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專利名稱：用于測定LogP值的高效率HPLC方法
技術領域：
本發明總的來說涉及化合物庫的Log P值的測定，例如，組合和/或引導產生(Lead generation)庫。
對于許多藥物和殺蟲劑來說，在它們的生理活性和疏水性之間存在一定關系。用于測定疏水性的經典方法為測定化合物在水和正辛醇的分配對數。當在色譜保留數據和正辛醇/水分配系數的對數(Log P)之間可以建立關系時，化合物的疏水性可以通過色譜測定，而不是通過振搖燒瓶的方法。正辛醇/水分配系統不一定是理想的方法。基于HPLC方法的可靠性，源于色譜的測定可能更可靠。
應用色譜方法同振搖燒瓶方法相比具有許多優越性。例如，色譜方法更快，并更適合含有雜質的化合物。因不需要定量測定，該方法可以應用于易揮發的化合物。
已經開發了多種用于測定Log P值的HPLC方法。與應用HPLC方法相關的一個限制是當評價電離的化合物時，必須要特別小心。通常，Log P值的的計算需要對化合物解離因子的校正(CD)。
一個應用HPLC測定Log P值的方法涉及涂布具有水飽和正辛醇的硅烷化硅藻土載體，并應用正辛醇飽和緩沖液作為洗脫劑(Mirrlees等，醫學化學雜質(J.Med.Chem.)，19615(1976))通過改變柱長和流速，可以獲得范圍在-0.3和3.7之間的Log P值。在C18柱中，還確定了LogP值與保留體積的對數值之間的相關性。已知Log P值與HPLC之間相關的多種其它方法，每個方法都有一定的優點和缺點(化學分析，91234-278(11章)，Wiley和Sons，紐約(1987))。
從HPLC測定(log k’)獲得的保留參數可以用于獲得有關化合物疏水性的信息。用疏水固定相和用水作為流動相的保留數據可以直接應用，盡管它通常導致過長的保留時間。在某個洗脫組分下測得的等分數據(對于給定的洗脫組分X，典型為log k’x)，可以用于計算Log P值。當應用含有可與水混合的有機溶劑(如甲醇、乙腈和丙酮)的水溶液，色譜數據可以外推至流動相中有機溶劑為0％的點，其可以使HPLC比單獨使用水時流速快，仍可以獲得合理可靠的結果。
但是，該方法有一定限制，因為只有少量可與水混溶的有機溶劑可存在于水中。如果有機溶劑存在量過多，濃度與log k’w之間的線性關系可能就不存在。幾個發明者已致力于應用等分log k’x值，而不是log k’w值。
用于測定Log P值的HPLC方法的進一步限制在于他們通常依賴于容量因子與Log P值之間的相關性，該相關性通常只是對相關化合物接近，對含有不同官能團的化合物較差。
盡管具有與應用過多有機溶劑相關的限制和與在反相柱上分析高極性電離化合物相關的問題，基于Log P值與log k’之間的線性關系，HPLC方法仍可以用于測定大量有機化合物。不論如何，提供能克服這些方法限制的其它HPLC方法，都是有利的。并且，提供用于測定化合物庫中疏水性的方法是很有利的。本發明提供了這類方法。
本發明公開了用于高效率化合物庫的Log P值測定的方法和裝置，例如，組合和/或引導產生庫。該方法涉及獲得多種要評價的化合物，應用HPLC方法測定化合物的Log P值。在一個優選的實施方案中，同時測定化合物的純度和Log P值。在另一個優選的實施方案中，對化合物進行Log P值測定和用于檢測其生物活性的生物檢測。對具有所需生物活性和Log P值的化合物可以進行進一步檢測，與具有所需Log P值、但活性不理想的化合物和具有所需活性、但Log P值不理想的化合物分別進行評價。
