專利名稱：熱反應(yīng)設(shè)備及使用其的方法
優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)要求各個(gè)下面申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2005年2月14日提出的美國專利申請(qǐng)No.11/058,106；2005年1月25日提出的美國專利申請(qǐng)No.11/043,895；2004年6月23日提出的No.10/876,046；以及2004年5月2日提出的美國專利申請(qǐng)No.10/837,885；各個(gè)申請(qǐng)通過引用以用于所有目的的其全文被結(jié)合。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)還涉及2004年4月5日提出的美國專利申請(qǐng)No.10/818,642；2003年4月3日提出的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/460,634；2004年4月5日提出的美國專利申請(qǐng)No.10/819,088；2004年4月5日提出的美國專利申請(qǐng)No.10/818,642；2002年11月27日提出的美國專利申請(qǐng)No.10/3063,798；2002年6月24日提出的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/391,529；以及美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/335,292；各個(gè)申請(qǐng)通過引用以用于所有目的的其全文被結(jié)合。
背景近來，為了實(shí)施提供用于準(zhǔn)備和分析應(yīng)用的各種化學(xué)和生化分析及合成，已經(jīng)進(jìn)行開發(fā)和制造微流體系統(tǒng)的嘗試。因?yàn)橄鄬?duì)于在宏大規(guī)模上實(shí)施的分析及合成根據(jù)微型化可以實(shí)現(xiàn)大量的優(yōu)點(diǎn)，因此出現(xiàn)制造這種設(shè)備的目標(biāo)。這種優(yōu)點(diǎn)包括利用這種設(shè)備實(shí)施分析或合成所需要的時(shí)間、成本及空間的真正的減少。另外，微流體設(shè)備具有適用于使用自動(dòng)系統(tǒng)的可能，從而因人為干擾減少而具有進(jìn)一步成本降低和減少操作者失誤的額外優(yōu)點(diǎn)。微流體設(shè)備已經(jīng)被提出用于各種應(yīng)用，包括例如毛細(xì)管電泳、氣相色譜和細(xì)胞分離。
然而，這些優(yōu)點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)因與迄今為止已經(jīng)被制造的微流體設(shè)備相關(guān)的各種錯(cuò)綜復(fù)雜而經(jīng)常受到阻礙。例如，許多目前微流體設(shè)備由基于硅石的基底制造；這些材料難于加工且是復(fù)雜的，并且由這些材料制造的設(shè)備是易碎的。另外，在許多現(xiàn)有微流體設(shè)備中的流體運(yùn)輸要求以使用所述設(shè)備的可控制方式對(duì)復(fù)雜電場的調(diào)節(jié)。
因此，除了現(xiàn)有設(shè)備的目前限制之外，考慮到使用微流體設(shè)備可以實(shí)現(xiàn)的前述優(yōu)點(diǎn)，仍舊存在對(duì)被設(shè)計(jì)用于實(shí)施各種化學(xué)和生化分析的微流體設(shè)備的需要。因?yàn)槠湓诂F(xiàn)代生物化學(xué)中的重要性，具體需要可被利用實(shí)施各種核酸擴(kuò)增反應(yīng)的的設(shè)備，該設(shè)備同時(shí)還具有用于各種類型分析中的足夠的通用性。
具有實(shí)施核酸擴(kuò)增作用的設(shè)備將具有多種用途。例如，這種設(shè)備可能被用作分析工具，以確定在樣本中是否存在或缺少感興趣的具體目標(biāo)核酸。因此，該設(shè)備可能被利用測試具體病原體(例如，病毒、細(xì)菌或真菌)的存在，以及識(shí)別用途(例如，父權(quán)(paternity)和法庭應(yīng)用)。這種設(shè)備還可以被利用檢測或特征化先前與具體疾病或基因紊亂相關(guān)聯(lián)的特殊核酸。在用作分析工具時(shí)，該設(shè)備還可能被用于實(shí)施基因類型分析和基因表達(dá)分析(例如，不同基因表達(dá)研究)。可替換地，可以制備方式使用該設(shè)備以擴(kuò)增足夠核酸用于進(jìn)一步分析，譬如擴(kuò)增產(chǎn)物、細(xì)胞類型、DNA指紋等。在各種基因工程應(yīng)用中還可使用擴(kuò)增產(chǎn)物，例如插入在然后可被使用以轉(zhuǎn)換細(xì)胞的向量中，用于想要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生產(chǎn)。
概述在這里提供了用于實(shí)施微流體分析的多種設(shè)備和方法，包括可被利用以實(shí)施例如核酸放反應(yīng)的熱循環(huán)反應(yīng)的設(shè)備。該設(shè)備不同于常規(guī)微流體設(shè)備在于它們包括彈性部件；在某些例子中，許多或全部設(shè)備由彈性材料組成。
具體設(shè)備被設(shè)計(jì)以實(shí)施熱循環(huán)反應(yīng)(例如，PCR)，所述設(shè)備包括一或多個(gè)彈性閥門，以調(diào)整流過設(shè)備的溶液。因此，還提供了使用這種設(shè)計(jì)的設(shè)備實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)的方法。
一些設(shè)備包括盲流動(dòng)通道，所述盲流動(dòng)通道包括起到反應(yīng)點(diǎn)作用的區(qū)域。具體這種設(shè)備包括形成在彈性材料內(nèi)的流動(dòng)通道，以及多個(gè)與流動(dòng)通道流體相通的盲流動(dòng)通道，各個(gè)盲流動(dòng)通道的區(qū)域限定反應(yīng)區(qū)域。所述設(shè)備還包括重疊和相交于各個(gè)盲流動(dòng)通道的一個(gè)或多個(gè)控制通道，其中彈性隔膜在各個(gè)交叉點(diǎn)將一個(gè)或多個(gè)控制通道與盲流動(dòng)通道隔開。在這種設(shè)備將彈性隔膜設(shè)置偏斜入盲流動(dòng)通道或從盲流動(dòng)通道收回，響應(yīng)于激勵(lì)作用力。所述設(shè)備可理想地進(jìn)一步包括多個(gè)保護(hù)通道，其形成在彈性材料中和重疊流動(dòng)通道和/或反應(yīng)點(diǎn)中一個(gè)或多個(gè)。保護(hù)通道被設(shè)計(jì)具有貫通其間的流體流，以減少從所述設(shè)備中的流動(dòng)通道和反應(yīng)點(diǎn)的蒸發(fā)。另外，所述設(shè)備可理想地包括沉積在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)試劑。
在某一設(shè)備中，流動(dòng)通道是多個(gè)流動(dòng)通道中之一，各個(gè)流動(dòng)通道與從那里分支的多級(jí)盲流動(dòng)通道相流體連通。在這種設(shè)計(jì)的設(shè)備中，在一些例子中，多個(gè)流動(dòng)通道互相內(nèi)部連接，以致于流體可經(jīng)由單入口被導(dǎo)入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。在其它設(shè)備中，然而，多個(gè)流動(dòng)通道互相隔離，以致于導(dǎo)入一個(gè)流動(dòng)通道的流體不能流入另一流動(dòng)通道，以及各個(gè)流動(dòng)通道包括在流體可被導(dǎo)入的一端或兩端處的入口。
其它設(shè)備包括具有至少50個(gè)點(diǎn)/cm2的密度的反應(yīng)點(diǎn)陣列，反應(yīng)點(diǎn)典型地形成在彈性材料內(nèi)。其它設(shè)備具有更高密度，例如至少250、500或1000個(gè)點(diǎn)/cm2。
另一其它設(shè)備包括形成在彈性基底內(nèi)的反應(yīng)點(diǎn)，在彈性基底處用于實(shí)施反應(yīng)的試劑為非共價(jià)固定的。試劑可以是一種或多種試劑，用于實(shí)質(zhì)上實(shí)施任意類型反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，試劑包括用于實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一種試劑。因此，在一些設(shè)備中，試劑包括引物、聚合酶和一種或多種核苷酸。在其它設(shè)備中，試劑是核酸模板。
還提供了各種矩陣或基于陣列的設(shè)備。這些設(shè)備中的某些包括(i)第一多個(gè)流動(dòng)通道，其形成在彈性基底內(nèi)，(ii)第二多個(gè)流動(dòng)通道，其形成在彈性基底內(nèi)，與第一多個(gè)流動(dòng)通道相交叉，以限定反應(yīng)點(diǎn)陣列，(iii)可被激勵(lì)的多個(gè)隔離閥門，其被設(shè)置在第一和第二多個(gè)流動(dòng)通道內(nèi)，以將各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的溶液與在另一反應(yīng)點(diǎn)處的溶液相隔離，以及(iv)多個(gè)保護(hù)通道，其重疊一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通道和/或一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，以阻止溶液從那里的蒸發(fā)。
前面設(shè)備可以被利用以實(shí)施大量不同反應(yīng)，包括涉及溫度調(diào)整的那些(例如，核酸分析的熱循環(huán))。使用某些盲道性設(shè)備實(shí)施的方法涉及提供包括形成在彈性材料內(nèi)的流動(dòng)通道的微流體設(shè)備；以及與流動(dòng)通道相連通的多個(gè)盲流動(dòng)通道，各個(gè)盲流動(dòng)通道的末端區(qū)域限定反應(yīng)點(diǎn)。至少一種試劑被引入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，然后反應(yīng)在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)處被檢測。方法可優(yōu)選擇地包括在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)對(duì)至少一種試劑加熱。因此，例如，方法可涉及引入用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的部件，以及然后對(duì)部件進(jìn)行熱循環(huán)以形成擴(kuò)增的產(chǎn)物。
其它方法涉及提供包括一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的微流體設(shè)備，各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)包括用于實(shí)施分析的第一試劑，所述試劑被非共價(jià)地沉積在彈性基底上。然后，第二試劑被導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，從而第一和第二試劑混合以形成反應(yīng)混合物。在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)處在第一和第二試劑之間的反應(yīng)隨后被檢測。
另一其它方法涉及提供微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備包括形成在基底內(nèi)的反應(yīng)點(diǎn)陣列且具有至少50個(gè)點(diǎn)/cm2的密度。至少一個(gè)試劑被引入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。然后，檢測在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)處的反應(yīng)。
又一其它方法涉及提供微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備包括形成在彈性基底內(nèi)的至少一個(gè)反應(yīng)點(diǎn)以及還有多個(gè)保護(hù)通道形成在彈性基底內(nèi)。至少一個(gè)試劑被引入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，然后在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)被加熱。在加熱之前或期間流體流過保護(hù)通道，以降低從至少一個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的蒸發(fā)。在至少一個(gè)反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的反應(yīng)隨后被檢測。
還提供了被設(shè)計(jì)降低流體從設(shè)備蒸發(fā)的另外設(shè)備。一般地，這種設(shè)備包括腔體，所述腔體是形成在彈性基底中的微流體網(wǎng)絡(luò)的部分；以及多個(gè)保護(hù)通道，其重疊腔體且通過隔膜與腔體相分離。在這種設(shè)備的保護(hù)通道被制成合適大小，(i)允許溶液流過其中，以及(ii)以致于因隔膜在激勵(lì)作用力對(duì)保護(hù)通道的作用而偏轉(zhuǎn)，流入、流出或流過腔體的溶液基本上沒有減少。其它設(shè)備包括(i)一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通道和/或一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)；以及(ii)多個(gè)保護(hù)通道，其重疊微流體設(shè)備且通過彈性體與那里相分離，其中保護(hù)通道之間的間隔在1μm至1mm之間。在其它設(shè)備中，間隔在5μm至500μm之間，在其它設(shè)備中，在10μm至100μm之間，在另一其它設(shè)備中，間隔在40μm至75μm之間。
還提供了在某些微流體設(shè)備的反應(yīng)點(diǎn)中實(shí)施核酸分析的合成物。某些這些合成物包括下面中的一種或多種阻滯蛋白質(zhì)結(jié)合在彈性材料上的試劑和洗滌劑。阻滯劑典型地由包含蛋白質(zhì)的組中選擇(例如明膠或清蛋白，例如牛血清清蛋白(BSA))。洗滌劑例如可以是SDS或Triton。
附圖簡要說明
圖1A是示例設(shè)備的示意表示，具有交叉垂直和水流動(dòng)通道的矩陣設(shè)計(jì)。
圖1B-E顯示圖1A中所示設(shè)備的部分的擴(kuò)增視圖，并示出其操作。
圖1F是另一示例矩陣設(shè)計(jì)設(shè)備的示意表示，其利用保護(hù)通道減少樣本蒸發(fā)。
圖2是示例盲道設(shè)備的平面圖。
圖3A是另一示例盲道設(shè)備的平面圖。
圖3B是更復(fù)雜盲道設(shè)備的示意表示，基于圖3A中所示的通用設(shè)計(jì)的單元。
圖4是利用混合設(shè)計(jì)的設(shè)備的平面圖。
圖5是顯示實(shí)施熱循環(huán)反應(yīng)的上升(ramp up)和下降時(shí)間的圖標(biāo)。
圖6顯示在盲道型設(shè)備中的反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)點(diǎn)樣試劑的位置(spotted reagent)的位置，示出試劑在設(shè)備拐角處反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)正確的排列。
圖7A和7B分別是另一混合型微流體設(shè)備的橫截面圖和示意圖，并且表示被用于實(shí)施例1-4中所述試驗(yàn)的這種設(shè)備。
圖8是條形圖，在其中繪出用于六種不同β肌動(dòng)蛋白TaqMan反應(yīng)的平均FAM/PRI/控制比率。這些反應(yīng)在微流體設(shè)備(芯片)中和Macro(宏)TaqMan反應(yīng)中被熱循環(huán)。所述控制為沒有DNA的第一和第四條形集合。誤差條是這些比率的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖9是描繪示例針點(diǎn)樣工藝的圖。從源(例如微量滴定板(microtiterplate))中汲取試劑，然后通過使加載針接觸基底被印刷。洗刷步驟包括在真空干燥之后在去離子水中的攪動(dòng)。
圖10是條形圖，描繪基于例2中所述試驗(yàn)的用于例1(見圖7B)中所述微流體設(shè)備(芯片)的FAM信號(hào)強(qiáng)度。數(shù)據(jù)為由標(biāo)準(zhǔn)線道的FAM/PRI比率衡量的(FAM信號(hào)/PRI信號(hào))形式。誤差條線為沿線道的標(biāo)準(zhǔn)偏差。“1.3X”和“1X”指示指代點(diǎn)樣極和探針相關(guān)于其標(biāo)稱值的集中度。
圖11是條形圖，顯示在微流體設(shè)備(實(shí)心條)中用于Macro TaqMan(條圖)和TaqMan反應(yīng)的9-10孔的平均VIC/PFI/控制比率。兩個(gè)負(fù)控制(控制)和具有100pg/nl基因組DNA的兩個(gè)樣本被熱循環(huán)，如上所述的反應(yīng)部件具有4倍的標(biāo)準(zhǔn)極/探針。誤差條線表示平均比率的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖12是條形圖，顯示用于從微流體設(shè)備的單流通通道(見圖7B)中分支的各個(gè)10-1nl孔的FAM/PRI/控制比率。基因組DNA的數(shù)量為0.25pg/nl，這產(chǎn)生每個(gè)孔的一個(gè)目標(biāo)備份的平均。
圖13是條形圖，描繪使用圖7B中所示的微流體設(shè)備的用于CYP2D6SNP的平均VIC/PRI/控制比率。Allele 1(Al-1)是針對(duì)基準(zhǔn)或野生型等位基因CYP2D6*1的用于VIC探針的位置控制。Allele 2(Al-2)是針對(duì)變型或突變等位基因CYP2D6*3的用于FAM探針的位置控制。控制沒有DNA模板。以100pn/pl或20pn/pl使用基因組DNA。誤差條線是這些比率的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖14是條形圖，顯示在圖7B中所示的微流體設(shè)備中用于CYP2D6SNP的平均FAM/PRI/控制比率。樣本與相關(guān)于圖13及例3中所述的相同。
圖15是用于例4中試驗(yàn)的微流體設(shè)備的示意圖。
圖16是包含來自圖7B中所示的微流體設(shè)備中Macro PCR和PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠。在左側(cè)上結(jié)果示出不同DAN基對(duì)長度的近似漂移。包含散布帶的線道為分子量標(biāo)示。標(biāo)示“Macro”的線道是來自不同稀釋液的Macro反應(yīng)的PCR產(chǎn)物。標(biāo)示“In chip(芯片中)”的線道是在芯片中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。包含貫通凝膠的許多條帶線道非特異性背景信號(hào)。
圖17a-17d描繪在閥門關(guān)閉和閥門閉合狀態(tài)中隔離微流體設(shè)備的兩個(gè)優(yōu)選設(shè)計(jì)。
圖18a和18b描繪在執(zhí)行熱循環(huán)反應(yīng)之后隔離微流體設(shè)備的圖像。圖18a描繪兩個(gè)彩色圖像，以及圖18b描繪減少控制紅色信號(hào)的之后的剩余信號(hào)。
圖19描繪每孔復(fù)制的平均數(shù)量與正極性孔數(shù)量比較的圖表。
圖20描繪等溫?cái)U(kuò)增配置-SCORPION。
圖21描繪示例矩陣微流體設(shè)備平面圖。
圖22A描繪根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的具有整體壓力累積井(well)的微流體設(shè)備的基底；圖22B描繪圖8A中所示的微流體設(shè)備的展開圖，進(jìn)一步包括彈性塊；圖22C是圖22B中所示的微流體設(shè)備的整體圖；圖22D是圖22B中所示的微流體設(shè)備的平面圖；圖22E是圖22B中所示的微流體設(shè)備的橫截面圖；圖23是在本發(fā)明微流體設(shè)備中某些實(shí)施例中使用的通路(via)的橫截面圖。
圖24是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于激勵(lì)微流體設(shè)備的情形的透視圖。
圖25描繪被推向根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的微流體設(shè)備的上表面的壓盤的剖視圖；圖26A是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的系統(tǒng)的簡化整體圖；圖26B是圖26A的系統(tǒng)中接收臺(tái)的透視圖；圖26C是在根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的板接口或壓盤內(nèi)流體選擇路線(routing)的后平面圖；圖27A和27B是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的界面壓盤的橫截面?zhèn)纫晥D，所示界面壓盤被匹配到載體上；圖28A是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的整體載體的透視圖；圖28B是根據(jù)本發(fā)明中另一實(shí)施例的使用PCR的整體載體的透視圖；圖29A是用于約束圖28A中載體的系統(tǒng)的簡化橫截面圖；圖29B是用于約束圖28B中載體的系統(tǒng)的簡化橫截面圖；圖29C是圖28B中載體部分的簡化平面圖；圖29D是使用圖28B中系統(tǒng)的真空卡盤(vacuum chuck)的簡化平面圖；以及圖30是使用圖28B中系統(tǒng)的真空卡盤的簡化整體圖。
詳細(xì)說明I.定義如果沒有特定限定，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員共同理解的含義。下面參考將本發(fā)明所使用的眾多術(shù)語的一般性定義提供給技術(shù)人員Singleton等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed.1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS，5TH ED.，R.Rieger等(eds.)，Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY(1991).如這里所使用的，下面術(shù)語歸若沒有特定限定則屬于它們的含義。
“流動(dòng)通道”通常指的是溶液通過其可流動(dòng)的流通路徑。
若沒有特定指示，術(shù)語“閥門”指的是在其中內(nèi)插入流通通道和控制通道且由彈性膈膜分隔開的結(jié)構(gòu)，所述彈性膈膜響應(yīng)激勵(lì)力可被偏轉(zhuǎn)入流動(dòng)通道或從流動(dòng)通道收回。
“盲道”或“死胡同通道”指的是流動(dòng)通道，其具有入口單沒有單獨(dú)的出口。因此，進(jìn)出盲道的溶液流出現(xiàn)在同樣位置。充填一個(gè)或多個(gè)盲道的填充過程有時(shí)被簡稱為“盲目填充(blind fill)”。
“隔離反應(yīng)點(diǎn)”通常指的是沒有與設(shè)備上存在的其他反應(yīng)點(diǎn)流體連通的反應(yīng)點(diǎn)。在相關(guān)于盲道被使用時(shí)，隔離反應(yīng)點(diǎn)為盲道末端的區(qū)域，所述區(qū)域可以由與盲道相關(guān)聯(lián)的閥門堵塞。
“通孔(via)”指的是形成在彈性材料設(shè)備中的通道，以提供流體在設(shè)備的外部端口和一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通道之間進(jìn)出。因此，通孔可用作樣本輸入或輸出，例如。
術(shù)語“彈性材料體”和“彈性材料”具有本領(lǐng)域所使用的通常含義。因此，例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry，第二代Ed)描述了通常作為存在于其玻璃轉(zhuǎn)化溫度和液化溫度之間溫度處的聚合物的彈性材料體。彈性材料展示彈性性能，因?yàn)榫酆衔镦溔菀资艿脚まD(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)以響應(yīng)于作用力而使主鏈伸直，在沒有作用力下主鏈重新纏繞呈現(xiàn)先前形狀。一般地，在施加作用力時(shí)彈性體變形，但然后在去除作用力時(shí)回復(fù)至其初始形狀。由彈性材料展示的彈性可以由楊氏模量具體化。在這里公開的的利用在微流體設(shè)備中的彈性材料典型地具有在大約1Pa-1Tpa的楊氏模量，在其它例子中在大約10Pa-100Gpa之間，在另一其他例子中在大約20Pa-1Gpa之間，在又-其他例子中在大約50Pa-10Mpa之間，以及具體例子中在大約100Pa-1Mpa之間。取決于具體應(yīng)用的需要，還可以利用具有這些范圍之外的楊氏模量的彈性材料。
這里所述的某些微流體設(shè)備由彈性體聚合物制造，例如，GE RTV 615(配方)、乙烯-硅烷交聯(lián)(型)硅酮彈性體(族)。然而，本微流體系統(tǒng)不限于這一種配方、型號(hào)或這族聚合物；而是，幾乎任意彈性體聚合物均是使用的。給定聚合物化學(xué)的差異性、母體、合成方法、反應(yīng)條件和可能的添加劑，有大量可能彈性體系統(tǒng)，其可被使用制造單片彈性微閥門和泵。對(duì)材料的選擇典型地取決于被實(shí)施應(yīng)用所要求的具體材料參數(shù)(例如，耐溶劑性(solvent resistance)、硬度、可透氣性和/或溫度穩(wěn)定性)。在這里公開的相關(guān)于在微流體設(shè)備部件的制造中可被使用的彈性體材料類型的另外細(xì)節(jié)被闡述在Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO02/43615及WO0I/01025中，其在此通過引用以其用于所有目的的全文被結(jié)合。
術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”在這里被使用用于包含任意長度的核苷酸的聚合體形式，包括但不限于核糖核苷酸(ribonucleotide)或脫氧核糖核苷酸。在這些術(shù)語之間在長度上沒有想要的差別。另外這些屬于僅僅指的是分子的主要結(jié)構(gòu)。因此，在具體實(shí)施例中，這些術(shù)語可以包含三個(gè)、雙個(gè)和單個(gè)絞合DNA，以及三個(gè)、雙個(gè)和單個(gè)絞合RNA。它們還包括變更，例如通過甲基化和/或壓蓋(capping)，以及多核苷酸的未變化的形式。尤其是，術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”包括多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)、為嘌呤或嘧啶堿的N-或C-糖苷的任意類型多核苷酸，以及包含非核苷酸主鏈(nonnucleotidic backbone)的其他聚合物，例如聚酰胺(譬如肽核酸(PNA))和聚嗎啉代(polymorpholino)(與Neugene一樣可以從Corvallis Oregon(康瓦利斯城俄勒岡州)Anti-Virals有限公司買到)聚合物以及其他合成序列特定核酸聚合物，假定聚合物在允許堿基配對(duì)和堿基堆積的結(jié)構(gòu)中包含核酸基鹽(nucleobases)，例如在DNA和RNA的構(gòu)造中。
“探針”是一種核酸，其使用一種或多種化學(xué)鍵能夠結(jié)合互補(bǔ)序列的目標(biāo)核酸，通常使用互補(bǔ)基對(duì)，通常使用氫鍵構(gòu)成，從而形成復(fù)式結(jié)構(gòu)。探針結(jié)合或雜交“探針結(jié)合點(diǎn)”。探針可由可檢測標(biāo)示來標(biāo)示，以允許探針的輕易檢測，具體地曾經(jīng)探針雜交至其互補(bǔ)目標(biāo)。例如，附連到探針的標(biāo)示可包括任意本領(lǐng)域已知的各種不同標(biāo)示，它們可以通過化學(xué)或物理手段來檢測。可被附連到探針的適當(dāng)標(biāo)示包括但不限于放射性同位元素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)示、電子密度顆粒、磁顆粒、自旋標(biāo)示、發(fā)射化學(xué)螢光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔助因子和酶基片。探針能夠在大小上明顯改變。一些探針是相當(dāng)?shù)亩恕Ｍǔ＃结槥橹辽?至15個(gè)核苷酸長。其它探針為至少20、30或40個(gè)核苷酸長。另一探針略微更長，為至少50、60、70、80、90個(gè)核苷酸長。又一探針更長，為至少100、150、200個(gè)或更多個(gè)核苷酸長。探針還可以為落入前面范圍內(nèi)的任意特定長。
