專利名稱：一種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR)口蹄疫病毒基因分型檢測方法及其試劑盒的應用的制作方法
技術領域：
本試發明屬于病毒核酸檢測領域，涉及口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的基因檢測和分型方法，特別是涉及使用一種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR) 的方法對口蹄疫病毒進行基因分型檢測，該方法進一步涉及一種檢測試劑盒，能夠對發病 動物水泡液、淋巴結等標本以及細胞培養液中口蹄疫病毒RNA進行分型檢測，適用于口蹄 疫病毒型感染的輔助診斷及流行病學調查。
背景技術：
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性高度傳染性疫 病，被國際獸疫部門列為A類動物傳染病之首。易感動物包括牛、綿羊和豬等70多種家養 和野生哺乳動物。FMDV經呼吸道感染是最主要的傳播途徑，也可經消化道感染，人員及運輸 工具等均可機械性的散播病毒。本病具有流行快、傳播廣、發病急、危害大等流行病學特點，疫區發病率可達 50%-100%，犢牛死亡率較高。病畜和潛伏期動物是最危險的傳染源。病畜的水皰液、乳 汁、尿液、口涎、淚液和糞便中均含有病毒。該病入侵途徑主要是消化道，也可經呼吸道傳 染。本病春秋兩季較多，尤其是春季。風和鳥類也是遠距離傳播的因素之一。該病病牛齒 齦、舌面、唇內面可見到蠶豆到核桃大的水皰，涎液增多井呈白色泡沫狀掛于嘴邊。水皰約 經一晝夜破裂，形成潰瘍。在口腔發生水皰的同時或稍后，趾間及蹄冠的柔軟皮膚上也發生 水皰。有時在乳頭皮膚上也可見到水皰。有些病例在水皰愈合過程中，病情突然惡化，往往 因心臟麻痹而突然死亡，死亡率高達25 % 50 %。犢牛發病主要表現為出血性胃腸炎和心 肌炎，死亡率很高。FMDV屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，通過交叉保護試驗和血清學試驗確定FMDV有 7個血清型，即0、A、C、Asial和SATU SAT2、SAT3等，及65個以上的血清亞型。根據7個 血清型的同源性將其分為兩群，即0、A、C和Asial型為一群，SATl、SAT2、SAT3為一群，兩 群之間的血清型同源性較低，群內同源性可達60 % 70 %，血清型之間無交叉和交叉免疫 現象。0、A、C、型FMDV的毒力和抗原性均易發生變異，幾乎遍布亞、非、拉、歐各洲。SAT1、 SAT2、SAT3主要分布在非洲，Asial型主要分布在亞洲。北美洲、中美洲、加勒比海地區及大 洋洲為較少發生FMD的疫情。控制FMD —直是各國政府關注的焦點，已經成了一個敏感的國際問題，以至于世 界動物及畜產品市場也因此而被劃分為兩個部分，即無FMD國家和有FMD國家。無FMD國 家的動物產品在國際市場上很受歡迎，而有FMD國家情況恰恰相反，在國際上的食品貿易 中處于不利地位。我國政府也高度重視口蹄疫的疫情控制。
發明內容
目前對于該種口蹄疫病毒的實驗室檢查主要包括以下幾種間接夾心酶聯免疫
3吸附試驗、反向間接血凝試驗(RIHA)、中和試驗、液相阻斷酶聯免疫吸附試驗、非結構蛋白 ELISA檢測、正向間接血凝試驗(IHA)、RT-PCR試驗和病毒分離鑒定等。前六種方法目的是 檢測相應的抗體，屬于血清學檢測方法，是建立在已經感染并產生抗體的基礎上，鑒于口蹄 疫病毒的高度變異性以及交叉性，其檢測的特異性難以保證，容易出現假陽性和假陰性，也 無法進行快速檢測。后兩種方法屬于確診實驗，其中從標本中分離病毒并鑒定需要幾天的 時間。RT-PCR試驗可以設計針對口蹄疫病的特異性引物，進行擴增，通過擴增產物電泳來 判斷結果。與上述其它幾種方法相比，該方法具有較高的靈敏度，但是容易產生非特異性擴 增，甚至會因為操作的原因出現假陽性，而且普通PCR擴增法其結果的判斷需要對產物進 行凝膠電泳分析，操作較為繁瑣。不僅如此，以上各種方法只是檢測的手段，不能對口蹄疫 病毒的基因型進行分型，也就是說目前尚沒有一種能對對口蹄疫病毒進行檢測并進行分型 的方法和試劑盒。熒光定量PCR技術其原理是在常規PCR擴增系統中加入一段與靶基因特異互補的 熒光標記探針。探針的5'端標記有報告基團，如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團， 如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發出的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不 到熒光信號。隨著PCR擴增的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針就會將探 針切斷產生熒光信號。用熒光檢測儀檢測熒光值的變化，即可準確判定擴增產物的量。熒 光定量PCR方法就是根據此原理。