国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

專利名稱：脂連蛋白抗體和測量脂連蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及測量存在于人血漿/血清中的人脂連蛋白的不同形式的方法，并且更特別地，所述方法是基于ELISA測定法，其利用針對脂連蛋白的不同單克隆抗體，與針對人脂連蛋白的不同結構域的不同的多克隆抗體組合。
當單克隆和多克隆抗體的不同組合被組合以構造ELISA測定法時，不同ELISA形式可以測量不同分子形式的脂連蛋白。此外，脂連蛋白的這些不同分子形式的一些與不同的生理狀態相關。不同脂連蛋白分子形式的水平可以與胰島素敏感性或空腹血糖相關，或與其他生理狀態如心血管疾病、皮脂腺病、炎癥以及其他疾病相關。
本發明還提供了脂連蛋白的獨特同種型和其抗體，包括多克隆和單克隆抗體。
本發明的方法是簡單、可靠和可再現的，并且能夠區分不同的脂連蛋白同種型，包括一些形式(M1球狀、M1 N-末端、M24球狀、M24 C-末端、A12820球狀、A12820 N-末端、A12820 C-末端)，其顯示了與糖尿病表型的顯著程度的相關性。此外，本發明表明簡單測量低或高分子量脂連蛋白同種型的先前方法不足以提供鑒定具有II型糖尿病形式的個體的能力。本發明的測定法也可以用于進一步定義脂連蛋白同種型與其他疾病的聯系，所述其他疾病為諸如心血管疾病、代謝綜合征、炎癥、血脂異常、NASH等等。本發明的方法也可以用于監測疾病進展、對治療的應答、預測治療應答，以及診斷早期形式的疾病。
同樣，這些測定法的效用，和所鑒定的新的脂連蛋白抗體和同種型可以用于監測疾病進展、對治療的應答、預測治療應答，以及診斷早期形式的疾病。
抗體開發和表征 開發了抗人脂連蛋白的球狀結構域、N-末端結構域和C-末端結構域的多克隆抗體。這些多克隆抗體可以用于蛋白質印跡中和開發ELISA，所述ELISA用于在體液，如血漿、血清等等中發現的脂連蛋白的不同形式。多克隆抗體在兔中產生，并且程序由Pocono Rabbit Farm & Laboratory Inc，Canadensis，PA，按照標準方案進行。標準方案用于抗原注射、加強和取血。通過親和層析用G蛋白瓊脂糖(Protein G-Agarose)從血清純化抗體。球狀結構域的抗原是重組脂連蛋白蛋白，其編碼氨基酸殘基107-244。該蛋白質在大腸桿菌中產生，并且通過標準純化技術純化。N-末端肽抗原具有N-末端序列ETTTQGPGVLLPLPKGASTGC(Seq.Id.No.1)。C-末端肽抗體具有序列CYADNVNDSTFTGFLLYHDTN(Seq.Id.No.2)。
使用N-末端序列ETTQGPGVLLPLPKGAC(Seq.Id.No.3)產生針對人脂連蛋白N-末端的新的單克隆抗體(M1 Seq.Id.No 4和Seq.Id.No.5，分別是輕鏈和重鏈可變區，M24 Seq.Id.No.6和Seq.Id.No.7，分別是輕鏈和重鏈可變區)。由Antibody Solutions，Mountain View，CA 94043在小鼠中產生這些抗體。Antibody Solutions使用他們的標準方案(本領域中公知的技術)進行免疫(抗體對抗原應答的PolyExpress專有方案)，產生雜交瘤文庫(免疫細胞的最后加強、與骨髓瘤細胞融合，和冷藏)，和單克隆培養物(使用流式細胞術細胞分選制備單克隆培養物)。
使用的方案是根據下面的一般程序方法的用于產生、制備和表征雜交瘤細胞的標準方案。(也見Oi.V.T..和L.A.Herzenberg.1979.在細胞免疫學中的選擇的方法(In Selected Methods in Cellular Immunology).B.B.Mishell & S.M.Shiigi，eds.Freeman，San Francisco.p.351，Reik，L.M.，S.L.Maines.D.E.Ryan，W.Levin，S.Bandiera.和P.E.Thomas.1987.用于單克隆抗體的簡單的非層析純化程序(A simple.non-chromatographicpurification procedure for monoclonal antibodies).免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods)100123，將所述參考文獻并入本文作為參考)。雜交瘤上清液的初次篩選用于檢測雜交瘤上清液中IgG與包被在96孔板上的N-末端肽的反應性。二次測定法涉及使用ELISA形式，捕獲來自血漿的人類脂連蛋白，接著是與針對人類脂連蛋白的多克隆抗體的反應性。能夠捕獲人脂連蛋白的單克隆抗體被認為是有用的，并且隨后通過ELISA分析并通過蛋白質印跡分析進一步表征。
ELISA測定法開發 用于測量人類脂連蛋白水平的ELISA測定法依賴于用針對脂連蛋白的特異性單克隆抗體捕獲不同的脂連蛋白同種型，然后使用識別不同脂連蛋白表位的不同多克隆抗體鑒定所捕獲的脂連蛋白同種型的能力。這些測定法的構造從而提供了特異識別不同脂連蛋白同種型的能力，其依賴于抗體對(單克隆抗體以及多克隆抗體)與獨特的脂連蛋白同種型特異相互作用的能力。我們在該分析中使用了5種不同的單克隆抗體(MAB3604(Chemicon International)，A12820(611645)(BD Biosciences)，MAB10651(R&D Systems，Inc)，N-ADIP-M1(Roche)，和N-ADIP-M24(Roche))，加上三種不同的多克隆抗體(N-末端的、C-末端的和球狀的)。從而，我們具有開發15種不同的測定法，和潛在鑒定15種不同的脂連蛋白同種型(M1球狀、M1 N-末端、M1 C-末端、M24球狀、M24 C-末端、M24 N-末端、A12820球狀、A12820 N-末端、A12820 C-末端、MAB10651球狀、MAB10651 N-末端、MAB10651 C-末端、MAB3604球狀、MAB 3604 N末端)的潛能。MAB 3604 C-末端的組合不產生信號。通過使用額外的單克隆和多克隆抗體，可能鑒定更多數目的潛在脂連蛋白同種型。
產生兔多克隆抗體的程序 純化的N-末端或C-末端脂連蛋白肽以1mg肽對1mg KLH的比例通過半胱氨酸殘基偶聯到KLH(綴合的肽)。將完全弗氏佐劑(CFA)中的100-200μg綴合的肽皮內注射到兔中。14天后，皮內注射不完全弗氏佐劑(IFA)中的50-100μg綴合的肽。14天后，皮內注射不完全弗氏佐劑(IFA)中的50-100μg綴合的肽。兔子在14天后取血得到用于分析目的的血清。之后，將兔子每30天用25-50μg綴合的肽皮下免疫，然后免疫后14天取血。收集血清，然后如下述純化IgG，并用于測定法開發中(pAb生產參考Lui，F.T.，Sinnecker，M.，Hamaoka，J.，and Katz，D.(1979)生物化學(Biochemistry)18，690-697。這是本領域技術人員常規使用的許多方案之一)。使用的抗原是大腸桿菌中產生的N-末端脂連蛋白肽、C-末端脂連蛋白肽，和重組球狀脂連蛋白，跨越氨基酸107-244。
