專利名稱：結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白、其制備方法及用途，具體涉及結核分枝桿菌H37Rv早期培養濾液蛋白的提取方法，以及所制備的早期培養濾液蛋白在診斷結核病或結核桿菌潛伏感染人群的用途。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌復合群感染引起的多器官感染性疾病，主要為肺結核。全球結核感染者高達20億人，每年新發病例約800萬 1000萬，其中我國每年新發患者高達150萬。結核桿菌流行病學的一個重要特征是結核分枝桿菌的潛伏感染。結核分枝桿菌潛伏性感染是一種亞臨床狀態，無放射檢查征象，細菌呈休眠狀態，約有10%的結核分枝桿 菌潛伏性感染人群一生中會發展成為結核病患者。結核分枝桿菌潛伏性感染人群，也稱為結核病聞危人群，或稱為結核桿菌潛伏感染人群，通常將PPD(結核菌素純蛋白衍生物)皮試試驗72小時后呈強陽性，即硬結直徑^ 15mm和/或伴有水皰、壞死者稱為結核病聞危人群，也稱為結核分枝桿菌聞危人群或結核桿菌潛伏感染人群，為簡便起見，本申請將其統稱為結核桿菌潛伏感染人群。我國屬于世界上結核病嚴重流行的國家之一，全國結核病流行病學調查顯示，我國三分之一左右的人口已經感染了結核桿菌，受感染人數超過4億，其中一部分人將會發展為活動性結核病。因此必須采取措施進行有效控制，預防潛伏感染人群發展為結核病患者，而如何有效的、全面的篩查出潛伏感染人群，則是首要解決的問題。目前結核桿菌潛伏感染人群尚無診斷金標準，pro皮試試驗是診斷結核桿菌潛伏感染人群的常用方法，但這一方法有一定的缺陷性，因為試驗所用pro抗原為結核分枝桿菌、非致病性分枝桿菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反應，診斷特異性差。我國是普遍接種卡介苗的國家，而由于卡介苗接種者和結核桿菌自然感染者對pro試驗的反應在表現上很難區分，即使采用上述的pro皮試試驗強陽性作為判斷標準，仍然會有一部分卡介苗接種者以及非致病性分枝桿菌的感染者被納入結核桿菌潛伏感染人群中，因此導致pro試驗在結核桿菌潛伏感染人群診斷中的實際作用十分有限。我國結核病疫情嚴重，而潛伏性感染人群大、范圍廣又是目前導致結核病暴發的一個重要因素，如果能全面有效的診斷出結核桿菌潛伏感染人群并能在感染的早期進行治療和干預，就可以有效預防結核病的發生。因此尋找合適的結核桿菌特異性抗原及新的診斷技術，對象中國這樣普遍接種卡介苗的國家或地區將十分必要，也尤為重要。y 干擾素釋放分析技術(interferon gamma release assays, IGRA),是一種用于結核桿菌感染的體外診斷方法，其原理為機體感染結核桿菌以后，存于血液中的效應T淋巴細胞會在再次接觸結核桿菌特異性抗原時，產生和分泌細胞因子Y干擾素，通過對Y干擾素或產生Y干擾素的特異性效應細胞的定量檢測，可以對結核病或結核感染進行診斷。對Y干擾素的檢測通常應用酶聯免疫吸附法(ELISA)，現有的商品化試劑盒QuantiFERON-TB(簡稱TB Gold)是應用此方法定量分析特異性IFN_Y的水平。對產生、干擾素的特異性效應細胞的定量檢測則應用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)，現有商品化試劑盒TB-SP0T. TB即應用此方法，在單細胞水平定量檢測分泌Y干擾素的效應性T細胞。上述兩種診斷產品都選用了只存在于結核分枝桿菌基因組，但在卡介苗和非致病性分枝桿菌中普遍缺失的RDl區編碼蛋白作為特異性的T細胞抗原。抗原均采用的是傳統的合成肽加載刺激的方法，即使用來源于特異性抗原的相互重疊的合成肽混合物作為檢測樣本的刺激源，所用的特異性抗原主要是結核分枝桿菌早期分泌蛋白中的ESAT-6和CFP-IO0但此方法也有其局限性，即混合多肽池并不能包括結核分枝桿菌全部的表位肽，在全人類群的檢測中仍存在缺失現象，會造成檢測遺漏產生假陰性，特別對于我國這樣一個疫情嚴重、潛伏性感染范圍大的情況，能夠盡可能全面的檢出潛伏性感染者有其重要的現實意義，而上述試劑盒在這一方面存在局限。結核分枝桿菌早期培養濾液中的分泌性蛋白抗原是記憶性免疫CD4+T細胞的靶分子。通常將培養不超過7天的濾液蛋白稱為早期培養濾液蛋白，所述早期培養濾液蛋白 包括多種抗原蛋白，例如可能存在已經被鑒別出的ESAT6、MPT64和Ag85b等蛋白。在結核分枝桿菌培養過程中，隨著培養天數的增加，濾液蛋白中的蛋白濃度和/或組成也在變化，本申請的發明人驚奇的發現，培養5天的濾液蛋白在區分卡介苗接種和結核桿菌感染方面比培養7天及以上的濾液蛋白具有更加優異的效果，這一效果沒有任何報道予以揭示或啟示。并且發明人通過實驗證明培養5天的濾液蛋白與PH)皮試強陽性結果一致性高，表明其能夠比市售產品更廣泛的檢測出結核桿菌潛伏感染人群，因此以培養5天的早期培養濾液蛋白作為刺激源，優選結合ELISPOT診斷技術，更適合于結核桿菌潛伏感染人群的篩查，其同時具有較高檢測靈敏度和特異性將能夠保證更多的感染人群被檢出，并且有效降低卡介苗接種者的干擾，在我國這樣高感染、高發病且普遍接種卡介苗的國家或地區具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。