在PCR過程中，連續不斷地檢測反應體系中熒光信號的 變化。當信號增強到某一閾值，此時的循環次數(用循環閾值Ct表示)就被記錄下來。Ct 值和PCR體系中起始模板的對數之間有著嚴格的線性關系，利用各梯度陽性定量標準品擴 增的Ct和定量模板數經對數擬合作圖制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值就可以準確 定出起始模板核酸的數量。基于熒光定量PCR技術原理，為了克服現有檢測技術中的缺陷和不足，本發明提 供了一種使用小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR)技術快速準確檢測出樣品(發病動物水泡液、 淋巴結等標本以及細胞培養液)中口蹄疫病毒并對該樣品中的病毒進行基因分型的方法， 該方法的主要原理和過程是首先針對所有口蹄疫病毒各型(0、A、C、Asial和SAT1、SAT2、 SAT3)基因序列設計特異性引物和熒光探針，作為口蹄疫病毒的通用型檢測，然后針對上述 每一型設計特異性引物和熒光探針，用于口蹄疫病毒的基因分型。采用熒光定量PCR方法， 在擴增儀上多管(Pool，小池)同時進行。主要過程包括(1)采集和運送樣品(發病動物 水泡液、淋巴結等標本以及細胞培養液)；(2)樣本預處理和提取RNA; (3)PoolFQ-PCR體外 擴增法對樣本進行分型檢測合成特定分型引物和熒光探針，用PoolFQ-PCR技術并用擴增 反應液(PCR MIX)對樣本進行分型檢測；(4)擴增反應結束后根據每個擴增反應的熒光強 度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣本中口蹄疫病毒的存在并對該病毒進行精確 分型。首先，對口蹄疫病毒的基因序列進行分析，從Genbank下載所有口蹄疫病毒的基 因序列(0、A、C、AsiaU SATU SAT2、SAT3等)，經過生物信息學分析反復比對，設計針對口 蹄疫病毒所有各型檢測(FMDV-U)的特異性引物和探針序列，以及針對各型的特異性引物 和探針序列，包括口蹄疫病毒0型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)、口蹄疫病毒Asia 1 型(FMDV-Al)、口蹄疫病毒C型(FMDV-C)以及其它型(FMDV-S，囊括SAT1、SAT2、SAT3三個 型)等，序列如下
FMDV-U 上游引物5，-CAGGCTAAGGATGCCCTTCA-3，(SEQ ID NO. 1)FMDV-U 下游引物5，-GCCTCAGTCCCCTTCTCAGAT-3，(SEQ ID NO. 2)FMDV-U 熒光探針5，Fam-ACCCCGAGGTAACACGCGACACTTG-Tamra3，(SEQ ID NO. 3)MDV-O 上游引物5，-CGGCTGGCGCTGCCTTACAC-3，(SEQ ID NO. 4)MDV-O 下游引物5，-CCGTACTTACTGCTCCCGTTGT-3，(SEQ ID NO. 5)MDV-O 熒光探針5，Fam-CTCCACACCGTGTCTTAGCGACCGTC-Tamra3，(SEQ ID NO. 6)FMDV-A 上游引物5，-CGACACAACTTCCTGCTTCCT-3，(SEQ ID NO. 7)FMDV-A 下游引物5，-TTCATGCGCACGAGAAGCT-3，(SEQ ID NO. 8)FMDV-A 熒光探針5，Fam-CTACGGTGCAATCAAGGCACAGGCC-Tamra3，(SEQ ID NO. 9)FMDV-Al 上游引物5，-GCCCTGGTACAAGCTCATCAA-3，(SEQ IDNO. 10)FMDV-Al 下游引物5，-CTTGGACCGTGCTGCTACAG-3，(SEQ ID NO. 11)FMDV-Al 熒光探針5，Fam-CTAAGCCGCCTGTCACGTATGGCC-Tamra 3，(SEQ ID NO. 12)FMDV-C 上游引物5，-GTGTTGGCTACGGCGTACACT-3，(SEQ ID NO. 13)FMDV-C 下游引物5，-TCGTTAGGTGAGCCGAATCC-3，(SEQ ID NO. 14)FMDV-C 熒光探針5，Fam-ACTACGACCTACACCGCCAGTGCACG_Tamra3，(SEQ ID NO. 15)FMDV-S 上游引物5，-TGTGCCCCGCATTCTCGAAT-3，(SEQ ID NO. 16)FMDV-S 下游引物5，-CACTCTTTGCTTTCCTGGTAT-3，(SEQ ID NO. 17)FMDV-S 熒光探針5，Fam-CAGCACAACCTGAACGACCCGTCAA_Tamra3，(SEQ ID NO. 18)根據本發明的一個優選實施方案，上述各引物合成后需經過HPLC(高效液相色 譜)的方法純化，各熒光探針均為在5’標記有Fam熒光素，作為報告基團，3’標記有Tamra， 作為淬滅基團。