上述方法導致產生三種不同的多克隆抗體，其被稱作N-末端抗體、C-末端抗體和球狀抗體，如上面在“抗體表征和開發”章節中所述。這些多克隆抗體的每一種與不同的單克隆抗體一起使用，以產生識別不同脂連蛋白同種型的獨特ELISA測定法。
產生單克隆抗體的步驟 免疫方案和mAb產生 雌性BALB/c小鼠用CFA中的50μg綴合的N-末端肽腹膜內免疫，5周后用CFA中的50μg綴合的N-末端肽腹膜內加強。6周后，腹膜內注射PBS中的50μg綴合的N-末端肽，48小鼠后進行相同的加強。該最后加強后2天，除去脾臟，挑成(teased into)細胞懸液，如以前所述(19)的與HAT-敏感的鼠骨髓瘤細胞Sp2/0融合。有許多相似的步驟，其是本領域技術人員常用的。雜交瘤在HAT培養基、HB 101培養基((Irvine Scientific，Irvine，CA)，7％FBS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，1X HAT，和10％雜交瘤克隆因子(HCF；IGEN，Rockville，MD)(Kenney et al，生物技術(Biotechnology)，13787，1995)中選擇。通過ELISA對10到14天后顯示出生長的細胞上清液(50ul)的等分試樣篩選抗脂連蛋白N-末端抗體。將N-末端肽包被在96孔板底部，并篩選與雜交瘤上清液的反應性。通過ELISA進一步篩選與N-末端肽反應的雜交瘤以確定它們是否與存在于人血漿中的天然脂連蛋白相互作用。通過在HAT培養基中有限稀釋克隆目的雜交瘤(Kenney et al，生物技術(Biotechnology)，13787，1995)。
通過將克隆的雜交瘤注射到降植烷(pristane)預處理的BALB/c小鼠(1-2x 10E6細胞/小鼠，i.p.)中產生腹水。通過組合辛酸和硫酸銨沉淀從熱滅活的腹水純化mAb，如前述。通過大規模培養，接著通過G蛋白層析純化IgG來產生mAb。
任選且優選地，這些方案的進一步改進涉及逆轉用于該測定法中的抗體的順序(order)。例如，多克隆抗體可以用于捕獲不同的脂連蛋白同種型，然后進一步使用識別不同脂連蛋白表位的不同單克隆抗體鑒定捕獲的脂連蛋白同種型。
以ELISA形式測量血漿/血清中和血漿級分中人類脂連蛋白的球狀、N-末端和C-末端結構域的量。將免疫平板用下面的單克隆抗體之一包被1∶5000稀釋度的MAB3604(Chemicon International)、0.5ug/ml的A12820(611645)(BD Biosciences)、0.25μg/ml的MAB10651(R&D Systems，Inc)、1ug/ml的N-ADIP-M1(Roche)，和1ug/ml的N-ADIP-M24(Roche)。具有100μg合適單克隆抗體的平板用平板密封器覆蓋并在4℃溫育16-20小時。然后用PBS-吐溫200.05％洗滌平板3次，PBS-吐溫200.05％用于所有隨后的洗滌。將平板用300μl PBS緩沖液中的BSA 1％+吐溫200.05％封閉1小時，并洗滌3次。向每個平板中加入最終體積50μl的合適的參考標準品(0.0195到10ng/孔)，其用于所有隨后的溫育。對于脂連蛋白檢測的球狀的和N-末端結構域，使用來自R&D Systems(cat#1065，在C-末端具有his-標記)的脂連蛋白(1-244)。對于C-末端脂連蛋白檢測，使用來自Alexis Biochemicals的脂連蛋白(16-247)(cat#ALX-522-063，具有N-末端FLAG標記)。血漿/血清或血漿級分在具有BSA 0.1％+吐溫200.05％的PBS中稀釋并加入每個平板。將平板在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，然后洗滌4次。向每個平板中具有BSA 0.1％+吐溫200.05的PBS中加入合適的檢測抗體并在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，接著洗滌4次。加入顯色抗體綴合到辣根過氧化物酶的驢抗兔抗體并在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，接著洗滌4次。在3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)存在下定量結合的綴合到辣根過氧化物酶的抗體。每孔加入50μl TMB溶液，平板用平板密封器蓋上并在微型有軌平板搖床上搖動下在21-23℃下溫育。在合適的時間加入50μl/孔0.5M磷酸終止反應。在450nm下讀出OD并通過從合適的標準曲線插值(interpolation)確定脂連蛋白的量。反應在OD讀數小于2的時間終止。該時間在2到10分鐘，取決于捕獲抗體和檢測抗體。
篩選分級分離的血漿樣品 使用10mM HEPES，pH 8中的5-20％蔗糖梯度分級分離來自三個正常供體的血漿級分，在2-ml的薄壁超速離心管(Becton Dickinson)中逐步倒入125mM NaCl，并允許在4℃過夜平衡。600ul總血漿以1∶10稀釋，應用并梯度離心。樣品在頂部分層(用10mM HEPES，pH 8，125mM NaCl以1∶10稀釋)后，梯度在Beckman TL-100臺式超速離心機中的TLS55轉子中4℃下以55,000rpm離心4小時(Pajvani et al 2004)。從管的頂部取出150μl樣品級分，并標記為1-20，級分1是梯度的頂層，級分20是梯度的底層。如下述將梯度級分順序取回并通過蛋白質印跡或ELIAS分析。不同的抗體用于蛋白質印跡分析，并且為單克隆或多克隆抗體。對于ELISA分析，通過使用ELISA，用不同組合的單克隆抗體作為捕獲試劑和不同多克隆抗體作為顯色試劑，分析每個級分的脂連蛋白同種型的存在。該布局也可以反向，使得多克隆抗體用作捕獲抗體，并且單克隆抗體用作顯色抗體。商業化人脂連蛋白ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)用于比較目的。
篩選患者血漿收集物 人血漿樣品的收集 募集男性和女性糖尿病和非糖尿病個體。過夜禁食后募集受試者并收集約50ml血液。受試者的身份保密(見知情同意表)。受試者包括糖尿病患者和非糖尿病的年齡匹配的對照。
排除標準病例和對照受試者都不能患有1型糖尿病或者糖尿病的繼發形式(例如，庫欣病、肢端肥大癥)。經歷類固醇治療或患有炎性疾病(例如，皮肌炎)的受試者將被排除。具有小于1年的預期壽命的受試者(研究人員判斷)將也被排除在外。除了這些標準外，對照受試者不能以前被診斷為2型糖尿病或者妊娠糖尿病，具有2型糖尿病家族史，或者具有空腹葡萄糖受損或者葡萄糖耐量受損(如上述)。
預期脂連蛋白同種型和這里公開和本發明ELISA方法中利用的抗體將導致更好地理解某些疾病(包括2型糖尿病)的病因，并且該理解將導致更好地治療和預防措施。
關鍵物質和參數 對于具有已知糖尿病的個體，過夜禁食后收集總共約50ml血液。