該方法的優點在于它可以進行不僅具有所需的生物活性、而且具有預定應用所需的疏水性/親水性的化合物的迅速測定。可以篩選組合庫中大量的化合物，迅速鑒別用于特定目的的化合物。
在另一個優選的實施方案中，該方法允許基于保留時間計算Log P值的測定，而不是等分方法(其不使用梯度)。


圖1為一系列標準物Log P值對保留時間的繪圖。
圖2為一系列標準物Log P值對容量因子的繪圖。
圖3為一系列標準物Log P值對Log K的繪圖。
本發明公開了用于化合物庫中測定Log P值以及任選的純度的方法和裝置。該方法可以廣泛應用于組合庫和引導產生庫，其可以任選進行鑒別和/或效果的評價，例如，應用于生物檢測。
在一個實施方案中，該方法使人們將化合物的Log P值與化合物在HPLC柱中的保留時間相對應，優選同時測定化合物的純度。在該方法中，可以調節具體柱的溶劑梯度和流速，以及柱填充物，使一系列標準物的保留時間等于振搖燒瓶方法測定的Log P值。然后，一旦系統建立，使保留時間近似等于Log P值后，就可以對化合物進行評價。在該實施方案中，優選使用短柱(小于或等于5×50mm柱)，優選使用具有相對小粒徑(5微米或更小)的柱填充物(吸附劑)，因為可以忽略柱的空體積。
在一個優選的實施方案中，有關化合物純度、同一性、Log P和生物活性可以儲存在數據庫中，可以從化合物庫中迅速鑒別出具有所需LogP值和生物活性的化合物。
在本文中，“HPLC相容的檢測器”是指適合用于HPLC系統的檢測器，其可以在洗脫出化合物峰后提供可檢測的信號。例如，當一種化合物從組分中洗脫出來，可以產生信號的檢測器為HPLC相容的檢測器。其中組分的吸收度變化較寬，可能有必要使用多個檢測器。由于其不能檢測出非需要的峰，能夠檢測出所需組分的檢測器不是“不相容”的檢測器。
HPLC裝置頂替色譜(一個HPLC的例子)基于樣品在固定相(SP)和流動相(MP)之間平衡的原則，改變SP的方向。樣品的單個組分像火車一樣互相替換，與SP親合更強的替換劑將組分的火車推出柱。HPLC色譜是頂替色譜中最熟知的例子。
一個HPLC裝置典型包括至少下列部分一個柱，填充有適合的固定相，流動相，在壓力下使流動相通過柱的泵，和一個用于檢測從柱中洗脫出的化合物存在的檢測器。該裝置可以任選包括用于提供梯度洗脫的裝置，其中溶劑系統在純化過程中變化。
用于進行HPLC分離的常規方法和裝置是本領域公知技術，例如，如下列文獻所描述色譜雜志(J.Chromatography)，192222-227(1980)，液相色譜雜志(J.Liquid Chromatography)，4661-680(1981)，和色譜雜志(J.Chromatography)，249193-198(1982)。
適合的固定相為能從其中洗脫出所需化合的那些物質。優選的柱為反相柱，其可以為天然的(具有不同長度烷基鏈的硅膠)或合成的交聯聚合物(由苯乙烯和二乙烯基苯組成)。固定相粒徑的大小范圍在幾微米至幾百微米之間。最優選的固定相為C18柱。
在一些實施方案中，因為許多化合物在堿性介質中的弱穩定性，如銨鹽，流動相的pH值必須為弱酸性的，可以通過酸的濃度或通過形成適當的緩沖液進行調節。
適合的檢測裝置包括質譜、蒸發光散射(ELSD)和紫外(UV)檢測器。本文描述的方法可以單獨使用或組合使用這些檢測器。
Log P方法在一個實施方案中，該方法涉及進行下列步驟a)選擇一個化合物庫進行評價，b)應用HPLC方法，測定化合物的Log P值，任選同時測定化合物的純度，c)任選化學鑒別化合物，和d)任選對化合物進行檢測，測定它們的生物活性。