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的分型檢測方法首先采集標 本，該分型檢測方法適用標本類型有發病動物水泡液、淋巴結等組織；病毒細胞培養液、血 清等。發病動物水泡液、淋巴結等需無菌條件下取Ig左右組織，置入1.5ml潔凈EP管。病 毒細胞培養液，需取500 μ 1左右，置入1. 5ml潔凈EP管。血清需用一次性注射器常規取抽 血2-3ml，注入5ml干燥管中，立即送檢。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的分型檢測方法對上述各種 標本提取RNA，淋巴結等固體組織，取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入 500 μ 1 RNA提取液，研磨或振蕩至勻漿狀，轉移到1. 5ml的EP管中；或者血清或病毒液，取 100 μ 1血清加入RNA提取液體充分震蕩。然后加入氯仿、異丙醇、75% DEPC乙醇處理，最終 用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀，即為本實驗要進行分型檢測的口蹄疫病毒RNA。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的分型檢測方法，擴增體系按 照如下方式配制，以FMDV-U為例FMDV-U 上游引物(IOuM) :lulFMDV-U 下游引物(IOuM) :lulFMDV-U 熒光探針(IOuM) 0. 5ulPCR 反應液17. 5ul_Total20. 0μ 1
根據本發明的一個優選實施方案，上述用于口蹄疫病毒分型檢測的PCR反應液 包含FQ buffer (由5XFQ buffer經雙蒸水稀釋為IX作為工作濃度)、四種核苷酸單體 (dNTPs)等成分。根據本發明的一個優選實施方案，上述用于口蹄疫病毒分型檢測的1 X FQbuffer 工作液各主要成分和濃度如下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01%的明膠等。根據本發明的一個優選實施方案，用于口蹄疫病毒0型(FMDV-O)、口蹄疫病毒 A型(FMDV-A)、口蹄疫病毒Asia 1型(FMDV-Al)、口蹄疫病毒C型(FMDV-C)以及其它型 (FMDV-S，囊括SAT1、SAT2、SAT3三個型)的分型擴增反應體系配制方法同FMDV-U。也就是 說，對于某標本進行口蹄疫病毒分型檢測，需要對該標本同時進行FMDV-U、FMDV-O、FMDV-A、 FMDV-AU FMDV-C以及FMDV-S共6個檢測反應。根據本發明的一個優選實施方案，用于口蹄疫病毒分型檢測的6個反應管(Pool) 作為一個整體(六聯)同步進行，各自檢測不同的型，所以稱為“小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR) ”，檢測結果囊括了 口蹄疫病毒的所有型，實現了快速準確分型檢測的目的。根據本發明的一個優選實施方案，本發明的口蹄疫病毒小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR)分型檢測方法引入了一種陽性質控品，作為實驗的陽性對照和實驗控制，該組陽性 質控品是由FMDV-U、FMDV-0、FMDV-A、FMDV-A1、FMDV-C以及FMDV-S擴增的特異性片段經克 隆構建的重組質粒組成，其中各自濃度均為107COpieS/ml，而陰性質控品是一種經過高壓 滅菌的TE緩沖液。所以，本發明的方法不但可以進行分行檢測，還可以對病毒進行定量檢 測。陽性質控品各型擴增曲線，如圖1。根據本發明的一個優選實施方案，本發明的口蹄疫病毒小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR)分型檢測方法，各小池(反應管)的反應體系設置為25ul，具體配制方法是上述 口蹄疫病毒分型檢測擴增體系(PCR-MIX) 20ul、AMV逆轉錄酶Iul、Taq耐熱DNA聚合酶Iul 以及提取的RNA或者陽性質控品或者陰性質控品分別為3ul。根據本發明的一個優選實施方案，本發明的試劑盒在ABI PRISM 7700、 ABIPRISM5700.ABI GeneAmp7000、ABIPRISM7300/7500、MJ Opticon 等熒光定量擴增儀的擴 增條件為42°C— 20分鐘，然后93°C — 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒，采集熒光，40 個循環。根據本發明的一個優選實施方案，反應結束后，使用手動調整閾值使陰性質控品 Ct值在40以上，Ct值小于35個循環的為陽性；Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進 行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環之間，判斷為陽性，沒有熒光值 增長為陰性。