如果個體以前沒有被診斷為患有2型糖尿病，或者如果他們是飲食治療的糖尿病患者，那么過夜禁食后收集總共約50ml血液。一些個體需要進行75g口服葡萄糖耐量測試。該測試需要過夜禁食(至少10小時)并且相對于施用口服葡萄糖0、30和120分鐘時抽血。最多抽取共60mL血液。
血液收集和血漿制備步驟 根據標準方法從患者抽取靜脈血。盡快地連續進行所有步驟以確保最好的樣品質量和防止蛋白酶解。
每名患者收集約50ml血液(4×10ml真空管(vacutainer))。將每個真空管倒置兩次以混合血液與抗凝劑并立即置于冰上(未冷凍)。
完成抽血后，所有真空管立即在4℃下以1500xg離心15分鐘。
打開冷卻(4℃或冰上)的真空管并使用1ml一次性吸管將上清液轉移到10ml Falcon管(冰上)。留下約2mm上清液防止沉淀物移行。
4℃下以3000xg離心Falcon管30分鐘。離心機制動器必須關閉。
用移液器回收Falcon管中的血漿上清液，留下所有沉淀。將所有血漿樣品轉移到一個50ml Falcon管并溫和混合以確保樣品均勻。
將樣品在液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中。在干冰上運輸。
篩選 將人血漿樣品解凍并在制備中等分到96孔用于篩選。
如測定法開發章節和如下面簡述的測定法步驟用于測定法的標準曲線圖7-12，并用于血漿級分的測定法，

圖13-18。測定法形式也用于測定人類血漿樣品收集物中脂連蛋白的水平以與疾病狀態相關，圖19-31。
1)合適的捕獲抗體加入免疫平板中100μl PBS體積中，在4℃下保持16-20小時。
2)吸出并洗滌平板3次。
3)平板用300μl體積的BSA 1％+吐溫200.05％+PBS在300μl體積中21-23℃下封閉1小時。
4)吸出并洗滌平板3次。
5)合適的參考標準品以BSA 0.1％+吐溫200.05％+PBS中的稀釋液加入每個平板，最終體積50μl。
6)血漿/血清以BSA 0.1％+吐溫200.05％+PBS中的稀釋液加入每個平板，最終體積50μl。
7)將平板置于有軌搖床上并在21-23℃下溫育1小時。
8)吸出并洗滌平板4次。
9)合適的檢測抗體加入每個平板的BSA 0.1％+吐溫200.05％+PBS中，終體積50μl，并置于有軌搖床上在21-23℃下溫育1小時。
10)吸出并洗滌平板4次。
11)顯色抗體驢抗兔-HRP加入每個平板的BSA 0.1％+吐溫200.05％+PBS中，終體積50μl，并置于有軌搖床上在21-23℃下溫育1小時。
12)吸出并洗滌平板4次。
13)將50μl TMB底物溶液加入平板中并置于有軌搖床上并在21-23℃下溫育直到合適的顯色時間。
14)通過加入50μl體積的0.5M磷酸終止反應。
15)在450nm讀出OD并通過從標準曲線插值確定脂連蛋白的量。
以ELISA形式測量血漿/血清中和血漿級分中不同人類脂連蛋白同種型的量。將免疫平板用下面的單克隆抗體之一包被1∶5000稀釋度的MAB3604(Chemicon International)、0.5ug/ml的A12820(611645)(BDBiosciences)、0.25μg/ml的MAB10651(R&D Systems，Inc)、1ug/ml的N-ADIP-M1(Roche)，和1ug/ml的N-ADIP-M24(Roche)。具有100μl合適單克隆抗體的平板用平板密封器覆蓋并在4℃溫育16-20小時。然后用PBS-吐溫200.05％洗滌平板3次，PBS-吐溫200.05％用于所有隨后的洗滌。將平板用300μl PBS緩沖液中的BSA 1％+吐溫200.05％封閉1小時，并洗滌3次。向每個平板中加入最終體積50μl的合適的參考標準品(0.0195到10ng/孔)，其用于所有隨后的溫育。對于脂連蛋白檢測的球狀的和N-末端結構域，使用來自R&D Systems(cat#1065，在C-末端具有his-標記)的脂連蛋白(1-244)。對于C-末端脂連蛋白檢測，使用來自AlexisBiochemicals的脂連蛋白(16-247)(cat#ALX-522-063，具有N-末端FLAG標記)。血漿/血清或血漿級分在具有BSA 0.1％+吐溫200.05％的PBS中稀釋并加入每個平板。將平板在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，然后洗滌4次。向每個平板中具有BSA 0.1％+吐溫200.05的PBS中加入合適的檢測抗體并在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，接著洗滌4次。加入顯色抗體綴合到辣根過氧化物酶的驢抗兔抗體并在有軌搖床上21-23℃下溫育1小時，接著洗滌4次。在3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)存在下定量結合的綴合到辣根過氧化物酶的抗體。每孔加入50μl TMB溶液，平板用平板密封器蓋上并在微型有軌平板搖床上搖動下在21-23℃下溫育。在合適的時間加入50μl/孔0.5M磷酸終止反應。在450nm下讀出OD并通過從合適的標準曲線插值確定脂連蛋白的量。反應在OD讀數小于2的時間終止。該時間在2到10分鐘，取決于捕獲抗體和檢測抗體和它們的濃度。
對脂連蛋白雜交瘤M1和M24的可變重鏈和輕鏈cDNA測序 材料和方法 培養雜交瘤細胞并通過標準步驟提取總RNA。見例如，“模擬肝素-誘導的血小板減少癥抗體的鼠單克隆抗體的表征(Characterization of amurine monoclonal antibody that mimics heparin-induced thrombocytopeniaantibodies)”.G.M.Arepally，S.Kamei，K.S.Park，K.Kamei，Z.Q.Li，W.Liu，D.L.Siegel，W.Kisiel，D.B.Cines and M.Poncz BLOOD(March 1，2000)95卷No.51533-1540頁，“來自任何免疫球蛋白家族的鼠可變區的有效擴增和直接測序(Efficient amplification and direct sequencing of mouse variableregions from any immunoglobulin family)”Thierry Chardes，Sylvie Villard，Gaelle Ferrieres，Marine Piechaczyk，Marine Cerutti，Gerard Devauchelle andBernard Pau FEBS Letters 452(1999)386-394頁。