“引物(primer)”是單旋多聚核苷酸，其在合適條件(也就是，四種不同三磷酸核苷和用于聚合的試劑例如或DNA或RNA聚合酶或反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶的情況下)下在合適緩沖物基在適當(dāng)溫度處能夠起到模板導(dǎo)向的DNA合成中的起始點(diǎn)作用。引物的合適長度取決于引物所要的長度，但是典型地為至少7個(gè)核苷酸長，以及更典型地在10至30個(gè)核苷酸長之間變化。短引物分子一般要求較低溫度，以與模板形成足夠穩(wěn)定的復(fù)合聯(lián)合體。引物不必反應(yīng)模板的特定序列，但必須足夠互補(bǔ)以與模板雜交。術(shù)語“引物點(diǎn)”或“引物結(jié)合點(diǎn)”指的是引物雜交的目標(biāo)DNA的節(jié)段。“引物對(duì)”標(biāo)示包括5′“上游引物”和3′“下游引物”的一序列引物，5′“上游引物”與將被擴(kuò)增的DNA序列的5′端的補(bǔ)充物雜交，3′“下游引物”與將被擴(kuò)增的DNA序列的3′端的補(bǔ)充物雜交。
“完美互補(bǔ)的”引物具有在引物整個(gè)長度上的完全互補(bǔ)的序列，并且沒有失諧。引物對(duì)目標(biāo)序列的部分(子序列)典型地是完美互補(bǔ)的。“失諧”指的是引物中的核苷酸和與其對(duì)齊的目標(biāo)核酸中的核苷酸不是互補(bǔ)的點(diǎn)。參照引物使用時(shí)的術(shù)語“基本上互補(bǔ)”表示引物與其目標(biāo)序列不是完美互補(bǔ)的；代替之，引物僅僅充分互補(bǔ)的，以在理想的引物結(jié)合點(diǎn)處選擇地雜交至各自的螺旋。
術(shù)語“互補(bǔ)”表示一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸分子是一致的或選擇性雜交的。相比總的特異性缺失，更多選擇性的雜交選擇性出現(xiàn)在雜交發(fā)生時(shí)。典型地，在至少14-25個(gè)核苷酸的拉伸上有至少大約55％相同時(shí)，，選擇性雜交將發(fā)生，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％，進(jìn)而最優(yōu)選至少90％。優(yōu)選地，一個(gè)核酸專門雜交至其余核酸。參見M.Kanehisa，Nucleic AcidsRes.12203(1984)。
術(shù)語“標(biāo)示”指的是可以通過物理、化學(xué)、電磁和其它相關(guān)分析技術(shù)檢測的分子或分子方面。可被利用的可檢測標(biāo)示的例子包括但不限于放射性同位元素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)示、電子密度顆粒、磁顆粒、自旋標(biāo)示、發(fā)射化學(xué)螢光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔助因子、鏈接至核酸探針的酶和酶基片。術(shù)語“可檢測標(biāo)示”表示與標(biāo)示共軛結(jié)合的試劑或具有某些固有特征(例如，大小、形狀或顏色)的試劑，所述特征允許其沒有共軛結(jié)合至分離標(biāo)示而被檢測。
“多形態(tài)標(biāo)記”或“多形態(tài)點(diǎn)”為擴(kuò)散發(fā)生處的地點(diǎn)。優(yōu)選的標(biāo)記具有至少兩個(gè)等位基因，各個(gè)等位基因以大于所選擇群體的1％的頻率出現(xiàn)，更優(yōu)選地以大于10％或20％。多形態(tài)地點(diǎn)可以與一基對(duì)一樣小。多形態(tài)標(biāo)記包括限制酶斷片長度多晶型、可變數(shù)量銜接重復(fù)(VNTR′s)、超變量區(qū)域、小隨體(minisatellite)、二核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、單序列重復(fù)和例如Alu的插入元素。第一可識(shí)別等位基因形式被任意設(shè)計(jì)為參考形式，以及其它等位基因形式被設(shè)計(jì)為替代的或可變的等位基因。在選擇的基團(tuán)中最頻繁出現(xiàn)的等位基因形式有時(shí)被稱為野生型形式。二倍有機(jī)體可以是等位基因形式的同型結(jié)合或雜合的。二對(duì)等位基因多形態(tài)具有兩種形式。三對(duì)等位基因多形態(tài)具有三種形式。
“單核苷酸多形態(tài)”(SNP)出現(xiàn)在由單核苷酸所占據(jù)的多形態(tài)點(diǎn)，所述多形態(tài)點(diǎn)為等位基因序列之間變化的位置。該部位之前或之后通常有等位基因的高度保守序列(例如，在小于人群1/100或1/1000的成員中改變)。單核苷酸多形態(tài)通常由于在多態(tài)位點(diǎn)一個(gè)核苷酸代替另一個(gè)而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)換是一個(gè)嘌呤被另一嘌呤代替或一個(gè)嘧啶被另一嘧啶代替。顛換是嘧啶代替嘌呤或反之。單核苷酸多形態(tài)也可由核苷酸缺失或核苷酸關(guān)于參考等位基因的插入而產(chǎn)生。
“試劑”廣義地指任何在反應(yīng)中應(yīng)用的藥劑。試劑可包含自身可被監(jiān)測的單一試劑(例如，當(dāng)其被加熱時(shí)被監(jiān)測的物質(zhì))或兩者或更多試劑的混合物。試劑可以是有生命的(例如，細(xì)胞)或無生命的。用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的可仿效的試劑包含但不局限于緩沖液、金屬離子、多聚酶、引物、模板核酸、核苷酸、標(biāo)記、染料、核酸酶以及諸如此類。用于酶反應(yīng)的試劑包含，例如，底物、輔助因子、聯(lián)結(jié)酶、緩沖液、金屬離子、抑制劑和催化劑。用于基于細(xì)胞的反應(yīng)的試劑包含但不局限于細(xì)胞、細(xì)胞特異性染料和結(jié)合至細(xì)胞受體的配基(例如，激動(dòng)劑和拮抗劑)。
“配基”是指任何分子，對(duì)于該分子存在另一特異性或非特異性結(jié)合至該配基的分子(即，抗配基)，所述結(jié)合由于抗配基對(duì)配基某部分的識(shí)別。
II.概述在這里提供具有獨(dú)特流動(dòng)通道構(gòu)造的大量不同微流體設(shè)備(有時(shí)成為芯片)，還有使用這些設(shè)備實(shí)施各種高吞吐量分析的方法。這些設(shè)備被設(shè)計(jì)用于需要溫度控制的分析中，尤其涉及熱循環(huán)的分析中(例如，核酸擴(kuò)增反應(yīng))。微流體設(shè)備結(jié)合具體設(shè)計(jì)特征假定具有明顯小于許多常規(guī)微流體設(shè)備的足跡的設(shè)備，使該設(shè)備將容易地與其他儀器相結(jié)合以及用于自動(dòng)分析。
某些微流體設(shè)備使用了典型地在這里被稱為“盲道”或“盲填充”的設(shè)計(jì)，其部分特征在于具有大量盲道，如在限定部分中所指示的，所述盲道是具有死端或封閉端的流動(dòng)通道，以使溶液可以僅僅在一端進(jìn)出盲道(也就是，沒有分離的盲道的進(jìn)口和出口)。這些設(shè)備僅僅需要用于各個(gè)盲道的單一閥門，以封閉盲道區(qū)域形成封閉的區(qū)域點(diǎn)。在這種設(shè)備的制造期間，將用于實(shí)施分析的一個(gè)或多個(gè)試劑沉積在反應(yīng)點(diǎn)，從而導(dǎo)致輸入和輸出數(shù)量的明顯減少。另外，盲道被連接到相互連接的通道網(wǎng)絡(luò)，以使可以從單一或有限數(shù)量的樣本輸入填充所有反應(yīng)點(diǎn)。因?yàn)檩斎牒洼敵龅膹?fù)雜度的降低以及基金單一閥門被用于封閉各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，所以增加了可用于反應(yīng)點(diǎn)的空間。因此這些設(shè)備的特點(diǎn)意味著各個(gè)設(shè)備可包括大量反應(yīng)點(diǎn)(例如，直至數(shù)千個(gè))且可以實(shí)現(xiàn)高反應(yīng)點(diǎn)密度(例如，超過1000-4000反應(yīng)點(diǎn)/cm2)。單獨(dú)地和共同地，相比于傳統(tǒng)微流體設(shè)備，這些特點(diǎn)還直接轉(zhuǎn)變?yōu)檫@些設(shè)備大小的明顯減小。
在這里公開的其他微流體設(shè)備使用矩陣設(shè)計(jì)。一般地，這種類型的微流體設(shè)備使用大量相互交叉的水平和垂直流動(dòng)通道，以在交叉點(diǎn)處限定反應(yīng)點(diǎn)陣列。因此，這種設(shè)計(jì)的設(shè)備還具有反應(yīng)點(diǎn)陣列；然而，使用這種設(shè)計(jì)，為了調(diào)節(jié)大量樣本而有大量樣本輸入和對(duì)應(yīng)的輸出。被稱為可轉(zhuǎn)換流動(dòng)陣列結(jié)構(gòu)的閥門系統(tǒng)使溶液能夠選擇性地僅僅流過水平流動(dòng)通道，從而允許矩陣中的各種流動(dòng)通道的可轉(zhuǎn)換封閉。因此，盡管盲道設(shè)備被設(shè)計(jì)以在不同狀況下使用有限數(shù)量樣本實(shí)施大量分析，然而矩陣設(shè)備被構(gòu)造以在有限數(shù)量狀況下對(duì)大量樣本進(jìn)行分析。另一其他設(shè)備使這輛中通常設(shè)計(jì)類型的組合。
被描述的微流體設(shè)備其另外特征部分在于，使用各種部件，例如由彈性體材料制造的流動(dòng)通道、控制通道、閥門和/或泵。在一些例子中，實(shí)質(zhì)上，整個(gè)設(shè)備由彈性體材料制造。因此，這種設(shè)備在形式和功能上明顯不同于由基于硅的材料制造的常規(guī)微流體設(shè)備的主要特點(diǎn)。
所述設(shè)備的設(shè)計(jì)使它們能夠與大量不同加熱系統(tǒng)相組合而被利用。因此，所述設(shè)備在實(shí)施要求溫度控制的各種分析中是有用的。另外，在加熱應(yīng)用中使用的這些微流體設(shè)備可結(jié)合另外的設(shè)計(jì)特征，以是從反應(yīng)點(diǎn)的樣本蒸發(fā)最小化。這種類型的設(shè)備通常包括形成在彈性設(shè)備內(nèi)的大量保護(hù)通道，水可以通過所述保護(hù)通道流入以增加形成所述設(shè)備的彈性材料內(nèi)的水蒸氣壓力，從而降低從反應(yīng)點(diǎn)的樣本蒸發(fā)。
在另一實(shí)施例中，可以使用溫度循環(huán)設(shè)備以控制微流體的溫度。優(yōu)選地，微流體設(shè)備可能適于與微流體設(shè)備實(shí)現(xiàn)熱接觸。其中微流體設(shè)備由例如載玻片的基底材料或例如塑料載體的載體板底部支承，可以在載體或載片的區(qū)域中形成窗口，以使微流體設(shè)備優(yōu)選具有彈性塊的設(shè)備可以直接接觸溫度循環(huán)的加熱/制冷塊。在優(yōu)選實(shí)施例中，加熱/制冷塊具有在其中的凹槽，以與供給微流體設(shè)備吸力的真空源相連通，優(yōu)選在其中發(fā)生反應(yīng)的部分。可替換地，可將剛硬熱傳導(dǎo)板粘結(jié)到微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備然后與加熱和制冷塊相匹配，用于實(shí)施熱傳導(dǎo)效應(yīng)。
某些設(shè)備的陣列格式意味著該設(shè)備能夠?qū)崿F(xiàn)高吞吐量。共同地，高吞吐量和溫度控制能力使這些設(shè)備對(duì)執(zhí)行大量核酸擴(kuò)增(例如，聚合酶鏈反應(yīng)-PCR)是有用的。這種反應(yīng)在這里將被詳盡地描述為所述設(shè)備效用的指示，尤其它們?cè)谛枰獪囟瓤刂频娜我夥磻?yīng)中的用途。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述設(shè)備不限于這些具體應(yīng)用。所述設(shè)備可被用于多種其他類型分析或反應(yīng)中。多個(gè)例子包括對(duì)蛋白質(zhì)配合基相互作用和多個(gè)單元和各種化合物之間相互作用的分析。在下文中提供了另外的例子。
III.微流體設(shè)備的一般結(jié)構(gòu)A.泵和閥這里公開的微流體設(shè)備通常至少部分由彈性體材料構(gòu)造和使用單一或多層柔軟平版印刷(MSL)技術(shù)或犧牲層封裝方法(參見，例如Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO01/01025中，其兩者在此通過引用以其用于所有目的的全文被結(jié)合)構(gòu)造。使用這種方法，微流體設(shè)備可被設(shè)計(jì)，在其中控制流過所述設(shè)備流動(dòng)通道的溶液，至少部分地使用由彈性隔膜或扇形體與流動(dòng)通道分離的一個(gè)或多個(gè)控制通道。這個(gè)隔膜或扇形體可被偏轉(zhuǎn)進(jìn)入流動(dòng)通道或從流動(dòng)通道中縮回，通過將激勵(lì)力作用到控制通道使控制通道與流動(dòng)通道相關(guān)聯(lián)。通過控制隔膜被偏轉(zhuǎn)進(jìn)入流動(dòng)通道或從流動(dòng)通道中縮回的程度，溶液流動(dòng)可以被減緩或完全被堵塞流動(dòng)通道。使用這種類型的控制通道和流動(dòng)通道的組合，人們可以制備各種不同類型的閥門和泵，用于調(diào)節(jié)溶液流動(dòng)，如在Unger等(2000)Science288113-116，和PCT公開WO/02/43615和WO01/01025中詳細(xì)地所述的一樣。
這里所提供的設(shè)備結(jié)合了這種泵閥，以選擇地隔離允許試劑發(fā)生反應(yīng)處的反應(yīng)點(diǎn)。反應(yīng)點(diǎn)可被定位在設(shè)備內(nèi)任意不同位置。例如，在一些矩陣型設(shè)備中，反應(yīng)點(diǎn)被定位在一套流動(dòng)通道的交叉處。在盲道設(shè)備中，反應(yīng)點(diǎn)被定位在盲道的末端。
如果在溫度控制反應(yīng)(例如，熱循環(huán)反應(yīng))中使用該設(shè)備，然后，如在下文中更詳細(xì)所述的，彈性體設(shè)備典型地被固定到支承上(例如，載玻片)。然后，可將得到的結(jié)構(gòu)放置在溫度控制板上，例如，以控制在各種反應(yīng)點(diǎn)處溫度。在熱循環(huán)反應(yīng)的情況中，可將該設(shè)備放置在任意數(shù)量的熱循環(huán)板上。
因?yàn)樵撛O(shè)備由是相對(duì)光透明的彈性材料制造，使用各種不同檢測系統(tǒng)可以容易地監(jiān)控實(shí)質(zhì)上在微流體設(shè)備上任意位置處的反應(yīng)。然而，大多數(shù)檢測典型地發(fā)生在反應(yīng)點(diǎn)自身處(例如，在包含流動(dòng)通道的交叉點(diǎn)或在流動(dòng)通道的盲端的區(qū)域內(nèi))。該設(shè)備由基本上透明材料制造的事實(shí)還意味著對(duì)常規(guī)基于硅的微流體設(shè)備沒有用途的當(dāng)前設(shè)備可以使用具體檢測系統(tǒng)。使用被結(jié)合進(jìn)所述設(shè)備或與所述設(shè)備分離但與將被檢測設(shè)備的區(qū)域?qū)R的檢測器，可以實(shí)施檢測。
B.保護(hù)通道為了減少樣本和試劑從這里提供的彈性微流體設(shè)備的蒸發(fā)，大量保護(hù)通道可以被形成在所述設(shè)備中。保護(hù)通道與控制通道類似之處在于典型地它們被成形在彈性體層中，所述彈性體層覆蓋在流動(dòng)通道和/或反應(yīng)點(diǎn)上。因此，與控制通道一樣，保護(hù)通道與下方流動(dòng)通道和/或反應(yīng)點(diǎn)由彈性材料的膈膜或扇形體分離開。與控制通道不一樣，保護(hù)通道的橫截面積是相當(dāng)小的。一般地，具有較小面積的膈膜比具有較大面積的膈膜在同樣施加的壓力下將更小偏斜。設(shè)計(jì)保護(hù)通道，以將被壓縮以使溶液(典型地是水)流入保護(hù)通道。源于保護(hù)通道的水蒸氣可散布入鄰近流動(dòng)通道或反應(yīng)點(diǎn)的彈性體孔徑中，從而增加鄰近流動(dòng)通道或反應(yīng)點(diǎn)的水蒸氣密度，并且減少從那里的溶液蒸發(fā)。
一般地，保護(hù)通道是足夠小的，以使在壓縮分離保護(hù)通道與下方流動(dòng)通道或反應(yīng)點(diǎn)的膈膜時(shí)，基本上不會(huì)限制溶液流入、流出或流過流動(dòng)通道或保護(hù)通道重疊的反應(yīng)點(diǎn)。術(shù)語“基本上限制”或其他類似術(shù)語在這個(gè)上下文中被使用時(shí)意味著與在相同條件下進(jìn)、出或通過流動(dòng)通道或反應(yīng)點(diǎn)的溶液流相比，在進(jìn)、出或通過流動(dòng)通道或反應(yīng)點(diǎn)的溶液流沒有減少多于40％，典型地少于30％，通常少于20％，以及在一些例子中少于10％，在保護(hù)通道沒有被壓縮以得到通過其中的溶液流時(shí)。通常這意味著保護(hù)通道具有在100μm2和50,000μm2之間的橫截面積，或者在其間的任意整體或非整體橫截面積。因此，例如，在某些例子中，橫截面積小于50,000μm2，在其它例子中小于10,000μm2，在另一例子中小于1000μm2，以及在又一例子中小于100μm2，保護(hù)通道可以具有任意各種形狀，包括但不限于圓形、橢圓形、正方形、矩形、六邊形和八面體形狀。
保護(hù)通道被設(shè)計(jì)以在它采用實(shí)施熱循環(huán)反應(yīng)的期間和條件下減少來自所述設(shè)備的樣本和試劑的蒸發(fā)至小于50％，在其它例子中小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％。因此，例如，包含40循環(huán)的典型PCR反應(yīng)可以在120分鐘內(nèi)被實(shí)施。保護(hù)通道系統(tǒng)被設(shè)計(jì)以在近似這個(gè)時(shí)間框架期間將蒸發(fā)減少至前述限制。為了達(dá)到這個(gè)蒸發(fā)減少的水平，保護(hù)通道典型地呈現(xiàn)在至少10線/cm2至1000線/cm2的密度，或者在其間的任意整數(shù)密度值。尤其是，保護(hù)通道一般為至少25線/cm2，在其他例中至少50線/cm2，在另一例中至少100線/cm2，以及在又一例中至少500線/cm2。為了達(dá)到蒸發(fā)減少的這個(gè)水平，保護(hù)通道典型地呈現(xiàn)如從一線的外邊沿至相鄰線最近外邊沿被測量的在1mm至1μm之間間隔處，或者在其間的任意整數(shù)密度水平。尤其是，保護(hù)通道一般地間隔500μm至5μm之間，在其他例子中在100μm至10μm之間，在另外例子中在75μm至40μm之間。因此，間隔典型地為至少μml，而小于1mm，在其他例子中小于500μm，在另外例子中小于400μm，在又一例子中小于300μm，在其他例子中小于200μm，在另一例子中小于100μm、50μm或25μm。
保護(hù)通道可被形成為分離的通道網(wǎng)絡(luò)，或者可是分支控制通道的較小通道。保護(hù)通道可伸展過所述設(shè)備或者僅有所述設(shè)備的具體區(qū)域或多個(gè)區(qū)域。典型地，保護(hù)通道被鄰近和在流動(dòng)通道和反應(yīng)點(diǎn)上方設(shè)置，與這些是蒸發(fā)主要涉及的主要位置處。保護(hù)通道在具體矩陣設(shè)備上的示例位置被示出在圖1C中，以及保護(hù)通道在具體盲道設(shè)備上的示例位置被示出在圖3B和3C中，并且在下文中被詳細(xì)說明。
流過保護(hù)通道的溶液包括能夠減少水蒸發(fā)的任意物質(zhì)。所述物質(zhì)可是增加鄰近流線和/或反應(yīng)點(diǎn)的水蒸氣濃度的一種，或是盡管沒有增加水蒸氣濃度但是阻礙從流線和/或反應(yīng)點(diǎn)的水蒸發(fā)的一種(阻塞劑)。因此，一種選擇是實(shí)質(zhì)上利用任意水溶液，在這種情況中合適的溶液包括但不限于水和緩沖溶液(例如，TaqMan緩沖溶液和磷酸緩沖鹽水)。合適的阻塞劑包括例如礦物油。
保護(hù)通道典型地被成形在彈性體中，利用上面引證的MSL技術(shù)和/或犧牲層封裝方法。
下面部分更詳細(xì)地描述大量具體結(jié)構(gòu)，其可被利用實(shí)施各種分析，包括需要溫度控制的分析(例如，核酸擴(kuò)增反應(yīng))。應(yīng)當(dāng)理解的是，然而，這些結(jié)構(gòu)是示例性的且對(duì)這些系統(tǒng)的改型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
IV.矩陣圖A.概述利用矩陣圖的設(shè)備一般具有多個(gè)垂直和水平流動(dòng)通道，所述多個(gè)垂直和水平流動(dòng)通道相互交叉形成連接點(diǎn)陣列，因?yàn)椴煌瑯颖竞驮噭?或成套試劑)可被導(dǎo)入各個(gè)流動(dòng)通道，因此大量樣本可在相當(dāng)多的反應(yīng)條件下以高吞吐量格式被測試。因此，例如，如果不同樣本被導(dǎo)入M個(gè)不同垂直流動(dòng)通道中的每個(gè)，并且不同試劑(或成套試劑)被導(dǎo)入N個(gè)不同水平流動(dòng)通道中的每個(gè)，然后可以同時(shí)實(shí)施M×N個(gè)不同反應(yīng)。典型地，矩陣設(shè)備包括用于垂直和水平流動(dòng)通道的可轉(zhuǎn)換隔離的閥門。所述不同地，使閥門定位以允許選擇僅僅穿過垂直流動(dòng)通道或僅僅穿過水平流動(dòng)通道的流動(dòng)。因?yàn)檫@種類型的設(shè)備允許相關(guān)于樣本的類型和數(shù)量、以及試劑數(shù)量和類型的選擇的彈性，所以這些設(shè)備非常好地適于實(shí)施分析，在其中人們?cè)噲D在相當(dāng)多的反應(yīng)條件下篩選大量樣本。矩陣設(shè)備可優(yōu)選地結(jié)合保護(hù)通道以有助于阻止樣本和試劑的蒸發(fā)。
本發(fā)明提供用于高密度矩陣設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)利用微流體設(shè)備中層間流體連通通孔，以構(gòu)造貫通設(shè)備的控制線和流體線。例如，通過使流體線位于兩層彈性體阻塞的各層中，更高密度反應(yīng)單元布置是可能的。圖21描繪了示例矩陣設(shè)計(jì)，其中各個(gè)具有流體通道的第一彈性層2110(第一層)和第二彈性層2120(第二層)形成在其間。例如，第一層2110中的試劑流體通道通過通孔2130被連接到第二層2120中的試劑流體通道，盡管第二層2120在其中也具有樣本通道，樣本通道和試劑通道分別終止在樣本和試劑腔2180中。樣本和試劑腔2180通過接口通道2150互相連通，所述接口通道2150具有與其相關(guān)聯(lián)的接口閥門2140以控制反應(yīng)單元2160中各個(gè)腔2180之間流體流通。使用中，接口被首先關(guān)閉，然后將試劑從試劑入口導(dǎo)入試劑通道，以及將樣本通過樣本入口導(dǎo)入樣本通道，然后容器閥門2170被閉合，以將各反應(yīng)單元2160與其它反應(yīng)單元2160隔離。一旦反應(yīng)單元2160被隔離，則打開接口閥門2140以使樣本腔和試劑腔處于互相連通之中，以使可以發(fā)生想要的反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選方面提供用于M數(shù)量不同樣本與N數(shù)量不同試劑反應(yīng)的微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備包括多個(gè)反應(yīng)單元、各個(gè)反應(yīng)單元包括樣本腔和試劑腔，樣本腔和試劑腔通過接口通道處于流體連通中，所述接口通道具有在其間關(guān)聯(lián)的接口閥，用于控制樣本腔和試劑腔之間樣本連通；多個(gè)試劑入口，各個(gè)處于與試劑腔的流體連通中；其中樣本入口或試劑入口中之一通過通孔分別處于與樣本腔之一或試劑腔之一相流體連通。具體實(shí)施例包括使反應(yīng)單元形成在彈性塊內(nèi)，所述彈性塊由結(jié)合在一起的多層形成，以及接口閥是可偏轉(zhuǎn)隔膜；使樣本入口通過樣本通道與樣本腔相連通，以及試劑入口通過試劑通道與試劑腔相連通，樣本通道部分和試劑通道部分被大約彼此平行地定位，并且各個(gè)具有相互關(guān)聯(lián)的容器閥，用于控制貫通的流體連通；使與樣本通道相關(guān)聯(lián)的閥門以及與試劑通道相關(guān)聯(lián)的閥門互相是可操作地連通的，通過公共容易控制通道；使容器公共控制通道沿大約垂直樣本通道或試劑通道之一的線被定位。
本發(fā)明的另一方面提供用于實(shí)現(xiàn)彈性材料塊中特征的方法，所述方法包括步驟提供第一彈性材料層；在第一彈性材料層表面上施加光致抗蝕劑層；對(duì)光致抗蝕劑層施加光圖案以形成反應(yīng)的光致抗蝕劑材料的圖案；去除未反應(yīng)的光致抗蝕劑材料，在第一彈性材料層表面上剩下已反應(yīng)的光致抗蝕劑圖案；對(duì)第一彈性材料層施加蝕刻試劑以蝕刻沒有由已反應(yīng)光致抗蝕劑材料的圖案覆蓋的第一彈性材料層表面，從而去除沒有由已反應(yīng)光致抗蝕劑材料的圖案覆蓋的第一彈性材料層區(qū)域，而剩下對(duì)應(yīng)于已反應(yīng)光致抗蝕劑材料圖案的彈性材料層圖案。在本方法的具體優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法包括去除已反應(yīng)光致抗蝕劑材料圖案的步驟；通過將粘接帶應(yīng)用到彈性材料層和已反應(yīng)光致抗蝕劑材料圖案的表面，引起實(shí)施去除，然后從彈性材料層分離粘接帶，同時(shí)一些或全部已反應(yīng)光致抗蝕劑材料圖案被從彈性材料的表面去除；使光致抗蝕劑為SU8；使蝕刻劑包括四丁銨氟化物一三水合物；使特征為通孔；使彈性材料塊包括粘接在一起的多個(gè)彈性材料層，其中兩個(gè)或多個(gè)彈性材料層具有形成在其中的進(jìn)出口，并且一個(gè)彈性材料層中的一個(gè)進(jìn)出口通過通孔與另一彈性材料層中的進(jìn)出口相連通。
本發(fā)明的微流體設(shè)備可被進(jìn)一步集成入載體設(shè)備，所述載體設(shè)備被描述在由Unger于2004年3月29日提出的待審及共有的US專利申請(qǐng)序列號(hào)60/557,715中，其在這里用于所有目的而被結(jié)合。Unger載體提供板上連續(xù)流體壓力，以使遠(yuǎn)離流體壓力源的閥門保持閉合，例如家庭氣壓。Unger另外提供用于自動(dòng)系統(tǒng)，用于對(duì)如這里所述的本發(fā)明的閥門進(jìn)行裝料(charge)和激勵(lì)。另一優(yōu)選實(shí)施例，用于對(duì)累積器裝料和對(duì)閥門激勵(lì)的自動(dòng)系統(tǒng)采用具有壓盤的設(shè)備，所述壓盤匹配在微流體設(shè)備的一個(gè)或多個(gè)表面上，其中壓盤具有于控制真空或壓力源向流體連通的至少兩個(gè)或多個(gè)口，以及可包括用于操縱微流體設(shè)備部分的機(jī)械部分，例如，但不限于止回閥。
本發(fā)明的另一方面提供用于使用基底用于使彈性材料塊、載體穩(wěn)定，優(yōu)選具有一個(gè)或多個(gè)下面特征井(well)或蓄積槽，其與彈性材料塊通過形成在載體中或使用載體的至少一個(gè)通道相流體連通；累積器與彈性材料塊通過形成在載體中或使用載體的至少一個(gè)通道相流體連通，以及流體口與彈性材料塊相流體連通，其中流體口對(duì)于自動(dòng)真空或壓力源優(yōu)選是可訪問的，譬如上述的自動(dòng)系統(tǒng)，其中自動(dòng)源進(jìn)一步包括端口的壓盤，所述端口與流體口相匹配，以形成自動(dòng)系統(tǒng)之間封閉流體連接，用于將流體壓力或真空施加給彈性材料塊。在具體實(shí)施例中，自動(dòng)源還可實(shí)現(xiàn)與相關(guān)聯(lián)于載體的一個(gè)或多個(gè)激勵(lì)器的流體連通，用于充斥和釋放保持在積累器上的壓力。在具體實(shí)施例中，載體可進(jìn)一步包括定位在接觸微流體設(shè)備的載體區(qū)域中的區(qū)域，其中區(qū)域有不同于載體另一部分的材料制造，被選擇用于改進(jìn)熱傳導(dǎo)和散布參數(shù)的區(qū)域材料不同于載體的其他部分。用于改進(jìn)熱傳導(dǎo)和散布參數(shù)的優(yōu)選材料包括，但不限于硅，優(yōu)選地硅被高度拋光，例如在半導(dǎo)體場中可利用的硅類型，如從晶片切割拋光晶片或部分，例如芯片(芯片)。
本發(fā)明的另一方面提供用于使用熱源，例如，但不限于PCR熱循環(huán)器，其可從其原始制造狀態(tài)被改變，熱源具有可以匹配載體部分的熱調(diào)節(jié)部分，優(yōu)選地，載體的熱傳導(dǎo)和散布部分用于對(duì)彈性塊載體提供通過熱傳導(dǎo)和散布部分的熱控制。在優(yōu)選實(shí)施例中，通過將真空源應(yīng)用至被形成在熱源的熱調(diào)節(jié)部分內(nèi)一個(gè)或多個(gè)通道，改進(jìn)熱接觸，其中通道被形成以接觸載體的熱傳導(dǎo)和散布部分的表面，以施加吸引和保持載體的熱傳導(dǎo)和散布部分的位置。在優(yōu)選實(shí)施例中，載體的熱傳導(dǎo)和散布部分沒有實(shí)際與載體相接觸，而是與載體和彈性材料塊相關(guān)聯(lián)，通過僅僅將熱傳導(dǎo)和散布部分粘結(jié)至彈性材料塊，以及剩下圍繞熱傳導(dǎo)和散布部分中邊沿的間隙，以減小由載體引起的寄生熱效應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在這里所述的本發(fā)明的許多方面中，優(yōu)選彈性材料塊可能被取代，使用在這里沒有描述的現(xiàn)有技術(shù)的任意已知的微流體設(shè)備，例如由美國加利福尼亞圣克拉拉的Affymetrix(R)或由美國加利福尼亞芒廷維尤的Caliper所制造的設(shè)備例如GeneChip(R)(基因芯片)。受讓給Soane、Parce、Fodor、Wilding、Ekstrom、Quake或Unger的美國專利描述微流體或中等規(guī)模流體設(shè)備，所述設(shè)備可被取代本發(fā)明的彈性材料塊以利用熱優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)，例如吸引定位，減少至流體設(shè)備的其他區(qū)域的寄生熱傳遞，這在上面使用彈性材料塊的上下文中被描述。
