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專利名稱：熒光標記大麻性別基因特異片段檢驗系統(tǒng)及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因特異片段檢驗系統(tǒng)及方法，具體涉及大麻性別基因特異片 段檢驗系統(tǒng)及方法。
背景技術：
大麻是一種古老的栽培植物，是世界上許多國家重要的經(jīng)濟作物，但因其 含有毒性成分——四氫大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD)，已被聯(lián)合國禁毒公 約列為毒品。大麻為雌雄異株植物，雄性植株中不含THC和CBD或含量很少， 雌性植株二者含量則相對較高，因此認為雌性植株具有藥用價值和作為毒品的 濫用潛力。然而大麻雌雄植株在幼苗時期難以區(qū)分，只有當植株開花后才能辨 認，從而錯過了鏟除毒品原植物的最佳時期。因此大麻性別的鑒別、特別是早 期鑒別對于打擊毒品犯罪具有重大意義。
隨著科學技術的發(fā)展，大麻性別檢驗技術也在飛速發(fā)展，早期是通過大麻 外部形態(tài)及生理生化特征的差異鑒別大麻性別，相繼發(fā)展到由細胞水平的差異 和目前在DNA分子水平上研究大麻性別。從上世紀90年代至本世紀初國內(nèi)外 學者用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)或隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)技術 對大麻性別進行鑒定，找到了相應的大麻性別的AFLP標記和RAPD標記并進 行了序列測定或轉化為可靠性穩(wěn)定性更好的SCAR(sequence characterized amplified regions)標記。這些DNA分子標記技術應用于雌雄異株植物的性別鑒 別，相對于形態(tài)及生理生化特征的鑒別提高了鑒別結果的準確性和可靠性。
RAPD標記技術是Williams等(19卯)提出的，其原理是用含有10個堿基隨 機序列組成的寡核苷酸做引物，通過PCR擴增獲得長度不同的多態(tài)性DNA片 段。它具有設計引物無須知道序列信息，不需要DNA探針，合成一套引物，可 用于不同生物，技術簡便，成本較低等優(yōu)點。由于這些優(yōu)點，使該技術在動植 物及人類基因定位和作圖研究中都得到了廣泛的應用。如在大麻性別研究中 Sakamoto等(1995)用15個隨機引物擴增得到一條700 bp的雄性特異帶；Hong Shao等(2003)用15個隨機引物對大麻雌雄株進行了 RAPD分子標記，其中有一個引物擴增出雌株特異條帶，找到了與雌性相關的特異標記。但RAPD標記 技術的實驗重復性差，每個標記提供的信息量少，不能鑒別雜合子和純合子， 檢測受反應條件的影響較大，結果可靠性低。
AFLP標記技術是由Zabeau和Vos于1993年創(chuàng)立的，該技術結合了 RFLP 技術和RAPD技術的特點，使用人工接頭(adaptor)與基因組DNA限制性內(nèi)切酶 酶切片段連接并以此為DNA模板，合成系列3， 一末端，隨機變化三個堿基且 與人工接頭系列互補PCR引物進行特異條件擴增，通過變性PAGE電泳檢測后 可獲得多態(tài)性圖譜，AFLP技術革新是繼RFLP、 SSR和RAPD之后近幾年來， 發(fā)展最快的DNA分子標記技術，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)、漁業(yè)、醫(yī)學等生命科 學領域中正得到廣泛應用。如在大麻性別研究中Giuseppe等(2002)對雄和雌 的BSA(bulked segregant analysis)進行AFLP分析，表明大麻雄性染色體的存在。 V.M.Cristiana Molitemil (2004)利用意大利的雌雄異株栽培種大麻品種 Fibranova，對大麻的性別差異進行了形態(tài)學及分子生物學研究。但AFLP技術 需進行酶切位點和構建人工接頭等，前期技術建立較復雜。