通過標準方法，使用寡聚dT或者反向PCR寡核苷酸作為引物合成第一鏈cDNA。使用下面的條件PCR擴增可變重鏈和輕鏈區cDNA 94C /5分鐘 94C /30秒 55C /30秒 72C /90秒 30個循環 72C /10分鐘 使用下面的PCR寡核苷酸 來自Ref 1 重鏈構架1(正向引物)(Seq.Id.No.8) GAG GTGAAG CTG GTG GAG(AT)C(AT)GG 重鏈恒定區(反向引物)(Seq.Id.No.9) GGG GCC AGT GGA TAG AC 輕鏈構架1(正向引物)(Seq.Id.No.10) CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGA CTC CA 輕鏈恒定區(反向引物)(Seq.Id.No.11) GTT GGT GCA GCA TCA GC 來自Ref 2 重鏈構架1(正向引物)(Seq.Id.No.12) CAG GT(GC)(AC)A(GA)CTG(GC)(A T)G(GC)AG(TA)C(AT)GG 重鏈恒定區(反向引物)(Seq.Id.No.13) CGA CAA GTC GAC TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC 輕鏈構架1(正向引物)(Seq.Id.No.14) GAC ATT(CG)AG CT(GC)ACC CAG TCT CCA 輕鏈恒定區(反向引物)(Seq.Id.No.15) CGA CTAGTC GAC TGG TGG GAAGAT GGATAC AG 通過瓊脂糖凝膠電泳分析產物。輕鏈擴增子通過凝膠分離并且不經克隆而測序。將重鏈擴增子亞克隆，并從克隆的質粒測定序列。
結果 測定法開發和標準化 開發了人脂連蛋白的不同測定法。使用的測定法形式是ELISA測定法，其利用特異單克隆抗體作為捕獲抗體，含有脂連蛋白的溶液，如合適的標準品、或人血漿或血清，接著加入多克隆抗體(圖4和5)。單克隆和多克隆抗體的每種組合代表不同的測定法形式。單克隆抗體加上多克隆抗體的特定組合提供了特定脂連蛋白測定法(圖5)。在一些情況下，該特定組合將根本不能測量脂連蛋白(如MAB3604C-末端的組合)，而使用其他組合測量脂連蛋白的不同水平。
為了方便開發ELISA，我們開發了對脂連蛋白的N-末端特異的新的單克隆抗體。這些mAb與N-末端脂連蛋白肽特異反應，并且也與脂連蛋白特異反應，如通過ELISA、蛋白質印跡分析和免疫熒光所測定。這些mAb與多克隆抗體組合進一步用于用ELISA測定法測量人血漿中脂連蛋白水平。
該測定法的基本形式涉及在96孔板上固定特定抗脂連蛋白單克隆抗體(圖4和5)。用于研究中的不同的抗脂連蛋白單克隆抗體包括A12820、MAB3604、MAB10651、M1和M24。ELISA測定法的第二種組分是針對脂連蛋白的多克隆抗體。使用了三種不同的多克隆抗體。這些包括N-末端、C-末端和球狀多克隆抗體。這三種多克隆抗體識別不同的脂連蛋白結構域。在圖6中給出了脂連蛋白ELISA測定法中不同步驟的圖示。使用針對脂連蛋白的不同結構域的不同的單克隆抗體或多克隆抗體，可能設定額外的測定法。此類抗體的組合可以提供額外的測定形式，其對于與疾病狀態相關的多種脂連蛋白同種型具有區別性質。
使用從商業來源得到的不同的重組脂連蛋白蛋白質將不同的測定法形式標準化(圖7-12)。從而，所報告的脂連蛋白的絕對水平是基于相對于用于每種測定法的標準品的定量。
不是所有測定法都能夠檢測獨特的脂連蛋白同種型。因此，對于與三種多克隆抗體的每一種組合的每種mAb，不是所有ELISA測定法都能夠測量脂連蛋白，無論其是標準脂連蛋白還是人類血漿中的脂連蛋白。在一些情況下，僅僅兩種多克隆抗體與一種單克隆抗體組合用于測量脂連蛋白水平。對于其他單克隆抗體，多克隆抗體的所有三種組合都能夠檢測脂連蛋白。我們已經觀察到通過抗體組合檢測到的脂連蛋白同種型水平可以在測定法之間顯著改變。對于一些，可以檢測為約0.05μg/ml(M24-N-末端pAb)的脂連蛋白水平，對于其他可以檢測約15μg/ml(M24-C-末端pAb)的脂連蛋白水平，其它具有高達約60μg/ml(A12820-球狀pAb)的水平。
通過不同測定法表征脂連蛋白同種型 一旦建立了不同測定法，我們注意到不同的測定法能夠識別不同水平的脂連蛋白。我們然后試圖確定測定法之間不同的本質。因為已經報導脂連蛋白以幾種不同的分子形式存在，所以我們尋求確定所述測定法是否可以識別不同的脂連蛋白分子形式(Berg et al，內分泌轉移傾向(TrendsEndocrinol Metab).2002 Mar；13(2)84-9.；Trujillo和Scherer，J Intern Med.2005Feb；257(2)167-75中的綜述)。速度梯度沉降提供了基于大小分離分子的簡單方法。已經報導了通過速度沉降分離脂連蛋白(Pajvani UB et al(2003).生物化學雜志(J.Biol.Chem).2789073-9085)。有額外的方法可基于大小分離分子，如凝膠過濾層析，其也可以用于該目的。
通過如所述的速度沉降分離人血漿樣品，并收集級分。為了確定脂連蛋白分布，通過ELISA使用不同的測定法形式測定級分的等分試樣。通過不同測定法形式測定每個級分中脂連蛋白的量，然后相對于來自速度梯度分級分離的級分數作圖。數據在圖13-18中給出。所觀察到的圖式表明脂連蛋白水平在測定法與測定法之間不同。MAB3604與球狀或N-末端pAb組合主要識別存在于級分3-7中的僅較小分子量脂連蛋白同種型(圖13)。另一方面，MAB10651與所有三種pAb組合主要識別存在于級分10-16中的較大分子量的脂連蛋白同種型(圖15)。通過測定法測定的脂連蛋白的量不同，而MAB10651與球狀pAb組合測量到最高水平，而MAB10651與N-末端pAb組合測量最少量的脂連蛋白。從而，這三種不同的測定法可以主要檢測較大的脂連蛋白同種型，而檢測的脂連蛋白蛋白質水平不同，提示抗體的不同組合識別了脂連蛋白分子中的一些差異。
當使用mAb A12820與三種不同的多克隆抗體組合對分級分離的人血漿樣品測定脂連蛋白時，觀察到非常不同的圖式(圖14)。在許多不同的級分中發現脂連蛋白水平，在級分5中的峰對應于較小分子量的脂連蛋白。也有來自級分7-17的脂連蛋白寬峰，其在級分13附近有一個峰。所有三種測定法觀察到類似的圖式，但是通過每種測定法檢測到的脂連蛋白水平是不同的(圖14)。從而，這三種不同的測定法可以檢測不同的脂連蛋白同種型，并且通過測定法檢測到的脂連蛋白蛋白質水平不同，提示在不同抗體組合識別的脂連蛋白分子中存在一定的差異。
當使用mAb脂連蛋白M1與三種不同的多克隆抗體組合對分級分離的人血漿樣品測定脂連蛋白時，觀察到非常不同的圖式(圖16)。mAb脂連蛋白M1與C-末端pAb組合產生最高水平的脂連蛋白。該形式識別的脂連蛋白廣泛分布于級分3-20中。對于mAb脂連蛋白M1與球狀和N-末端pAb組合也觀察到脂連蛋白的可檢測水平。該水平低得多，并且似乎在許多不同的級分中分布。
當使用mAb脂連蛋白M24與三種不同的多克隆抗體組合對分級分離的人血漿樣品測定脂連蛋白時，觀察到非常不同的圖式(圖17)。mAb脂連蛋白M24與C-末端pAb組合產生最高水平的脂連蛋白。該形式識別的脂連蛋白廣泛分布于級分3-20中。對于mAb脂連蛋白M24與球狀和N-末端pAb組合也觀察到脂連蛋白的僅僅可檢測的水平。該水平低得多，并且似乎在許多不同的級分中分布。
使用脂連蛋白R&D測定法測定分級分離的人血漿樣品的脂連蛋白(圖18)。發現脂連蛋白分布在級分3-20中，具有兩個峰，一個在級分5中，第二個更豐富的峰在級分13中。所觀察到的圖式不同于其他脂連蛋白測定法。