B.示例設(shè)計(jì)和用途圖1A提供一種示例矩陣設(shè)備的圖示。這種設(shè)備100包括七個(gè)垂直流動(dòng)通道102和七個(gè)水平直流動(dòng)通道104，它們交叉形成49個(gè)不同交叉或反應(yīng)點(diǎn)106的陣列。這種具體設(shè)備因此使七種樣本能夠與其中七種不同試劑或套試劑起反應(yīng)。在垂直方向中調(diào)節(jié)溶液流量的列閥門110可以由控制通道118控制，所述控制通道118可以在單一入口114處被全部激勵(lì)。
類似地，行閥門108調(diào)節(jié)水平方向中的溶液流量；這些由控制通道116所控制，所述控制通道116由單一控制入口112所激勵(lì)。如圖1A所顯示，調(diào)節(jié)行閥門108的控制通道116取決于位置在寬度上變化。在控制通道116交叉垂直流動(dòng)通道102時(shí)，控制通道116是足夠窄的，以使在它被激勵(lì)時(shí)它不會(huì)偏轉(zhuǎn)入垂直流動(dòng)通道102，從而基本上減少貫穿其中的溶液流量。然而，控制通道116的寬度在它重疊水平流動(dòng)通道104時(shí)被增加；這使控制通道的膈膜足夠大以阻塞穿過水平流動(dòng)通道104的溶液流動(dòng)。
在操作中，試劑R1-R7被引入它們各自的水平流動(dòng)通道104和樣本S1-S7被噴射入它們各自的垂直流動(dòng)通道102。在各個(gè)水平流動(dòng)通道104中的試劑因此與在各個(gè)垂直流動(dòng)通道102樣本在交叉106處混合，所述交叉106在具體設(shè)備中為井或腔的形狀。因此，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的具體情況中，例如，擴(kuò)增反應(yīng)必需的試劑被導(dǎo)入各個(gè)水平流動(dòng)通道104。不同核酸模板被導(dǎo)入垂直流動(dòng)通道102。在某些分析中，被導(dǎo)入作為試劑混合物部分的引物(primer)可能在流動(dòng)通道之間不同，所述試劑混合物被導(dǎo)入各個(gè)水平流動(dòng)通道104中。這使將起反應(yīng)的各個(gè)核酸模板具有大量不同引物。
圖1B-E顯示圖1A中所述設(shè)備中的鄰近反應(yīng)點(diǎn)的放大平面圖，以更具體地說明設(shè)備如何在分析中操作。用于簡明目的，沒有顯示反應(yīng)孔形式的交叉106，以及控制通道116、118被省略，僅僅行及列閥門110、108被顯示(矩形盒子)。如圖1B中所示，通過閉合列閥門110和打開行閥門108開始分析，以允許溶液流過水平流動(dòng)通道104，同時(shí)阻塞流過垂直流動(dòng)通道102。試劑R1然后被導(dǎo)入水平流動(dòng)通道104進(jìn)而完全流過水平流動(dòng)通道104的長度，以使所有反應(yīng)點(diǎn)106被填充。通過外部泵可以得到穿過水平流動(dòng)通道104的溶液流，但是更典型地通過將蠕動(dòng)泵結(jié)合進(jìn)彈性材料設(shè)備自身而得到。如在例如Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO01/01025中中詳細(xì)所述的。
一旦R1被導(dǎo)入，則關(guān)閉行閥門108及打開列閥門2(見圖1C)。這使樣本S1和S2被導(dǎo)入垂直流動(dòng)通道102以及流過其各自流動(dòng)通道。當(dāng)樣本流過垂直流動(dòng)通道102時(shí)，它們從反應(yīng)點(diǎn)106排出R1，從而在反應(yīng)點(diǎn)106剩下樣本。然后，如圖1D中所示，打開行閥門108允許S1和S2散布且與R1混合。因此，在各個(gè)交叉點(diǎn)或反應(yīng)點(diǎn)106區(qū)域中獲得樣本和試劑(R1S1和R1S2)的混合物。在使S1和S2與R1散布持續(xù)足夠時(shí)間之后，所有行及列閥門108、110被閉合以將S1和S2隔離在其各自反應(yīng)點(diǎn)106之內(nèi)且阻止S1和S2的相互混合(參見圖1E)。然后允許混合物起反應(yīng)，并且通過監(jiān)測交叉部106或包含交叉部106的交叉形狀區(qū)域檢測反應(yīng)。用于需要加熱的分析(例如，在擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)中)，設(shè)備被放置在加熱器上，并且在加熱同時(shí)樣本保持被隔離。
圖1A中所示設(shè)備的修改版本顯示在圖1F中。通常結(jié)構(gòu)具有與圖1A中所述的許多類似之處，以及兩圖中的共同部分共用相同參考標(biāo)記。圖1F中所示的設(shè)備150不同之處在于水平流動(dòng)通道104對(duì)被連接到公共入口124。這實(shí)質(zhì)上使用進(jìn)入入口124的唯一單一注射口，使雙套試劑被導(dǎo)入兩相鄰流動(dòng)通道。公共入口的使用相對(duì)于垂直流動(dòng)通道102進(jìn)一步被擴(kuò)展。在這個(gè)具體例子中，使用進(jìn)入樣本入口120的單一注射口，各個(gè)樣本被導(dǎo)入五個(gè)垂直流動(dòng)通道102。因此，使用這個(gè)具體設(shè)備，實(shí)質(zhì)上有用于樣本和試劑的各個(gè)具體組合的十個(gè)重復(fù)反應(yīng)。當(dāng)然，重復(fù)反應(yīng)的數(shù)量可以理想地通過改變連接到公共入口120、124的垂直和/或水平流動(dòng)通道102、104的數(shù)量而被改變。
圖1F所示的設(shè)備還包括調(diào)節(jié)控制通道130的分離控制通道入口128和調(diào)節(jié)控制通道134的另一控制通道入口132，所述控制通道130可被用于支配流向出口132的溶液流，所述控制通道134調(diào)節(jié)至出口136的溶液流。另外地，設(shè)備150結(jié)合保護(hù)通道138。在具體設(shè)計(jì)中，保護(hù)通道138被形成為控制通道116的部分。如前所述，保護(hù)通道138小于行閥門108；因此，保護(hù)通道138的隔膜沒有被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)進(jìn)入下面的水平流動(dòng)通道104中，以使溶液流被中斷。
最后，圖1F中所示設(shè)計(jì)不同之處在于在水平和垂直流線交叉處的孔中沒有發(fā)生反應(yīng)，而是在交叉自身中。
V.盲道設(shè)計(jì)A.概述利用盲道設(shè)計(jì)的設(shè)備具有具體特點(diǎn)。首先，設(shè)備包括一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通道，一個(gè)或多個(gè)盲道從所述一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通道分支出來。如上所述，這種通道的末端區(qū)域可用作反應(yīng)點(diǎn)。由重疊流動(dòng)通道形成的閥門可被激勵(lì)以隔離盲道末端處的反應(yīng)點(diǎn)。閥門提供用于可轉(zhuǎn)換地隔離反應(yīng)點(diǎn)的機(jī)構(gòu)。
第二，與盲道相連通的流動(dòng)通道網(wǎng)絡(luò)被配置，以使反應(yīng)點(diǎn)的所有或大多數(shù)可以使用單個(gè)或有限數(shù)量入口(例如，小于5個(gè)或小于10個(gè))來填充。填充盲流動(dòng)通道的能力是可能實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)樗鲈O(shè)備由彈性材料制造。彈性材料是足夠多孔的，以使當(dāng)溶液被導(dǎo)入通道時(shí)流動(dòng)通道和盲道內(nèi)的空氣可以通過這些孔逃逸。在其他微流體設(shè)備中利用的材料的孔隙缺乏排除了盲道的使用，因?yàn)樵谌菀脖蛔⑷霑r(shí)如果在沿流體路徑某處沒有提供通孔則盲道中的空氣不再溢出。
第三特點(diǎn)在于，在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)制造期間，一個(gè)或多個(gè)試劑被非共價(jià)地沉積在彈性體的地層上(見下文的關(guān)于制造工藝的另外細(xì)節(jié))。試劑被非共價(jià)地粘附，因?yàn)樵噭┍辉O(shè)計(jì)以在樣本被導(dǎo)入反應(yīng)點(diǎn)時(shí)被溶解。為了使分析數(shù)量最大化，不同試劑或成套試劑被沉積在各個(gè)不同反應(yīng)點(diǎn)處。
設(shè)計(jì)具體盲道設(shè)備，以使反應(yīng)點(diǎn)以陣列形式被布置。
因此，在被設(shè)計(jì)用于實(shí)施核算擴(kuò)增反應(yīng)的那些盲道設(shè)備中，例如，實(shí)施擴(kuò)展反應(yīng)所需要的一個(gè)或多個(gè)試劑在該設(shè)備被制造期間被沉積在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)處。這種試劑包括例如下面的一些或全部引物、聚合酶、核苷、輔助因子、金屬離子、緩沖劑、添加的染料等。為了使高吞吐量最大化，被選擇擴(kuò)增DNA中不同區(qū)域的不同引物被沉積在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。因此，當(dāng)核酸模板經(jīng)由入口被導(dǎo)入反應(yīng)點(diǎn)時(shí)，大量擴(kuò)展反應(yīng)可以在模板的不同區(qū)段處被執(zhí)行。通過將設(shè)備放置在熱循環(huán)板上和在各種所要求溫度之間循環(huán)設(shè)備，可以完成必須用于擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)。
可以以各種方法穩(wěn)定試劑。例如在一些例子中，一種或多種試劑被非共價(jià)地沉積在反應(yīng)點(diǎn)，而在另外例子中，一個(gè)或多個(gè)試劑被共價(jià)地在反應(yīng)點(diǎn)粘附到基底。如果被共價(jià)粘接，試劑可被經(jīng)由鏈接物(linker)鏈接至基底。各種鏈接物型號(hào)可以被利用，例如光化學(xué)/對(duì)光不安定的鏈接物、對(duì)熱不安定連接物以及可由酶化作用裂開的鏈接物。某些鏈接物是雙功能的(也就是，鏈接物包含在各端的功能基團(tuán)，其與被定位在鏈接物將被附著的元素上基團(tuán)是有反應(yīng)的)；在各端的功能基團(tuán)可以是相同的或不同的。在某些測定中可以被使用的合適鏈接物的例子包括直鏈或支鏈碳鏈接物、雜環(huán)鏈接物和肽鏈接物。各種型號(hào)鏈接物是可以從Rockford，Illinois(伊利諾斯州羅克福德)的Pierce Chemical Company得到，并且被描述在EPA188256；US專利No.4671958、4659839、4414148、4669784、4680338、4569789和4589071，并且由Eggenweiler，H.M，Pharmaceutical AgentDiscovery Today 1998，3，552所描述。NVOC(6硝基藜蘆氧基碳酰基)鏈接物和其它NOVC相關(guān)鏈接物是合適的光化學(xué)鏈接物的例子(見，例如WO90/15070和WO92/10092)。例如在US5382513中討論了具有蛋白酶劈裂點(diǎn)的肽。
圖2是一種利用盲道設(shè)計(jì)的示例設(shè)備的簡化平面圖。設(shè)備200包括形成在彈性材料基底202中的流動(dòng)通道204和從那里分支的一套分支流動(dòng)通道206。各個(gè)分支流動(dòng)通道206終止于反應(yīng)點(diǎn)208，從而形成反應(yīng)點(diǎn)陣列。重疊分支流動(dòng)通道206的是控制通道210，其由隔膜212與分支流動(dòng)通道206相分離。對(duì)控制通道210的激勵(lì)使隔膜212偏轉(zhuǎn)入分支流動(dòng)通道206(也就是起到閥門的作用)，從而使各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)208與其余反應(yīng)點(diǎn)相分離。
這種設(shè)備的操作包括將測試樣本注入流動(dòng)通道204，然后溶液流入各個(gè)分支通道206。一旦樣本填充各個(gè)分支通道206，則激勵(lì)控制通道210引起閥門/隔膜212啟動(dòng)以偏轉(zhuǎn)入分之同道206，從而封閉各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)208。當(dāng)樣本流入和保持在反應(yīng)點(diǎn)208時(shí)，它溶解預(yù)先被點(diǎn)樣在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)208的試劑。一旦被溶解，則試劑可與樣本起反應(yīng)。閥門212通過擴(kuò)散防止在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)208溶解的試劑互相混合。在樣本和試劑之間反應(yīng)然后被檢測到，典型地在反應(yīng)點(diǎn)208內(nèi)。反應(yīng)可以優(yōu)選被加熱，如在下文的溫度控制部中所述的。
圖3A顯示某種程度更復(fù)雜盲流通通道設(shè)計(jì)的例子。在這個(gè)具體設(shè)計(jì)300中，各個(gè)水平流動(dòng)通道304套在其末端被連接直兩個(gè)垂直流動(dòng)通道302。多個(gè)分支流動(dòng)通道306從各個(gè)水平流動(dòng)通道304伸展出去。在這個(gè)具體設(shè)計(jì)的分支流動(dòng)通道304是隔行交替的，以使附連到任意給定水平流動(dòng)通道304的分支流動(dòng)通道306被定位在被直接連接到相鄰水平流動(dòng)通道304的兩個(gè)分支通道306之間，或者被定位在直接連接到相鄰流動(dòng)通道304的分支流動(dòng)通道306和一個(gè)垂直流動(dòng)通道302之間。當(dāng)使用圖3A所述的設(shè)計(jì)時(shí)，各個(gè)分支流動(dòng)通道306終止于反應(yīng)點(diǎn)308。還與圖3A中所示設(shè)計(jì)相一致，控制通道310重疊各個(gè)分支通道且與下面分支通道由隔膜312相隔離。在端口316處啟動(dòng)控制通道。垂直和水平流動(dòng)通道302、304相交叉，以使樣本對(duì)入口314的諸如允許溶液流過水平和垂直流動(dòng)通道網(wǎng)絡(luò)，并且最終經(jīng)由分支流動(dòng)通道306進(jìn)入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)308。
因此，在操作中，樣本被注入入口以將溶液導(dǎo)入各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。一旦反應(yīng)點(diǎn)被填充，則通過在端口擠壓控制通道啟動(dòng)閥門/隔膜以將溶液俘獲在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)。預(yù)先沉積在反應(yīng)點(diǎn)的試劑被重新懸浮在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)，從而允許在沉積試劑和樣本之間的反應(yīng)在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)。反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的反應(yīng)由檢測器來監(jiān)控。再者，反應(yīng)可優(yōu)選地可控制加熱的，根據(jù)在下面溫度控制部中所闡述的方法。
在圖3A中顯示的通常設(shè)計(jì)的更復(fù)雜的復(fù)制品被顯示在圖3B中。圖3B中所示設(shè)備是一種圖3A中所示的水平和分支流動(dòng)通道302的單元組織被重復(fù)多次的設(shè)備。圖3B中所示設(shè)備進(jìn)一步顯示了保護(hù)通道320在將被使用在涉及加熱(例如，熱循環(huán))的應(yīng)用中的這些設(shè)備的包含。保護(hù)通道320相對(duì)于流動(dòng)通道304和分支通道306的示例定位以在圖3B右平面中所述的擴(kuò)增視圖被顯示。保護(hù)通道320重疊分支流動(dòng)通道306和反應(yīng)點(diǎn)308。如上所述，在對(duì)設(shè)備300的加熱期間水流過保護(hù)通道320，以增加設(shè)備中水的局部濃度，從而減少從流動(dòng)通道306和反應(yīng)點(diǎn)308中的溶液中水的蒸發(fā)。
在這部分開始論述的盲通道設(shè)備的特征使設(shè)備的痕跡最小化，以及使大量反應(yīng)點(diǎn)將被形成在設(shè)備上以及用于將被獲得高密度。例如具有2500個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的這種類型的設(shè)備可被容易地制造以裝配在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡玻片上(25mm×75mm)前述特征還能夠使用利用盲道設(shè)計(jì)的設(shè)備獲得反應(yīng)點(diǎn)中的非常高的密度。例如，可以輕易地獲得至少50、60、70、80、90或100個(gè)反應(yīng)點(diǎn)/cm2的密度或在其間的任意整數(shù)密度值。然后，具體設(shè)備具有更高密度范圍，例如在100至4000個(gè)反應(yīng)點(diǎn)/cm2，或在其間的任意整數(shù)密度值。例如，一些設(shè)備具有100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)反應(yīng)點(diǎn)/cm2的密度。也可以獲得具有至少2000、3000或4000個(gè)反應(yīng)點(diǎn)/cm2的非常高密度的設(shè)備。這種高密度直接轉(zhuǎn)變?yōu)樵O(shè)備上的非常多的反應(yīng)點(diǎn)。利用盲道結(jié)構(gòu)的設(shè)備典型地具有至少10-100反應(yīng)點(diǎn)，或者在其間的任意整數(shù)點(diǎn)。更具體地，設(shè)備具有至少100-1000反應(yīng)點(diǎn)，或者在其間的任意整數(shù)點(diǎn)。較高密度設(shè)備可以具有更多反應(yīng)點(diǎn)，例如至少1000-10000反應(yīng)點(diǎn)，或者在其間的任意整數(shù)點(diǎn)。因此，取決于設(shè)備的整個(gè)尺寸，具體設(shè)備具有至少100；500；1000；2000；3000；4000；5000；6000；7000；8000；9000；10000；20000；30000；40000；50000或100000反應(yīng)點(diǎn)。
大量反應(yīng)點(diǎn)和可以得到的密度還是制造非常小的井(well)或腔的能力的結(jié)果。例如，腔或井典型地具有小于50nL的容積；在另外例子中，小于40nL、30nL、20nL或10nL；以及在又一例子中，小于5nL或1nL。作為具體例子，具體設(shè)備具有300微米長、300微米寬和10微米深的井。
在這里提供的盲道設(shè)備可以利用具體設(shè)計(jì)特征和在PCT申請(qǐng)PCT/US01/44549(公告為WO02/43615)和PCT/US02/10875(公告為WO02/082047)中所述的方法論，包括例如用于填充死端通道、液體起動(dòng)(priming)、壓縮除氣起動(dòng)的手段，以及用于在微流體通道的填充期間置換氣體的各種手段。這兩個(gè)PCT公開在此通過標(biāo)準(zhǔn)以其全文被結(jié)合用于所有目的。
VI.混合設(shè)計(jì)又一設(shè)備使矩陣和盲填充設(shè)計(jì)的混合體。這種類型設(shè)備的設(shè)計(jì)類似于圖3A中所示的盲道設(shè)備，除了各個(gè)水平流動(dòng)通道被連接到其自身樣本入口和水平流動(dòng)通道經(jīng)由垂直流動(dòng)通道沒有相互連接之外。因此，導(dǎo)入任意給定水平流動(dòng)通道的樣本僅僅填充水平流動(dòng)通道和附連到那里的反應(yīng)點(diǎn)。然而，在圖3A所示的盲流動(dòng)通道中，樣本可經(jīng)由垂直流動(dòng)通道302在水平流動(dòng)通道304之間流動(dòng)。
這種通常設(shè)備的設(shè)備例子被顯示在圖4中。設(shè)備400包括多個(gè)水平流動(dòng)通道404，各個(gè)水平流動(dòng)通道具有從它或自身樣本入口414伸展的多個(gè)分支流動(dòng)通道406。控制通道410重疊各個(gè)分支流動(dòng)通道406，并且膈膜(閥門)412將控制通道410與下面分支流動(dòng)通道406分離。當(dāng)使用盲流動(dòng)通道設(shè)計(jì)時(shí)，在入口416對(duì)控制通道的起動(dòng)引起使膈膜412偏轉(zhuǎn)向分支流動(dòng)通道406，以及隔離反應(yīng)點(diǎn)408。在這種設(shè)計(jì)的變化中，各個(gè)水平流動(dòng)通道404可包括在各端的入口414，從而允許從兩端導(dǎo)入樣本。
在一些例子中，試劑在設(shè)備制造期間被沉積在反應(yīng)點(diǎn)。在相當(dāng)多的反應(yīng)狀況下，這使大量樣本以短時(shí)間被測試，無需如矩陣設(shè)備所要求的試劑額外的時(shí)間消耗。可替換地，在注射在芯片之前可以制備反應(yīng)混合物。一旦注入混合物，它們可以被分析或進(jìn)一步處理(例如，被加熱)。
通過將不同樣本注入各個(gè)水平流動(dòng)通道，大量樣本可以被快速分析。假定試劑已經(jīng)被預(yù)先沉積在反應(yīng)點(diǎn)。與任意給定水平流動(dòng)通道相關(guān)聯(lián)的在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)處相同試劑存在提供了容易的方法，以使用各個(gè)通道實(shí)施大量重復(fù)反應(yīng)。如果替換，則在反應(yīng)點(diǎn)處的試劑不同于任意給定的流動(dòng)通道，然后各個(gè)樣本實(shí)質(zhì)上同時(shí)接受各種不同反應(yīng)條件。
因此，這里提供的設(shè)備被調(diào)整用于各種不同類型的研究。如果研究包括在用戶控制條件下相當(dāng)多的不同樣本的篩選(例如，100樣本對(duì)100種用戶選擇試劑)，則矩陣設(shè)備提供有用的溶液。然而如果研究包括對(duì)一種或有限數(shù)量樣本在大量反應(yīng)條件下的分析(例如，一個(gè)樣本對(duì)10000個(gè)反應(yīng)條件)，則盲道設(shè)計(jì)是有用的。最后，如果人們針對(duì)限定反應(yīng)條件想檢驗(yàn)相當(dāng)多數(shù)量樣本，不必注入試劑(例如，100樣本對(duì)100種預(yù)先限定的試劑)，則混合設(shè)備是有用的。
VII.溫度控制A.設(shè)備和部件大量不同選擇的變化復(fù)雜度(sophistication)是可以利用的，用于控制微流體設(shè)備或整個(gè)設(shè)備中選擇區(qū)域內(nèi)的溫度。因此，如這里所使用的，術(shù)語溫度控制器被廣泛地意味著指代可以調(diào)節(jié)整個(gè)微流體設(shè)備或微流體設(shè)備部分內(nèi)的溫度的設(shè)備或部件(例如，在具體溫度區(qū)域內(nèi)或在盲道型微流體設(shè)備矩陣中的一個(gè)或多個(gè)連接點(diǎn)處)。
通常地，將該設(shè)備放置在熱循環(huán)板上以熱循環(huán)該設(shè)備。大量這種板是容易通過商業(yè)渠道可以得到的，包括例如ThermoHybaid Px2(Franklin，MA)，MJ Research PTC-200(South San Francisco，CA)，Eppendorf Part#E5331(Westbury，NY)，Techne Part#205330(Princeton，NJ)。
陣列設(shè)備與熱控制設(shè)備相接觸，以致于熱控制設(shè)備與熱控制源相連通，以使至少一個(gè)反應(yīng)腔中的反應(yīng)溫度隋若控制源溫度的改變而改變。
在不同實(shí)施例中，熱傳遞設(shè)備可以包括例如硅的半導(dǎo)體，可以包括反射材料和/或可以包括金屬。
熱控制設(shè)備可以適于將作用力施加給熱傳遞設(shè)備以將熱傳遞設(shè)備推向熱控制源。作用力在不同實(shí)施例中可以包括磁的、靜電的或真空作用力。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，作用力包括通過通道施加向熱傳遞設(shè)備的真空作用力，所述通道形成在熱控制設(shè)備或熱傳遞設(shè)備的表面。在熱控制設(shè)備的表面和熱傳遞設(shè)備的表面之間得到的真空度可以被檢測到。這種檢測可以使用真空度檢測器被執(zhí)行，所述真空度檢測器被定位在沿通道的位置或遠(yuǎn)離真空源位置的通道處。在真空沒有超過預(yù)先設(shè)定值時(shí)，可以顯示警報(bào)或可以符合重新排列協(xié)議。
陣列設(shè)備可以與熱控制設(shè)備相接觸，通過一個(gè)或多個(gè)機(jī)械或電機(jī)械定位設(shè)備的使用。該方法的執(zhí)行可以是自動(dòng)控制的和監(jiān)控的。例如，這種自動(dòng)控制和監(jiān)控可以使用自動(dòng)控制系統(tǒng)來執(zhí)行，所述自動(dòng)控制系統(tǒng)可操作的與機(jī)器人控制系統(tǒng)相通訊，用于引入熱控制設(shè)備或從熱控制設(shè)備去除陣列設(shè)備。還可以監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)程。
可以提供包括熱控制設(shè)備的單元。可以提供包括陣列設(shè)備和熱控制設(shè)備的系統(tǒng)。
為了確保熱循環(huán)步驟的精確度，在具體設(shè)備中，有用的是將檢測溫度的傳感器結(jié)合在設(shè)備的各個(gè)區(qū)域處。用于檢測溫度的一種結(jié)構(gòu)是熱電偶。這種熱點(diǎn)偶可能如圖案化在下面基底材料上的薄膜導(dǎo)線或者如直接結(jié)合進(jìn)微制造彈性材料自身的導(dǎo)線一樣被制造。
還可以通過電阻變化來檢測溫度。例如，熱電阻器中的電阻變化可以被校準(zhǔn)為給定的溫度變化，利用常規(guī)技術(shù)可將所述熱電阻器制造在下面半導(dǎo)體基底上。可替換地，熱電阻器可能被直接插入微制造彈性材料。通過電阻檢測溫度的另一方案被描述在Wu等“MEMS Flow Sensors forNano-fluidic Applications”，Sensors and Actuators A89 152-158(2001)，該文因此通過引用以其全文被結(jié)合。這篇論文描述了摻雜多晶硅結(jié)構(gòu)對(duì)控制和檢測溫度的用途。用于多晶硅和其它半導(dǎo)體材料，電阻的溫度系數(shù)可以通過特性和雜質(zhì)數(shù)量精確控制，從而優(yōu)化用于給定應(yīng)用的傳感器的性能。
熱色(thermochromatic)材料是可用于檢測擴(kuò)增設(shè)備中區(qū)域上溫度的另一類型結(jié)構(gòu)。尤其是，具體材料當(dāng)其經(jīng)過不同溫度時(shí)動(dòng)態(tài)地和可再生地改變顏色。這種材料在其經(jīng)過不同溫度時(shí)可能被添加至溶液。熱色材料可以被形成在下面基底上或被結(jié)合在彈性材料內(nèi)。可替換地，熱色材料可以顆粒形式被添加至樣本溶液。
檢測溫度的另一方法是通過紅外照相機(jī)的使用。與顯微鏡連接的紅外照相機(jī)可被用于確定整個(gè)擴(kuò)增結(jié)構(gòu)的溫度曲線。彈性體材料對(duì)射線的滲透將會(huì)有助于這樣分析。
檢測溫度的另一方法是通過熱電物質(zhì)的使用。尤其是，某些水晶材料，具體地這些材料還展示壓電行為，展示壓電效應(yīng)。這種效應(yīng)描述了材料晶體點(diǎn)陣的極化以及材料兩端電壓高度依賴于溫度的現(xiàn)象。這種材料可被結(jié)合在基底或彈性體上，以及被用于檢測溫度。
其它電現(xiàn)象，例如電容和電感，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例可被展示以檢測溫度。
B.精確熱循環(huán)的校驗(yàn)如在下文制造部分詳細(xì)所描述的，盲道設(shè)備具有基底層，試劑被放置在所述基底層上。包括包含流動(dòng)通道和控制通道的兩層的結(jié)構(gòu)被重疊在基底層上，以使流動(dòng)通道與沉積試劑相對(duì)齊。然后將基底層的外側(cè)放置在基底(例如玻璃)上。通常，反應(yīng)在其上發(fā)生的反應(yīng)點(diǎn)為在基底/玻璃界面上面的大約100-150微米。使用已知熱擴(kuò)散率方程及設(shè)備中所使用的彈性體和玻璃的近似值，人們可計(jì)算在反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)溫度到達(dá)控制器試圖保持的溫度所要求的時(shí)間。在表1中示出的計(jì)算出的數(shù)值說明可以快速達(dá)到溫度，即使使用比反應(yīng)點(diǎn)為近似100-150微米的設(shè)備中所使用的厚許多的彈性體和玻璃(也就是，用于這里所述設(shè)備的典型距離)。
表1計(jì)算出的在指示時(shí)間處通過PDMS和玻璃層的熱擴(kuò)散長度。
圖5顯示使用盲道設(shè)備到達(dá)理想溫度的速度。