在一個優選的實施方案中，從化合物在HPLC柱中的保留時間測定Log P值，應用下列實施例1中描述的優選方法或其它方法，其中，例如應用不同的溶劑、注射體積、流速、柱體積和/或柱填充物，提供了保留時間和Log P值之間的直接關系。該方法優選涉及梯度洗脫，其中該梯度用于使具有某一疏水性的化合物在某一時間間隔內洗脫出來。
應用該方法，保留時間本身可以等于Log P，或者Log P為保留時間與線的斜率相乘，其中該線為一組化合物已知的Log P值與這些化合物應用給定的HPLC方法測定的保留時間之間的線性相關線。應用適當的HPLC方法，如本文實施例1中描述的方法，可獲得保留時間和Log P值之間的線性關系。也可以應用實施例1中未描述的、但可以提供保留時間和Log P之間線性關系的其它方法，其也在本發明的范圍內。或者，其它應用HPLC測定Log P值的方法，包括本領域公知的等分HPLC方法，也可以使用。
通過測定化合物的Log P值，優選同時測定它們的純度，可以排除不具有所需Log P值的化合物，可以鑒定只具有所需Log P值(疏水性)的化合物，評價其生物活性。這可以使評價化合物庫的速度更快。
可以任選進行下列步驟。化合物的信息(即紫外吸收和MS信息)可以儲存在相關的數據庫中，數據庫中還優選包括關于化合物的其它信息(即合成條件、生物檢測信息、產量等)。可以進一步鑒別化合物，例如，通過1H NMR。為了更快地評價化合物的純度，HPLC可以包括兩個或更多的柱，其中的一個用于測定化合物的Log P值，而另一個清洗和再生。該步驟消除了色譜平衡等待時間。
可以應用該方法評價的化合物的類型應用本文描述的方法，可以測定能從HPLC柱洗脫的任何有機化合物的Log P值和純度。該化合物優選為一個化合物庫的一部分，更優選為引導產生的或組合化合物庫。
術語“庫”指至少3個，優選為102-109，更優選為102-104化合物。優選這些化合物是在一個易于合成它們的單一溶液中或反應混合物中制備的多種化合物。庫中的每個化合物可以是分離的，或任選已被鑒定。
一般情況下，化合物具有一個核心結構，其中在至少一個位置，優選兩個或更多的位置上被多種不同的官能團進行修飾，以產生一個庫，例如，組合的或引導優化(lead optimizaton)的化合物庫。
典型的核心結構為直鏈的、支鏈的或環狀有機化合物，其包括至少3個碳原子，并且至少1個，優選至少2個部位能夠進行反應以改變結構，通常通過將其它分子加入到反應部位來進行。
殺蟲劑族的例子包括1-芳基吡唑、吡咯、吡咯烷酮和煙酸衍生物。然而，可以結合到適當結合部位的配位體化合物可以為，例如，甾類、激素、肽、蛋白質、低聚核苷酸、寡核糖核苷酸、酶等。
適合的核心結構包括，但不限于肽、蛋白質、低聚核苷酸、寡核糖核苷酸、低聚糖、生物堿、喹啉、異喹啉、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、嘧啶、四氫噻唑、咪唑并吡嗪酮、呃唑并吡啶、吡咯、吡咯烷、咪唑酮、guinolone、氨基酸、大環內酯物、penems、糖類、葉黃素、苯丙噻二嗪、anthracycline、二苯并環庚二烯、肌糖、卟啉、咕啉、和碳骨架存在的幾何體(例如，十二面體)。核心結構可以來源于天然存在的化合物，或者可以包括非天然修飾物(即，非天然存在的氨基酸和核苷。
適合的核心結構修飾物包括1)氨基酸衍生物，其中包括，例如，天然的和合成的氨基酸殘基，其中包括所有天然存在的α氨基酸，具有衍生物的種類，天然存在的側鏈的變異體或類似物；N-取代的甘氨酸殘基；已知的在功能上類似氨基酸殘基的天然的和合成的種類，如抑制素、苯丁抑制素等。