根據本發明的一個優選實施方案，用TE buffer稀釋陽性質控品(107COpieS/ml)， 濃度梯度為每 ml 1· 0Χ106、1· 0Χ105、1· 0Χ104、1· 0Χ103、1· 0Χ102、1· OxiOlCopies,進行 靈敏度實驗，結果證實本試劑盒檢測靈敏度為ι. ο X 102copies/ml，比RT-PCR方法更為敏 感和精確，如圖2和3。根據本發明的一個優選實施方案，用其它病毒感染的陽性標本(豬藍耳病標本、 豬細小病毒標本、豬皰疹病毒、水泡病毒等)進行特異性實驗，結果證實，本試劑盒特異性 較好，吻合度為100%。
本發明的試劑盒經過多次不同的重復實驗驗證證實，具有良好的重復性好和穩定 好的性能。在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達12個月。本發明的試劑盒用于口蹄疫病毒0型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)、口蹄 疫病毒Asia 1型(FMDV-Al)、口蹄疫病毒C型(FMDV-C)以及其它型(FMDV-S，囊括SATl、 SAT2、SAT3三個型)的分型檢測，不但可以檢測口蹄疫病毒的存在，同時還可以對其所屬的 型進行準確鑒定，并根據陽性質控品對病毒的含量進行定量。由于該方法引入了特異性擴 增引物和熒光探針，使得分型檢測具有更好的靈敏度和特異性，另一方面，本發明的試劑盒 采用的是一步RT-PCR方法，使得整個試驗過程可以在2小時內完成，所以本發明的試劑盒 具有有操作簡單、快速準確的優點。因此，本發明的試劑盒為口蹄疫病毒的快速分型檢測提 供了新的方法，并為確定某一型感染或者混合感染提供了可靠的方法學依據。
四
圖1顯示口蹄疫病毒0型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)、口蹄疫病毒Asia 1型(FMDV-Al)、口蹄疫病毒C型(FMDV-C)以及(FMDV-S)的分型檢測的擴增曲線較好，呈 標準的S型擴增曲線。圖2為用TE buffer稀釋陽性質控品(107COpies/ml)，濃度梯度 依次為 1. 0X106/ml、1. OX 105/ml、l. 0 XioVml、1. 0 X103/ml、1. 0 X102/ml、1. OX 107ml， 進行靈敏度實驗，結果證實本小池熒光PCR(Pcx)I FQ-PCR) 口蹄疫分型檢測試劑盒靈敏度 為1. OX 102COpieS/ml，比RT-PCR方法更為敏感和精確，如圖3，1-6為梯度稀釋的質控標 準品PCR反應產物，2%瓊脂瓊脂糖凝膠電泳，樣品濃度分別為1. OX 107ml、l. OX 106/ml、 1. 0 X105/ml >1. 0 XioVml >1. 0 XlOVml >1. OX 102/ml)。
五具體實施例方式實施例1 口蹄疫病毒檢測標本的采集和運送本發明的方法和試劑盒適用標本類型包括發病動物水泡液、淋巴結等組織；病 毒細胞培養液、血清等。發病動物水泡液、淋巴結等需無菌條件下取Ig左右組織塊，置入 1. 5ml潔凈EP管，立即送檢。病毒細胞培養液取500 μ 1左右，置入1. 5ml潔凈EP管，立即 送檢。血清，用一次性注射器常規取抽血2-3ml，注入5ml干燥管中，密閉送檢。以上標本短 期內可保存于-20°C，長期保存可置-70°C。但不能超過6個月，標本運送應采用0°C冰壺。實施例2 口蹄疫病毒RNA的提取取500 μ 1樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機13，OOOrpm離 心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入150ul RNA提取液充分震蕩，室溫放置 5min。加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心IOmin0小心將 上層水相轉移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin。棄上 清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心IOmin,小心吸去大部分乙醇。 將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發干凈，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。取 50 μ 1陰性質控品加入150 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置lOmin。后按上述操作，口蹄 疫分型檢測試劑盒陽性質控品可直接取3μ1進行小池熒光PCR(P001 FQ-PCR)分型檢測。