發明內容
本發明提供了一種具有較好的靈敏度和特異性、與pro皮試強陽性結果一致性高、適于結核病或結核桿菌潛伏感染人群篩查的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白。該早期培養濾液蛋白是結核分枝桿菌培養5天獲得的濾液蛋白，所述結核分枝桿菌優選H37Rv分枝桿菌(可商購)，所述培養條件優選振蕩培養，所述培養的培養基優選液體蘇通培養基，所述培養優選于活化培養后進行，所述活化培養優選于斜面培養基上進行，所述斜面培養基優選羅氏雞蛋培養基，所述濾液蛋白優選由培養5天后的菌液經離心、過濾、超濾離心濃縮后獲得，所述超濾離心濃縮優選包括培養基置換的步驟。本發明提到的結核分枝桿菌早期濾液蛋白特指培養5天獲得的濾液蛋白。進一步的，本發明提供結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白，其制備方法包括如下步驟I)菌種活化培養取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養基培養，收集培養好的菌體；2)用液體蘇通培養基重懸菌體，接種于液體蘇通培養基中，37°C振蕩培養5天；3)取培養5天的菌液進行離心分離，收集培養上清,將培養上清過濾除菌；4)將無菌培養上清進行超濾離心濃縮，得到本發明的早期培養濾液蛋白。本發明的上述早期培養濾液蛋白，其中第I)步菌種活化培養溫度優選35_37°C，更優選37°C，培養21天，本領域的普通實驗人員能夠判斷生長良好、無污染的菌體；培養基優選羅氏雞蛋斜面培養基；菌體收集方法優選用生理鹽水洗下，離心收集菌體；在用液體蘇通培養基重懸菌體前，優選用液體蘇通培養基洗滌收集到的菌體，洗滌方法為補充液體蘇通培養基到離心前的體積，再離心收集菌體，優選進行3次洗滌；步驟2)接種濃度優選I X IO6個細胞/ml I X IO8個細胞/ml，優選I X IO7個細胞/ml ;振蕩培養的優選條件為100-200rpm ;優選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養基的三角瓶中；步驟3)離心分離的優選條件為0_8°C, 4000-10000rpm,離心時間為10-60min,更優選為4°C, 8000rpm,離心時間30min ;過濾除菌可用常規的蛋白質過濾除菌的方法，優選使用0. 22 y m的濾膜；步驟4)超濾離心濃縮的優選條件為0-8°C, 2000-6000rpm,更優選為4°C, 4000rpm ;步驟4)優選將無菌培養上清進行超濾離心濃縮至5-15倍，優選為10倍，然后補加pH6. 5-7. 5，優選PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進行超濾離心濃縮，再重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟1-4次，優選3次，得到早期培養濾液蛋白。本發明還提供了結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白的制備方法，包括以下步驟I)菌種活化培養取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養基培養，收集培養好的菌體； 2)用液體蘇通培養基重懸菌體，接種于液體蘇通培養基中，37°C振蕩培養5天；3)取培養5天的菌液進行離心分離，收集培養上清,將培養上清過濾除菌；4)將無菌培養上清進行超濾離心濃縮，得到本發明的早期培養濾液蛋白。本發明提供的上述制備方法，其中第I)步菌種活化培養溫度優選35_37°C，優選37°C，培養21天，本領域的普通實驗人員能夠判斷生長良好、無污染的菌體；培養基優選羅氏雞蛋斜面培養基；菌體收集方法優選用生理鹽水洗下，離心收集菌體；在用液體蘇通培養基重懸菌體前，優選用液體蘇通培養基洗滌收集到的菌體，洗滌方法為補充液體蘇通培養基到離心前的體積，再離心收集菌體，優選進行3次洗滌；步驟2)接種濃度優選I X IO6個細胞/ml I X IO8個細胞/ml，優選I X IO7個細胞/ml ;振蕩培養的優選條件為100-200rpm ;優選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養基的三角瓶中；步驟3)離心分離的優選條件為0_8°C, 4000-10000rpm,離心時間為10-60min,更優選為4°C, 8000rpm,離心時間30min ;過濾除菌可用常規的蛋白質過濾除菌的方法，優選使用0. 