SCAR分子標記是1993年由Paran和Michelmore提出的基于PCR技術的單 基因位點多態(tài)性遺傳標記，SCAR分子標記是在序列未知的DNA標記(RAPD， AFLP等)基礎上，對其特異產(chǎn)物進行回收、克隆和測序，根據(jù)擴增產(chǎn)物的堿基 序列重新設計特異引物，并以此引物對基因組DNA進行PCR擴增獲得。新的 SCAR引物一般是在原來標記引物的基礎上延長了 IO個左右堿基，不僅加強了 與模板的特異性結合，而且提高了退火溫度，提高了轉化后新標記檢測的專一 性。SCAR具有已知序列，標記共顯性且簡單易用、重復性好等優(yōu)點。如Otto T6rjek等(2002)利用20條RAPD引物對雌雄異株和雌雄同株大麻栽培種進 行分子標記，其中有2個引物產(chǎn)生了與雄性植株的特異帶。將這兩條帶進行了 分離、克隆和測序，并轉換為了SCAR標記，通過F2檢測這兩個標記與雄性表 現(xiàn)型緊密連鎖，通過F2的遺傳分析確定它們在Y染色體上。
從檢測的角度來看，AFLP標記、RAPD標記和SCAR標記在國內(nèi)主要采用 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染技術或瓊脂糖電泳EB染色技術分析，相對于可應用熒 光毛細管電泳技術檢測的熒光標記大麻性別特異片段檢驗系統(tǒng)具有操作步驟多、耗時、靈敏度低，丙烯酰胺、EB染料試劑等對實驗人員健康和環(huán)境等危害
較大，對實驗操作人員技術水平要求較高等缺點。特別是AFLP標記和RAPD 標記的電泳圖譜的譜帶較多，結果不簡單易判，給檢驗人員在分析識別時造成 了一定的難度，可能造成誤判或漏判，這是法庭科學鑒定中的最嚴重的錯誤。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服現(xiàn)有AFLP標記、RAPD標記和SCAR標記的上述缺 點，本發(fā)明提供一種操作簡單、檢驗時間短、結果可靠直觀、擴增片段長度短 的大麻性別基因檢驗系統(tǒng)及方法。
本發(fā)明提供一種熒光標記大麻性別基因特異片段檢驗系統(tǒng)，其中，所述檢 驗系統(tǒng)是以熒光標記的DM016為雄性引物、以熒光標記的DM029為雌性引物、 并以待測大麻DNA為模板的PCR反應系統(tǒng)，其中所述引物序列如下
DM016: (F) 5'FAM畫GCCCAAGTTGCTGCTGAG3， (R) 5，CCCACCGTTTAGGGAGCA3'
DM029: (K) 5,FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3， (R) 5'ACGTTGTTGCTCGTAAAT3，
本發(fā)明通過以待測大麻DNA為模板、以熒光標記的DM016為雄性引物、以 熒光標記的DM029為雌性引物的PCR反應系統(tǒng)，成功的擴增出可用于大麻性別 鑒定的長度較短的基因片段，此方法操作簡單、檢驗時間短、結果可靠直觀。
本發(fā)明還提供上述檢驗系統(tǒng)的檢驗方法，其中
PCR反應體系的初始變性條件92-98'C， 2-11分鐘；
變性條件91-97°C， 30秒鐘-2分鐘
退火54-66 °C, 30秒鐘-2分鐘，30循環(huán)；
延伸條件69-75匸，l分鐘；
終延伸72"C,2分鐘;
保溫4'C維持
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳測得各產(chǎn)物的片段長度，得到待測植物性別檢測結果。
其中優(yōu)選條件為