實施例3 小池熒光PCR(Pool FQ-PCR)方法對口蹄疫病毒進行分型檢測從試劑盒中取出PCR MIX、Taq酶系和逆轉錄酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10，OOOrpm離心IOs進行PCR擴增，各小池(Pool)對應的分型檢測體系為 小池(Pool)編號從1到6分別對應口蹄疫病毒通用型(FMDV-U)、口蹄疫病毒0 型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)、口蹄疫病毒Asial型(FMDV-Al)、口蹄疫病毒C型 (FMDV-C)以及其它型爾1 ￥-5，囊括5々11、5412、5413三個型)的分型檢測，同時設置一組 陽性質控品對照和陰性對照，加入處理后的樣品(或相應的FMDV陽性質控品或陰性質控 品)3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心30s。做好標記，置入PCR反應槽內，進行分型檢測，標記熒光 基團種類(報告基團FAM、猝滅基團TAMRA)，循環條件為ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、 ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon 等儀器，循環條件，42°C—20 分鐘， 然后93°C— 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒，采集熒光信號，40個循環。LightCycler 等使用毛細管的儀器，循環條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，后93°C 5秒一55°C 45秒， 采集熒光信號，共40個循環。實施例4 小池熒光PCR(Pool FQ-PCR)分型結果的分析和判定反應結束后使用手動調整閾值使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循 環的為陽性；Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果 Ct值仍然在35-40個循環之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。需要滿足陰性質控 品應為全部陰性；陽性質控品的Ct值均應小于30，且呈標準S型擴增曲線。以上條件應同 時滿足，否則此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。結果判斷如下如果檢測標本所有 各池均為陰性，則未檢測到口蹄疫病毒；如果檢測標本1池陽性，2-6池任一池陽性，為該型 口蹄疫病毒感染；如果檢測標本1池陽性，2-6池任兩池或者多池陽性，為口蹄疫病毒混合 感染。實施例5 本發明方法及試劑盒的臨床應用使用本發明的Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR) 口蹄疫病毒基因分型檢測方法及其 試劑盒，對大量標本進行分型檢測，并最終經測序實驗驗證。結果顯示本發明方法的試劑 盒，靈敏度為102COpieS，準確性和特異性達100%，重復性和穩定性較好，本試劑盒的保存 條件和有效期為-20°C可存放12個月。本試劑盒將逆轉錄和分型檢測的試驗過程通過一 步法完成，大大簡化了檢測流程。用本試劑盒可以在2小時內快速檢測口蹄疫病毒的感染 并確定病毒的型別，進一步為口蹄疫疫情的監測和預防控制工作方案的制定提供科學的分 子流行病學實驗數據。六、序列表SEQUENCE LISTING<110>江蘇省動物衛生監督所北京索奧生物技術有限公司<120>—種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR) 口蹄疫病毒基因分型檢測方法及其試 劑盒的應用<130><160>21<170>PatentIn version 3. 3
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<212>DNA
<213>人工序列
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caggctaagg atgcccttca 20
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權利要求