22 y m的濾膜；步驟4)超濾離心濃縮的優選條件為0-8°C, 2000-6000rpm,更優選為4°C, 4000rpm,步驟4)優選將無菌培養上清進行超濾離心濃縮至5-15倍，優選為10倍，然后補加pH6. 5-7. 5，優選PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進行超濾離心濃縮，再重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟1-4次，優選3次，得到早期培養濾液蛋白。本發明的早期培養濾液蛋白的制備方法中，優選的培養基置換步驟，即在第4)步中的重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾濃縮的步驟，這樣能夠用磷酸鹽緩沖液置換掉培養上清中的大部分培養基成分，使獲得的早期培養濾液蛋白成分簡單、純度更高。本發明的早期培養濾液蛋白的制備方法優選包括接種液體培養基前對菌體進行洗滌，隨著清洗次數的增多，菌種接種液中含有的蛋白量逐漸減少，能夠去除菌體本身殘余的分泌蛋白和菌體膜蛋白，有助于提高目標濾液蛋白的純度。本發明還提供了上述培養5天的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白在制備結核病或結核桿菌潛伏性感染的診斷試劑或試劑盒中的用途及包括所述濾液蛋白的診斷試劑盒。所述診斷試劑或試劑盒優選為以所述早期培養濾液蛋白為刺激源的IFN-Y-ELISP0T診斷試劑及試劑盒，所述診斷試劑或試劑盒中早期培養濾液蛋白的劑量優選5 i! g/ml。目前結核桿菌潛伏感染人群尚無診斷金標準，而本發明通過研究驚奇的發現，培養5天的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白相比于培養7天的早期培養濾液蛋白以及現有的市售試劑盒更適于結核桿菌潛伏感染人群的篩查，培養5天的早期濾液蛋白比培養7天的早期濾液蛋白能夠更好的區分BCG接種和結核桿菌感染，從而克服PH)試驗診斷特異性差的缺陷，同時培養5天的早期濾液蛋白-INF-Y-ELISPOT方法與PTO皮試強陽性結果具有很高的一致性(93. 7% )，而現有的T-SP0T. TB試劑盒一致性僅為50%，表明培養5天的早期濾液蛋白能夠更廣泛的篩查出結核桿菌潛伏感染者，因此培養5天的早期培養濾液蛋白更適宜于結核桿菌潛伏感染人群的篩查。
具體實施例方式
實施例I :早期培養濾液蛋白的制備本實施例詳細說明了 H37Rv分枝桿菌的培養和早期培養濾液蛋白的制備方法。I. IH37Rv分枝桿菌的培養和接種將H37Rv分枝桿菌(ATCC 93009)接種于羅氏雞蛋斜面培養基上，37°C培養21天。取斜面生長良好且無污染的菌體，以生理鹽水洗下菌種，收集至離心桶內，4°C，SOOOrpm,離心30min，離心結束后棄去培養上清，收集菌體。用液體蘇通培養基洗滌菌體3次，洗滌方法為補充液體蘇通培養基到離心前的體積，再離心收集菌體，第一次清洗后上清中蛋白含量為547iig/ml，第二次清洗后上清中蛋白含量為147iig/ml，第三次清洗后上清中蛋白含量為64ii g/ml,由此可知,接種前對菌體進行洗漆能夠有效去除殘余分泌蛋白和菌體膜蛋白等。取液體蘇通培養基重懸洗滌后的菌體，按I X IO7個細胞/ml的接種濃度接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養基的三角瓶中，100 200rpm，37°C震蕩培養。I. 2培養濾液蛋白的收集和制備將培養0、3、5、7、10、13、15天的結核分枝桿菌菌液收集到離心桶內，4 °C，8000rpm,離心30min，離心結束后棄去菌體，收集培養上清。將培養上清過0. 22 y m濾膜過濾除菌。將除菌過濾后的培養上清進行超濾離心濃縮和置換緩沖液。實驗條件5000bp的超濾離心管或超濾離心杯，mi I Iipore公司；冷凍離心機，eppendorf 公司。實驗試劑pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液。實驗步驟首先將無菌培養上清置于超濾離心管或離心杯中進行離心，離心條件為4°C，4000rpm，控制離心時間使培養上清濃縮10倍；然后補加磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件進行超濾離心濃縮10倍；離心結束后再重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟3次，將培養上清中的培養基成分去除，置換成磷酸鹽緩沖液；最后濃縮得到的蛋白即為培養濾液蛋白。