PCR反應體系的初始變性條件95°C， 11分鐘；變性條件94。C，30秒鐘； 退火6(TC，30秒鐘，30循環(huán)； 延伸條件72'C，1分鐘； 終延伸72"C，2分鐘； 保溫4'C維持。
所述電泳采用熒光毛細管電泳技術檢測。
大麻是雌雄異株植物，其為二倍體，染色體數(shù)20條，18條為常染色體，2 條為性染色體，大麻的性別主要由遺傳物質決定，含有一個X和一個Y染色體 的植株一般為雄株，含有兩個X染色體的植株一般為雌株，但受環(huán)境等因素的 影響，大麻的性別又表現(xiàn)出具有一定的可變性。
本發(fā)明檢測毒品植物大麻基因組中性染色體上的特異片段，是用聚合酶鏈 反應在一個反應中使用熒光標記引物同時擴增兩個特異DNA片段來進行大麻的 性別和初步的種屬鑒定。
本發(fā)明以GENEBANK中的大麻X、 Y染色體上的DNA序列為基礎設計多 對引物，經(jīng)過大量試驗挑選出具有對大麻性別特異型、擴增效率和特異性高的 雄雌性引物各一對。實驗表明該對引物具有組織同一性，在區(qū)分大麻雄性和雌 性植株方面具有良好的表現(xiàn)特征，并且在對大麻近親植物和大麻類毒品中經(jīng)常 參雜的植物桑、谷子、煙草、苜蓿、水稻、罌粟的種屬檢驗中表現(xiàn)出種屬特 異性。
本發(fā)明提供的同時鑒別雌、雄性大麻的熒光標記大麻X、 Y染色體引物的復 合擴增體系，將用于復合擴增分析的大麻雄、雌性寡核苷酸引物混合在同一個 試管內(nèi)。復合擴增體系中的大麻性別片段被位于該基因兩側的一對引物擴增， 其中每對引物中有一條引物的5'端進行FAM熒光標記。擴增產(chǎn)物為129個堿基 和238個堿基，控制在300個堿基以內(nèi)，實現(xiàn)對高度降解、腐敗檢材(如大麻 煙、大麻脂)的檢測。大麻雄、雌性植株檢測結果見圖3。
本發(fā)明首先在國內(nèi)研制出大麻性別片段、并在單一反應中復合擴增的熒光 標記復合擴增體系。為毒品原植物大麻的早期性別鑒別、為禁毒鏟毒、維護社 會穩(wěn)定提供了 一個有力的工具。經(jīng)過研究篩選出的DM016和DM029兩對性別鑒定引物組合，其中DM016 的擴增片段是238bp， DM029的擴增片段是129bp，目的片段相差lOObp左右， 適合用同一種熒光標記，并且擴增產(chǎn)物片段較小實現(xiàn)了高靈敏度和檢測抗腐敗 樣品的目的。兩者在實驗中的最佳退火溫度均是60°C，引物間無穩(wěn)定的二聚體 或發(fā)夾結構，其復合擴增效率高，靈敏度強，能夠滿足大麻性別鑒別的需要。 大麻雄、雌性植株檢測結果見圖3。
本發(fā)明在國內(nèi)首先研制出大麻雄、雌性特異片段的熒光復合擴增檢測體系， 其所使用的毛細管電泳檢測設備在全國大多數(shù)法醫(yī)DNA實驗室都已裝備，較易 推廣和應用于全國毒品原植物大麻的早期性別鑒別和禁毒鏟毒的實際案件中。
用DM016、 DM029兩對引物分別對內(nèi)蒙、山西、甘肅、新疆、云南、貴 州、安徽等八個不同產(chǎn)地的大麻雄、雌性樣本進行擴增并測序，八個產(chǎn)地雄、 雌性大麻的擴增片段大小一致。測序結果表明雄性擴增片段序列與GENEBANK 中提供的序列比對一致，說明擴增片段在大麻植物中具有很好的穩(wěn)定性。雌性 擴增產(chǎn)物在擴增片段的第30個堿基與GENEBANK中的堿基不同，存在突變， 但不影響結果判定。
在對大麻近親植物和大麻類毒品中經(jīng)常參雜的植物桑、谷子、煙草、苜 蓿、水稻、罌粟的種屬檢驗中本復合擴增體系結果表現(xiàn)出種屬特異性。
本發(fā)明的檢驗系統(tǒng)適合中國范圍內(nèi)種植的大麻。


圖1大麻性別種屬特異性檢測結果(瓊脂糖電泳) 從左至右依次為Kb為空白對照；
l一7:桑、谷子、煙草、苜蓿、水稻、罌粟、大麻雄性樣本； 圖2大麻性別種屬特異性檢測結果(熒光電泳)
