析方法的適用性、穩定性和操作要點。由于粘蛋白中的糖有一半是氨基糖，而上述比色方法均不能測定氨基糖，故用對2-氨基糖選擇性很強的乙酰丙酮法來測定氨基糖。幾種方法相結合，可以反映脫毛液中的糖含量，并能估算糖鏈的平均大小，可用于進一步研究酶法脫毛的機理。
發明內容
本發明采用硫酸-苯酚法來測定脫毛液中羥基糖含量，乙酰丙酮法來測定氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量。
具體實施例方式實施例一1.脫毛豬皮充分水洗，并脫脂后，經過堿膨脹，切成4cmX4cm的皮塊，用于脫毛。酶用量按每克皮400u計，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂緩沖溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 :1配制。皮塊和酶按用量放入廣口瓶中，蓋緊，32°C，振搖器中振搖。每隔一定時間，吸取酶液，測定脫毛液中糖含量。2.硫酸-苯酚法測定羥基糖含量(I)標準曲線的確定分別取葡萄糖標準溶液O. 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5ml置于干燥的比色管中，加水至O. 5ml，分別加入5%苯酚溶液O. 5ml，搖勻，快速加入2. 5ml濃硫酸，充分振搖，于25 30°C放置20min，以空白為參比調零，于490nm測量吸光度，并作標準曲線。(2)脫毛液的測定脫毛液稀釋10倍，再取O. 5ml進行測定，并以O時酶液為空白。(3)羥基糖含量的計算脫毛液的測定結果用2.⑴中的標準曲線計算羥基糖含量。3.乙酰丙酮法測定氨基糖含量(I)標準曲線的確定分別取鹽酸氨基葡萄糖標準溶液O、1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0ml，置于干燥的比色管中，各加水至5. 0ml，再加入1. Oml乙酰丙酮溶液，搖勻，沸水浴中加熱25min，取出，冷卻。加對-二甲氨基苯甲醛溶液1.0!111，搖勻，601保溫lhr，放置冷卻。以空白為參比調零，于525nm測量吸光度，并作標準曲線。(2)脫毛液的測定將脫毛液用6M鹽酸100°C水解6hr，用6M氫氧化鈉中和至pH7. 0，并以適量體積定容。取5. Oml進行測定，并以O時酶液為空白，(3)氨基糖含量的計算；
脫毛液的測定結果用3.⑴中的標準曲線計算氨基糖含量。4.總糖含量的計算將2中得到的羥基糖含量和3中得到的氨基糖含量相加即可得到總糖含量。實施例二1.脫毛牛皮充分水洗，經過堿膨脹，切成4cmX4cm的皮塊，用于脫毛。酶用量按每克皮400u計，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂緩沖溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 I配制。皮塊和酶按用量放入廣口瓶中，蓋緊，320C，振搖器中振搖。每隔一定時間，吸取酶液，測定脫毛液中糖含量。2.其它步驟同實施例一，即可得到總糖含量。
權利要求
1.本發明分別測定脫毛液中羥基糖含量和氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量。
2.(I)中測定脫毛液中羥基糖含量的方法是硫酸-苯酚法。
3.(I)中測定脫毛液中氨基糖含量的方法是乙酰丙酮法。
全文摘要
在皮革生產的脫毛工序中，測定總糖含量是研究和控制酶法脫毛的一種重要手段。本發明采用硫酸-苯酚法來測定脫毛液中羥基糖含量，乙酰丙酮法來測定氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量，克服了以往測定總糖含量時，忽略了氧基糖含量的缺點。本發明可用于皮革生產中的脫毛工序。
文檔編號G01N31/22GK103063803SQ20111031938
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月20日 優先權日2011年10月20日
發明者宋健 申請人:江南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