速度沉降導致清楚地表明單克隆和多克隆抗體的不同組合識別不同分子量形式的脂連蛋白。不僅脂連蛋白的大小不同，如通過速度沉降不同確定，而且所檢測到的脂連蛋白水平也是非常不同的。因此，不同的抗體組合代表不同的測定法形式，其特異識別不同的脂連蛋白分子形式(同種型)。這些測定法形式的可用性提供了評估脂連蛋白同種型是否與不同的生理或疾病狀態相關的機會。
正常和糖尿病血漿樣品的篩選 為由正常個體、糖尿病患者、葡萄糖耐受不良和空腹葡萄糖受損個體組成的個體群體測定每種脂連蛋白同種型水平。收集空腹血漿樣品并保存在-80℃備用。然后測試樣品等分試樣以測定多種脂連蛋白同種型的水平。將通過不同ELISA測定法形式測定的脂連蛋白水平對空腹血糖水平作圖，并在圖19-24中給出。脂連蛋白水平相對于空腹血糖水平的分布在不同測定法之間不同。在下面給出統計學分析(表1中概述)。一些脂連蛋白測定法沒有顯示在脂連蛋白水平和空腹血糖之間的任何差別。這些測定法包括商業脂連蛋白R&D測定法(圖24)、MAb 3604測定法(圖19)、和MAB 10651測定法(圖21)(表1中概述)。相反，使用脂連蛋白mAb M1(圖22)、脂連蛋白mAb M24(圖23)和mAb 12820(圖20)的脂連蛋白測定法表明脂連蛋白水平與空腹葡萄糖值的顯著相關性(表1中總結)。
結果的統計學分析 用Logistic回歸模型，使用SAS 9.1(SAS Institute，Carey，NC)的logistic程序檢查了多種脂連蛋白形式區分對照與II型糖尿病患者的能力。為每種脂連蛋白形式運行單獨的模型。在每個模型中，組狀態(即，對照或糖尿病)用作輸出變量并且預測子變量包括一種脂連蛋白形式。年齡、人體質量指數(BMI)和胰島素用作每個模型中的協變量。用SAS 9.1的freq和logistic程序計算脂連蛋白形式的靈敏性和特異性。為三種多克隆形式計算接收器運行特征(ROC)圖以顯示脂連蛋白濃度的多種截斷點的靈敏性和特異性的變異性。提供曲線下面積(AUC)作為每個ROC曲線的總結性統計值?？梢詫UC解釋為將從正常患者正確鑒定真實病例(即II型糖尿病患者)的概率。例如，1.0的AUC將代表沒有錯誤分類的完美測試，而AUC小于0.5的測定法將不比隨機分配更好。具有AUC為0.65和更高的ROC圖、更優選AUC為0.70和更高的ROC圖的測定法表明顯著相關性并且預測值作為對所研究的疾病狀態如糖尿病(II型)的易感性的指標。所有不同測定法的結果在表1中總結。
表1基于126名II型糖尿病患者和124名正常對照對多種脂連蛋白形式的Logistic回歸和相關性結果。為每種形式運行單獨的回歸模型，對年齡、體重指數(BMI)和胰島素水平進行調節。為每種形式給出Pearson相關系數，表明其與空腹血糖關系的強度。

指出了M1和M24雜交瘤之間的差異 在分析前，篩選數據的正常性和異常值(outlier)的存在。這些數據遵循正態性假設并且因此不進行轉化。在分析前用Grubb’s檢驗來檢驗異常值的存在并且將p＜0.05時顯著異常的數據點去除。
群體樣本特征如下檢查了N＝126名II型糖尿病患者(T2D)和N＝124名正常個體。該樣本中用于T2D的診斷標準是空腹血糖(FBG)＞126。
對M1球狀形式的logistic回歸結果表明球狀形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方(Chi-square)＝7.26；p＜0.01)。球狀形式的優勢率(OR＝0.84，95％c.i.0.74-0.95)顯著小于1，表明低水平的M1球狀形式與II型糖尿病風險相關(圖25)。圖25中的ROC曲線顯示了3.0，4.0，和5.0μg/ml的球狀濃度截斷值的靈敏性和特異性。M1球狀形式的曲線下面積為0.731。
對M1N-末端形式的logistic回歸結果表明N-末端形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝6.01；p＜0.01)。球狀形式的優勢率(OR＝0.53，95％c.i.0.32-0.88)顯著小于1，表明低水平的M1N-末端形式與II型糖尿病風險相關(圖26)。圖26中的ROC曲線顯示了0.8和1.0μg/ml的N-末端濃度截斷值的靈敏性和特異性。N-末端形式的曲線下面積為0.705。
對M24球狀形式的logistic回歸結果表明球狀形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝11.9；p＜0.0005)。球狀形式的優勢率(OR＝0.47，95％c.i.0.30-0.72)顯著小于1，表明低水平的M24球狀形式與II型糖尿病風險相關(圖27)。圖27中的ROC曲線顯示了1.2和1.5μg/ml的球狀濃度截斷值的靈敏性和特異性。M1球狀形式的曲線下面積為0.742。
對M24C-末端形式的logistic回歸結果表明C-末端形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝15.9；p＜0.0001)。C-末端形式的優勢率(OR＝0.87，95％c.i.0.80-0.92)顯著小于1，表明低水平的M24C-末端形式與II型糖尿病風險相關(圖28)。圖28中的ROC曲線顯示了10.0和15.0μg/ml的C-末端濃度截斷值的靈敏性和特異性。M24C-末端形式的曲線下面積為0.740。
對A12820球狀形式的logistic回歸結果表明A12820球狀形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝15.9；p＜0.0001)。A12820球狀形式的優勢率(OR＝0.87，95％c.i.0.80-0.92)顯著小于1，表明低水平與II型糖尿病風險相關(圖29)。圖29中的ROC曲線顯示了3.0，4.0和5.0μg/ml的A12820球狀濃度截斷值的靈敏性和特異性。M1球狀形式的曲線下面積為0.714。
對A12820 N-末端形式的logistic回歸結果表明A12820 N-末端形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝5.18；p＝0.02)。A12820 N-末端形式的優勢率(OR＝0.97，95％c.i.0.95-0.99)顯著小于1，表明低水平與II型糖尿病風險相關(圖30)。圖30中的ROC曲線顯示了11.0和16.0μg/ml的A12820N-末端形式濃度截斷值的靈敏性和特異性。M1 N-末端形式的曲線下面積為0.673。
對A12820 C-末端形式的logistic回歸結果。A12820 C-末端形式是組狀態的顯著預測子(Wald卡方＝4.91；p＝0.03)。A12820 C-末端形式的優勢率(OR＝0.97，95％c.i.0.93-0.99)顯著小于1，表明低水平與II型糖尿病風險相關(圖31)。圖31中的ROC曲線顯示了12.0和15.0μg/ml的A12820C-末端形式濃度截斷值的靈敏性和特異性。M1球狀形式的曲線下面積為0.663。
剩余測定法的統計學分析在表1中總結。這些似乎沒有顯示來自所進行的分析的顯著性。