一種Pool FQ PCR(小池 熒光PCR)口蹄疫病毒分型檢測方法及其試劑盒，針對所有各型口蹄疫病毒的基因序列(O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3等)，設分型檢測的特異性引物和探針序列如下FMDV U上游引物5’ CAGGCTAAGGATGCCCTTCA 3’(SEQ ID NO.1)FMDV U下游引物5’ GCCTCAGTCCCCTTCTCAGAT 3’(SEQ ID NO.2)FMDV U熒光探針5’Fam ACCCCGAGGTAACACGCGACACTTG Tamra3’(SEQ ID NO.3)MDV O上游引物5’ CGGCTGGCGCTGCCTTACAC 3’(SEQ ID NO.4)MDV O下游引物5’ CCGTACTTACTGCTCCCGTTGT 3’(SEQ ID NO.5)MDV O熒光探針5’Fam CTCCACACCGTGTCTTAGCGACCGTC Tamra 3’(SEQ ID NO.6)FMDV A上游引物5’ CGACACAACTTCCTGCTTCCT 3’(SEQ ID NO.7)FMDV A下游引物5’ TTCATGCGCACGAGAAGCT 3’(SEQ ID NO.8)FMDV A熒光探針5’Fam CTACGGTGCAATCAAGGCACAGGCC Tamra 3’(SEQ ID NO.9)FMDV A1上游引物5’ GCCCTGGTACAAGCTCATCAA 3’(SEQ ID NO.10)FMDV A1下游引物5’ CTTGGACCGTGCTGCTACAG 3’(SEQ ID NO.11)FMDV A1熒光探針5’Fam CTAAGCCGCCTGTCACGTATGGCC Tamra 3’(SEQ ID NO.12)FMDV C上游引物5’ GTGTTGGCTACGGCGTACACT 3’(SEQ ID NO.13)FMDV C下游引物5’ TCGTTAGGTGAGCCGAATCC 3’(SEQ ID NO.14)FMDV C熒光探針5’Fam ACTACGACCTACACCGCCAGTGCACG Tamra 3’(SEQ ID NO.15)FMDV S上游引物5’ TGTGCCCCGCATTCTCGAAT 3’(SEQ ID NO.16)FMDV S下游引物5’ CACTCTTTGCTTTCCTGGTAT 3’(SEQ ID NO.17)FMDV S熒光探針5’Fam CAGCACAACCTGAACGACCCGTCAA Tamra 3’(SEQ ID NO.18)其中FMDV S檢測囊括了SAT1、SAT2、SAT3三型，上述各引物合成后需經過HPLC(高效液相色譜)的方法純化，各熒光探針均在5’標記有Fam熒光素，作為報告基團，3’標記有Tamra，作為淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的一種PoolFQ-PCR (小池-熒光PCR) 口蹄疫病毒分型檢測方 法及其試劑盒，用于口蹄疫病毒分型檢測的有6個反應管(小池，Pool)，編號從1到6，作為 一個整體(六聯)同步進行各自檢測不同的型，所以稱為“小池熒光PCR(Pool FQ-PCR) 檢測結果囊括了 口蹄疫病毒的所有型，實現了快速準確分型檢測的目的。
3.根據權利要求1所述的一種分型檢測試劑盒，每個小池分型檢測所用的擴增體系按 照如下方式配制上游引物(10uM) :lul 下游引物(10uM) :lul 熒光探針(10uM) 0. 5ul PCR 反應液 17. 5ulTotal20. 0u 1PCR反應液(PCR MIX)包含FQ buffer (由5XFQ buffer經雙蒸水稀釋為IX作為工 作液)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。其中1XFQ buffer工作液各主要成分和濃度為 50mM Tris-HCl(pH8. 0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。
全文摘要
本發明提供了一種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR)口蹄疫病毒基因分型(囊括了FMDV-O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3等)檢測方法及其試劑盒，為口蹄疫病毒的快速分型檢測提供了新的方法，該檢測過程包括(1)采集和運送待檢樣品；(2)樣品預處理和提取RNA；(3)Pool FQ-PCR體外擴增法對樣本進行分型檢測合成特定分型引物和熒光探針，用Pool FQ-PCR技術并用擴增反應液(PCR MIX)對樣本進行分型檢測；(4)擴增反應結束后根據每個擴增反應的熒光強度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣品中口蹄疫病毒的存在并對該病毒進行精確分型。
文檔編號G01N21/64GK101928781SQ20091014819
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者任美峰, 劉健翊, 史成軍, 徐貴峰 申請人:北京索奧生物醫藥科技有限公司
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