2)核苷酸衍生物，其中包括天然的和合成的核苷酸，如腺苷、胸腺嘧啶，胍，尿苷，胞核嘧啶，它們的衍生物和嘌呤環的變異體和類似物，糖環，磷酸鍵和它們中的一些或全部的組合。核苷酸探針(2-25個核苷酸之間)和低聚核苷酸(超過25個核苷酸)包括所有各種可能的結構修飾；天然存在的核苷酸的同型和異型合成的排列和組合；含有合成的嘌呤或嘧啶類的衍生物和變異體，或它們的類似物；各種糖環類似物；多種可選的骨架類似物，包括但不限于磷酸二酯、硫逐磷酸酯、二硫逐磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸鹽、3’-硫醛乙縮醛(thioformacetal)，亞甲基(亞氨甲基)，3-N-氨基甲酸鹽，嗎啉代氨基甲酸鹽和肽核酸類似物。
3)碳水化合物的衍生物，其包括天然生理活性的碳水化合物；相關化合物，如葡萄糖、半乳糖、唾液酸、β-D-葡糖胺和nojorimycin，其均為葡萄糖苷酶抑制劑；偽糖，如5a-carba-2-D-比喃半乳糖，已知其抑制肺炎克雷白桿菌的生長(n=1)；合成的碳水化合物殘基和它們的衍生物(n=1)，并且它們的所有的復合寡聚排列均發現于自然界中，包括高甘露糖低聚糖，已知的抗生素鏈霉素(n＞1)。
4)天然存在的或合成有機結構基序，術語“基序”被定義為具有或含有生物活性的特定結構的有機分子，如對酶活性部位具有互補結構的分子。該術語包括任何已知的藥物化合物的基本結構，包括藥效基團或它們的代謝物。該基本結構包括β-內酰胺，如青霉素，已知其抑制細菌細胞壁生物合成；二苯并氮卓，已知其與CNS受體結合，用作抗抑郁藥；多聚乙酰大環內酯物，已知其與細菌核糖體酶結合。這些結構基序已知具有特異性的所需的與配體受體結合的性能。
5)報告元件，如能夠光放大的天然或合成的染料或殘基，其具有可反應基團，可以在合成中結合到氨磺酰亞胺結構或反應程式中，可以通過這些基團附著，而干擾或影響基團的指示功能。優選的反應基團為氨，硫，羥基，羧酸，羧酸酯，特別是甲基酯，酰基氯，異氰酸鹽，烷基鹵化物，芳基鹵化物，和環氧乙烷基團。
6)含有可聚合基團的有機部分，如雙鍵，或能夠進行聚合或共聚的其它官能團。適合的基團包括乙烯基，環氧乙烷基，羧酸，酰基氯，酯，酰胺，二氫唑酮，內酯和內酰胺，還可以使用那些被定義為R和R’的其它有機部分。
7)大分子成分，如通過上面歸納的各種反應基團可以附著到氨磺酰亞胺結構上的大分子表面或結構，其結合方式使這種相連的種類與配體-受體分子的接合不產生負面影響，并且該連接的功能團的相互作用活性由該大分子確定或限制。大分子成分的例子包括多孔的和非多孔的無機成分，例如，二氧化硅，氧化鋁，氧化鋯，二氧化鈦等，其通常用于不同方面，如普通或反相色譜分離，水純化，用于著色的顏料等；多孔的和非多孔的有機大分子成分，包括合成成分，如苯乙烯丁二烯苯小珠，各種甲基丙烯酸酯小珠，PVA小珠等，其通常用于蛋白質純化，水軟化，和多種其它的應用；天然成分如天然的和功能化的纖維素，如，例如，瓊脂糖和殼質，由尼龍制成的薄片和中空纖維膜，聚醚砜，或任何上面提到的材料。這些大分子的分子量范圍可以直到大約2000道爾頓。
適合的化學修飾物還包括化學鍵合到適當的有機部分，放射性部分，氫原子，含有適當的親電子基團的有機部分，如醛，酯，烷基鹵化物，酮，腈，環氧化物等；適合的親核基團，如羥基，氨，羧酸鹽，酰胺，負碳離子，尿素等；或其中一個下面定義的其它結構成分。另外，化學修飾物可以以環、雙環或三環系統的形式；或連接到上述分子式定義的化合物重復單元末端的結構；或可以分別連接到其它部分上。