在另一實(shí)施例中，通過使用具有已知溶解溫度(tm)的雙旋低聚核苷酸聚合物可以測量溫度，其中可將其內(nèi)部對(duì)照指示低聚核苷酸是否是雜交的或變性的內(nèi)部對(duì)照染色劑(例如SYBR Green(TM)或溴化乙錠)用于確定各個(gè)腔體在陣列上是恒定的范圍，其中通過將包含帶有染色劑的低聚核苷酸的溶液導(dǎo)入微流體設(shè)備的腔體，所述微流體設(shè)備的腔體具有反應(yīng)腔陣列。在這個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)溫度升高到溶解溫度之上時(shí)，內(nèi)部對(duì)照染色劑將其對(duì)低聚核苷酸的關(guān)系變性(denataturation應(yīng)為denaturation)改變?yōu)閱尉€低聚核苷酸。可替換地，如果溫度高于tm或被降低，則染料進(jìn)入現(xiàn)有淬光低聚核苷酸的內(nèi)部對(duì)照可以被監(jiān)測。實(shí)質(zhì)上染料的使用提供用于“低聚核苷酸溫度計(jì)”，所述“低聚核苷酸溫度計(jì)”相應(yīng)于相對(duì)低聚核苷酸的溶解溫度的溫度改變而改變特性，例如熒光性。通過設(shè)計(jì)或使用選擇的溶解溫度的低聚核苷酸，以類似方式可以確定反應(yīng)腔陣列改變溫度的范圍。
VIII.檢測A.概述這里提供的微流體設(shè)備可以利用大量不同監(jiān)測手段。對(duì)合適系統(tǒng)的選擇部分上是關(guān)于被選擇的事件和/或試劑的類型的信息。可以設(shè)計(jì)檢測器以檢測大量不同信號(hào)類型，包括但不限于來自放射性同位元素、熒光基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、電子密顆粒、磁顆粒、自旋標(biāo)示、發(fā)射化學(xué)螢光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔助因數(shù)、連接到核酸探針和酶基底的酶的信號(hào)。
適于本發(fā)明微流體設(shè)備使用的圖示的檢測技術(shù)包括但不限于光散射、多通道熒光檢測、UV和可見波長吸收、冷光、不同反射率和共焦激光掃描。在具體應(yīng)用中可以使用的另外檢測方法包括閃爍接近測定技術(shù)、輻射化學(xué)檢測、熒光極化、熒光關(guān)聯(lián)能譜法(FCS)、時(shí)間分辨能量轉(zhuǎn)移(TRET)、熒光諧振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和例如生物熒光諧振能量轉(zhuǎn)移(BRET)的變型。另外的檢測選擇包括電阻、電阻率、阻抗和電壓檢測。
檢測發(fā)生在“檢測部分”或“檢測區(qū)域”。這些術(shù)語和其它相關(guān)術(shù)語指代發(fā)生檢測的微流體設(shè)備部分。如上所指示，使用利用盲道設(shè)計(jì)的設(shè)備，檢測部分通常是如由與各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)閥門所隔離的反應(yīng)點(diǎn)。用于基于矩陣的設(shè)備的檢測部分通常在鄰近交叉點(diǎn)的流動(dòng)通道的區(qū)域、交叉點(diǎn)自身或包圍交叉點(diǎn)的區(qū)域和圍繞區(qū)域內(nèi)。
檢測部分可以與一個(gè)或多個(gè)顯微鏡、光激勵(lì)設(shè)備(例如激光器)、光倍增管、處理器及前述的組合相連接，它們合作檢測與具體事件和/或試劑相關(guān)聯(lián)的信號(hào)。被檢測的信號(hào)經(jīng)常是光信號(hào)，其在檢測部分由光檢測器檢測。光檢測器可包括一個(gè)或多個(gè)光二極管(例如雪崩二極管)、光纖光導(dǎo)導(dǎo)管，例如光倍增管、顯微鏡和/或攝像機(jī)(例如CCD照相機(jī))。
可將檢測器微制造在微流體設(shè)備內(nèi)，或者可以是分離部件。如果檢測器作為分離部件存在且微流體設(shè)備包括多個(gè)檢測部分，則可在單個(gè)檢測部分內(nèi)在任意給定時(shí)刻發(fā)生檢測。可替換地，可以使用掃描系統(tǒng)。例如，具體自動(dòng)系統(tǒng)相對(duì)于微流體設(shè)備掃描光源；其它系統(tǒng)掃描在檢測上發(fā)射的光，或者包括多通道檢測器。作為具體說明的例子，微流體設(shè)備可被附連到可轉(zhuǎn)移平臺(tái)上或在顯微鏡目鏡下被掃描。所要求的信號(hào)然后被傳遞給處理器，用于信號(hào)解釋和處理。還可以利用光倍增管陣列。另外，可以利用具有從所有不同檢測部分同時(shí)收集信號(hào)且同時(shí)根據(jù)各個(gè)部分確定信號(hào)能力的光學(xué)系統(tǒng)。
外部檢測器是有用的，因?yàn)樘峁┑脑O(shè)備完全或大范圍上由在被檢測波長處是光透明的材料制造。這個(gè)特點(diǎn)使這里所述設(shè)備使用大量光檢測系統(tǒng)，常規(guī)基于硅的微流體設(shè)備使用所述光檢測系統(tǒng)是不可能的。
具體優(yōu)選檢測器使用CCD照相機(jī)和提供用于大視場和高數(shù)值孔徑的光路，以使從各個(gè)反應(yīng)腔收集的光數(shù)量最大化。關(guān)于這一點(diǎn)，CCD被用作光檢測器陣列，其中各個(gè)象素或象素組對(duì)應(yīng)于反應(yīng)腔而不是被用于產(chǎn)生陣列圖像。因此，光學(xué)器件可以被改變以使圖像品質(zhì)被降低，或被重新聚焦以增加光學(xué)系統(tǒng)景深以從各個(gè)反應(yīng)腔收集更多光線。在優(yōu)選實(shí)施例中，有用的是采用高縱橫比或柱狀腔體，以集中將被檢測器沿光學(xué)系統(tǒng)的光軸質(zhì)詢的樣本，以及優(yōu)選地通過對(duì)圖像重新聚焦以增加景深。低NA透鏡系統(tǒng)的使用，優(yōu)選使用雙側(cè)向?qū)ΨQ(symetrical)透鏡系統(tǒng)。同樣有用的是使用檢測器設(shè)備，例如一個(gè)或更多CCD設(shè)備，其具有將被成像的彈性塊面積的尺寸或大于將被成像的彈性塊面積。在低NA光學(xué)器件中相連的使用中，可以實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的檢測靈敏度。
檢測器可包括用于激發(fā)指示器的光源，所述指示器產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。所使用的光源類型部分取決于被激發(fā)的指示器的類型。合適的光源包括，但不限于激光器、激光二極管和高密度燈。如果使用激光器，可以使用激光器掃描一套檢測部分或單個(gè)檢測部分。激光二極管可被制造在微流體設(shè)備自身上。可替換地，激光二極管可被制造在鄰近被使用的微流體設(shè)備而放置的另一設(shè)備中，以實(shí)施熱循環(huán)反應(yīng)，以致于來自二極管的激光被指向進(jìn)入檢測部分。
檢測部分可另外包括大量非光學(xué)方法。例如，檢測器還可包括，例如溫度傳感器、導(dǎo)電傳感器、電勢(shì)測定傳感器(例如pH電極)和/或電流測定傳感器(例如，監(jiān)測氧化和減少反應(yīng))。
大量在市場上可以買到的外部傳感器可以被使用。其中許多為熒光檢測器，因?yàn)槿菀字苽錈晒鈽?biāo)示試劑。可以得到的檢測器的具體例子包括但不限于Applied Precision ArrayWoRx(Applied Precision Issaquah，WA)。
B.對(duì)擴(kuò)增的核酸的檢測1.嵌入染料(intercalation dye)在粘合至雙旋DNA上僅僅發(fā)熒光的具體嵌入染料可被用于檢測雙旋擴(kuò)增DNA。適合染料的例子包括但不限于SYBRTM和Picro Green(從OR，Eugene的Molecure Probe有限公司)、溴化乙錠、亞丙基、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-1、Yoy-1和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚氫氯化物)(4′，6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride)。涉及嵌入染料使用的另外論述由Zhu等于Anal.Chem.661941-1948(1994)提供其通過引用起全文被結(jié)合。
2.基于FRET的檢測方法這種類型的檢測方法包括在施主/受主熒光團(tuán)對(duì)中檢測來自施主(指示劑)和/或受主(猝光劑)熒光團(tuán)的熒光變化。選擇施主/受主熒光團(tuán)對(duì)以使施主的發(fā)射譜重疊受主的激發(fā)譜。因此，當(dāng)熒光團(tuán)對(duì)充分進(jìn)入互相靠近時(shí)，可發(fā)生從施主至受主的能量轉(zhuǎn)移。這種能量轉(zhuǎn)移可以被檢測到。
FRET和模板擴(kuò)展反應(yīng)。這些方法通常利用使用施主/受主對(duì)中一個(gè)元素標(biāo)示的引物(primer)和使用施主/受主對(duì)中另一個(gè)元素標(biāo)示的核苷酸。在模板依賴擴(kuò)展反應(yīng)期間在將標(biāo)示的核苷酸進(jìn)合金引物之前，施主和受主被間隔開足夠遠(yuǎn)以使不能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。然而，如果標(biāo)示的核苷酸被結(jié)合進(jìn)引物以及空間足夠低靠近，則能量轉(zhuǎn)移發(fā)生且能被檢測到。這些方法對(duì)單核苷酸多態(tài)性的檢測中實(shí)施單基底對(duì)擴(kuò)展反應(yīng)尤其是有用(見下文)，以及被描述在US專利No.5945283核PCT公開WO97/22719。
定量PT-PCR。各種所謂“實(shí)時(shí)擴(kuò)增”方法或“實(shí)時(shí)定量PCR”方法還可被用于檢測存在于樣本中的目標(biāo)核酸數(shù)量，通過在擴(kuò)增過程自身期間或之后測量擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。熒光團(tuán)(fluorogenic)核酸酶測定是實(shí)時(shí)定量方法的一個(gè)具體例子，所述方法可被連續(xù)使用這里所述的設(shè)備。監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物形成的這種方法包括使用雙標(biāo)示熒光團(tuán)低聚核苷酸探針對(duì)PCR產(chǎn)物累積的持續(xù)測量——經(jīng)常在文獻(xiàn)中被稱為“TaqMan”方法的途徑。
在這種測定中使用的探針典型地是短(ca.20-25基數(shù))多聚核苷酸(polynucleotide)，其使用兩個(gè)不同熒光團(tuán)染料被標(biāo)示。探針的5′終端典型地被附連到指示器染料，以及3′終端被附連到淬光染料(quenching dye)，盡管染料也可被附連到探針的其它位置。設(shè)計(jì)探針，以至少具有與在目標(biāo)核酸上探針結(jié)合點(diǎn)的真正序列互補(bǔ)。在反應(yīng)混合物中還包括上游核下游的PCR引物，所述PCR引物備年接到與探針結(jié)合點(diǎn)成側(cè)面的區(qū)域。
在未觸動(dòng)探針時(shí)，在兩個(gè)熒光體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，以及猝光劑(quencher)對(duì)來自指示器的發(fā)射猝光。在PCR的擴(kuò)展階段期間，通過例如Taq核酸酶的核酸聚合酶的5′核酸酶活性穿過探針，從而從多聚核苷酸猝光劑中釋放指示劑，從而導(dǎo)致可由合適檢測器測量的指示劑發(fā)射濃度的增加。
專門適用于測量如在熒光測定中產(chǎn)生的熒光團(tuán)發(fā)射例的一種檢測器是ABI 7700，其由Foster City，CA的Applied Biosystems有限公司制造。該儀器所使用的計(jì)算機(jī)軟件能夠記錄指示劑的熒光基團(tuán)濃度，并在擴(kuò)增過程中淬光。然后，這些被記錄的數(shù)值可被用于計(jì)算在連續(xù)基礎(chǔ)上標(biāo)準(zhǔn)指示劑發(fā)射濃度的增加，以及最終統(tǒng)計(jì)被擴(kuò)增的mRNA數(shù)量。
關(guān)于用于實(shí)時(shí)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度熒光團(tuán)的理論劑操作的另外細(xì)節(jié)被描述，例如在授予Gelfand的US專利No.5210015、授予Livak等的US專利No.5538848、授予Haaland的US專利No.5863736以及Heid，C.A.等的Genome Research，6986-994(1996)；Gibson，U.E.M等的GenomeResearch，6995-1001(1996)；Holland，P.M等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA887276-7280，(1991)；以及Livak，K.J.等的PCR Methods and Applications357-362(1995)，其各個(gè)通過引用其全文被結(jié)合。
因此，因擴(kuò)增反應(yīng)過程，增加的染料數(shù)量受到限制，并且由信號(hào)中伴隨的增加而被相伴。
還可以以不同途徑使用例如上述的相互對(duì)照染料，以定量化PCR方法。如上所述，這些染料選優(yōu)結(jié)合至雙旋DNA(例如，SYBR GREEN)，進(jìn)而僅僅在限制之后產(chǎn)生信號(hào)。因此，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，染料的增加數(shù)量被限制，以及由可被檢測的信號(hào)中伴隨的增加而被相伴。
分子標(biāo)記使用分子標(biāo)記，探針構(gòu)造的改變當(dāng)其雜交至擴(kuò)增產(chǎn)物的互補(bǔ)區(qū)域時(shí)導(dǎo)致可檢測信號(hào)的形成。探針自身包括兩部分在5′端處的一部分和在3′端處的另一部分。這些部分在對(duì)探針結(jié)合點(diǎn)淬火的探針部分的側(cè)面，并且彼此是互補(bǔ)的。一末端部典型地被附連至指示劑染料，以及其余端部分被通常附連到淬光劑染料。
在溶液中，兩端部可以互相雜交以形成發(fā)夾環(huán)(hairpin loop)，在這種構(gòu)造中，指示劑和淬光劑染料處于足夠接近中，以使來自指示劑染料的熒光團(tuán)由淬光劑染料有效地被淬光。相對(duì)比地，雜交探針產(chǎn)生線性構(gòu)造，在所述構(gòu)造中，淬光程度被降低。因此，通過監(jiān)控兩種染料的發(fā)射變化，可能的是間接監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的形成。這種類型探針及其使用的方法被進(jìn)一步描述，例如，通過Piatek，A.S.等的Nat.Biotechnol.16359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F(xiàn).R，Nature Biotechnology 14303-308(1996)；以及Tyagi，S等的Nat.Biotechnol.1649-53(1998)，其各個(gè)在這里通過以其全文用于所有目的的引用而被結(jié)合。
侵入物(invader)侵入物測定(第三波技術(shù)(Third WaveTechnologies/Madison，WI))被用于SNP基因定型和使用低聚核苷酸，指定信號(hào)探針，所述信號(hào)探針對(duì)目標(biāo)核酸(DNA或RNA)或多形性點(diǎn)是互補(bǔ)的。第二低聚核苷酸，指定低聚侵入物，包含相同的5′核苷酸序列，但3′核苷酸序列包括核苷酸多形性(polymorphism)。低聚侵入物干涉信號(hào)探針至目標(biāo)核酸的結(jié)合，以使信號(hào)探針的5′端在包含多形性的核苷酸處形成“片狀物(flap)”。這種復(fù)合體由結(jié)構(gòu)指定核酸內(nèi)切酶(endonuclease)所確認(rèn)，稱為可分裂性酶制劑(cleavase enzyme)。可分裂性酶分裂核苷酸的5′片狀物。釋放的片狀物與接收FRET標(biāo)示的第三探針結(jié)合，從而形成由可分裂性酶制劑所確認(rèn)的另一雙結(jié)構(gòu)。這次，可分裂性酶制劑分裂遠(yuǎn)離淬光劑的熒光團(tuán)，進(jìn)而產(chǎn)生熒光信號(hào)。用于SNP基因定型，信號(hào)探針將被設(shè)計(jì)以與基準(zhǔn)(野生型)等位基因或變形(突變型)等位基因相雜交。與PCR不一樣，有信號(hào)的線性擴(kuò)增，所述擴(kuò)增沒有核酸的擴(kuò)增。進(jìn)一步細(xì)節(jié)足以引導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例如Neri，B.P等Advances in Nucleic Acidand Protein Analysis 3826117-125，2000而提供。
Nasba基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)是使用RNA作為檢測模板的檢測方法。對(duì)RNA的引物互補(bǔ)包含用于T7啟動(dòng)子點(diǎn)(promoter site)的序列這個(gè)引物允許與模板RNA和添加的逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)(RT)相結(jié)合，以產(chǎn)生從3′至5′的互補(bǔ)旋轉(zhuǎn)。隨后RNase H被添加，以消化掉RNA，剩下單旋cDNA。然后，引物的第二版可結(jié)合單選cDNA和制造雙旋cDNA。添加T7 RNA聚合酶，以通過第一引物從被結(jié)合進(jìn)cDNA序列的T7促進(jìn)劑點(diǎn)產(chǎn)生更多版的RNA。提及的所有酶能夠在41℃處起作用(參見，例如Compton，J.Nucleic Acid Sequence-basedAmpli1fication，Nature 35091-91，1991)。
Scorpion。這種方法例如由Thelwell N等的Nucleice Acids Research，283752-3761，2000所描述，因此其通過引用其全文用于所有目的被結(jié)合，以及圖20描繪了其方案，其中Scorpion探針機(jī)制如下。步驟1目標(biāo)和Scorpion主干序列的初始變性。步驟2將Scorpion引物退火至目標(biāo)。步驟3延長Scorpion引物產(chǎn)生雙鏈DNA。步驟4變性步驟3中產(chǎn)生的雙鏈DNA。這產(chǎn)生附著Scorpion引物的單鏈目標(biāo)分子。步驟5通過冷卻，Scorpion探針序列以分子內(nèi)的方式結(jié)合至其目標(biāo)。由于互補(bǔ)目標(biāo)鏈的分子間結(jié)合這是具有優(yōu)勢(shì)的。Scorpion(如圖24所示)包含容納在由探針的3′和5′側(cè)上互補(bǔ)的主干序列形成的發(fā)夾環(huán)內(nèi)的特殊探針序列。附著于5′末端的熒光基團(tuán)被連接至環(huán)的3′末端的部分(通常甲基紅)猝滅。發(fā)夾環(huán)通過PCR終止序列(止動(dòng)裝置)連結(jié)至引物的5′末端。當(dāng)引物在PCR擴(kuò)增過程中延伸后，特異性探針序列能夠在DNA的相同鏈內(nèi)結(jié)合至它的互補(bǔ)序列。該雜交事件打開發(fā)夾環(huán)因此熒光基團(tuán)不再被猝滅以及可觀察到信號(hào)的增加。PCR終止序列防止通讀，該通讀可能導(dǎo)致發(fā)夾環(huán)在缺乏特異性目標(biāo)序列的情況下打開。這種通讀將導(dǎo)致檢測非特異性PCR產(chǎn)物，例如，引物二聚物或引導(dǎo)錯(cuò)誤事件。
3.容性DNA檢測DNA濃度和電容改變之間具有線性關(guān)系，該電容改變由跨越1khz電場的核酸通道引起。已發(fā)現(xiàn)這種關(guān)系是不依賴物種的。(見，例如Sohn，等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9710687-10690)。這樣，在某些設(shè)備中，流動(dòng)通道內(nèi)的核酸(例如，圖1的幾乎環(huán)形的流動(dòng)通道或圖2的反應(yīng)腔)經(jīng)受這樣的場以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。可代替地，包含擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液被取出以及然后經(jīng)受這樣的電場。
IX.實(shí)施反應(yīng)的合成物的成分此處披露的由微流體設(shè)備進(jìn)行的反應(yīng)典型地由某些添加劑實(shí)施以增強(qiáng)反應(yīng)。因此，例如，在反映物沉積在其內(nèi)的設(shè)備的例子中，這些添加劑可在例如反應(yīng)部位被一種或更多試劑污染。一套添加劑為封閉彈性材料基質(zhì)上蛋白結(jié)合位點(diǎn)的封閉試劑。很多種這樣的合成物可以被使用包含多種不同蛋白(例如，凝膠和各種清蛋白，例如牛血清清蛋白)和甘油。
洗滌劑添加劑也可以是有用的。可以使用多種不同洗滌劑中的任何洗滌劑。例子包含，但不局限于SDS和各種Triton洗滌劑。
在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的特異例子中，可以包含多種不同類型添加劑。一種是促進(jìn)擴(kuò)增反應(yīng)的增強(qiáng)劑。這樣的添加劑包含但不局限于減少核酸內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)的試劑(例如，三甲銨乙內(nèi)酯)、和減少錯(cuò)誤引導(dǎo)事件的試劑(例如，四甲基銨氯化物)。
還發(fā)現(xiàn)在某些擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行中某些多聚物酶增強(qiáng)效果。例如，雖然使用來自Thermus aquaticus(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA)的AmpliTaq Gold聚合酶獲得良好效果，在某些情況下使用Finnzyme，Espoo，F(xiàn)inland的DyNAzyme聚合酶獲得改善的反應(yīng)。該聚合酶來自嗜熱菌，Thermus brockianus。其它可被使用的范例的多聚酶包含但不局限于rTH多聚酶XL，其為Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)、嗜超熱原始細(xì)菌pyrosoccus woesei(Pwo)和Tgo DNA多聚酶的結(jié)合。在反應(yīng)混合物中合并兩種或更多多聚物酶對(duì)增加PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確度或敏感度是有用的。其它試劑例如DMSO的加入尤其那些包含內(nèi)部對(duì)照染料者加入至PCR混合物中可進(jìn)一步輔助實(shí)施反應(yīng)。使用甘油或PEG溶液用于對(duì)照列液體也可改善PCR反應(yīng)的實(shí)施。
關(guān)于添加劑在應(yīng)用此處披露的某些設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)包含核酸擴(kuò)增反應(yīng)中是有用的的其它細(xì)節(jié)，在下文例1中提供。
X.應(yīng)用范例由于此處提供的微流體設(shè)備可被制造為包含巨大數(shù)量的反應(yīng)部位，該設(shè)備在非常多種篩選和分析方法中是有用的。通常，該設(shè)備可用于檢測發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生可檢測信號(hào)的種之間的反應(yīng)，或一旦和另一物種相互作用產(chǎn)生可檢測信號(hào)的產(chǎn)物。考慮到它們?cè)诟鞣N類型溫度控制系統(tǒng)下的使用，設(shè)備也可被用在多個(gè)不同類型的需要溫度控制的分析或反應(yīng)中。
A.核酸擴(kuò)增反應(yīng)此處披露的設(shè)備主要可被用于進(jìn)行任何類型核酸擴(kuò)增反應(yīng)。因此，例如，擴(kuò)增反應(yīng)可以是線性擴(kuò)增，(使用單一引物擴(kuò)增)，和指數(shù)擴(kuò)增(即，由前向和逆向引物集實(shí)施的擴(kuò)增)。
當(dāng)使用盲通道類型設(shè)備實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，典型地沉積在反應(yīng)部位內(nèi)的試劑是那些實(shí)施所需類型擴(kuò)增反應(yīng)必須的試劑。通常這意味著以下物質(zhì)的某些或全部是沉積的例如引物、多聚酶、核苷酸、金屬離子、緩沖液、和協(xié)同因子。在這樣的例子中引導(dǎo)進(jìn)入反應(yīng)部位的樣本是核酸模板。
然而可替換的，模板可以被沉積以及擴(kuò)增試劑流入反應(yīng)部位。如以上討論的，當(dāng)矩陣設(shè)備用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，包含核酸模板的樣本通過垂直流動(dòng)通道流動(dòng)以及擴(kuò)增試劑通過水平流動(dòng)通道或反之亦然。
雖然PCR可能是最佳公知擴(kuò)增技術(shù)，該設(shè)備不局限于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其它類型可被實(shí)施的擴(kuò)增反應(yīng)包含但不局限于(i)連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)和Landegren等，Science2411077(1988))；(ii)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(見Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861173(1989))；(iii)自身維持的序列復(fù)制(即Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))；和(iv)基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)(見，Sooknanan，R和Malek，L，BioTechnology13563-65(1995))。每一前述參考以它們的整體為了所有目的在此通過參考被結(jié)合。
使用任何以上描述的用于檢測擴(kuò)增的DNA的檢測方法可以完成對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。
B.SNP分析和基因分型1.概述很多與或者宿主機(jī)體或者感染性機(jī)體的基因組更改相關(guān)的疾病是少數(shù)核苷酸改變的結(jié)果，常常包含單個(gè)核苷酸的改變。這樣的單個(gè)核苷酸的改變指單核甘酸多形態(tài)或簡單SNPs，以及SNP產(chǎn)生的位點(diǎn)典型地指多形態(tài)的位點(diǎn)。此處描述的設(shè)備可用于檢測出現(xiàn)在這樣的多形態(tài)位點(diǎn)處的核苷酸的鑒定。作為這種能力的擴(kuò)展，該設(shè)備可用于基因分型分析。基因分型包含確定二倍體有機(jī)體(即每一基因具有兩個(gè)拷貝的有機(jī)體)是否包含參考等位基因的兩個(gè)拷貝(參考類型純和體)、每一參考的一個(gè)拷貝和一個(gè)變異的等位基因(即雜合子)、或包含變異等位基因的兩個(gè)拷貝(即變異型純和體)。當(dāng)進(jìn)行基因分析分析時(shí)，本發(fā)明的方法可被用于檢測單一變異位點(diǎn)。然而，如以下多元化部分中進(jìn)一步描述的，該方法也可用于檢測個(gè)體或在同一基因、或不同基因或它們的組合上的多個(gè)不同DNA基因座位的基因型。
用于進(jìn)行基因分型分析的設(shè)備設(shè)計(jì)為使用適當(dāng)大小的反應(yīng)部位以從統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)確保二倍體受試者的兩個(gè)等位基因中的每一個(gè)的拷貝以可工作的DNA濃度出現(xiàn)在反應(yīng)部位。否則，分析可能產(chǎn)生提示雜和子是純和體的結(jié)果，僅僅由于第二等位基因的拷貝沒有出現(xiàn)在反應(yīng)部位。下面的表2指示了使用此處描述的設(shè)備可被使用的以各種示例的DNA濃度出現(xiàn)在1nl反應(yīng)體積中的基因組拷貝的數(shù)目。
表2以指示的DNA濃度出現(xiàn)在1nl體積中的基因組拷貝的數(shù)目
通常而言，由于樣本的隨機(jī)比例，在擴(kuò)增反應(yīng)開始之前出現(xiàn)的拷貝數(shù)目決定檢測中的可能錯(cuò)誤。使用某些設(shè)備的基因分型分析典型地以具有大約0.1μg/μL DNA濃度的樣本進(jìn)行，盡管目前發(fā)明者們已以各濃度進(jìn)行成功的每一反應(yīng)部位有單一基因組的Taqman反應(yīng)。
2.方法基因型分析可以應(yīng)用各種不同方法進(jìn)行。在這些方法中，通常獲得“是”或“否”的結(jié)果就足夠了，即，檢測只需能夠回答某一等位基因是否存在的問題。因此，僅使用檢測多形態(tài)位點(diǎn)可能出現(xiàn)的一個(gè)等位基因所必須的引物或核苷酸可進(jìn)行分析。然而，更典型地，包含檢測多形態(tài)位點(diǎn)每一可能的等位基因的出現(xiàn)的引物和核苷酸。以下是合適的方法的例子。