雜交瘤細胞系M1和M24的CDR的序列測定 測定mAb脂連蛋白M1和M24 IgG cDNA的CDR的序列并在圖32和33中顯示。兩種IgG的序列非常相似，然而卻不同。這兩種IgG蛋白質都結合到N-末端脂連蛋白區，包含氨基酸19-34，ETTQGPGVLLPLPKGAC(SEQ ID NO.3)。
討論 識別脂連蛋白的ELISA測定法 開發了識別脂連蛋白的ELISA測定法。不同的單克隆抗體用作捕獲抗體，與三種不同的多克隆抗體組合。在多數情況下，抗體組合能夠識別脂連蛋白，而一些組合不能檢測脂連蛋白(MAB 3604 C-末端)。通過使用脂連蛋白的重組形式可以標準化所有測定法。標準化提供了測定發現于生物樣品如血漿中的脂連蛋白水平的基礎。然后ELISA測定法可以用于測量脂連蛋白水平，以確定脂連蛋白分子形式的大小分布，和確定特定脂連蛋白同種型的濃度是否與特定生理狀態相關。重要的是注意到測量前，本發明的測定法不需要任何樣品預處理，或者樣品變性。同樣，所述測定法測量脂連蛋白的天然形式。
不同的脂連蛋白分子形式 為了闡明不同的脂連蛋白分子形式被不同的ELISA測定法識別，將人類血漿通過速度沉降分級分離，并使用不同的ELISA測定法測定級分的脂連蛋白水平。圖13-18清楚地表明脂連蛋白水平的分布是顯著不同的，取決于使用的多克隆和單克隆抗體的組合。對于一些測定法，僅僅識別了低分子量脂連蛋白形式(圖13，級分4、5、6)。對于其他測定法，識別了僅僅較高分子形式的脂連蛋白(圖15，級分11-14)。最后，一些測定法識別較高和較低分子量形式的脂連蛋白(圖14，16，17)。測定法不僅識別不同大小的脂連蛋白，如通過速度沉降圖譜闡明(圖13-18)，而且一些測定法(圖14，15，16，17)識別不同水平的脂連蛋白，再次提示在被不同測定法識別的脂連蛋白分子類型中存在獨特差異。所述測定法識別不同的脂連蛋白分子量形式這一事實提供的有力的簡單工具來評估個體之間脂連蛋白的差異，和確定任一脂連蛋白形式是否與疾病狀態相關。
脂連蛋白形式水平在個體之間不同 當用不同的測定法測定不同個體中脂連蛋白水平時，在所觀察的脂連蛋白水平中有顯著差異。對于一些測定法，脂連蛋白水平相差10-50倍。這些結果提示一些脂連蛋白測定法可以測量存在于人類血漿或血清中的多數脂連蛋白同種型，而其他測定法測量非常特異的脂連蛋白同種型。例如，mAb 12820與球狀結構域pAb組合檢測30-120μg/ml的脂連蛋白。相反，mAb脂連蛋白M24與N-末端多克隆抗體組合僅僅檢測0.02-0.1μg/ml。該差異代表在人類血漿中檢測的脂連蛋白水平中約1000倍差異。這些差異在圖13-18中是顯著的，其中測定分級分離的人類血漿中的脂連蛋白水平。這些差異也在圖19-24中觀察到。這些差異的一些在與表型的相關性方面是顯著的(表1中總結)而其他的差異不是顯著的。表征來自多種疾病狀態的血漿樣品的能力將提供顯著的相關性。
某些脂連蛋白形式與葡萄糖水平相關 所有不同的脂連蛋白測定法用于篩選人類血漿樣品收集物以尋找與葡萄糖的相關性。我們觀察到某些脂連蛋白同種型顯示出與葡萄糖的中等強度相關性。顯示出與葡萄糖的顯著相關性的測定法是mAb脂連蛋白M1球狀和N-末端(圖22，25，26)，mAb脂連蛋白M24球狀和C-末端(圖23，27，28)，mAb A12820球狀、N-末端和C-末端(圖20，29，30，31)，和MAB1051N-末端和C-末端(表1中總結)。其他測定法沒有一種(包括R&D商業化脂連蛋白測定法)表明與葡萄糖的任何顯著關聯。
某些脂連蛋白形式預測糖尿病狀態 mAb脂連蛋白M1球狀和N-末端(圖25，26)、mAb脂連蛋白M24球狀和C-末端(圖27，28)，和mAb 12820球狀(圖29)的低脂連蛋白水平是糖尿病的顯著預測子(表1中總結)。該觀察結果提示這些測定法對于確定哪些正常個體將患糖尿病、哪些個體將具有對特定糖尿病治療的最佳應答，哪些個體將對于他們的糖尿病有最好的預后是重要的。ROC圖表明特定形式對于臨床中的應用具有良好水平的特異性和靈敏性。特別地，60％或更大的靈敏性/特異性水平可以用于臨床。使用這些測定法得到進一步預測值的能力取決于收集縱向樣品，以確定與疾病發展和與治療結果的相關性。
上面的實施例不意在限制本發明的范圍，這些實施例闡明了本發明的單克隆和多克隆抗體、本發明的ELISA方法和脂連蛋白形式/水平對某些疾病狀態如糖尿病的預測/診斷方法。這些實施例被包括用于說明的目的并且本發明僅僅受到本文的權利要求范圍的限制。
PA093338C.SEQ
序列表
<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司
<120>脂連蛋白抗體和測量脂連蛋白的方法
<130>23630WO
<150>US 60/879179
<151>2007-01-08
<160>19
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>1
Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ala Ser Thr Gly Cys
20
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>2
Cys Tyr Ala Asp Asn Val Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu
1 5 10 15
Tyr His Asp Thr Asn
20
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>3
Glu Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro Lys Gly Ala
1 5 10 15
Cys
<210>4
<211>110
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>4
Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn
20 25 30
Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
65 70 75 80
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val
85 90 95
Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg
100 105 110
<210>5
<211>114
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>5
Ser Trp Trp Arg Ser Trp Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Val
1 5 10 15
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe His Met
20 25 30
Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