從上至下依次為l雌性大麻；2雄性大麻；3小麥；4桑葉;5煙葉;6核 桃葉；7月季葉；8柿子葉； 圖3使用熒光標記大麻性別特異片段檢驗系統(tǒng)對大麻雄、雌性植株檢測結 果(3100基因分析儀電泳)； 從上至下依次為大麻雌性樣本、大麻雄性樣本-,圖4使用熒光標記大麻性別特異片段檢驗系統(tǒng)對大麻煙檢測結果(橫坐標 為堿基數(shù)、縱坐標為相對熒光強度)； 本發(fā)明的有益效果如下
1、 靈敏度好，利于檢驗涉毒案件中常遇到的腐敗干枯檢材。
2、 準確率高
采自不同產(chǎn)地的336份大麻樣本，經(jīng)過檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計并分析基因型和表 型一致率達到95%以上。
3、 具有種屬特異性
在對大麻近親植物和大麻類毒品中經(jīng)常參雜的植物桑、谷子、煙草、苜
蓿、水稻、罌粟的種屬檢驗中表現(xiàn)出種屬特異性(圖l、圖2)。
具體實施例方式
在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例
使用熒光標記大麻性別特異片段檢驗系統(tǒng)對寧夏回族自治區(qū)固原市禁毒支 隊繳獲的大麻煙進行檢驗。
一、以硅珠法提取大麻煙樣品中的DNA，使用試劑和具體操作如下
1、試劑配制
Tris/NaCl (TES)消化緩沖液100mM Tris-HCL， 500mMNaCl， 2%SDS， 50mMDTT， 0.25mg/mL Proteinase K, lOmMEDTA， PH 8.0
吸附液12g GuSCN溶于10mL 0.1M Tris-HC1(PH6.4)，加入0.8mL 0.5M EDTA(PH 8.0)和0.5mLTriton-X100
漂洗液1: 12g GuSCN溶于10mL O.IM Tris-HC1(PH6.4)
漂洗液2: 50mM Tris-HCL， 10mMEDTA， 0.15mM NaCl(PH6.5)。用時取 30mL加入無水乙醇70rnL。
硅珠懸浮液lmL去離子水加入0.06g硅珠。
2、 DNA提取步驟
1 )取大麻煙約50mg研磨成粉末轉移至1.5mL離心管中加入400^L Tris/NaCl (TES)消化緩沖液，56'C消化2小時，期間每半小時震蕩混勻一次。2) 消化完畢后13000rpm離心2分鐘，取上清液300pL置于新1.5mL離心 管中，加入三倍體積的吸附液，震蕩混勻，56。C保溫15分鐘。
3) 取出離心管5000rpm離心15分鐘，將上清液轉移到另一新1.5mL離心 管中，加入硅珠懸液40uL,混勻后吸附1小時，期間每10分鐘混勻一次。
4) 將離心管5000rpm離心10分鐘，棄去上清液。加入500uL漂洗液1連 同硅珠轉移到新1.5mL離心管中，5000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。
5) 加入500uL漂洗液2，震蕩洗滌，5000rpm離心IO分鐘，棄上清廢液。 重復此步驟兩次。
6) 打開離心管蓋，室溫下?lián)]發(fā)干燥硅珠10 15分鐘。
7) 加入TE緩沖液50uL， 56°。孵育15分鐘，其間振蕩1次。
8) 12000rpm離心2分鐘，取上清進行后續(xù)PCR反應或4。C保存?zhèn)溆谩?二、使用熒光標記大麻性別特異片段檢驗系統(tǒng)進行PCR反應。
1、 PCR反應體系
總體系 25
去離子水 13.6pL
10xPCR GOLD Buffer 2.5|iL
dNTP(2.5醒ol/L;) 2.0(xL
Mg2+(25mmol/L) 2單
雄性Primer(5^imol/L) 各LO(xL
雌性Primer(5拜ol/L) 各0.85^L
Taq Gold DNA聚合酶5U^iL 0.2pL
模板DNA l.OpL
2、 PCR反應循環(huán)程序
1) 將PCR擴增管置于熱循環(huán)儀上。
2) 使用下面推薦的程序進行熱循環(huán)。
AB公司9600和9700熱循環(huán)儀的擴增程序: 初始變性條件為95°C， ll分鐘;