這種修飾可以相同或不同，每個可以含有一個或更多的碳、氮、硫、氧原子，任何無機元素，或它們的組合。例如，核心結構可以用氰基、氮、鹵素、氧、羥基、烷氧基、硫、直鏈或支鏈烷基、碳環芳基，和它們的取代或雜環衍生物。修飾可以是在不同的相鄰的分子核中，對于它們附著的碳原子具有選擇的立體化學排列。
化合物可以邏輯化的方式在多管排列(array)或多孔板，以化學化合物排列的形式合成。優選地，化合物都具有中心核結構，具有各種修飾，其可以進行結構-活性關系的鑒別，用其確定用于特定應用的最佳化合物。
排列的安排方式應可加快合成、純化和評價，以從測試獲得最大的信息內容，并便于迅速評價這些數據。
排列可以從邏輯排列的化合物的亞排列來建立。可以制備這樣一種亞排列，這種亞排列包括結構相關的單個化學化合物的可空間尋址的組，這些化合物具有共同的結構和可變的修飾。當結構中多個位置被修飾時，亞排列特別有用，在給定亞排列中的任何兩個化合物之間的變化可以包括，例如，結構中0個或1個改變。
這些亞排列和排列可以被組織形成更高次序的排列，其包括多組排列，可以被作為更高次序的排列評價，以提供關于感興趣的共同核結構的最佳結構特征的信息。
這種亞排列的安排方式應可通過直接比較化合物自動產生有關已知的片段在所期望的應用中所具有的效果的信息，以及對物理和反應性質的影響的信息。按照簡單群組理論(simple set theory)，對于任何數量的獨立可變結構多樣性元素(independently variable structural diversityelements)n，存在n個邏輯高階排列，這樣通過從適當排列的亞排列中相關地址的測試數據的比較，可以以類似的方式獲得每個n結構多樣性元素變化的效果的關系信息。
通過篩選核分子的所有可能合成變化，最佳候選者的選擇與選擇化合物的“合理”基礎相比，更應該說是數據收集方法的函數。可以迅速優化期望的物理和化學性質，即結合親和性與生物活性，直接在特定的排列或亞排列內與結構的改變相關。
因為已知每個化合物在多管架的空間地址，可以測試排列以產生完全的相關結構信息，因此一個正結果提供(1)關于在任何給定空間地址的化合物的信息；(2)在一組系統結構同種物上同時并列這一信息；(3)在存在正結果的負結果中提取相關結構信息的能力。
純化優選通過計算機控制進行，其中多管排列中每個管或多孔盤中每個孔的位置儲存在計算機中，要合成的化合物的身份被儲存在計算機中的“記憶圖”中，或儲存在將化合物的數據與管或孔的位置相關的其它的裝置中。或者，可以人工進行純化，優選在多管架或多孔盤內進行，信息儲存在計算機中。可以純化和/或鑒別管中的化合物。
參照下列非限定性的實施例，可以進一步理解本發明。實施例1分析方法極性范圍從高到低、已知Log P值范圍從-1.05至5.77的16個化合物的溶液應用下表1描述的條件進行評價。
儀器使用Gilson HPLC系統，其具有兩個Gilson 306型泵(10SC泵壓頭)，Gilson170二極管排列紫外檢測器(254nm)，Gilson215液體處理器作為注射器。蒸發光散射檢測器(Richard Scientific)和平臺式LC質譜(Micromass)用作檢測器。
流動相為甲醇/水的雙向梯度。固定相為用5納米ODS-AQ填充的4.6×50nm柱。注射體積為5μl。調節流動相的梯度，以使Log P接近等于HPLC柱中的保留時間。溶劑和流速總結在下表1中。
表1
*溶劑A為98.5％/1.5％(v/v)水/乙腈**溶劑B為100％甲醇6.1分鐘后設定柱進行再平衡。
HPLC測試每個樣品進行3次，以說明方法的重現性。保留時間，平均保留時間，標準差(STD)和與振搖燒瓶方法Log P值的比較(lit.LogP)列于下表2中。