其中培養5天獲得的濾液蛋白稱為早期培養濾液蛋白。使用時可根據使用劑量對蛋白濃度進行調整。實施例2 :不同培養時間收獲的培養濾液蛋白濃度及其診斷效果比較2. I蛋白含量測定用Lowry法進行蛋白含量的測定(參見文獻Loery OH, Rosebrough NJ, FarrAL,et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J BiolChem. 1951,193(I)265-275)。實施例I獲得的不同培養時間收獲的培養濾液中蛋白濃度如下0天培養濾液蛋白濃度18 U g/ml3天培養濾液蛋白濃度33 u g/ml5天培養濾液蛋白濃度51 ii g/ml7天培養濾液蛋白濃度61 ii g/ml10天培養濾液蛋白濃度72 ii g/ml13天培養濾液蛋白濃度188 u g/ml 15天培養濾液蛋白濃度222 U g/ml2. 2培養5天的早期濾液蛋白穩定性分析由實施例2. I結果可知，隨著培養時間的延長,不同培養時間后結核分枝桿菌分泌到培養濾液上清中的蛋白濃度和/或組成也不同。目前為止，雖然有研究從所述濾液蛋白中分離出某些單一蛋白加以分析，但迄今并沒有也很難清楚的確定出結核分枝桿菌培養濾液蛋白中的所有蛋白及確切濃度，因此本領域對于結核分枝桿菌培養濾液蛋白組合物的表征均是采用培養天數進行表征，這樣才能夠更清楚的確定所述蛋白組合物。并且本領域技術人員知道，以活化狀態的菌種接種于液體培養基后，不同批次的生長曲線是相近的，菌體對特定蛋白的分泌時間也是相對恒定的，且發明人采用實施例I的方法重復進行多次實驗，結果培養5天的濾液蛋白濃度均在50 V- g/ml左右，即證實在一定菌體接種量和培養條件下，固定培養天數的濾液中蛋白濃度相對穩定，其差異屬于本領域可接受的誤差范圍，因此，以培養時間表征濾液蛋白能夠更清楚的表征所述蛋白組合物，對其功能的實現不產生影響。2. 3不同培養時間收獲的培養濾液蛋白的診斷效果比較將培養濾液蛋白進行稀釋，分別以g/ml的劑量對不同培養時間收獲的培養濾液蛋白的性能進行比較。實驗方法選取臨床確診的結核病人(簡稱病人)和無結核接觸史且接種過BCG的健康志愿者(簡稱健康接種者)，體外分離外周血單個核細胞，單個核細胞經過計數并調好細胞濃度后，分別與陰性對照物(培養基)、3y g/ml的不同培養時間獲得的培養濾液蛋白和陽性對照物(PHA)在5% C02，37°C條件下共同孵育16-20小時。孵育結束后棄去培養液，用200 u LPBS緩沖液重復洗板4次。每孔加入50 ii L標記抗體工作液，置2 8°C孵育60分鐘。孵育結束后棄去反應孔內液體，用200 u L PBS緩沖液重復洗板4次。每孔加入顯色底物溶液50 u L，在室溫中反應5 10分鐘后形成斑點。用實驗用水洗滌各孔終止反應。經過上述抗原抗體結合反應和酶促反應后形成斑點，計數斑點個數以進行診斷(陽性判斷標準為實驗孔斑點數> 6個)。比較結果見表I。表I :不同培養時間收獲的培養濾液蛋白-INF-Y-ELISPOT的診斷結果
權利要求
1.一種結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白，其特征在于該早期培養濾液蛋白是結核分枝桿菌培養5天的培養濾液蛋白。
2.如權利要求I所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白，其特征在于，其由包括以下步驟的制備方法獲得 1)菌種活化培養取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養基培養，收集培養好的菌體；所述斜面培養基優選為羅氏雞蛋斜面培養基，培養條件優選為37°C條件下培養21天，菌體收集方法優選為用生理鹽水洗下，離心收集菌體； 2)用液體蘇通培養基重懸菌體，接種于液體蘇通培養基中，37°C振蕩培養5天；優選在用液體蘇通培養基重懸菌體前，用液體蘇通培養基洗滌收集到的菌體；接種時優選的接種濃度為I X IO6個細胞/ml I X IO8個細胞/ml，更優選I X IO7個細胞/ml ;振蕩培養條件優選100-200rpm ;優選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養基的三角瓶中； 3)取培養5天的菌液進行離心分離，收集培養上清，將培養上清過濾除菌；離心分離的條件優選為4°C、8000rpm條件下離心30min,過濾除菌優選使用0. 22 y m的濾膜； 4)將無菌培養上清進行超濾離心濃縮，得到本發明的早期培養濾液蛋白；優選在4°C、4000rpm的條件下進行所述超濾離心濃縮。