單堿基對(duì)延伸(SBPE)反應(yīng)。SBPE反應(yīng)是為進(jìn)行基因分型分析特異性發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)。盡管已發(fā)展了數(shù)個(gè)SBPE反應(yīng)，總的方法是十分相似的。典型地，這些分析包含將與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的引物進(jìn)行雜交，這樣引物的3′末端緊密靠近變異位點(diǎn)的5′或與其毗鄰。延伸在存在一個(gè)或更多標(biāo)記的不可延伸核苷酸和多聚酶的情況下進(jìn)行，所述不可延伸核苷酸與占據(jù)變異位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)。不可延伸核苷酸是核苷酸類似物，它一旦結(jié)合進(jìn)入引物阻止多聚酶作用下的進(jìn)一步延伸。如果加入的非延伸核苷酸是在變異位點(diǎn)與核苷酸互補(bǔ)的，那么標(biāo)記的非延伸核苷酸結(jié)合至引物的3′末端以產(chǎn)生標(biāo)記的延伸產(chǎn)物。因此，延伸的引物提供核苷酸出現(xiàn)在目標(biāo)核酸變異位點(diǎn)的指示。這樣的方法和相關(guān)方法例如在美國專利第5,846,710；6,004,744；5,888,819；5,856,092和5,710,028和WO92/16657號(hào)中描述。
延伸產(chǎn)物的檢測可使用在上述檢測部分描述的用于延伸反應(yīng)的FRET測方法檢測。這樣，例如，使用此處描述的設(shè)備，包含標(biāo)記的供體/受體熒光基團(tuán)中一個(gè)成員的試劑混合物、一至四種標(biāo)記的非延伸核苷酸(如果包含多于一種非延伸核苷酸，被不同標(biāo)記)、和多聚酶被引入(或之前被點(diǎn)樣)至反應(yīng)部位。然后包含模板DNA的樣本被引入反應(yīng)部位以允許產(chǎn)生模板延伸。任何形成的延伸產(chǎn)物被FRET信號(hào)的形成檢測(見，例如，美國專利第5,945,283和PCT出版物WO97/22719)。可選擇性地使反應(yīng)熱循環(huán)以使用溫度控制方法和以上描述的裝置增加信號(hào)。
定量PCR。基因分型分析也可使用更早描述的定量PCR方法進(jìn)行。在這種情況下，與等位基因形式的每一個(gè)互補(bǔ)的不同標(biāo)記探針被包含作為試劑，還有引物、核苷酸和多聚酶。然而，反應(yīng)可僅使用單一探針進(jìn)行，盡管這在是否缺乏信號(hào)是由于缺乏特異性等位基因或僅由于反應(yīng)失敗上能產(chǎn)生含糊。對(duì)于典型的雙等位基因的例子，其中對(duì)于多形態(tài)位點(diǎn)兩個(gè)等位基因是可能的，通常在試劑混合物中包含兩者不同標(biāo)記的探針，每一個(gè)都與等位基因之一完美互補(bǔ)，還有擴(kuò)增引物、核苷酸和多聚酶。包含目標(biāo)DNA的樣本被引入反應(yīng)部位。如果探針與其互補(bǔ)的等位基因存在于目標(biāo)DNA上，那么產(chǎn)生擴(kuò)增，因而導(dǎo)致如在以上檢測中所述的可檢測信號(hào)。基于獲得的不同信號(hào)的種類，可確定多形態(tài)位點(diǎn)核苷酸的鑒定。如果兩種都被檢測到，那么兩種基因都存在。反應(yīng)過程中的熱循環(huán)如以上溫度控制部分中所述一樣被實(shí)施。
B.基因表達(dá)分析1.概述基因表達(dá)分析涉及測定特定細(xì)胞中一種或更多基因表達(dá)的水平。這種測定可以是定性的，但通常是定量的。在差異性基因表達(dá)分析中，一種細(xì)胞(例如檢測細(xì)胞)中基因水平與另一種細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)中相同基因表達(dá)的水平相比較。可進(jìn)行非常多種這樣的比較。例子包含但不局限于，健康和患病細(xì)胞之間、用一種藥物治療的個(gè)體的細(xì)胞與另一未治療個(gè)體的細(xì)胞之間、暴露于特定毒物的細(xì)胞和未暴露細(xì)胞之間的比較等等。檢測和對(duì)照細(xì)胞之間表達(dá)水平不同的基因可作為標(biāo)志和/或治療的目標(biāo)。例如，如果發(fā)現(xiàn)某組基因在患病細(xì)胞中的上調(diào)多于健康細(xì)胞，這樣的基因可作為該疾病的標(biāo)志并可能用作診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)。這些基因也可成為目標(biāo)。治療疾病的策略可包含導(dǎo)致上調(diào)基因的表達(dá)減少的程序。
此處披露的設(shè)備的設(shè)計(jì)對(duì)于易化多種基因表達(dá)分析是有用的。因?yàn)樵撛O(shè)備包含巨大數(shù)量的反應(yīng)部位，巨大數(shù)量的基因和/或樣本可以同時(shí)被檢測。使用盲流動(dòng)通道設(shè)備，例如，可同時(shí)檢測數(shù)百或數(shù)千基因的表達(dá)水平。該設(shè)備還方便了差異基因表達(dá)分析。通過矩陣設(shè)計(jì)，例如，從健康細(xì)胞獲得的樣本可在一個(gè)流動(dòng)通道檢測，而來自患病細(xì)胞的樣本在密切靠近的通道進(jìn)行。該特征增強(qiáng)了檢測的簡便性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，因?yàn)樵搩蓸颖驹谙嗤瑫r(shí)間在相同設(shè)備和相同條件下進(jìn)行。
2.樣本制備和濃度為了檢測一基因或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平(和從而表達(dá)水平)，獲得包含該基因或基因片段的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸樣本或來自mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸。來自mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸是指對(duì)于該核酸的合成而言，mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其序列最終作為模板。這樣從mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、從該cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA、從該cDNA擴(kuò)增的DNA、從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA都來自mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及檢測這樣的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物指示了樣本中原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在和/或豐度。這樣，合適的樣本包含但不局限于，基因或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、從mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、從cDNA轉(zhuǎn)錄的cRNA、從基因擴(kuò)增的DNA、從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA。
在有些方法中，核酸樣本從生物樣本分離的總mRNA；在其它例子中，核酸樣本是來自生物樣本的總RNA。術(shù)語“生物樣本”，如此處應(yīng)用的，指從有機(jī)體或從有機(jī)體的組分例如細(xì)胞、生物組織和液體中得到的樣本。在某些方法中，樣本來自人類患者。這樣的樣本包含唾液、血液、血細(xì)胞(例如白細(xì)胞)、組織或細(xì)針活檢樣本、尿、腹膜的液體、漿膜液或它們的細(xì)胞。生物樣本也可包含組織的部分例如取來用于組織學(xué)目的的冷凍部分。常常提供兩個(gè)樣本用于比較的目的。樣本可以是，例如，來自不同細(xì)胞或組織類型、來自不同個(gè)體或來自接受不同治療的相同來源樣本(例如藥物治療和對(duì)照)。
任何不選擇性反對(duì)mRNA分離的RNA分離技術(shù)可被用于這樣的RNA樣本的提純。例如，核酸分離和提純的方法在WO97/10365、WO97/27317、Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分第3章、Theory and Nucleic AcidPreparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y.(1993)、Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分中第3章、Theory and Nucleic Acid Preparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y.(1993)、和Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring harbor Press，N.Y.(1989)、Current Protocols in MolecularBiology，(Ausubel，F(xiàn).M.等，eds.)John Wiley&Sons，Inc.，NewYork(1987-1993)中詳細(xì)描述。巨大數(shù)量的組織樣本可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地處理，包含例如，Chornczynski，P.在美國專利第4,843,155號(hào)中描述的單一步驟RNA分離程序。
在使用所述設(shè)備的基因表達(dá)分析中，影響結(jié)果的重要因素是樣本中核酸的濃度。在低拷貝數(shù)目時(shí)，干擾與拷貝數(shù)目的平方根相關(guān)。因此，認(rèn)為可接受的錯(cuò)誤水平?jīng)Q定了所需拷貝數(shù)目。在特定樣本體積中所需的拷貝數(shù)目確定了所需DNA的濃度。盡管不一定最佳，定量反應(yīng)可以用達(dá)50％的錯(cuò)誤水平實(shí)施，但優(yōu)選更低。假設(shè)1納升體積，獲得特定錯(cuò)誤水平所需的DNA濃度如表3所示。如所示的，以微流體設(shè)備可工作的濃度，例如通過某些設(shè)備使用的1納升體積具有足夠的基因表達(dá)產(chǎn)物拷貝數(shù)。
表3基因表達(dá)——DNA定量
進(jìn)一步的計(jì)算證實(shí)此處提供的使用1nL反應(yīng)部位的設(shè)備中的某些包含足夠的DNA以獲得準(zhǔn)確的表達(dá)結(jié)果。特別地，典型mRNA制備程序產(chǎn)生大約10μgmRNA。已證明典型地在每一細(xì)胞中具有每一mRNA的1到10,000個(gè)拷貝。在任何特定細(xì)胞中表達(dá)的mRNA中，大約四個(gè)最常見信息包含總mRNA水平的約13％。這樣，這種高表達(dá)信息包含1.3μg mRNA(每一個(gè)是4×10-12克分子或大約2.4×1012拷貝)。根據(jù)前述表達(dá)范圍，預(yù)期稀有信息以2×10-8拷貝的水平存在。如果在標(biāo)準(zhǔn)分析中mRNA樣本溶解在10μl中，稀有信息的濃度約為2×107拷貝/μl；該濃度對(duì)應(yīng)于每1nl孔20,000拷貝(或4×1011M)。
3.方法由于表達(dá)分析典型地變化定量分析，典型地使用以上描述的定量實(shí)時(shí)PCR方法中之一完成檢測。這樣，如果使用Taqman方法，引入(或之前點(diǎn)樣)反應(yīng)部位的試劑可包含以下物質(zhì)之一或全部引物、標(biāo)記探針、核苷酸和多聚酶。如果使用嵌入染料，試劑混合物典型地包含以下物質(zhì)之一或全部引物、核苷酸、多聚酶和嵌入染料。
D.多元化此處描述的基于陣列的設(shè)備(見，例如，圖1A、1F、2、3A、和3B以及伴隨的文本)本質(zhì)上設(shè)計(jì)為為了同時(shí)實(shí)施巨大數(shù)量擴(kuò)增反應(yīng)。然而這個(gè)特點(diǎn)通過在每一反應(yīng)部位內(nèi)進(jìn)行多種分析(例如，基因分型和表達(dá)分析)可以容易地進(jìn)一步擴(kuò)展。
甚至可在單一反應(yīng)部位實(shí)施多元擴(kuò)增，通過例如在熱循環(huán)過程中使用多種引物，每一種是特定感興趣目標(biāo)核酸特異性的。不同擴(kuò)增產(chǎn)物的存在可以使用有差別地標(biāo)記的探針檢測以進(jìn)行定量RT-PCR反應(yīng)或通過使用有差別地標(biāo)記的分子標(biāo)志(見上述)。在這樣的方法中，每一有差異地標(biāo)記的探針設(shè)計(jì)為只與特定擴(kuò)增目標(biāo)雜交。通過明智選擇所使用的不同探針，分析得以進(jìn)行，其中不同標(biāo)記在單一反應(yīng)中在不同波長被激活和/或檢測。關(guān)于適用于這樣的方法的適當(dāng)熒光標(biāo)記的選擇的進(jìn)一步指導(dǎo)包含F(xiàn)luorescence Spectroscopy(Pesce等，Eda.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White等，F(xiàn)luorescence AnalysisApractical Approach，Marcel Dekker，New York，(1970)；Berlman，handbook of Fluorescence Spectra ofAromaticMolecules，第二版，Academic Press，New York，(1971)；Griffiths，Colour andConstitution of Organic Molecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，19723；和Haugland，handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，MolecularProbes，Eugene(1992)。
多種基因分型和表達(dá)分析可在每一反應(yīng)部位可選擇地進(jìn)行。如果使用定量PCR方法例如TaqMan，那么用于擴(kuò)增感興趣目標(biāo)DNA不同區(qū)域的引物被包含在單一反應(yīng)部位內(nèi)。使用用于每一區(qū)域的有差別地標(biāo)記的探針區(qū)別形成的產(chǎn)物。
E.非-核苷酸分析雖然對(duì)進(jìn)行非常多種核酸分析是有用的，設(shè)備也可被用于多種其它用途。如更早提示的，設(shè)備可主要被用于分析兩個(gè)或更多物種之間的相互反應(yīng)，所述反應(yīng)產(chǎn)生可檢測信號(hào)或能與可檢測試劑反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，該可檢測試劑一旦與反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)可產(chǎn)生信號(hào)。
因此，例如，該設(shè)備可被用于多個(gè)篩選應(yīng)用以識(shí)別具有特定所需活性的檢測試劑。作為特殊的例子，該設(shè)備可被用于篩選化合物，篩選其作為一種或更多酶的底物或抑制劑的活性。在這樣的分析中，檢測的化合物和其它必須的酶分析試劑(例如，緩沖液、金屬離子、協(xié)同因子和底物)被引入(如果之前未沉積)反應(yīng)部位內(nèi)。然后引入酶樣本以及反應(yīng)(如果檢測化合物是底物)或抑制反應(yīng)(如果檢測化合物是抑制劑)被檢測。這樣的反應(yīng)或抑制可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成，例如直接或間接檢測底物的喪失和/或產(chǎn)物的出現(xiàn)。
具有足夠大量流動(dòng)通道和反應(yīng)部位的設(shè)備也可被用于進(jìn)行細(xì)胞分析以檢測細(xì)胞和一種或更多試劑之間的相互作用。例如，某些分析涉及確定特定細(xì)胞類型是否存在于樣本內(nèi)。用于完成這種分析的一個(gè)例子是使用優(yōu)先與某些細(xì)胞類型反應(yīng)的細(xì)胞特異性染料。因此，這樣的染料可被引入反應(yīng)部位以及然后加入細(xì)胞。細(xì)胞的染色可使用標(biāo)準(zhǔn)顯微技術(shù)檢測。如另一例子，檢測的化合物可被篩選觸發(fā)或抑制細(xì)胞反應(yīng)的能力，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路。在這樣的分析中，檢測的化合物被引入反應(yīng)部位然后加入細(xì)胞。然后檢查反應(yīng)部位以檢測細(xì)胞反應(yīng)的形成。
相關(guān)設(shè)備和這樣的設(shè)備的應(yīng)用的進(jìn)一步闡述在2001年11月30日提交的待審查和共同所有的美國臨時(shí)申請(qǐng)第60/335,292號(hào)中闡述，其在此處為了所有目的以其整體通過參考被結(jié)合。
XI.制造A.一般方面作為先前提及的，利用單和多層軟光刻(MSL)技術(shù)和/或犧牲層封裝方法，一般構(gòu)造提供的微流體設(shè)備。基本MSL漸進(jìn)法包括在微加工模具上鑄造一系列彈性材料層，從模具去除該層，然后將該層熔化在一起。在犧牲層封裝方法中，光致抗蝕劑層圖案被沉積在通道是理想的地方。這些技術(shù)及其在生產(chǎn)微流體設(shè)備中的使用由下述文獻(xiàn)詳細(xì)論述，例如Unger等(2000)Science 288113-116、Chou等(2000)“Integrated Elastomer FluidicLab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagonstics”、在Solid StateActuator and Sensor Workshop的Hilton Head，S.C.會(huì)議論文集中以及在PCT公開WO01/01025中，其中各個(gè)在這里通過引用器全文用于所有目的而被結(jié)合。
簡單地說，前面制造方法最初涉及通過使用光致抗蝕劑(Shipley SJR5740)光蝕刻在硅基片上制造用于頂層(例如，具有控制通道的彈性層)和底層(例如，具有流動(dòng)通道的彈性層)的模模具。通過旋涂速率可以精確地控制通道高度。通過在顯影之后將光致抗蝕劑暴露至UV光，形成光致抗蝕劑通道。熱回流處理和保護(hù)處置典型地被實(shí)現(xiàn)，與M.A.Unger，H.-P.Chou，T.Throsen，A.Scherer和S.R.Quake，Science(2000)288113，其在這里通過引用其全文而被結(jié)合。然后，混合兩部硅彈性體(GE RTV 615)分別被旋進(jìn)底部模具并且被傾瀉在頂部模具上。這里，還有，可以利用旋涂控制底部聚合體流體層的厚度。局部固化頂層在烘箱中以80℃烘焙25分鐘之后被從起模具中剝離，與底層對(duì)齊且組裝。使用80℃、1.5小時(shí)最終烘焙不可逆地結(jié)合這兩層。一旦被從底部硅母模具剝離，這個(gè)RTV設(shè)備典型地使用HCL被處置(0.1N，30分鐘、80℃)。這種處置起到裂開某些Si-O-Si結(jié)合的作用，從而露出使通道更親水的羥基團(tuán)(hydroxy group)。
然后，該設(shè)備可優(yōu)選地被氣密地密封至支座。該支座可以實(shí)質(zhì)上由任意材料制造，盡管表面應(yīng)當(dāng)是平坦的以確保良好密封，因?yàn)樾纬傻拿芊庵饕蛘辰Y(jié)力。合適支座的例子包括剝離、塑料等。
根據(jù)前面方法形成的設(shè)備產(chǎn)生形成流動(dòng)通道中一個(gè)壁的基片(例如，載玻片)。可替換地，一旦從母模具移除的設(shè)備就被密封至薄彈性隔膜，以致于流動(dòng)通道被整體密封在彈性材料中。因此，得到的彈性設(shè)備可被優(yōu)選連接至基底支座。
B.利用盲道設(shè)計(jì)的設(shè)備1.層結(jié)構(gòu)基于盲道設(shè)計(jì)的微流體設(shè)備典型地由三層形成，在所述微流體設(shè)備中試劑在制造期間被沉積在反應(yīng)點(diǎn)。底層是試劑沉積在其上的層。底層可以由各種彈性材料形成，如在上面引證的MLS方法中在引用中所述的。典型地，材料是聚二甲基硅氧烷(PMDS)彈性體。基于該裝置和理想的用于具體設(shè)備的反應(yīng)點(diǎn)的定位，人們可以確定在適當(dāng)試劑應(yīng)當(dāng)點(diǎn)樣在其上的底層上的定位。因?yàn)镻MDS是親水的，則沉積的含水點(diǎn)收縮移形成非常小的點(diǎn)。沉積的試劑被沉積以使在試劑和彈性體表面之間沒有形成共價(jià)鍵，因?yàn)槿缦惹八龅脑噭┮坏┍粚?dǎo)入反應(yīng)點(diǎn)中則被用于融解在樣本溶液中。
設(shè)備的其余兩層是形成流動(dòng)通道的層和形成控制和優(yōu)選保護(hù)通道的層。這兩層根據(jù)在這個(gè)部分先前所述的一般方法被制備，然后，將得到的兩層結(jié)構(gòu)放置在第一層的頂部，試劑已經(jīng)被沉積在所述第一層上。三層中的組成的具體例子如下(組成A對(duì)組成B的比率)第一層(樣本層)30∶1(重量上)；第二層(流動(dòng)通道層)30∶1；以及第三層(控制層)4∶1。然而，可以想象到的是，也可以利用彈性部件的其它組成和比率。使用結(jié)合兩或多層和或基片的其它方法可以包括使用粘結(jié)劑或等離子結(jié)合，優(yōu)選空氣等離子體結(jié)合，以形成彈性材料塊或微流體設(shè)備的其他部分。在一些實(shí)施例中，與其它層通過通孔內(nèi)部連接的附加層，優(yōu)選彈性層可被用于增加彈性材料塊中每單元區(qū)域的反應(yīng)密度或者減小彈性材料塊的大小。
在這種處理過程中，反應(yīng)點(diǎn)與沉積的試劑相對(duì)齊，以致于試劑被定位在合適的反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)。圖6是一套從設(shè)備四角截取的照片；這些照片顯示利用前面方法，沉積的試劑可被精確地與反應(yīng)點(diǎn)相對(duì)齊。這些照片顯示保護(hù)通道和反應(yīng)點(diǎn)被定位在分支流動(dòng)通道的末端處。白色圓圈指示沉積試劑相對(duì)于反應(yīng)點(diǎn)的位置。如所指示，各個(gè)試劑點(diǎn)很好地處于反應(yīng)點(diǎn)的限制內(nèi)。
2.點(diǎn)樣(spotting)利用任意數(shù)量的在市場上可以買到的試劑點(diǎn)樣器和使用各種構(gòu)建的點(diǎn)樣技術(shù)，可以沉積試劑。在設(shè)備制備中可被利用的合適點(diǎn)樣器的例子包括針點(diǎn)樣器、超聲點(diǎn)樣器、自動(dòng)微吸移管管理器、電泳泵、噴墨打印機(jī)設(shè)備、滴墨打印機(jī)和某些滲透泵。在市場上可以買到的點(diǎn)樣器包括CartesianTechnologies MicroSys 5100(Irvine，CA)，Hitach SPBIO(Alameda，CA)，Genetix Q-Array(United Kingdom(大不列顛聯(lián)合王國))，Affymetrix 417(Santa Clara，CA)和Packard Bioscience SpotArray(Aeriden，CT)。一般地，沉積非常小的試劑點(diǎn)；通常小于10nl的點(diǎn)被沉積，在另一例子中小于5nl、2nl或1nl，在又一例子中，小于0.5nl、0.25nl或0.1nl。
使用Foder等的US專利No.5445935名稱為“Array ofoligonucleotideon a solid substrate”中所述的方法還可以形成材料陣列，其中例如SNP探針的低聚核苷酸探針使用空間光引導(dǎo)光蝕刻在原位置被合成。這種陣列還將被用作本發(fā)明中微流體設(shè)備的基片或基底，以致于對(duì)應(yīng)于反應(yīng)點(diǎn)的基片區(qū)域例如盲填充腔將排列在基片上在一個(gè)已知位置中包含一個(gè)或者優(yōu)選多余一個(gè)的低聚核苷酸探針。在分離微流體結(jié)構(gòu)的情形中，例如在這里圖15中所描繪的一種，被描繪為沿蛇形線(serpentine)的正方形盒子的反應(yīng)點(diǎn)，流動(dòng)通道將包含多個(gè)不同SNP探針，優(yōu)選適于從單體的總和中識(shí)別單體的SNP探針的集合，以致于如果包含來自多個(gè)單體中的核酸序列的流體樣本，在此處被導(dǎo)入蛇形線流動(dòng)通道，和與蛇形線流動(dòng)通道相連通的多個(gè)閥門，以致于被起動(dòng)時(shí)導(dǎo)致蛇形線流動(dòng)通道被分離，從而隔離互相隔離各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，以在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)中包含流體樣本的片斷。可以執(zhí)行對(duì)樣本組成的擴(kuò)增以增加分子數(shù)，例如核酸分子，用于結(jié)合至被定位在各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的SNP探針陣列。在一些實(shí)施例中，沿蛇形線流動(dòng)通道的各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)各是相同的陣列，也就是具有相同的排列SNP探針，以及在另一實(shí)施例中，沿蛇形線流動(dòng)通道的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)將具有不同系列SNP探針。其它分離流動(dòng)通道構(gòu)造還可能被使用，例如分支的和/或分支的分支系統(tǒng)等等。其它排列技術(shù)，例如這里所述的點(diǎn)樣，同樣的可被用于形成定位在沿蛇形線或普通流動(dòng)通道(例如分支的)的可分離反應(yīng)點(diǎn)內(nèi)的陣列。
下面例子被表述，以進(jìn)一步說明這里公開的設(shè)備和方法的具體方面。所述例子不被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。
例1信號(hào)強(qiáng)度評(píng)價(jià)I.介紹這套實(shí)驗(yàn)的目的是證明使用此處闡述的設(shè)計(jì)的微流體設(shè)備可進(jìn)行成功的PCR反應(yīng)，信號(hào)強(qiáng)度比Macro TaqMan反應(yīng)大50％。
II.微流體設(shè)備使用MSL程序制造的三層微流體設(shè)備被設(shè)計(jì)和制造，用于進(jìn)行下面例子中描述的實(shí)驗(yàn)。圖7A示出該設(shè)備的橫截面圖。如所示，設(shè)備700包含層722，在其內(nèi)形成流動(dòng)通道。該液體層722被夾在覆蓋層720和底層密封層724之間，覆蓋層720包含控制和保護(hù)層。封閉層724層形成流動(dòng)通道的一個(gè)側(cè)面。作為結(jié)果的三層結(jié)構(gòu)被固定至基層726(在這個(gè)例子中，滑板或蓋片)，基層726提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，增加熱傳導(dǎo)，并幫助防止從微流體設(shè)備700底部的蒸發(fā)。
圖7B示出流動(dòng)層722內(nèi)流動(dòng)通道的設(shè)計(jì)的略圖以及控制/保護(hù)層720內(nèi)控制通道和保護(hù)通道的設(shè)計(jì)的略圖。設(shè)備700包含十個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)通道702，每一個(gè)帶有自己的入口708，以及分支盲通道704，每一盲通道704具有1nl的反應(yīng)部位706。設(shè)備700包含控制線712的網(wǎng)絡(luò)，其在施加足夠壓力時(shí)分隔反應(yīng)部位706。還包含一系列保護(hù)通道716以防止液體蒸發(fā)出反應(yīng)部位706；液體通過入口718引入。
II.試驗(yàn)配置在設(shè)備700中實(shí)施PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)使用β肌動(dòng)蛋白引物和TaqMan探針以從人類男性染色體組DNA(Promega，Madison WI)擴(kuò)增β肌動(dòng)蛋白基因的外顯子3。TaqMan反應(yīng)包括下面成分1×TaqMan緩沖劑A(50mM KCI，10mM Tris-KCI，0.01MEDTA，60nM Passive Reference1(PR1)，pH8.3)；3.5-4.0mM Macl；200nM dATP，dCTP，dGTP，400nMdUTP，300nM激動(dòng)蛋白前向引物和逆向引物；200nMFAM標(biāo)記的β肌動(dòng)蛋白探針；0.01U/ul AmpEraseUNG(Applied Biosystems Foster市，CA)；0.1-0.2U/ul DyNAzyme(Finnzyme，F(xiàn)spoo，F(xiàn)inland(芬蘭))；0.5％Triton-x-100(Sigma，St.Louis，MO)；0.8ug/ul凝膠(Calbiochem，San Diego，CA)；5.0％甘油(Sigma，St.Louis，MO)；去離子水和男性染色體組DNA。加入反應(yīng)成分以生成25ul總反應(yīng)容積。每一套PCR反應(yīng)中包含陰性對(duì)照(negative control)，陰性對(duì)照包含除去目標(biāo)DNA之外的所有TaqMan反應(yīng)成分。