表2
如表2所示，該方法具有重現性，當保留時間對Log P值作圖時，線性相關，如圖1所示。直線的斜率為1.0088，y軸截距為0.0268。
保留時間(X)，振搖燒瓶Log P(Y)，上圖的斜率和截距用于計算這些標準物的Log P。結果如下表3所示，表明保留時間乘斜率，再加上截距，得到的Log P值近似接近于文獻值，除了尿嘧啶，其為高極性化合物。已知該化合物是高極性的。
表3
Log P對這些化合物的容量因子K(K=t-t0/t0)作圖，得到線性曲線，如圖2所示。當Log P對這些標準物容量因子K的對數值作圖，得到下列指數曲線，如圖3所示。
應用該指數方程和這些標準物的HPLC保留時間，計算出Log P和Log K，與保留時間和文獻Log P值相比較，結果總結在下表4中。
表4
計算如下Y=0.6972e1.5966XR2=0.9673如表4所示，在應用指數方程通過保留時間計算的Log P值與從振搖燒瓶方法得到的文獻Log P值之間，存在合理的相關性。
ODS-AQ4.6×50nm柱(由YMC制造的C18反相柱)的空體積(V0)和空時間(t0)相當小。
下列方程可以用于計算V0和t0。
V0=0.65×3.14(d/2)2L，其中d為柱內徑(ID)(cm)，L為柱長(mm)。
空時間(t0)=V0／F，其中F為流速(mL/min)。
按照上面方程計算的V0和t0，柱的空體積和空時間分別為大約0.5mL和0.35min。實際上，該數值通常大約為0.38mL和0.25min。
本領域技術人員應用常規的實驗，可以發現或確定許多與本文描述的本發明具體實施方案相等價的方法。這些等價的方法包括在下面權利要求的范圍內。
權利要求
1．一種用于測定化合物庫中Log P值的方法，包括a)選擇一個化合物庫進行評價；b)通過HPLC測定化合物的Log P值。
2．按照權利要求1的方法，其中數據儲存在數據庫中。
3．按照權利要求2的方法，進一步包括鑒別化合物。
4．按照權利要求3的方法，其中只鑒別那些具有期望Log P值的化合物。
5．按照權利要求2的方法，進一步包括對化合物進行生物檢測。
6．按照權利要求5的方法，其中只對那些具有期望Log P值的化合物進行生物檢測。
7．按照權利要求1的方法，其中用于測定Log P值的方法涉及根據化合物在HPLC柱中的保留時間計算Log P。
8．一種用于計算一種或多種化合物的Log P值的方法，包括a)確定一組適當的HPLC條件，使Log P值基本上等于HPLC柱中的保留時間，和b)通過將化合物從HPLC柱中洗脫出來，測定一種或多種化合物的Log P值。
9．按照權利要求8的方法，其中一種或多種化合物的純化和Log P值的測定是同時進行的。
10．按照權利要求8的方法，其中要分析的化合物存在于組合或引導產生庫中。
11．按照權利要求8的方法，其中通過一種或多種選自UV、MS和ELSD的方法進行檢測和/或鑒別。
全文摘要
本發明公開了計算有機化合物Log P值的方法。該方法可以鑒別庫中具有期望Log P值的化合物。該方法可以用于減少在給定的組合或引導產生的庫中需要進一步鑒別和/或檢測的化合物的數量。優選在檢測的化合物進行純化的同時獲得Log P值。Log P值優選與HPLC柱中的保留時間相關,如保留時間等于Log P值。
文檔編號G01N30/88GK1288157SQ0012093
公開日2001年3月21日 申請日期2000年8月4日 優先權日1999年8月4日
發明者亞萊·阿茲米·阿貝迪 申請人:安萬特作物科學公司