3.如權利要求2所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白，其特征在于，步驟4)的超濾離心濃縮為將所述無菌培養上清超濾離心濃縮5-15倍，優選濃縮10倍，然后補加PH6. 5-7. 5，優選pH7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進行超濾離心濃縮，再重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮的步驟1-4次，優選重復3次，得到早期培養濾液蛋白。
4.權利要求I所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)菌種活化培養取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養基培養，收集培養好的菌體；所述斜面培養基優選為羅氏雞蛋斜面培養基，培養條件優選為37°C條件下培養21天，菌體收集方法優選為用生理鹽水洗下，離心收集菌體； 2)用液體蘇通培養基重懸菌體，接種于液體蘇通培養基中，37°C振蕩培養5天；優選在用液體蘇通培養基重懸菌體前，用液體蘇通培養基洗滌收集到的菌體；接種時優選的接種濃度為I X IO6個細胞/ml I X IO8個細胞/ml，更優選I X IO7個細胞/ml ;振蕩培養條件優選100-200rpm ;優選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養基的三角瓶中； 3)取培養5天的菌液進行離心分離，收集培養上清，將培養上清過濾除菌；離心分離的條件優選為4°C、8000rpm條件下離心30min,過濾除菌優選使用0. 22 y m的濾膜； 4)將無菌培養上清進行超濾離心濃縮，得到本發明的早期培養濾液蛋白；優選在4°C、4000rpm的條件下進行所述超濾離心濃縮。
5.如權利要求4所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4)的超濾離心濃縮為將所述無菌培養上清超濾離心濃縮5-15倍，優選濃縮10倍，然后補加pH6. 5-7. 5，優選pH7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進行超濾離心濃縮，再重復補加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮的步驟1-4次，優選重復3次，得到早期培養濾液蛋白。
6.權利要求1-3任一項所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白在制備結核病或結核桿菌潛伏感染的診斷試劑或診斷試劑盒中的應用。
7.權利要求4-5任一項的制備方法制備得到的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白在制備結核病或結核桿菌潛伏感染的診斷試劑或診斷試劑盒中的應用。
8.根據權利要求6-7任一項所述的應用，其中診斷試劑為以權利要求1-3任一項所述的早期培養濾液蛋白，或以權利要求4-5任一項所述的制備方法制備得到的早期培養濾液蛋白為刺激源的IFN-Y-ELISPOT診斷試劑，優選早期培養濾液蛋白的濃度為5 ii g/ml。
9.用于診斷結核病或結核桿菌潛伏感染的診斷試劑盒，其特征在于，以權利要求1-3任一項所述的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白或權利要求4-5任一項的制備方法制備得到的結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白為刺激源，優選早期培養濾液蛋白的濃度為5 y g/ml。
10.根據權利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包括IFN-y-ELISPOT 診斷試劑。
全文摘要
本發明提供結核分枝桿菌早期培養濾液蛋白、其制備方法及其在制備用于診斷結核病和結核桿菌潛伏感染人群的試劑及試劑盒中的應用。本發明的早期培養濾液蛋白的制備方法包括將H37Rv菌種接種斜面培養基，培養好的菌種接種到液體蘇通培養基中，37℃振蕩培養5天后分離得到。
文檔編號G01N33/68GK102746390SQ20111011141
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者徐苗, 楊蕾, 沈小兵, 王國治, 蘇城, 都偉欣, 陳保文 申請人:中國食品藥品檢定研究院
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