一旦TaqMan反應(yīng)樣本和對(duì)照被制備，則使用連接至1毫升注射器的凝膠加載吸管尖端，將它們注射入微流體設(shè)備700中。吸管尖端被充滿反應(yīng)樣本，然后通過708被注入流體。通過手動(dòng)將反向壓力施加給注射器，流動(dòng)通道702被填充，直至所有整個(gè)盲道704和反應(yīng)部位706被填充。控制線712被填充去離子水，并且在所有樣本被加載進(jìn)流線702、704之后被壓縮至15-20psi。壓縮的控制線712被激勵(lì)以關(guān)閉閥門和將樣本隔離在1nl孔706中。然后，將引導(dǎo)通道716填充去離子水，進(jìn)而壓縮至5-7psi。將礦物油(15ul)(Sigma)放置在熱循環(huán)器的平板上，然后將微流體設(shè)備/蓋片700放置在熱循環(huán)器上。微流體設(shè)備700因而被熱循環(huán)，使用初始斜面和三步或兩步熱循環(huán)曲線。
1.初始斜面至95℃，并且保持1分鐘(1.0℃/s至75℃，0.1℃/sec(秒)至95℃)。
2.三步熱循環(huán)持續(xù)40周(92℃持續(xù)30秒，54℃持續(xù)30秒以及72℃持續(xù)1分鐘)或者；3.兩步熱循環(huán)持續(xù)40周(92℃持續(xù)30秒以及60℃持續(xù)60秒)帶有殘留反應(yīng)混合物的MicroAmp(微安)管(Applied Biosystems Foster市，CA)，為了將它們與在微流體設(shè)備中進(jìn)行的反應(yīng)相區(qū)分而標(biāo)明MacroTaqMan反應(yīng)，被放置在GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(Applied Biosystems，F(xiàn)oster市，CA)中，并且在9600型號(hào)中被熱循環(huán)。Macro TaqMan反應(yīng)被用作微流體設(shè)備中進(jìn)行的反應(yīng)的宏觀對(duì)照。熱循環(huán)協(xié)議被設(shè)置以與微流體設(shè)備中的相匹配，除了初始斜面比率不是為Macro T aqMan反應(yīng)而控制之外。
一旦完成熱循環(huán)，對(duì)照和保護(hù)線被減壓以及該片被轉(zhuǎn)移到玻璃滑片(VWR，West Chester，PA)上然后該片被放置進(jìn)入具有改良的托架的ArrayWoRx掃描器(Applied Precision，Issaquah，WA)。熒光強(qiáng)度在三種不同激發(fā)/發(fā)射波長下被測量475/510nm(FAM)，510/560nm(VIC)，和580/640nm(Passive Reference 1(PR1))。使用Array Works軟件顯像微流體設(shè)備中的熒光和測量每一1nl孔中的信號(hào)和背景強(qiáng)度。然后使用Microsoft Excel文件分析結(jié)果，計(jì)算β肌動(dòng)蛋白TaqMan反應(yīng)的FAM/PR1比值。對(duì)于傳統(tǒng)MacroTaqMan，目標(biāo)DNA的陽性樣本使用制造商提供的協(xié)議(TaqMan PCR試劑盒協(xié)議)中描述的計(jì)算方法測定。信號(hào)強(qiáng)度通過用對(duì)照的FAM/PR1比值除樣本的FAM/PR1比值來計(jì)算。成功的反應(yīng)定義為樣本比值高于99％置信度閾值水平。
III.結(jié)果開始，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems，F(xiàn)oster市，CA)被用在TaqMan反應(yīng)中以及與Macro TaqMan反應(yīng)5.0-14.0的反應(yīng)比值相比，產(chǎn)生1.5-2.0的FAM/PR1對(duì)照比值。盡管結(jié)果是陽性的，需要增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。因此，由于DyNAzyme聚合酶的熱穩(wěn)定性、校正和對(duì)雜質(zhì)的抵抗增強(qiáng)，AmpliTaq Gold聚合酶被DyNAzyme聚合酶代替。0.025U/μl的標(biāo)準(zhǔn)MacroTaqMan DyNAzyme濃度被用于微流體實(shí)驗(yàn)中。聚合酶改變?yōu)镈yNAzyme產(chǎn)生了3.5-5.8的FAM/PR1對(duì)照比值。信號(hào)強(qiáng)度被改善，但難于獲得穩(wěn)定的結(jié)果。由于已知某些蛋白粘至PDMS，增加了多聚酶的濃度并包含了表面改良添加劑。以微流體設(shè)備中每nl 100pg或10pg基因組DNA檢測了兩種濃度增加的DyNAzyme，8×(0.2U/μl)和4×(0.1U/μl)用于MacroTaqMan的標(biāo)準(zhǔn)濃度。加入凝膠、甘油和0.5％Triton-x-100以防止多聚酶粘附到PDMS。微流體設(shè)備(片)中和Macro TaqMan對(duì)照的反應(yīng)結(jié)果在圖8示出。
微流體TaqMan反應(yīng)比值范圍從4.9-8.3而Macro TaqMan反應(yīng)范圍從7.7-9.7。因此，片中TaqMan反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到Macro TaqMan反應(yīng)的87％。4×和8×DyNAzyme之間沒有顯著差異。該結(jié)果證實(shí)PCR反應(yīng)可以在微流體設(shè)備中進(jìn)行，信號(hào)強(qiáng)度大于與Macro TaqMan反應(yīng)相比的50％。該結(jié)果在至少四次的嘗試中是一致的。
例2試劑點(diǎn)樣I.介紹該實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)微流體設(shè)備中成功的點(diǎn)樣PCR反應(yīng)。該文本中的術(shù)語“spotted”是指小滴試劑(斑點(diǎn))在基質(zhì)上的放置，該基質(zhì)然后被組合成為微流體設(shè)備的部分。被點(diǎn)樣的試劑通常是實(shí)施PCR所需的試劑混合物的子集。
II.過程A.試劑的點(diǎn)樣試劑的常規(guī)點(diǎn)樣通過接觸打印來實(shí)施。試劑從一套源孔被取到金屬針上，以及通過使針接觸目標(biāo)基質(zhì)而被沉積。該打印過程在圖9中進(jìn)一步概括。如所示，試劑被從源(例如微滴定板)取得，以及然后通過使裝載的針與基質(zhì)接觸而被打印。洗滌步驟包含在去離子水中搖動(dòng)然后真空干燥。用于打印試劑斑點(diǎn)的系統(tǒng)是Caresian Techologies MicroSys 5100(IrvineCA)，使用TeleChem“ChipMaker”打印針，盡管如上所述可使用其它系統(tǒng)。
使用的針是TeleChem ChipMaker 4針，其結(jié)合有電切削狹槽(見圖9)以增加攝取的體積(以及因此可打印斑點(diǎn)的數(shù)量)。在使用的操作條件下(典型地，75％相對(duì)濕度和大約25℃)，每針每裝載循環(huán)打印超過一百個(gè)斑點(diǎn)。在以上條件下，點(diǎn)樣在PDMS基質(zhì)上的試劑的體積是0.1nl級(jí)的。
針尖端的大小為125×125μm。干燥的試劑的最終斑點(diǎn)實(shí)質(zhì)上是小于此的(小到直徑7μm)，針的大小依然決定可容易獲得的斑點(diǎn)間距的下限。可獲得的間距決定了最終設(shè)備中最小的孔-至-孔間距。使用這樣的設(shè)備和前述的方法，可獲得180μm間距的陣列。構(gòu)建在工作片中的陣列趨向于具有從600到1300微米的間距。
在某時(shí)間僅使用一個(gè)針進(jìn)行點(diǎn)樣。然而，使用的系統(tǒng)具有可容納達(dá)到32個(gè)針的針頭部。打印標(biāo)準(zhǔn)尺寸的片(20×25nm級(jí)陣列大小)花費(fèi)低于5分鐘。
B.點(diǎn)樣的片的組合PCR設(shè)備的流動(dòng)和控制層根據(jù)以上描述的正常MSL程序組合。微流體設(shè)備設(shè)計(jì)與例1中所描述的那個(gè)相同。同時(shí)，包含A∶B成分比30∶1的150μm厚PDMS的基質(zhì)層，通過旋轉(zhuǎn)被覆空白硅晶片，以及然后在80℃固化90分鐘。
固化的PDMS空白基質(zhì)層(圖7A的封閉/基層724)用作為試劑點(diǎn)樣的目標(biāo)。點(diǎn)樣的圖案被打印在仍然在空白晶片上的基質(zhì)上，用于PCR反應(yīng)的點(diǎn)樣的試劑是即將被擴(kuò)增的特定基因的特異性引物和探針。點(diǎn)樣的試劑包含體積比1∶1∶1的300nM β肌動(dòng)蛋白前向引物(FP)，300nM nMβ肌動(dòng)蛋白逆向引物(RP)，和200nM β肌動(dòng)蛋白探針(Prb)。在某些情況下，通過濃縮點(diǎn)樣的混合物進(jìn)一步調(diào)整化學(xué)性質(zhì)是有用的。已發(fā)現(xiàn)調(diào)整濃度以使引物和探針濃度等于或稍微高于常規(guī)宏觀的配方值產(chǎn)生一致性良好結(jié)果。因此，點(diǎn)樣的試劑被濃縮至宏觀反應(yīng)濃度的3倍和4倍。試劑的濃縮在Centrivap加熱和抽空離心分離機(jī)內(nèi)進(jìn)行并且不改變FP∶RP∶Prb的相對(duì)比值。斑點(diǎn)濃度的增加產(chǎn)生當(dāng)試劑在1nl反應(yīng)體積被重新懸浮時(shí)的恰當(dāng)終濃度。點(diǎn)樣的試劑不需限制為引物和探針；也不必所有三者(FP、RP和Prb)被點(diǎn)樣。可以進(jìn)行只有探針、或甚至引物之一被點(diǎn)樣的應(yīng)用。點(diǎn)樣的樣本引物/探針套是TaqManβ肌動(dòng)蛋白和TaqManRNAse-P的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行。
在基質(zhì)層上點(diǎn)樣過程之后，結(jié)合的流動(dòng)和控制層(即圖7A的層720和722)與斑點(diǎn)圖案對(duì)齊并接觸。使用進(jìn)一步在80℃烘烤60-90分鐘以將基質(zhì)結(jié)合至片的其余部分。在片組裝后，PCR反應(yīng)的其余成分(在例1中描述)被注入片的流動(dòng)通道以及片被如例1中所述進(jìn)行熱循環(huán)。
III.結(jié)果使用其中引物(向前和反向引物)和探針分子被點(diǎn)樣的設(shè)備，連續(xù)地和重復(fù)地執(zhí)行PCR反應(yīng)。類子芯片的數(shù)據(jù)例被顯示在圖10中，在該芯片中連續(xù)執(zhí)行反應(yīng)。點(diǎn)樣的試劑產(chǎn)生如在例子1中限定的連續(xù)PCR反應(yīng)。使用2階和3階熱循環(huán)協(xié)議連續(xù)執(zhí)行反應(yīng)。
例3基因定型I.介紹下面試驗(yàn)的目的是闡述利用這里所述的例如微流體設(shè)備或芯片可以實(shí)施基因定型試驗(yàn)。具體地，這些試驗(yàn)被設(shè)計(jì)以確定在該設(shè)備中實(shí)施的反應(yīng)是否具有足夠的靈敏度且確保除β肌動(dòng)蛋白之外其它引物/探針集合可被執(zhí)行在微流體設(shè)備中。
II.方法/結(jié)果A.Rnase P試驗(yàn)如例1中所述在微流體設(shè)備中執(zhí)行Rnase P TaqMan反應(yīng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster city，CA)，以說明其它引物/探針集合產(chǎn)生可檢測的結(jié)果。Rnase P反應(yīng)還要求更高靈敏度，因?yàn)榕cβ肌動(dòng)蛋白引物/探針集合相對(duì)照Rnase P引物/探針集合檢測單拷貝基因(2拷貝/染色體組)。β肌動(dòng)蛋白集合檢測單拷貝β肌動(dòng)蛋白基因和幾種假基因，它們每個(gè)染色體組集中總共近似17份。使用如例1中所述的相同組成運(yùn)行Rnase P反應(yīng)，除了β肌動(dòng)蛋白引物/探針集合由Rnase P引物/探針集合取代之外。另外，Rnase P引物/探針集合在4×制造商推薦數(shù)值處被使用，以增強(qiáng)熒光信號(hào)。將VIC染料共軛結(jié)合至用于Rnase P的探針，并且關(guān)注針對(duì)VIC/PRI比率分析。四種試驗(yàn)之一的結(jié)果被顯示在圖11中。
用于Macro TaqMan反應(yīng)的VIC/PRI/對(duì)照比率是1.23。用于微流體設(shè)備中TaqMan反應(yīng)的相應(yīng)比率是1.11和1.21。微流體設(shè)備中染色體組DNA樣本的比率在高于99％確信閾值之上。另外，微流體設(shè)備中TaqMan反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度為Macro TaqMan反應(yīng)的50％和93.7％。微流體設(shè)備中對(duì)照TaqMan反應(yīng)具有標(biāo)準(zhǔn)偏差.006和.012，說明了在微流體設(shè)備上的反應(yīng)連貫性。因此，確定芯片中TaqMan反應(yīng)是靈敏的，足夠檢測每個(gè)染色體組的2個(gè)拷貝。
B.DNA稀釋試驗(yàn)為了進(jìn)一步確定微流體設(shè)備中TaqMan反應(yīng)的靈敏度，對(duì)染色體組DNA的稀釋液進(jìn)行測試，使用β肌動(dòng)蛋白引物/探針集合。反應(yīng)組成通常與例子1中所述的一樣被組成，使用4×DyNAzyme和染色體組DNA的稀釋液。染色體組DNA被稀釋至0.25pg/nl之下，其相應(yīng)于近似每nl1份。一種稀釋系列的結(jié)果被顯示在圖12中。
根據(jù)泊松分布，如果平均目標(biāo)數(shù)為一，則孔總數(shù)的37％應(yīng)當(dāng)為負(fù)的。孔數(shù)5、6和7低于計(jì)算的閾值，因此是負(fù)的。這建議微流體芯片中的β肌動(dòng)蛋白TaqMan反應(yīng)可以檢測每nl一份的平均值。因此，微流體設(shè)備中的反應(yīng)靈敏度是足以執(zhí)行基因定型試驗(yàn)的。
C.基因定型試驗(yàn)因?yàn)槲⒘黧w設(shè)備中的TaqMan能夠檢測低目標(biāo)數(shù)，預(yù)先測試SNP(單核苷酸多態(tài))，所以使用針對(duì)CYP2D6 P450細(xì)胞色素基因的預(yù)定AllelicDiscrimination包(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA)執(zhí)行基因定型。所述包包含一引物集和兩探針；標(biāo)示用于野生型或參考等位基因的FAM，CYP2D6*1和標(biāo)示用于CYP2D6*3突變或變異等位基因的VIC。用于沿染色體組DNA的各個(gè)等位基因的正極性對(duì)照、PCR產(chǎn)物在設(shè)備中被測試，使用與例1中所述的相同條件。來自一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果被顯示在圖13和14中，該試驗(yàn)被重復(fù)至少三次，以驗(yàn)證結(jié)果和論述可靠性。
如圖13中所示，分別被產(chǎn)生3.5和2.2的平均VIC/PRI/對(duì)照比率的A1-1(Allele 1，CYP2D6*1野生型等位基因)和染色體組DNA(100pg/nl)，指示染色體組DNA是用于CYP2D6*1野生型等位基因的正極性。這些數(shù)值在用于反應(yīng)的閾值限之上。微流體設(shè)備中TaqMan反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度分別是Macro TaqMan對(duì)照的59％和40％。在VIC通道中應(yīng)當(dāng)位負(fù)的的A1-2(Allele 2，CYP2D6*3突變或變異等位基因)，被顯示在對(duì)照(1.5)之上的一些信號(hào)，可能因?yàn)镕AM熒光泄漏進(jìn)檢測器的VIC通道。使用改進(jìn)的檢測處理可將泄漏最小化。
A1-2正極性對(duì)照給出3.0的平均VIC/PRI/對(duì)照比率，其為MacroTaqMan信號(hào)的37％和在計(jì)算的閾值限之上(見圖14)。用于CYP2D6*3突變等位基因的染色體組樣本是負(fù)的，由于CYP2D6*3等位基因的頻率是低的期望結(jié)果。再者，顯示有一些A1-1、VIC探針的泄漏進(jìn)入檢測器的FAM通道。總的來說，SNP檢測反應(yīng)在微流體設(shè)備中是成功的。
例4使用凝膠電泳的PCR校驗(yàn)I.介紹當(dāng)證實(shí)DNA擴(kuò)增的可選擇方法發(fā)生在微流體設(shè)備中時(shí)，使用凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的試驗(yàn)被執(zhí)行。PCR反應(yīng)組成與例子1中所述的一樣，除了TaqMan探針被省略和β肌動(dòng)蛋白向前引物被共軛結(jié)合至FAM。
II.過程A.微流體設(shè)備使用MSL處理制造的三層微流體設(shè)備被設(shè)計(jì)和制造，用于實(shí)施在這個(gè)例子中所述的試驗(yàn)；圖15顯示該設(shè)計(jì)的示意圖。設(shè)備1500一般包括樣品區(qū)域1502和對(duì)照區(qū)域1504。樣品區(qū)域1502包含三百四十一個(gè)1nl反應(yīng)點(diǎn)1508，該反應(yīng)點(diǎn)由沿流動(dòng)通道1506排列的矩形所表示，流動(dòng)通道1506包括進(jìn)入通孔1510和出去通孔1512。對(duì)照區(qū)域1504包含三個(gè)控制流動(dòng)通道1514，各個(gè)流動(dòng)通道包含1nl反應(yīng)點(diǎn)1518，同樣由矩形和進(jìn)入通孔1516所表示。在足夠壓力被施加給進(jìn)入通孔1524中時(shí)，控制線網(wǎng)1522隔離各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)1508、1518。包括一系列保護(hù)通道1520，以阻止流體蒸發(fā)到反應(yīng)點(diǎn)1508、1518的外面。該設(shè)備與例1中所述的一樣是三層設(shè)備(見圖7A)。整個(gè)芯片被放置在蓋玻片上。
B.試驗(yàn)配置使用例1中所述的3個(gè)溫度曲線，加載和熱循環(huán)微流體設(shè)備1500。殘留的反應(yīng)樣本在GeneAmp 9700中被熱循環(huán)，使用與用于微流體設(shè)備1500一樣的熱循環(huán)曲線。在熱循環(huán)被完成之后，反應(yīng)產(chǎn)物被再現(xiàn)。為了再現(xiàn)擴(kuò)增的DNA，將3μl水注入樣本通孔1506，并且從出通孔1512取出3-4μl產(chǎn)物。來自設(shè)備1500和Marco反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物被使用2μl ExoSAP-IT(USB，Cleveland，OH)被處理，ExoSAP-IT由DNA Exonuclease I和ShrimpAlkaline Phosphatase組成，以去除過量的核苷酸和引物。Marco產(chǎn)物被從1∶10稀釋至1∶106。設(shè)備1500中的產(chǎn)物被脫水，以及被重新懸浮在4μl甲酰胺中。
III.結(jié)果針對(duì)聚丙烯酰胺凝膠，連同負(fù)對(duì)照一起對(duì)兩個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行分析。圖15顯示凝膠電泳結(jié)果。在圖16中觀察到在長度上294帶基對(duì)的合適大小DNA帶。
來自Marco反應(yīng)的產(chǎn)物被示出在凝膠的左手側(cè)，并且對(duì)應(yīng)于大約294帶基對(duì)(β肌動(dòng)蛋白PCR產(chǎn)物所期望的大小)。負(fù)對(duì)照缺少PCR產(chǎn)物。類似地，從該設(shè)備中得到的產(chǎn)物給出期望的β肌動(dòng)蛋白PCR產(chǎn)物。因此，目標(biāo)DNA在微流體設(shè)備中被擴(kuò)增。
例5大塊分割聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)成為分子生物學(xué)中的主要工具。其與靈敏度(DNA單個(gè)分子的擴(kuò)增)、特異性(區(qū)分單帶基失配)和動(dòng)態(tài)范圍(實(shí)時(shí)測試設(shè)備的105)的組合使其成為現(xiàn)有中最強(qiáng)大分析工具之一。描述了當(dāng)反應(yīng)容積減小時(shí)PCR性能提高我們?cè)趩挝⒘黧w芯片上執(zhí)行21000個(gè)同時(shí)發(fā)生的PCR反應(yīng)，在每個(gè)反應(yīng)90pL的容積中且具有單溫度分子靈敏度。
圖17a-17d描繪了單排和雙排分割微流體設(shè)備，其中多層軟光蝕刻(MSL)(1)被用于產(chǎn)生彈性微流體芯片，該彈性微流體芯片起到活動(dòng)閥門的作用，以將幾種流體樣本中的每個(gè)大塊地隔離為大量隔離的反應(yīng)容積。在樣本備注如入口1703之后，所述入口1703與微流體設(shè)備1701中的分支隔離通道系統(tǒng)1705相連通(圖17b)，2400個(gè)各個(gè)樣本的90pL容積1709由沿單微流體通道(圖17d)間隔開的關(guān)閉閥1707隔離開。然后，芯片設(shè)備在平板熱循環(huán)器上被熱循環(huán)，以及在在市場上可以買到的熒光度數(shù)器中成像。
通過改變模板DNA的濃度以及測量給出正極性Taqmantm信號(hào)的孔的數(shù)量，評(píng)估芯片中的PCR性能。我們發(fā)現(xiàn)，在每孔復(fù)制品的平均數(shù)量是低的時(shí)觀察到數(shù)字?jǐn)U增(圖18a和18b)。即使在每孔平均數(shù)量復(fù)制品低于1時(shí)，也觀察到強(qiáng)化正極性和清楚的負(fù)極性信號(hào)；這意味著甚至目標(biāo)的單復(fù)制品可能具有良好擴(kuò)增。正極性孔的數(shù)量與計(jì)算的控?cái)?shù)量是一致的，以通過Poisson(泊松)分布具有≥1的目標(biāo)版本(圖19)。這種結(jié)果確認(rèn)這種系統(tǒng)即使根據(jù)單目標(biāo)版本也具有恒定的擴(kuò)增。來自微流體TaqmantmPCR的熒光信號(hào)強(qiáng)度針對(duì)宏觀PCR反應(yīng)與相同DNA濃度是可比較的-即使宏觀反應(yīng)每個(gè)反應(yīng)包含多于＞104個(gè)模板版本。
也許被觀察的確限度(fidelity)的主要來源是目標(biāo)的有效濃度90pL容積中的單分子比5μL容積中的單分子濃于55000倍。由于目標(biāo)分子數(shù)nt沒有改變(也就是，nt＝1)以及可產(chǎn)生側(cè)反應(yīng)的分子數(shù)ns(也就是，樣本中的引物-二聚物和非互補(bǔ)DNA序列)與容積成線性比例的(也就是，ns∝V)，目標(biāo)對(duì)側(cè)反應(yīng)的比率與容積成反比例nt/ns∝1/V。由于側(cè)反應(yīng)是PCR事故(4)的主要原因，則減小反應(yīng)容積的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。
從模板的單拷貝的PCR擴(kuò)增已經(jīng)在前面被報(bào)告(5)。然而，在宏觀容積中實(shí)現(xiàn)從單拷貝可靠擴(kuò)增的當(dāng)前方法經(jīng)常需要改變熱循環(huán)協(xié)議(例如，長延展時(shí)間，許多循環(huán))、對(duì)錯(cuò)誤引物(mispriming)和非特定擴(kuò)增(例如，“熱啟動(dòng)”PCR(聚合酶的熱激勵(lì))、“增壓器”PCR、添加劑，以減少非特定雜交等)的預(yù)防措施，并且?guī)缀跻恢笔褂脙扇CR作出，其中第一PCR中的部分被用作第二反應(yīng)中的模板。相相反地，這種系統(tǒng)從單拷貝實(shí)現(xiàn)可靠的擴(kuò)增，使用標(biāo)準(zhǔn)條件離開隔板引物和探針和單圈標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)協(xié)議。作為完整地封閉，還幾乎不受環(huán)境污染的影響。相比于宏觀容積(，同時(shí)作大量PCR反應(yīng)的能力提供明確邏輯的、成本和時(shí)間益處具有21000個(gè)反應(yīng)的1芯片對(duì)219個(gè)分離的96孔板，以及相關(guān)聯(lián)時(shí)間、設(shè)備和跟蹤基礎(chǔ)結(jié)構(gòu))。
使用數(shù)字PCR讀出的大量分離的這種原理可以被用于樣本中目標(biāo)濃度的絕對(duì)數(shù)量。例如，可被使用的是，簡單地通過統(tǒng)計(jì)給出如上所述的特定等位基因或多個(gè)等位基因正極性的孔數(shù)量，對(duì)染色體組DNA的存儲(chǔ)(pool)樣本基因定型。由于對(duì)側(cè)反應(yīng)的增強(qiáng)阻力，在量化野生型DNA中的突變異種(相關(guān)于癌癥檢測的問題)中，應(yīng)當(dāng)還是可使用的。通過隔離的濃度的一般原則在其它反應(yīng)中可能還是有用的，在其中對(duì)單分子、細(xì)菌、病毒或細(xì)胞的檢測是感興趣的(例如，用于蛋白質(zhì)檢測的ELISA反應(yīng))。Brown等的US專利No.6143496、名稱為“Method of sampling，amplifying and quantifying segment of nucleic acid，polymerase chain reactionassembly having nanoliter-sized chambers and methods of filling chambers”以及Vogelstein等的US專利No.6446706、名稱為“Digital PCR”描述了數(shù)字PCR，從而其兩者通過以其全文引用被結(jié)合。使用微流體設(shè)備可獲得的小容積允許高度并行化和非常高的目標(biāo)-背景濃度比率。高目標(biāo)-背景濃度比率允許單分子擴(kuò)增確限度。這些因素建議用于PCR，越小越好。
本發(fā)明提供用于在微流體環(huán)境中實(shí)施數(shù)字PCR的方法和設(shè)備，所述方法包括步驟提供在其中流體通道的微流體設(shè)備，所述流體通道具有在其間相關(guān)的兩個(gè)或更多閥門，閥門被啟動(dòng)時(shí)能夠?qū)⒘黧w通道隔離為兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)或腔體；引入包含至少一個(gè)目標(biāo)核酸聚合體的樣本，啟動(dòng)閥門將流體樣本隔離為兩個(gè)或多個(gè)部分，其中至少一部分包含目標(biāo)核酸聚合體，而另一部分不包含目標(biāo)核酸聚合體，擴(kuò)增目標(biāo)核酸聚合體，以及確定包含目標(biāo)分子的流動(dòng)通道部分的數(shù)量。在優(yōu)選實(shí)施例中，微流體設(shè)備包括彈性體材料，更優(yōu)選地包括包含彈性體材料的至少一層。在具體優(yōu)選實(shí)施例中，微流體設(shè)備進(jìn)一步包括可偏轉(zhuǎn)的隔膜，其中可偏轉(zhuǎn)的隔膜可偏轉(zhuǎn)入流體通道或偏轉(zhuǎn)出流體通道，以控制流體通道內(nèi)的流體流和/或隔離流體通道中一部分與另一部分，優(yōu)選地其中可偏轉(zhuǎn)的隔膜對(duì)于微流體設(shè)備層來說是完整的，在其中具有形成在其中的通道或進(jìn)出口，以及優(yōu)選地其中形成可偏轉(zhuǎn)的隔膜，在該處微流體設(shè)備的第一層中的第一通道由第二層中的第二通道所重疊。在一些實(shí)施例中，樣本流體包含實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)所需的所有部件，而在其它實(shí)施例中，在引入樣本流體之前，微流體設(shè)備包含擴(kuò)增反應(yīng)的至少一個(gè)部件。在一些實(shí)施例中，微流體設(shè)備進(jìn)一步包括檢測試劑，優(yōu)選地對(duì)至少部分目標(biāo)核酸聚合物有用的(complimentary)一個(gè)或多個(gè)核酸聚合物，優(yōu)選地多種不同核酸聚合物在空間上排列在微流體設(shè)備的反應(yīng)點(diǎn)或腔體內(nèi)。
通過例如PCR的熱循環(huán)反應(yīng)或者通過絕熱反應(yīng)可以獲得擴(kuò)增，所述絕熱反應(yīng)例如由Van Ness等描述在美國專利申請(qǐng)No.10/196740中，其被公告為US2003/0138800A1，其再次通過引用其全文用于教導(dǎo)絕熱擴(kuò)增放案的目的被結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步使用熒光染料用于蛋白質(zhì)微量熱法測定，例如SYBER綠(TM)，以測量蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，例如變性，尤其是如果在蛋白質(zhì)與例如配合基或復(fù)合物或其他蛋白質(zhì)的另一半族(moiety)相互作用時(shí)蛋白質(zhì)變形溫度改變。使用SYBR綠(TM)的另外優(yōu)點(diǎn)在于它在比其他UV范圍染料低的波長處被使用，從而減少典型地與許多塑料材料相關(guān)的背景問題。