35 40 45
Ile Asp Pro Glu Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
50 55 60
Lys Ala Ile Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
85 90 95
Ser Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser
<210>6
<211>110
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>6
Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn
20 25 30
Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
65 70 75 80
Glu Ser Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val
85 90 95
Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>7
<211>114
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>7
Ser Trp Trp Arg Ser Trp Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Val
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr His Met
20 25 30
Ser Trp Leu Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
35 40 45
Ile Asp Pro Glu Asn Ser Asn Ala Ile His Asp Pro Lys Phe Gln Asp
50 55 60
Lys Ala Ile Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
85 90 95
Ser Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物
<400>8
gaggtgaagc tggtggagat catgg25
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物
<400>9
ggggccagtg gatagac 17
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物
<400>10
ccagttccga gctccagatg acccagactc ca32
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物
<400>11
gttggtgcag catcagc 17
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物
<400>12
caggtgcaca gactggcatg gcagtacatg g 31
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物
<400>13
cgacaagtcg actagccctt gaccaggcat cc32
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物
<400>14
gacattcgag ctgcacccag tctcca 26
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物
<400>15
cgactagtcg actggtggga agatggatac ag32
<210>16
<211>329
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<400>16
atgacccaga ctccactctc cctgcctgtc agtcttggag atcaagcctc catctcttgc 60
agatctagtc agagtattgt atatagtaat ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag 120
aaaccaggcc agtctccaaa gctcctgatc tacaaagttt ccaaccgatt ttctggggtc 180
ccagacaggt tcagtggcag tggatcaggg acagatttca cactcaagat cagcagagtg 240
gaggctgagg atctgggagt ttattactgc tttcaaggtt cgcatgttcg tcggacgttc 300
ggtggaggca ccaagctgga aatcagacg 329
<210>17
<211>336
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<400>17
agctggtgga gatcatgggc tgatcttgtg aggccagggg ccttagtcaa gttgtcctgc 60
aaagcttctg gcttcaacat taaagacttc catatgagtt gggtgaagca gaggcctgaa 120
cagggcctgg agtggattgg atggattgat tataacatca gacacatcct ccaacacagc 180
ctacctgcag ctcagcagcc tgacatctga ggacactgcc gtctattact gtagtaggag 240
cggtcccgcc tggtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa 300
aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccccct 336
<210>18
<211>330
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<400>18
atgacccaga ctccactctc cctgcctgtc agtcttggag atcaagcctc catctcttgc 60
agatctagtc agaccattgt atatagtaat ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag 120
aaaccaggcc agtctccaaa gctcctgatc tacaaagttt ccaaccgatt ttctggggtc 180