變性條件為94°C， 30秒鐘；退火條件為6CTC， 30秒鐘，30循環(huán)； 延伸條件72°C， l分鐘； 終延伸72°C， 2分鐘； 保溫4t:維持；
3)擴增后的樣品應盡快檢測，否則應密封避光保存在-2(TC。
三、 擴增產(chǎn)物用ABI PRISM 3100遺傳分析儀檢測
1、 按1: 100比例混合內(nèi)標(LIZ-500, AB公司)和去離子甲酰胺配制成 上樣混合物，振蕩混合均勻。
2、 向96孔板的每孔中加入15pL上樣混合物和lpL擴增產(chǎn)物，快速離心， 避免產(chǎn)生氣泡。
3、 95。C變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后將96孔板置于ABI PRISM 3100遺傳分析儀中盡快電泳。
四、 檢驗結果
使用3100型遺傳分析儀對PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測后，采用GeneMapper ID3.2 (AB公司)軟件分析后得到各產(chǎn)物的片段長度(圖4)。
獲得結果證明所繳獲的大麻煙均是由雌性大麻植株制備而來，說明此大麻 煙是有組織的種植、與辦案單位偵查結果相一致。
權利要求
1.一種熒光標記大麻性別基因特異片段檢驗系統(tǒng)，其特征在于所述檢驗系統(tǒng)是以熒光標記的DM016為雄性引物、以熒光標記的DM029為雌性引物并以待測大麻DNA為模板的PCR反應系統(tǒng)，其中所述引物序列如下DM016(F)5’FAM-GCCCAAGTTGCTGCTGAG3’ (R)5’CCCACCGTTTAGGGAGCA3’DM029(F)5’FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3’ (R)5’ACGTTGTTGCTCGTAAAT3’。
2. 根據(jù)權利要求1所述的檢驗系統(tǒng)的檢驗方法，其特征在于 PCR反應體系的初始變性條件92-98°C， 2-11分鐘； 變性條件91-97。C,30秒鐘-2分鐘；退火54-66°C, 30秒鐘-2分鐘，30循環(huán); 延伸條件:69-75。C， 1分鐘； 終延伸72。C，2分鐘； 保溫4'C維持；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳測得各產(chǎn)物的片段長度，得到待測植物性別檢測結果。
3. 根據(jù)權利要求2所述的檢驗系統(tǒng)的檢驗方法，其特征在于 PCR反應體系的初始變性條件95i:，ll分鐘； 變性條件94。C,30秒鐘;退火6CTC， 30秒鐘，30循環(huán); 延伸條件72"C,1分鐘； 終延伸72i:，2分鐘； 保溫4'C維持；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳測得各產(chǎn)物的片段長度，得到待測植物性別檢測結果。
4. 根據(jù)權利要求2、 3所述的檢驗系統(tǒng)的檢驗方法，其特征在于 所述電泳采用熒光毛細管電泳技術。
全文摘要
本發(fā)明提供一種熒光標記大麻性別基因特異片段檢驗系統(tǒng)，其中，所述檢驗系統(tǒng)是以熒光標記的DM016為雄性引物、以熒光標記的DM029為雌性引物并以待測大麻DNA為模板的PCR反應系統(tǒng)。本發(fā)明同時提供該檢驗系統(tǒng)的檢驗方法。
文檔編號G01N21/64GK101525666SQ200910081869
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權日2009年4月14日
發(fā)明者濤 馮, 政 凃, 季安全, 穎 張, 張貴芹, 彭建雄, 徐小玉, 董林芳, 黎 裴, 佳 郭 申請人:公安部物證鑒定中心