圖22B描繪了完整的微流體設(shè)備2899的展開圖，所述微流體設(shè)備2899包括圖22A中所示的部件，且進(jìn)一步包括彈性材料塊2808，所述彈性材料塊2808被附連或更優(yōu)選地使用粘結(jié)劑被粘結(jié)以及更優(yōu)選地直接被粘結(jié)，優(yōu)選地不使用至基底2800的彈性材料塊位置2807的粘結(jié)劑以形成完整的微流體設(shè)備2899(圖22C)。在彈性材料塊2808內(nèi)是處于與一個(gè)或多個(gè)通孔2814相流體連通的一個(gè)或多個(gè)通道，所述通孔2814接下來提供彈性材料塊內(nèi)通道和基底內(nèi)通道之間的流體連通，所述流體連通然后在井排2806a-d內(nèi)產(chǎn)生井(well)2805以提供基底2800的井(well)2805和彈性材料塊2808內(nèi)通道之間的流體連通。累積器井(well)頂部2809和2810被附連至累積器井(well)2801和2802以形成累積器腔2815和2816。累積器井(well)頂部2809和2810分別包括閥門2812和2811，其優(yōu)選為在壓力下用于引導(dǎo)和保持氣體進(jìn)入累積器腔2815和2816的止回閥門。當(dāng)存在于累積器腔2815和2816內(nèi)時(shí)，閥門2811和2812為了保持液體而適于距離接觸閥門2811和2812被定位在排水井2802和2804內(nèi)側(cè)。閥門2811和2812可優(yōu)選是在優(yōu)選止回閥門內(nèi)通過擠壓薄片、銷釘?shù)榷粰C(jī)械打開的，以克服止回閥門的自動(dòng)關(guān)閉力，以允許從累積器腔釋放壓力從而降低被包含在累積器腔內(nèi)的流體壓力。
圖22B描繪了完整的微流體設(shè)備2899的展開圖，所述微流體設(shè)備2899包括圖22A中所示的部件，且進(jìn)一步包括彈性材料塊2808，所述彈性材料塊2808被附連或更優(yōu)選地被粘結(jié)以及更優(yōu)選地直接被粘結(jié)，優(yōu)選地不使用至基底2800的彈性材料塊位置2807的粘結(jié)劑以形成完整的微流體設(shè)備2899(圖22C)。在彈性材料塊2808內(nèi)是處于與一個(gè)或多個(gè)通孔2814相流體連通的一個(gè)或多個(gè)通道，所述通孔2814接下來提供彈性材料塊內(nèi)通道和基底內(nèi)通道之間的流體連通，所述流體連通然后在井排2806a-d內(nèi)產(chǎn)生孔(well)2805以提供基底2800的孔(well)2805和彈性材料塊2808內(nèi)通道之間的流體連通。累積器井(well)頂部2809和2810被附連至累積器井(well)2801和2802以形成累積器腔2815和2816。累積器井(well)頂部2809和2810分別包括閥門2812和2811，其優(yōu)選為在壓力下用于引導(dǎo)和保持氣體進(jìn)入累積器腔2815和2816的止回閥門。當(dāng)存在于累積器腔2815和2816內(nèi)時(shí)，閥門2811和2812為了保持液體而適于距離接觸閥門2811和2812被定位在排水井2802和2804內(nèi)側(cè)。閥門2811和2812可優(yōu)選是在優(yōu)選止回閥門內(nèi)通過擠壓薄片、銷釘?shù)榷粰C(jī)械打開的，以克服止回閥門的自動(dòng)關(guān)閉力，以允許從累積器腔釋放壓力從而降低被包含在累積器腔內(nèi)的流體壓力。
圖22D描繪了微流體設(shè)備2899和井(well)2805的平面圖，其中斷口被鄰近井(well)基底被定位，優(yōu)選底部，或可選擇地井(well)2805的側(cè)面，用于從京津如形成在基底2800中通道的流體的通過，優(yōu)選在井(well)2805對(duì)過在基底2800的側(cè)面上。在具體優(yōu)選實(shí)施例中，基底2800被模制，在其中帶有凹槽，所述凹槽通過優(yōu)選粘結(jié)劑膜或密封層的密封層被制造在通道中。
基底2800機(jī)器相關(guān)部件可以由聚合物制造，例如聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚三氟氯乙烯PTFE或Teflon(R)、玻璃、石英或金屬(例如鋁)、透明材料、多晶硅等等。累積器井(well)頂部2809和2810進(jìn)一步可包括進(jìn)口螺旋2812，可以將進(jìn)口螺旋2812去除以從累積器腔2815和2816導(dǎo)入或去除氣體或液體，優(yōu)選地，閥門2812和2811可被啟動(dòng)以釋放否則保持在累積器腔2815和2816內(nèi)的流體壓力。使用凹口2817協(xié)助校正微流體設(shè)備在其它儀器中的位置，例如，用于操作或分析微流體設(shè)備或在其中執(zhí)行反應(yīng)的儀器圖22D進(jìn)一步描述圍繞彈性材料塊區(qū)域2807的水合腔2850，所述水合腔可以使用水合蓋體2851覆蓋以形成濕潤腔，以有利于對(duì)彈性材料塊周圍濕度的控制。通過將例如水的揮發(fā)性液體添加至水合腔2851可以增加濕度，優(yōu)選通過對(duì)吸附材料或海綿增濕。可優(yōu)選使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)。通過改變優(yōu)選用于增濕吸附材料或海綿的聚乙烯醇和水的比率可以獲得濕度控制。通過使用例如HUMIDIPAKTM濕潤封裝的濕度控制設(shè)備還可以控制水合，所述濕度控制設(shè)備例如使用水蒸氣可透過的而液體不可透過的密封袋容納具有適于維持理想濕度值的鹽濃度的鹽溶液。參見Saari等的US專利No.6244432，在這里通過引用用于包括濕度控制設(shè)備和方法的特定目的的所有目的被結(jié)合。水合蓋體2850優(yōu)選是透明的，以為了在使用期間在彈性材料塊內(nèi)不掩蓋可視化的情況。同樣地，在彈性材料塊區(qū)域2807下面的基底2800的部分優(yōu)選是透明的，但也可是模糊的或反射的。
圖22E描繪了基底2800的橫截面圖，帶有沿密封層2881被定位在彈性材料塊區(qū)域2807的彈性材料塊808，所述密封層2800在彈性材料塊2808的對(duì)面被附連到基底2800的側(cè)面。井(well)2805處于與彈性材料塊2808流體連通中，通過第一端口2890、通道2870和第二端口2892、進(jìn)而進(jìn)入彈性材料層2808的凹槽，所述凹槽由基底2800的上頂面2897密封以形成通道2885。密封層2881由模制或加工入基底2800底表面2898的凹槽形成通道2870。密封層2881優(yōu)選是透明材料，例如聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯。在一個(gè)實(shí)施例中，密封層2881是彈性的，例如粘接帶，并且可通過粘接被附連到基底2800，例如使用粘接劑或加熱密封或機(jī)械附連，例如通過壓縮。用于密封層2881的材料優(yōu)選是易于形成帶有凹槽的流體密封的，以形成具有最小泄露的流體通道。密封層2881可進(jìn)一步由是剛性的附加支承層(未顯示)支承。在另一實(shí)施例中，密封層2881是剛性的。
流體的閉合細(xì)節(jié)展示了基底2800的彈性材料塊2808和彈性材料塊區(qū)域2807之間界面。如在Grossman等待審查專利申請(qǐng)US11/043395中所描述的，其中用于這里這里和那里掃描述的所有目的而被結(jié)合，以及用于公開關(guān)于集成載體和自動(dòng)啟動(dòng)設(shè)備的使用的進(jìn)一步細(xì)節(jié)的目的，由被結(jié)合在一起以形成彈性材料塊的多層彈性材料可以形成彈性材料塊。優(yōu)選地，具有形成在那里的凹槽的第一彈性材料層被粘接至具有形成在那里的凹槽的第二材料層，以形成形成在那里的凹槽的彈性材料塊。第一彈性材料層的凹槽被整體或部分阻塞，以形成在第一彈性材料層中的通道。當(dāng)彈性層被粘接至基底時(shí)，形成在第二材料層中的凹槽同樣地被整體或部分阻塞，以形成第二彈性材料層中的通道，從而形成具有形成在其中帶有通道的多層的微流體設(shè)備。
在圖23中，第一彈性材料層2920和第二彈性材料層2923被粘接在一起以形成具有通道2907(由第一凹槽2901和第二彈性材料層2923頂面形成)的彈性材料塊，所述第一彈性材料層2920具有形成在其中帶有第一凹槽2901的底表面，所述第二彈性材料層2923具有形成在其中的帶有第二凹槽2905的頂表面和底表面。基底2800被附連到第二彈性材料層2923的底表面，以由基底2800的頂表面2897和第二彈性材料層2923的底表面形成通道2909。端口2892可使用第二彈性材料層的通道2909連接基底2800的通道2872，通道2909部分通過基底2800的頂表面形成。可替換地如圖23中所示，經(jīng)由通孔2950，端口2892使用彈性材料塊2808的第一彈性材料層2920的通道2907連接基底2800的通道2872。通孔2950大約垂直于基底表面2897被形成，優(yōu)選形成在第二彈性材料層2923，在其與彈性材料層2920粘接之前，以及更具體在第一和第二彈性層被粘接在一起之后。參見待審查的且共同受讓的由Unger于2004年三月29日提出的US臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/577715，其通過用于所有目的和教導(dǎo)經(jīng)由構(gòu)成使用自動(dòng)激光消融系統(tǒng)和方法的專用目的而被結(jié)合。用于制造通孔的示例方法包括包括微制造同時(shí)形成第二彈性材料層2923、激光專控、使用CO2激光器的激光鉆孔、使用受激準(zhǔn)分子激光器的激光鉆孔、機(jī)械鉆孔和取芯，優(yōu)選地其中使用機(jī)器人鉆孔系統(tǒng)執(zhí)行鉆孔，優(yōu)選地具有x、y自動(dòng)階段的鉆孔系統(tǒng)。
圖23描繪通孔的另一優(yōu)選使用的橫截面圖，所述通孔位于這里所述的微流體設(shè)備中。微流體塊2921包括具有形成在其中的第一層凹槽(或粘接至第二層時(shí)的通道)2907的第一層2920和具有在其中的第二層凹槽(或粘接至基底時(shí)的通道)2950的第一層2923。兩個(gè)第二層通道處于穿過第一層通道的流體連通中，使用兩個(gè)或多個(gè)通孔2950。優(yōu)選地，至少一個(gè)通孔2950處于與基底2800中的孔2999另外流體連通中，穿過基底凹槽2892(或者通道，如果密封層(未顯示)被結(jié)合至基底2800)。至少一個(gè)第二層通道2909被第一層通道2907重疊，沒有處于流體連通中。在圖23中所示的實(shí)施例中，因?yàn)橐粚又械牧黧w通道可以在同一層中的居間流體通道上或下行進(jìn)，所以得到微流體設(shè)備中每單元面積的較高密度的反應(yīng)和/或檢測帶。有消融碎片腔2989，用于收集由激光消融通孔2950產(chǎn)生的碎片。使用兩層鑄造方法可以將碎片腔2989鑄入層2920內(nèi)，其中在第一光致抗蝕劑層被圖案化和開發(fā)出之后，第二光致抗蝕劑層被重疊在第一圖案上，并且第二圖案被形成在第一光致抗蝕劑層的圖案上，以致于使光致抗蝕劑圖案區(qū)域可以是不同高度。一個(gè)在另一個(gè)上可以構(gòu)造多層，以產(chǎn)生變化高度的圖案。不同光致抗蝕劑材料還可以被使用，以使例如光致抗蝕劑上層能夠在被加熱時(shí)重新流動(dòng)，然而下層由在相同加熱溫度出基本上不會(huì)重新流動(dòng)的光致抗蝕劑材料制造。
本發(fā)明的流動(dòng)通道取決于它們想要的應(yīng)用可選擇地被設(shè)計(jì)具有不同橫截面尺寸和形狀，呈現(xiàn)不同優(yōu)點(diǎn)。例如下流動(dòng)通道的橫截面形狀可以具有彎曲的上表面，或者沿其整個(gè)長度或處于設(shè)置在上橫截通道下面的區(qū)域中。這種彎曲上表面有利于閥門密封，如下面。通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的隔膜厚度剖面和流動(dòng)通道橫截面包括矩形的、梯形的、圓形的、橢圓形的、拋物面形的、雙曲線形的和多邊形的，還有上面形狀部分。更復(fù)雜橫截面形狀，例如具有隆起部分(protrusion)的實(shí)施例或在流動(dòng)通道中具有凹陷的實(shí)施例，還使用本發(fā)明被實(shí)現(xiàn)。
另外，盡管本發(fā)明主要結(jié)合其中流動(dòng)通道的壁和天花板由彈性體構(gòu)成且流動(dòng)通道的地面由下面基底構(gòu)成的實(shí)施例被描述，但是本發(fā)明不限于這種具體定位。通道的壁和地面還可能被形成在下面基底中，流動(dòng)通道中只有天花板由彈性體構(gòu)造。響應(yīng)施加的激勵(lì)力，這種彈性體流動(dòng)通道天花板將向下突出進(jìn)入通道，從而控制穿過流動(dòng)通道的材料的流動(dòng)。一般地，單片彈性體結(jié)構(gòu)優(yōu)選用于微流體應(yīng)用。盡管可能有用的是，采用形成在基底中的通道，其中這種結(jié)構(gòu)具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，包括光波導(dǎo)的基底可以被構(gòu)造，以使光波導(dǎo)專門將光引導(dǎo)至微流體設(shè)備的側(cè)面。
本發(fā)明的微流體設(shè)備可被用作單獨(dú)的設(shè)備，或優(yōu)選地可被用作如由本發(fā)明所提供的系統(tǒng)中的部件。圖24描繪了用于起動(dòng)微流體設(shè)備的機(jī)器人站的透視圖。自動(dòng)氣動(dòng)控制和累積器裝料站3200包括接受灣(bay)3203，用于保持本發(fā)明的微流體設(shè)備3205，例如在圖22A-22E中所描繪的類型。壓盤3207適于接觸微流體設(shè)備3205的上面3209。壓盤3207在其中具有于微流體設(shè)備3205對(duì)齊的端口，以將優(yōu)選氣體壓力的流體壓力提供至微流體設(shè)備3205內(nèi)的孔和累積器。在一個(gè)實(shí)施例中，壓案3207通過臂3211的運(yùn)動(dòng)被推動(dòng)向微流體設(shè)備3205的上面3221，所述臂3211懸掛在樞軸3213上且通過活塞3215被激勵(lì)，所述活塞3215在一端被連接至3211且在另一端被連接至平臺(tái)3217。沿活塞3215的傳感器檢測活塞運(yùn)動(dòng)和將關(guān)于活塞位置的信息中轉(zhuǎn)至控制器，優(yōu)選地在遵循軟件腳本(software script)的計(jì)算機(jī)(未顯示)控制下的控制器。壓盤檢測器3219檢測微流體設(shè)備3205在接收灣3203內(nèi)側(cè)的存在，優(yōu)選地可檢測為流體鎖骨把3205的正確定位。例如通過將光偏離微流體設(shè)備3205的側(cè)面使用光檢測微流體設(shè)備3205的存在和位置，這可能實(shí)現(xiàn)。壓盤3207可以機(jī)器人化地、氣動(dòng)地、電力地等等被下降。在一些實(shí)施例中，壓盤3207被手動(dòng)下降以結(jié)合設(shè)備3205。
在一個(gè)實(shí)施例中，指向壓盤3207的流線被定位在臂3211內(nèi)且被連接到流體壓力源，優(yōu)選在控制器控制下的自動(dòng)氣動(dòng)壓力源。壓力源將控制流體壓力提供給壓盤3207的壓盤表面(未顯示)內(nèi)的端口，將受控壓縮流體供給至微流體設(shè)備3205。通過采用壓盤3207連接至臂3211的萬向節(jié)(gimbal joint)3223，至少部分地實(shí)現(xiàn)對(duì)壓盤3207的微定位，以使壓盤3207可圍繞垂直微流體設(shè)備3205上表面3221的軸用萬向架固定。
圖25描繪了壓盤3207的剖開側(cè)面圖，所述壓盤3207被推向微流體設(shè)備3205的上表面3221。壓盤3207被推向微流體設(shè)備3205上表面3221，以形成在微流體設(shè)備3205和壓盤面3227之間或設(shè)備32056部分和表面3227之間的流體密封。在一個(gè)實(shí)施例中，壓盤面3227包括或由順應(yīng)材料制造，例如彈性彈性體，優(yōu)選耐久橡膠等。壓盤3207內(nèi)是分離流體壓力線，優(yōu)選氣體壓力線，其與微流體設(shè)備3205的上表面3221上各個(gè)位置相匹配。還示出的是止回閥(check valve)凈化致動(dòng)器3233，所述止回閥凈化致動(dòng)器3233優(yōu)選氣動(dòng)地被激勵(lì)以及在被激勵(lì)時(shí)將銷釘3231向下推入止回閥2812，以打開和緩解流體壓力，或者通過克服其開啟阻力允許流體通過止回閥2718的引入。在一個(gè)實(shí)施例中，壓盤3207具有第一和第二凈化致動(dòng)器3233，其與止回閥2811和2812嚙合(見圖22B)。
在另一實(shí)施例中，芯片或設(shè)備3205被制造具有常閉容器和/或分界閥門。在這個(gè)實(shí)施例中，累積器不必在在培養(yǎng)期間保持閥門關(guān)斷。在分界面和/或容器閥是理想被打開時(shí)，將壓力應(yīng)用到載體或設(shè)備3205孔區(qū)域。用于全部或大多數(shù)其他時(shí)間，閥門將保持閉合以將各個(gè)芯片試驗(yàn)互相分離，和/或?qū)⑿酒系脑噭┖偷鞍踪|(zhì)孔互相分離。
圖25描繪了壓盤3207的剖開圖，所述壓盤3207被推向微流體設(shè)備3205的上表面3221，其中通過將壓盤表面3227接觸在上表面3221的脊部3250上將壓力腔3255形成在井排2806上方。然后，流體壓力優(yōu)選氣體壓力被應(yīng)用至壓力腔3255，通過將流體從追溯到裝料站(chargingstation)3200的臂3211的壓力線導(dǎo)入腔體3255。通過與裝料站3200相關(guān)的壓力調(diào)整器調(diào)整壓力，優(yōu)選地通過根據(jù)裝料站控制器發(fā)送的信號(hào)而可變化輸出壓力的電受控可變壓力調(diào)整器，優(yōu)選在計(jì)算機(jī)控制下。壓力腔體3255內(nèi)的流體壓力接下來驅(qū)動(dòng)孔2805內(nèi)的流體穿過基底2800內(nèi)的通道，進(jìn)而進(jìn)入彈性材料塊2808的通道和/或腔體內(nèi)，以填充通道或腔體或激勵(lì)彈性材料塊2808的可偏轉(zhuǎn)部分，優(yōu)選如前所述的可偏轉(zhuǎn)隔膜閥門。
圖27A和27B描繪了系統(tǒng)3500的具體實(shí)施例，更具體地，描繪了界面板3520的具體實(shí)施例。在圖27A中，界面板3520被耦合至集成芯片和載體3400，以流體密封其某一區(qū)域的方式。具體地，流體密封被設(shè)置在分界板3520和載體3400和芯片中一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之間，例如第一蛋白質(zhì)區(qū)域3430、第二蛋白質(zhì)區(qū)域3432、第一井區(qū)域3420、第二井區(qū)域3422分界累積器3460、止回閥3465、容器累積器3450和/或止回閥3455。在一個(gè)實(shí)施例中，分界板3520將流體密封提供給區(qū)域3420、3422、3430、3432，以及提供給累積器3450和3460。在一個(gè)實(shí)施例中，分界板3520提供一個(gè)或多個(gè)止回閥致動(dòng)器3570，如在圖27B中最佳看到的。
在一些實(shí)施例中，分界板3520將所有理想的流體密封提供給載體3400和微流體設(shè)備。這樣做時(shí)，分界板3520可包括密封墊圈3580。密封墊圈3580可包括廣泛的材料，包括但不限于硅膠、彈性體等。在一些實(shí)施例中，墊圈3580包括順應(yīng)材料，以有助于在想要的位置出形成流體密封。以這種方式，系統(tǒng)3500可將想要的壓力提供給芯片和載體3400中的合適區(qū)域。在其它實(shí)施例中，分界板3520為兩個(gè)或多個(gè)板部件。例如，在載體3400和微流體設(shè)備上的區(qū)域或端口各個(gè)可被流體耦合至分離板3520，所述分離板3520適于裝配所述端口或區(qū)域。系統(tǒng)3500然后將包括必要數(shù)量的分界板3520，用于各個(gè)端口或區(qū)域。另外，在一些實(shí)施例中，多于一個(gè)區(qū)域或端口被耦合至具體分界板3520，而其余區(qū)域或端口被耦合至分離分界板3520。分界板和載體/芯片區(qū)域和端口的其它組合還落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)3500的操作包括將一個(gè)載體3400裝載入接收站3510內(nèi)。在某些實(shí)施例中，載體3400包括耦合至那里的微流體設(shè)備，并且在將載體放置入接收站3510之前將想要的試劑和蛋白質(zhì)裝載入載體孔。在其它實(shí)施例中，載體3400被放置進(jìn)接收站3510，隨后使用試劑和蛋白質(zhì)裝載。載體3400進(jìn)一步可裝載有水合流體。水合流體可被放置在水合腔3440中。在載體3400被裝載入系統(tǒng)3500之后，分界板3520被被降低或相反被轉(zhuǎn)移結(jié)合載體3400。板3520可以手動(dòng)地、機(jī)器人地或相反被降低以使用下片/載體3400的部分或全部流體密封。水合流體被提供給分界累積器3460和/或容器累積器3450，以及通過使用耦合至分界板3520的壓力源將合適壓力應(yīng)用到累積器3450、3460而驅(qū)入芯片。在具體實(shí)施例中，系統(tǒng)3500自動(dòng)執(zhí)行這個(gè)工藝，所述工藝在具體實(shí)施例中在水合流體被添加至載體3400之后在大約二十(20)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。結(jié)果是，使用水合流體將芯片充分加載，以操作芯片容器和/或分界閥，如這里及本專利更充分的所述的和在這里通過引用結(jié)合先前應(yīng)用。
通過將理想的壓力施加給圍繞合適入口的合適密封芯片區(qū)域，將包括試劑和樣本的溶液分發(fā)進(jìn)芯片。例如，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區(qū)域3420和3422，使驅(qū)動(dòng)試劑進(jìn)入芯片。類似地，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區(qū)域3420、和3422，使驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)進(jìn)入芯片。在具體實(shí)施例中，這在芯片裝載水合流體之后在大約六十(60)分鐘之內(nèi)發(fā)生。一旦溶液被驅(qū)趕至芯片內(nèi)的想要的孔、腔、蓄積庫等等，通過釋放分界累積器3460中的止回閥3465打開芯片內(nèi)的分界閥門。在具體實(shí)施例中，止回閥3465被釋放，以打開芯片中的分界閥，此時(shí)系統(tǒng)3500激勵(lì)結(jié)合止回閥3465的止回閥致動(dòng)器3570。在一些實(shí)施例中，止回閥致動(dòng)器3570包括適于結(jié)合止回閥3465的銷釘、接線柱等，以釋放分界累積器3460內(nèi)的壓力。在可替換實(shí)施例中，止回閥3465被手動(dòng)釋放或打開。
在使溶液混合理想時(shí)間之后，使用例如常規(guī)混合或重復(fù)打開和關(guān)閉分界閥以增加流體在腔中運(yùn)動(dòng)的分散或其它工藝，閉合分界閥。將壓力施加給致動(dòng)器3450和/或3460，以保持閉合的分界閥門和容器閥門。載體3400可以從系統(tǒng)3500中去除，用于在這里所述的工藝中培養(yǎng)或存儲(chǔ)或使用。致動(dòng)器3450和3460使壓力保持持續(xù)想要的時(shí)間，從數(shù)小時(shí)至數(shù)天，以阻止或幫助阻止容器或分界閥打開。在具體實(shí)施例中，致動(dòng)器3450和3460保持芯片內(nèi)壓力在理想閾值壓力之上，足以保持容器和/或分界閥閉合。在一個(gè)實(shí)施例中，致動(dòng)器3450和3460保持壓力在閾值壓力之上持續(xù)至少兩(2)天、至少七(7)天等。致動(dòng)器3450和3460保持理想壓力的時(shí)間長部分取決于培養(yǎng)溫度。部分取決于理想培養(yǎng)時(shí)期長和/或培養(yǎng)條件，載體3400可以往返至系統(tǒng)3500，為了重復(fù)裝料或重復(fù)壓縮致動(dòng)器3450、3460。以這種方式，培養(yǎng)時(shí)期可以在具體實(shí)施例中，集成載體3400和微流體設(shè)備適于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的想要的實(shí)驗(yàn)，通過使用本發(fā)明的系統(tǒng)。更具體地，如圖26A中所示，系統(tǒng)3500包括一個(gè)或多個(gè)接收站3510，各個(gè)適于接收載體3400。在具體實(shí)施例中，系統(tǒng)3500包括四個(gè)(4)接收站3510，盡管在本發(fā)明的可選擇實(shí)施例中提供更少或更多數(shù)量的站3510。圖26B描繪在站3510中被組合設(shè)置的載體3400和設(shè)備，處于分界板3520下面。在圖26B中，分界板3520適于向下傳遞，以使分界板3520結(jié)合載體3400的上表面及其微流體設(shè)備。在一些實(shí)施例中，站3510和壓盤3520類似于站3200和壓盤3207。分界板3520包括一個(gè)或多個(gè)端口3525，用于與適于在載體3400中容納流體、壓力等的區(qū)域相耦合。在一些實(shí)施例中，分界板3520包括兩端口、三端口、四端口、五端口、六端口、七端口、八端口、九端口、十端口等。在優(yōu)選實(shí)施例中，分界板3520被耦合至用于將壓力提供至載體3400中想要區(qū)域的六條線以及用于提供激勵(lì)止回閥3455和3465的機(jī)械的兩條線。
如圖26A所示，系統(tǒng)3500進(jìn)一步包括處理器，在一個(gè)實(shí)施例中所述處理器是與筆記本計(jì)算機(jī)或其它計(jì)算機(jī)設(shè)備3530相關(guān)聯(lián)的處理器。計(jì)算機(jī)設(shè)備3530包括適于保存用于執(zhí)行本發(fā)明的理想工藝的軟件、方案等的存儲(chǔ)器。另外，計(jì)算機(jī)設(shè)備3530包括用于呈現(xiàn)微流體設(shè)備的研究和分析結(jié)果的屏幕3540，在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)3500使用GUI顯示器。系統(tǒng)3500被耦合至一個(gè)或多個(gè)壓力源，例如壓力流體、氣體等，用于將同樣的傳遞給微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備被流動(dòng)地耦合至分界板3520。
圖27A和圖27B描繪了系統(tǒng)3500的具體實(shí)施例，更具體地，描繪了分界板3520。在圖27A中，分界板3520被耦合至集成芯片和載體3400，以流體密封其中某一區(qū)域的方式。具體地，流體密封被設(shè)置在分界板3520和載體3400及芯片中的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之間，例如第一蛋白質(zhì)區(qū)域3430、第二蛋白質(zhì)區(qū)域3432、第一井區(qū)域3420、第二井區(qū)域3422、分界累積器3460、止回閥3465、容器累積器3450和/或止回閥3455。在一個(gè)實(shí)施例中，分界板3520將流體密封提供給區(qū)域3420、3422、3430、3432，以及提供給累積器3450和3460。在一個(gè)實(shí)施例中，分界板3520提供一個(gè)或多個(gè)止回閥累積3570，如在圖27B中最佳所看到的。
在一些實(shí)施例中，分界板3520將全部理想流體密封至載體3400和微流體設(shè)備。這樣作，分界板3520可包括密封墊圈3580。密封墊圈3580可包括廣泛的材料，包括但不限于硅膠、彈性體等。在一些實(shí)施例中，墊圈3580包括順應(yīng)材料，以有助于在想要的位置出形成流體密封。以這種方式，系統(tǒng)3500可將想要的壓力提供給芯片和載體3400中的合適區(qū)域。在其它實(shí)施例中，分界板3520為兩個(gè)或多個(gè)板部件。例如，在載體3400和微流體設(shè)備上的區(qū)域或端口各個(gè)可被流體耦合至分離板3520，所述分離板3520適于裝配所述端口或區(qū)域。系統(tǒng)3500然后將包括必要數(shù)量的分界板3520，用于各個(gè)端口或區(qū)域。另外，在一些實(shí)施例中，多于一個(gè)區(qū)域或端口被耦合至具體分界板3520，而其余區(qū)域或端口被耦合至分離分界板3520。分界板和載體/芯片區(qū)域和端口的其它組合還落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)3500的操作包括將一個(gè)或多個(gè)載體3400裝載入接收站3510內(nèi)。在某些實(shí)施例中，載體3400包括耦合至那里的微流體設(shè)備，并且在將載體放置入接收站3510之前將想要的試劑和蛋白質(zhì)裝載入載體孔。在其它實(shí)施例中，載體3400被放置進(jìn)接收站3510，隨后裝載有試劑和蛋白質(zhì)。載體3400進(jìn)一步可裝載有水合流體。水合流體可被放置在水合腔3440中。在載體3400被裝載入系統(tǒng)3500之后，分界板3520被被降低或相反被轉(zhuǎn)移以結(jié)合載體3400。板3520可以手動(dòng)地、機(jī)器人地或相反被降低以與下片/載體3400的部分或全部流體密封。水合流體被提供給分界累積器3460和/或容器累積器3450，以及通過使用耦合至分界板3520的壓力源將合適壓力應(yīng)用到累積器3450、3460而驅(qū)入芯片。在具體實(shí)施例中，系統(tǒng)3500自動(dòng)執(zhí)行這個(gè)工藝，在具體實(shí)施例中所述工藝在水合流體被添加至載體3400之后在大約二十(20)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。結(jié)果是，芯片被充分加載水合流體，以操作芯片容器和/或分界閥，如這里及本專利更充分的所述的和在這里通過引用結(jié)合先前應(yīng)用。