ccagacaggt tcagtggcag tggatcaggg acagatttca cactcaagat cagcagagtg 240
gagtctgagg atctgggaat ttattactgc tttcaaggtt cacatgttcc tcggacgttc 300
ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacgg 330
<210>19
<211>244
<212>PRT
<213>人
<400>19
Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly His
1 5 10 15
Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro
20 25 30
Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly
35 40 45
His Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu
50 55 60
Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly
85 90 95
Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg
100 105 110
Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met
115 120 125
Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp
130 135 140
Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe
145 150 155 160
Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Phe
165 170 175
Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn
180 185 190
Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly
195 200 205
Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu
210 215 220
Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr
225 230 235 240
His Asp Thr Asn
權利要求
1.針對脂連蛋白N-末端的單克隆抗體。
2.權利要求1的抗體，其中包含Seq.Id.No.3的脂連蛋白肽用于產生抗體。
3.權利要求1或2的抗體，其中它包含選自由Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的氨基酸21-36、氨基酸52-58和氨基酸91-99和Seq.Id.No.5或Seq.Id.No.7的氨基酸25-33、氨基酸48-64和氨基酸97-104組成的組的至少兩個CDR序列。
4.權利要求3的抗體，其中它包含選自由Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的氨基酸21-36、氨基酸52-58和氨基酸91-99和Seq.Id.No.5或Seq.Id.No.7的氨基酸25-33、氨基酸48-64和氨基酸97-104組成的組的至少3個CDR序列，更優選至少4個、甚至更優選至少5個、最優選6個CDR序列。
5.權利要求1-4的抗體，其中該抗體包含選自Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的輕鏈可變區和選自Seq.Id.No.5或7的重鏈可變區。
6.權利要求1-5的抗體，其中該抗體包含Seq.Id.No.4中給出的輕鏈可變區和Seq.Id.No.5中給出的重鏈可變區。
7.權利要求1-5的抗體，其中該抗體包含Seq.Id.No.6中給出的輕鏈可變區和Seq.Id.No.7中給出的重鏈可變區。
8.多核苷酸序列，其包含編碼選自Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的輕鏈可變區的序列。
9.多核苷酸序列，其包含編碼選自Seq.Id.No.5或7的重鏈可變區的序列。
10.權利要求8或9的多核苷酸序列，其中所述序列選自由Seq.Id.No.16、Seq.Id.No.17和Seq.Id.No.18組成的組。
11.診斷人類受試者的糖尿病易感性的方法，其包括在測定法中至少一種脂連蛋白單克隆抗體和至少一種脂連蛋白多克隆抗體用于篩選患者樣品的脂連蛋白，其中對應于具有0.65或更高值的AUC的接受者操作特征曲線(ROC)圖的測定值表明糖尿病易感性。
12.權利要求11的方法，其中所述至少一種單克隆抗體選自權利要求1到7的抗體和mAb A12820。
13.權利要求11或12的方法，其中所述至少一種單克隆抗體是mAb脂連蛋白M1并且至少一種多克隆抗體選自由球狀和N-末端抗體組成的組。
14.權利要求11或12的方法，其中所述至少一種單克隆抗體是mAb脂連蛋白M24并且至少一種多克隆抗體選自由球狀和C-末端抗體組成的組。
15.權利要求11或12的方法，其中所述至少一種單克隆抗體是mAbA12820并且至少一種多克隆抗體選自由球狀，N-末端和C-末端抗體組成的組。
16.權利要求11-15的方法，其中所述測定法是ELISA。
17.權利要求11-16的方法，其中AUC值為0.70或更高。
18.權利要求1-7的抗體或mAb A12820與至少一種脂連蛋白多克隆抗體組合用于診斷人類受試者的糖尿病易感性的用途。
19.權利要求18的用途，其中所述多克隆抗體選自由球狀，N-末端和C-末端脂連蛋白抗體組成的組。
20.針對脂連蛋白N-末端的多克隆抗體，其中包含Seq.Id.No.1的脂連蛋白肽用于產生抗體。
21.針對脂連蛋白C-末端的多克隆抗體，其中包含Seq.Id.No.2的脂連蛋白肽用于產生抗體。
22.針對脂連蛋白球狀結構域的多克隆抗體，其中包含Seq.Id.No.19的氨基酸107-244的脂連蛋白肽用于產生抗體。
20.如前述的本發明。
全文摘要
本發明涉及測量存在于人類血漿/血清中的人類脂連蛋白的不同形式的方法，更具體地所述方法基于ELISA測定法，其利用針對脂連蛋白的不同的單克隆抗體，與針對人脂連蛋白的不同結構域的不同多克隆抗體組合。本發明還提供了脂連蛋白的獨特同種型和其抗體，包括多克隆和單克隆抗體。
文檔編號G01N33/68GK101583875SQ200880001713
公開日2009年11月18日 申請日期2008年1月3日 優先權日2007年1月8日
發明者查爾斯·布格哈特, 雅雷馬·彼得·科漢, 埃里克·羅伊·拉斯馬森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司