通過將理想的壓力施加給圍繞合適入口的合適密封的芯片區(qū)域，將包括試劑和樣本的溶液散布進(jìn)芯片。例如，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區(qū)域3420和3422，驅(qū)動(dòng)試劑進(jìn)入芯片。類似地，將在大約1psi和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區(qū)域3420、3422，驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)進(jìn)入芯片。在具體實(shí)施例中，這在芯片裝載水合流體之后大約六十(60)分鐘之內(nèi)發(fā)生。一旦溶液被驅(qū)至芯片內(nèi)的想要的井、腔、蓄積庫等等，通過釋放分界累積器3460中的止回閥3465打開芯片內(nèi)的分界閥門。在具體實(shí)施例中，止回閥3465被釋放，以打開芯片中的分界閥，此時(shí)系統(tǒng)3500激勵(lì)結(jié)合止回閥3465的止回閥致動(dòng)器3570。在一些實(shí)施例中，為了釋放分界累積器3460內(nèi)的壓力，止回閥致動(dòng)器3570包括適于結(jié)合止回閥3465的銷釘、接線柱等。在可替換實(shí)施例中，止回閥3465被手動(dòng)釋放或打開。
在使溶液混合理想時(shí)間之后，使用例如常規(guī)混合或重復(fù)打開和關(guān)閉分界閥以增加流體在腔中運(yùn)動(dòng)的分散或其它工藝，閉合分界閥。將壓力施加給致動(dòng)器3450和/或3460，以保持閉合的分界閥門和容器閥門。載體3400可以從系統(tǒng)3500中去除，用于在這里所述的工藝中培養(yǎng)或存儲(chǔ)或使用。致動(dòng)器3450和3460使壓力保持持續(xù)想要的時(shí)間，從數(shù)小時(shí)至數(shù)天，以阻止或幫助阻止容器或分界閥打開。在具體實(shí)施例中，致動(dòng)器3450和3460保持芯片內(nèi)壓力在理想閾值壓力之上，足以保持容器和/或分界閥閉合。在一個(gè)實(shí)施例中，致動(dòng)器3450和3460保持壓力在閾值壓力之上持續(xù)至少兩(2)天、至少七(7)天等。致動(dòng)器3450和3460保持理想壓力的時(shí)間長度部分取決于培養(yǎng)溫度。部分取決于理想培養(yǎng)時(shí)期長度和/或培養(yǎng)條件，載體3400可以往返至系統(tǒng)3500，為了重復(fù)裝料或重復(fù)壓縮致動(dòng)器3450、3460。
在一些實(shí)施例中，如在這里一般所述的集成芯片載體(ICC)和附連至那里的彈性體芯片被使用，以促進(jìn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。然而，在使用PCR片進(jìn)行PCR時(shí)，塑料ICC的熱傳導(dǎo)率可能不足于在隱蔽在彈性芯片內(nèi)的反應(yīng)陣列中產(chǎn)生均勻熱場。例如，盡管圖28A中所述的ICC對(duì)其它工藝中的蛋白質(zhì)結(jié)晶是有用的，但不可能充分均勻地將熱量傳遞給耦合至那里的芯片。另外，圖28A中的ICC的操作可能要求將它保留約束在壓盤上。如圖29A中所示，收縮力的應(yīng)用可對(duì)芯片產(chǎn)生不利影響。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，使用結(jié)合圖28B所述的ICC提供改進(jìn)的均勻熱場，并且改進(jìn)的ICC保留方法被描繪在圖29B中。
在一些實(shí)施例中，彈性芯片被設(shè)計(jì)，以致于與ICC的流體連接被定位在彈性芯片的外邊沿。以這種方式，ICC部分不必以來于流體傳遞。一種這樣的實(shí)施例被描述在圖28A中。在一些實(shí)施例中，沒有與ICC表面相接觸的彈性芯片中的區(qū)域位于反應(yīng)腔陣列被定位的地方。這種反應(yīng)區(qū)域3810包括彈性芯片和導(dǎo)熱材料，彈性芯片和導(dǎo)熱材料被匹配在芯片的下側(cè)(另外地，彈性塊側(cè)面將接觸ICC的塑料部分)。反應(yīng)區(qū)域3810的大小和形狀可在本發(fā)明的范圍內(nèi)發(fā)生變化，圖29C中所述的一個(gè)實(shí)施例顯示了ICC和芯片之間的關(guān)系。
以這種方式，具有最小或降低的熱阻抗，可將熱能(例如，來自PCR設(shè)備)傳遞至彈性塊。在一些實(shí)施例中，導(dǎo)熱材料包括硅(Si)。在具體實(shí)施例中，使用來自拋光和平滑硅晶片的硅，與半導(dǎo)體工業(yè)中所使用的類似或相同。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可以使用其它低熱阻抗材料，依賴于所尋求的熱曲線的屬性。在一些實(shí)施例中，導(dǎo)熱材料具有低熱量(也就是，影響溫度快速改變的材料，即使良好熱導(dǎo)體，例如銅)。在一些實(shí)施例中，使用拋光硅，以增強(qiáng)反射效應(yīng)和增加可由系統(tǒng)中使用的檢測器收集的光的數(shù)量，或?qū)崟r(shí)地或如PCR反應(yīng)中末端點(diǎn)分析的。這些益處還可改善絕熱反應(yīng)。
使用ICC3800，執(zhí)行PCR的一種清洗可以實(shí)現(xiàn)，通過使彈性塊的反應(yīng)區(qū)域與熱控制源相匹配。熱控制源可包括連同其它一道的PCR設(shè)備、受熱壓盤、分離熱源。在一些實(shí)施例中，ICC裝配入接收平底反應(yīng)盤的標(biāo)準(zhǔn)PCR設(shè)備和/或具有平熱壓盤，其中用于基于管的PCR的各種制式的適配器可以被使用。然而，各個(gè)這些結(jié)構(gòu)通常依賴于盤向下壓縮，以得到良好(均勻)的熱接觸，如圖29A中所示。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，彈性材料片對(duì)向下壓縮是不可修正的，因?yàn)閾闲蚤y門和彈性腔體在彈性片內(nèi)可變形和引起不想要的流體行為。
在其它實(shí)施例中，通過使用真空卡盤(vacuum chuck)以匹配在結(jié)合至其它暴露彈性塊下側(cè)的熱材料上，降低或避免了對(duì)ICC的向下壓縮的不利影響。以這種方式，在將真空施加至卡盤時(shí)，在真空卡盤和ICC熱材料之間產(chǎn)生緊密密封。在如圖29B中所示的一個(gè)實(shí)施例中，真空卡盤3950包括或由為良好導(dǎo)熱體的一種或多種材料制造，所述良好導(dǎo)熱體被結(jié)合至熱控制源，例如一個(gè)或多個(gè)Peltier(珀耳帖)器件。在一個(gè)實(shí)施例中，使用多個(gè)熱控制產(chǎn)生在反應(yīng)陣列中的熱剃度。
使用中，ICC被定位在真空卡盤3950上方，以及向下降低或被轉(zhuǎn)移，以使集成芯片3910和ICC3930中的熱部分3920與真空卡盤3950相接觸。再者，在一個(gè)實(shí)施例中，熱部分3920包括硅。熱部分3920被描繪耦合至彈性塊或片3910，使用在一些實(shí)施例中的粘結(jié)劑等實(shí)時(shí)這種耦合。如所示，塊3910結(jié)合ICC3930，以及在一個(gè)實(shí)施例中，間隙3940被保持在熱部分3920和ICC3930之間。間隙3940由于與例如卡盤或壓盤3950的熱源的熱隔離ICC3930。另外，在一個(gè)實(shí)施例中，間隙3940允許塊3910和/或熱部分3920的一些折曲。以這種方式，在這些實(shí)施例中的間隙3940在對(duì)卡盤3950施加真空時(shí)有助于形成密封，通過一個(gè)或多個(gè)真空口3960以將熱部分3920拉向卡盤3950。可以監(jiān)測得到的真空數(shù)量，以變化在卡盤3950和熱部分3920之間真正地需要制造的良好熱接觸。在一些實(shí)施例中，真空卡盤中的一個(gè)或多個(gè)端口被使用用于監(jiān)測真空度。在圖29D和圖30中所示的具體實(shí)施例中，用于監(jiān)測真空度的一個(gè)或多個(gè)端口將被定位在真空端口的遠(yuǎn)端以及通過通路彼此流體連通，所述通路優(yōu)選曲折的且狹窄的通路。以這種方式，真空卡盤的一側(cè)-ICC中的熱部分之間差異可以與真空卡盤的另一側(cè)-ICC中的熱部分之間相比較，以確定在真空卡盤上重新放置ICC的努力能否可以解決真空損耗問題(若有的話)。折可以是自動(dòng)或手動(dòng)、或其中一些組合的迭代處理。
圖30描繪根據(jù)本發(fā)明的卡盤的一個(gè)實(shí)施例。在本發(fā)明范圍內(nèi)可以改變曲折通路的屬性，所述曲折通路的屬性被用于得到對(duì)真空卡盤熱部分區(qū)域上不同真空度的精確測量，以及促進(jìn)真空對(duì)ICC熱部分的均勻或相對(duì)均勻地應(yīng)用。通過使用這種方案，被用于執(zhí)行PCR反應(yīng)的彈性塊可以處于與PCR設(shè)備的良好接觸，如果將使用通常向下壓縮，則沒有對(duì)彈性塊的彈性(可偏轉(zhuǎn)的)部分的功能冒險(xiǎn)。
盡管本發(fā)明在這里已經(jīng)參考其中的具體實(shí)施例被描述，但是大范圍改變、各種變化和替代被意味在前面公開中，并且將會(huì)理解的是在一些例子中，不脫離所述的本發(fā)明范圍沒有對(duì)應(yīng)的其它特征的用途，本發(fā)明的一些特征將被采用。例如，除了上述的基于壓力的制動(dòng)系統(tǒng)之外，可選的靜電和磁致動(dòng)系統(tǒng)還被實(shí)現(xiàn)。還可能的是，激勵(lì)所述設(shè)備，通過基于熱能應(yīng)用在控制通道中產(chǎn)生流體流動(dòng)，或通過熱膨脹或通過從液體的氣體生成。另外，在另一實(shí)施例中，使用離心力將蛋白質(zhì)和試劑驅(qū)動(dòng)進(jìn)入芯片。因此，不脫離本發(fā)明的真實(shí)范圍和宗旨針對(duì)本發(fā)明教導(dǎo)可作出適于具體情形或材料的許多改進(jìn)。其目的在于，本發(fā)明不限于如具體實(shí)施方式
所公開的用于執(zhí)行本發(fā)明的具體實(shí)施例，而是本發(fā)明將包括落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有實(shí)施例和等價(jià)物。
引用1.Unger等，Science 288，113-116(2000)2.通過“盲填充”裝載樣本通道和控制線-PDMS是充分透氣的，以幾個(gè)磅/平方英寸(psi)壓縮的液體將氣體趕出通道，剩下完全由液體填充的它們。參見Hansen等，PNAS 99，16531-16536(2002)3.人β肌動(dòng)蛋白基因的294bp片段被使用5′核酸外切酶分析(Taqman)擴(kuò)增。前向和逆向引物序列分別是5′-TCACCACACTGTGCCCATCTACGA-3′和5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。圖1b是使用基于TAMRA的FRET探針，序列5′-(FAM)ATGCCC-X(TAMRA)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3′采取的。圖1c中的數(shù)據(jù)是使用基于黑-猝滅劑的探針采取的，由于大量這些引物探針套開始能夠商業(yè)提供。反應(yīng)包含1×Taqman緩沖液A(50nMKCL，10nM Tris-Hcl，0.01MEDTA，60nM Passive Reference 1，pH 8.3)，4mM MgCl2，200nMdATP，dCTP，dTTP，400nMdUTP，300nM前向引物，300nM逆向引物，200nM探針，0.01U/μlAmperase UNG(全部來自Applied Biosystems，F(xiàn)oster市，CA)，0.2U/μlDyNAzyme(Calbiochem，San Diego，CA)，5.0％甘油，去離子水和人男性基因組DNA(Promega)。
4.定量PCR技術(shù)。關(guān)于“基因定量”章節(jié)，LJ McBride，K Livak，M Lucero，等，編輯，F(xiàn)rancois Ferre，Birkauser，Boston，MA，p97-110，1998。
見E.T.Lafally，I.Medntz，R.A.Mathies，Anal Chem73(3)，565-570(2001)，和B.Vogelstein，K.W.Kinzler，PNAS96，9236-9241(1999)。
理解的是，這里所示例子及實(shí)施例僅僅用于說明目的，其中闡述的各種改變或變化將給予本領(lǐng)域技術(shù)人員建議，并且被包含在本申請(qǐng)的宗旨和條款及附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。這里列舉的全部公開、專利和專利申請(qǐng)通過以其全文應(yīng)用用于所有目的而被結(jié)合，在相同程度上，與各個(gè)單個(gè)公開、專利和專利申請(qǐng)被專門和單獨(dú)地指示一樣，通過應(yīng)用被結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種隨時(shí)間在選擇溫度處或溫度范圍內(nèi)實(shí)施反應(yīng)的方法，所述方法包括提供用于包含多個(gè)分離反應(yīng)腔的陣列設(shè)備，所述陣列設(shè)備包括由多層形成的彈性塊，其中至少一層具有形成在其中的至少一個(gè)凹槽，所述凹槽具有與凹槽可集成所述層的至少一個(gè)可偏轉(zhuǎn)的隔膜，陣列設(shè)備另外包括接近至少一個(gè)反應(yīng)腔的熱傳遞設(shè)備，熱傳遞設(shè)備被成形以接觸熱控制源；引入陣列設(shè)備試劑，用于執(zhí)行想要的反應(yīng)；和使陣列設(shè)備接觸熱控制設(shè)備，從而熱控制設(shè)備處于與熱控制源相熱連通中，以使至少一個(gè)反應(yīng)腔中的反應(yīng)溫度隨熱控制源的溫度改變而改變。
2.如權(quán)利要求1中所述方法，其中熱傳遞設(shè)備包括半導(dǎo)體。
3.如權(quán)利要求1中所述方法，其中熱傳遞設(shè)備包括硅。
4.如權(quán)利要求1中所述方法，其中熱傳遞設(shè)備包括反射材料。
5.如權(quán)利要求1中所述方法，其中熱傳遞設(shè)備包括金屬。
6.如權(quán)利要求1中所述方法，其中熱控制設(shè)備適于將作用力施加到熱傳遞設(shè)備，以將熱傳遞設(shè)備推向熱控制源。
7.如權(quán)利要求6中所述方法，其中作用力包括磁、靜電或真空作用力。
8.如權(quán)利要求7中所述方法，其中作用力包括通過形成在熱控制設(shè)備或熱傳遞設(shè)備的表面中通道施加給熱傳遞設(shè)備的真空作用力。
9.如權(quán)利要求8中所述方法，進(jìn)一步包括檢測真空度，所述真空在熱控制設(shè)備表面和熱傳遞設(shè)備表面之間得到。
10.如權(quán)利要求9中所述方法，其中使用真空度檢測器執(zhí)行檢測真空度，所述真空度檢測器位于距離真空源位置的沿通道或多個(gè)通道遠(yuǎn)端的位置。
11.如權(quán)利要求10中所述方法，其中真空度不超過報(bào)警所呈現(xiàn)的或重新校整協(xié)議所結(jié)合的預(yù)設(shè)置值。
12.如權(quán)利要求1中所述方法，其中通過一個(gè)或多個(gè)機(jī)械或電機(jī)械定位設(shè)備的使用，執(zhí)行使陣列設(shè)備與熱控制設(shè)備的接觸。
13.如權(quán)利要求1中所述方法，進(jìn)一步包括自動(dòng)控制和監(jiān)測所述方法的執(zhí)行。
14.如權(quán)利要求13中所述方法，其中使用自動(dòng)控制設(shè)備執(zhí)行自動(dòng)控制和監(jiān)測所述方法的執(zhí)行，所述自動(dòng)控制設(shè)備與機(jī)器人控制設(shè)備可操作的相連通，用于從熱控制設(shè)備中導(dǎo)入和去除陣列設(shè)備。
15.如權(quán)利要求1中所述方法，進(jìn)一步包括監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)程。
16.一種包括權(quán)利要求1中所要求的陣列設(shè)備的設(shè)備。
17.一種包括權(quán)利要求9中所述的熱控制設(shè)備的單元。
18.一種包括權(quán)利要求1中陣列設(shè)備和權(quán)利要求9中熱控制設(shè)備的系統(tǒng)。
19.一種微流體系統(tǒng)，其包括陣列設(shè)備，其用于包含多個(gè)分離反應(yīng)腔，所述分離反應(yīng)腔被設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域內(nèi)且使用設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域外測的陣列設(shè)備的流體入口相流體連通，所述陣列設(shè)備包括由多層形成的彈性塊，其中至少一個(gè)層具有形成在其中的至少一個(gè)凹槽，所述凹槽具有使用凹槽可結(jié)合置所述層的至少一個(gè)可偏轉(zhuǎn)隔膜；載體，其適于保持陣列設(shè)備且具有使用流體入口分界的多個(gè)流體腔；以及熱傳遞界面，其包括熱傳導(dǎo)材料，所述熱傳導(dǎo)材料被設(shè)置以提供從熱控制源至反應(yīng)區(qū)域的大致均勻的熱連通。
20.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中熱傳導(dǎo)材料是反射性的。
21.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中熱傳導(dǎo)材料包括半導(dǎo)體。
22.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中熱傳導(dǎo)材料包括硅。
23.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中熱傳導(dǎo)材料包括拋光硅。
24.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中熱傳導(dǎo)材料包括金屬。
25.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，其中反應(yīng)區(qū)域被定位在陣列設(shè)備的中心部分，以及流體入口被設(shè)置在陣列設(shè)備外周邊。
26.如權(quán)利要求25中所述微流體系統(tǒng)，其中陣列設(shè)備與載體耦合在陣列設(shè)備外周邊，以及熱傳導(dǎo)材料與陣列設(shè)備表面耦合在反應(yīng)區(qū)域。
27.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，進(jìn)一步包括將作用力應(yīng)用到熱傳遞設(shè)備以將熱傳遞設(shè)備推向熱控制源的裝置。
28.如權(quán)利要求27中所述微流體系統(tǒng)，其中施加作用力的裝置包括將真空源施加至熱傳遞界面的裝置，通過形成在熱控制設(shè)備中或熱傳遞設(shè)備中的通道。
29.如權(quán)利要求28中所述微流體系統(tǒng)，進(jìn)一步包括真空度檢測器，其用于檢測在熱控制設(shè)備表面和熱傳遞設(shè)備表面之間得到真空的水平。
30.如權(quán)利要求29中所述微流體系統(tǒng)，其中所述真空度檢測器被定位在距離真空源位置的沿通道或多個(gè)通道遠(yuǎn)端的位置。
31.如權(quán)利要求19中所述微流體系統(tǒng)，進(jìn)一步包括自動(dòng)控制系統(tǒng)，所述自動(dòng)控制系統(tǒng)可操作的與機(jī)器人控制系統(tǒng)相連通，用于從熱控制設(shè)備中導(dǎo)入和去除陣列設(shè)備。
32.一種用于使M種不同樣本與N種不同試劑反應(yīng)的微流體設(shè)備，其包括·多個(gè)反應(yīng)單元，各個(gè)反應(yīng)單元包括樣本腔和試劑腔，所述樣本腔和所述試劑腔通過具有與其兩者相關(guān)聯(lián)的分界閥的分界通道處于流體連通中，所述分界閥用于控制所述樣本腔和所述試劑腔之間的流體連通；·多個(gè)樣本入口，各個(gè)與所述樣本腔處于流體連通中；·多個(gè)試劑入口，各個(gè)與所述試劑腔處于流體連通中；其中所述樣本入口和試劑入口中之一分別經(jīng)由通孔與所述樣本腔中之一或所述試劑腔中之一處于流體連通中。
33.如權(quán)利要求1中所述微流體設(shè)備，其中所述反應(yīng)單元被形成在彈性塊內(nèi)，所述彈性塊由粘結(jié)在一起的多層構(gòu)成，以及所述分界閥是可偏轉(zhuǎn)的隔膜。
34.如權(quán)利要求1中的微流體設(shè)備，其中所述樣本入口與所述樣本腔通過樣本通道處于連通中，以及所述試劑入口與所述試劑腔通過試劑通道處于連通中，所述樣本腔的部分和所述試劑腔的部分大約互相平行地被定位且各個(gè)具有相關(guān)聯(lián)其兩者的容器閥門，用于控制通過其中的流體連通。權(quán)利要求3中的微流體設(shè)備，其中所述相關(guān)聯(lián)于所述樣本腔的所述閥門和相關(guān)聯(lián)于所述試劑腔的所述閥門可操作地通過公共容器控制通道互相處于連通中。
35.如權(quán)利要求4中所述的微流體設(shè)備，其中所述公共容器控制通道沿大約垂直所述樣本腔和所述試劑腔中之一的線被定位。
36.一種實(shí)現(xiàn)彈性材料塊中縱橫比特點(diǎn)的方法，所述方法包括步驟·提供第一彈性材料層；·將光致抗蝕劑層應(yīng)用在所述第一彈性材料層表面上；·將光圖案應(yīng)用至所述光致抗蝕劑層，以形成已反應(yīng)的光致抗蝕劑材料圖案；·去除未反應(yīng)的光致抗蝕劑材料，在所述第一彈性材料層的所述表面上剩下已反應(yīng)的光致抗蝕劑材料圖案；·將蝕刻劑應(yīng)用到所述第一彈性材料表面，以蝕刻沒有由已反應(yīng)的光致抗蝕劑材料的所述圖案所覆蓋的所述第一彈性材料層的所述表面，從而去除沒有由已反應(yīng)的光致抗蝕劑的所述圖案所覆蓋的所述第一彈性材料層的區(qū)域，進(jìn)而剩下對(duì)應(yīng)于已反應(yīng)的光致抗蝕劑材料的所述圖案的所述彈性材料層的圖案，其中從側(cè)面看去時(shí)，縱橫比等于或大于至少兩倍于特征寬度的長度的高度。
37.如權(quán)利要求6中所述的方法，進(jìn)一步包括去除已反應(yīng)光致抗蝕劑材料的所述圖案的步驟。
38.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中通過將粘結(jié)帶應(yīng)用到所述彈性材料層的所述表面和已反應(yīng)光致抗蝕劑材料的所述圖案而進(jìn)行所述去除，然后將所述粘結(jié)帶與所述彈性材料層分離，同時(shí)已反應(yīng)光致抗蝕劑材料的所述圖案的部分或全部從所述彈性材料層的所述表面被去除。
39.如權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述光致抗蝕劑是SU8。
40.如權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述蝕刻劑包括四丁銨氟化物一三水合物。
41.如權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述特點(diǎn)為通孔。
42.如權(quán)利要求1 1中所述的方法，其中所述彈性材料塊包括粘結(jié)在一起的多個(gè)彈性材料層，其中兩個(gè)或多個(gè)彈性材料層具有形成在其中的凹槽，以及一個(gè)彈性材料層中的一個(gè)凹槽與另一個(gè)彈性材料層中的凹槽通過通孔處于連通中。
43.一種用于使M種不同樣本與N種不同試劑反應(yīng)的微流體設(shè)備，其包括·多個(gè)反應(yīng)單元，各個(gè)反應(yīng)單元包括樣本腔和試劑腔，所述樣本腔和所述試劑腔通過具有與其兩者相關(guān)聯(lián)的分界閥的分界通道處于流體連通中，所述分界閥用于控制所述樣本腔和所述試劑腔之間的流體連通；·多個(gè)樣本入口，各個(gè)與所述樣本腔處于流體連通中；·多個(gè)試劑入口，各個(gè)與所述試劑腔處于流體連通中；其中所述腔中的至少一個(gè)包含低聚核苷酸或蛋白質(zhì)聚合物劑及內(nèi)部對(duì)照(intercollating)染料。
44.如權(quán)利要求1中所述微流體設(shè)備，其中所述反應(yīng)單元被形成在彈性塊內(nèi)，所述彈性塊由粘結(jié)在一起的多層構(gòu)成，以及所述分界閥是可偏轉(zhuǎn)的隔膜。
45.如權(quán)利要求1中所述的微流體設(shè)備，其中所述樣本入口與所述樣本腔通過樣本通道處于連通中，以及所述試劑入口與所述試劑腔通過試劑通道處于連通中，所述樣本腔部分和所述試劑腔部分大約互相平行地被定位且各個(gè)具有相關(guān)聯(lián)其兩者的容器閥門，用于控制通過其中的流體連通。
46.如權(quán)利要求3中所述的微流體設(shè)備，其中所述相關(guān)聯(lián)于所述樣本腔的所述閥門和相關(guān)聯(lián)于所述試劑腔的所述閥門可操作地通過公共容器控制通道互相處于連通中。
47.如權(quán)利要求4中所述的微流體設(shè)備，其中所述公共容器控制通道沿大約垂直所述樣本腔和所述試劑腔中之一的線被定位。
48.如權(quán)利要求1中所述的設(shè)備，其中內(nèi)部對(duì)照染料是SYBR Green(TM)。
49.一種用于確定蛋白質(zhì)或低聚核苷酸變性溫度的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1中的設(shè)備的步驟，改變?cè)O(shè)備中的溫度，進(jìn)而檢測染料中的改變。
50.一種將PCR反應(yīng)容器保持在熱控制設(shè)備的熱控制表面的真空使用。
51.如權(quán)利要求50中所述的使用，其中容器是微流體設(shè)備。
52.如權(quán)利要求51中所述的使用，其中容器是彈性材料微流體設(shè)備。
53.一種在微流體支撐基底內(nèi)以使熱傳導(dǎo)局部化的熱傳導(dǎo)插入物的使用。
54.如權(quán)利要求53中所述的使用，其中基底是集成載體。
55.如權(quán)利要求53中所述的使用，其中熱傳導(dǎo)插入物是硅。
56.如權(quán)利要求55中所述的使用，其中硅是拋光的。
57.如權(quán)利要求50中所述的使用，其中通過形成在熱控制表面中的與微流體設(shè)備接觸的通道，施加真空壓力。
58.如權(quán)利要求57中所述的使用，其中微流體設(shè)備是彈性材料微流體設(shè)備。
59.如權(quán)利要求57中所述的使用，其中微流體設(shè)備另外包括熱傳導(dǎo)部分。
60.如權(quán)利要求59中所述的使用，其中熱傳導(dǎo)部分是硅。
61.一種微流體設(shè)備執(zhí)行PCR的使用，其中PCR設(shè)備具有在流體隔離中每平方cm(厘米)面積大于100個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)密度。
62.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于250。
63.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于500。
64.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于750。
65.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于1000。
66.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于1250
67.如權(quán)利要求61中所述的使用，其中反應(yīng)密度大于1500。
68.一種對(duì)稱光學(xué)系統(tǒng)的使用，所述對(duì)稱光學(xué)系統(tǒng)具有低于1.5的NA，對(duì)包含PCR反應(yīng)的微流體設(shè)備成像。
69.如權(quán)利要求68中所述的使用，其中NA低于1.0。
70.一種甘油作為控制線流體的使用。
71.如權(quán)利要求70中所述的使用，其中甘油為溶液的一部分。
72.一種PEG溶液作為控制線流體的使用
73.一種自動(dòng)激勵(lì)設(shè)備的使用，以控制微流體設(shè)備中的PCR反應(yīng)。
74.如權(quán)利要求73中所述的使用，其中激勵(lì)設(shè)備控制閥門。
75.如權(quán)利要求73中所述的使用，其中微流體設(shè)備包括彈性塊。
76.如權(quán)利要求73中所述的使用，其中在采用熱控制設(shè)備的系統(tǒng)中使用自動(dòng)閥門激勵(lì)設(shè)備。
77.如權(quán)利要求76中所述的使用，其中熱控制設(shè)備采用真空，以協(xié)助實(shí)現(xiàn)與微流體設(shè)備的熱接觸。
78.如權(quán)利要求73中所述的使用，其中自動(dòng)閥門激勵(lì)設(shè)備、計(jì)算機(jī)控制用于PCR的微流體設(shè)備的激勵(lì)。
79.如權(quán)利要求74中所述的使用，其中閥門包括可偏轉(zhuǎn)的隔膜。
全文摘要
一種用于執(zhí)行矩陣反應(yīng)的M×N矩陣微流體設(shè)備，所述設(shè)備(100)具有與樣本入口(120)或試劑t入口(124)中之一通過通孔相連通的多個(gè)反應(yīng)單元(106)，所述通孔形成在設(shè)備的彈性材料塊。提供的方法包括在微流體設(shè)備的彈性材料塊的彈性材料層中并行形成通孔的方法，所述方法包括使用已圖案化的光致抗蝕劑掩膜和蝕刻劑蝕刻掉彈性材料塊的彈性材料層中的區(qū)域或部分。
文檔編號(hào)G01N15/06GK1997454SQ200580022583
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月2日
發(fā)明者費(fèi)德里科·顧特塞德, 馬克·A·恩格, 黃江, 埃默森·全, 羅伯特·格羅斯曼, 菲里普·林, 周厚樸, 吉克·金保爾, 馬丁·皮普瑞茲克, 杰弗里·費(fèi)塞 申請(qǐng)人:弗盧丁公司
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