專利名稱：用于抑制腫瘤性損傷的化合物的鑒定方法
背景技術：
本發明提供了用于鑒定化合物的方法，所述化合物可用于治療和預防哺乳動物中的前癌損傷和癌損傷。本申請是美國專利申請08/866027(Piazza et al.,1997年5月30日申請)的接續申請。
家族性腺瘤息肉病(FAP)是一種遺傳病，在大多數情況下患者的結腸中有許多息肉或腺瘤。由于這些患者長有許多息肉或腺瘤，而這些息肉或腺瘤發展成癌癥的可能性很大--通常的治療方法是通過外科手術除去結腸。在約1983年，Waddell發現，當將非甾體抗炎藥(NSAID)舒林酸施用給患FAP的患者時，會使結腸息肉(一種前癌損傷)退化并防止其復發。Waddell用舒林酸治療FAP患者的結果在數個隨后的研究中得到證實。不幸的是，由于舒林酸和其它NSAIDS會使長期施用它們的患者的消化道損傷(更不用說與腎有關的副作用和干擾正常的血液凝集)，因此，該方法不是可行的治療FAP或任何其它需長期給藥的癌或前癌指征(即腫瘤)的方法。
Waddell最初假設舒林酸對結腸息肉的作用機制是抑制前列腺素(PG)的合成。(Waddell,W.R.et al.,“Sulindac for Polyposis of theColon”,Journal of Surgical Oncology,24:83-87,1983)。前列腺素(PG)合成的抑制產生于因NSAID而引起的環加氧酶(COX)的抑制。NSAID的一種常見好處是降低炎癥，通常認為這是由PG水平的降低引起的。由于已知NSAID可抑制COX,COX抑制PG合成，因此普遍認為結腸息肉的退化是這種特性作用的結果。事實上，盡管與最新的發現相反，但人們已經習慣地認為將PG合成抑制劑(如NSAID)施用給患FAP或其它前癌損傷或癌損傷的患者后，會因PG水平的降低而使損傷退化。
但最新發現將科學家引向一個完全不同的方向--即不需抑制COX就可成功地治療腫瘤患者。Pamukcu等在美國專利5401774中公開了磺酰基化合物可出人意料地抑制多種腫瘤細胞(包括結腸息肉細胞)的生長，而以前報道認為這些化合物沒有PG合成抑制劑的活性(因此不是一種NSAID或抗炎化合物)。已在結腸癌的大鼠模型中證實了這些磺酰基衍生物是有效的，而且已證明一種變體(現稱為exisulind)在FAP病人的初期臨床試驗中是有效的。
不能夸大該發現--以及抗腫瘤活性和COX抑制之間沒有關系的重要性。如果這兩種現象是有關的，那么對于用于FAP患者的NSAID治療的安全性就不能寄于什么希望，因為NSAID的副作用，如胃刺激也是由COX抑制引起的。前列腺素對于胃內壁(lining)有保護作用。在施用NSAID時，COX受到抑制，PG水平降低胃刺激是一種普遍結果。在短期(急性)治療中，這些副作用本身并不顯著。但是在長期(緩慢的)NSAID治療中，胃刺激、出血和潰瘍是很常見的。在許多病例中，均由于這些嚴重的副作用以及其它可能的致死副作用而必須終止NSAID治療。此外，所述副作用的嚴重性隨年齡的增加而增加，可能是因為胃粘膜中的天然PG水平隨年齡而下降的緣故。因此，用于治療腫瘤損傷的有用的化合物應能合理地抑制腫瘤細胞的生長，但不應抑制COX。
可以用篩選化合物的常規方法找到抑制腫瘤細胞生長的改進的化合物。在這種情況下，可用體外模型篩選藥物。但常規體外篩選方法可能會由于許多意想不到的問題而放過許多在以后的動物模型中表明是無效的化合物，問題之一可能是體外篩選不能預測化合物的功效。動物模型費時費錢。因此，需要能提供預兆的治療腫瘤信息的更精確的體外篩選化合物的方法，以便在人試驗前篩選化合物。有關抑制人癌癥特異性靶的知識可以使精確度和效力更高，由此在動物試驗前鑒定出高效安全的化合物。
目前，合理藥物鑒定方法被用于藥物工業以改進臨床上有用的化合物的鑒定方法。通常，合理藥物鑒定方法指“鎖-匙”概念，由此，確定治療靶分子(鎖)和藥物化合物(匙)之間的結構關系。通過專用的計算機軟件進入化合物數據庫，以鑒定與靶分子吻合的可能的幾何接合，從而大大改進了所述方法。不幸的是，為了使用這些系統，人們不得不深入了解靶分子(鎖)。所述靶可能是例如酶、蛋白質、膜或核受體、或核酸序列。
在復雜的疾病如腫瘤中，科學家已經鑒定了許多可能的靶點。但是，可用于治療腫瘤的許多藥物是非特異性的并對正常組織有毒性，因此不能用于治療前期癌，而只有當腫瘤細胞發展為癌時才能使用這些藥物。對癌癥機制的進一步了解可以使科學家轉向設計更具特異性的抗腫瘤藥物-即可以在疾病進展的早期安全施用的藥物。本發明概述本發明涉及新的體外篩選試驗化合物的方法，該方法用于檢測化合物安全治療和預防腫瘤、特別是前癌損傷的能力。具體地說，本發明提供了鑒定試驗化合物的方法，所述化合物可用于治療和預防腫瘤、包括前癌損傷并且與COX抑制和其它非特異性相互作用有關的副作用最小。
因此，在本發明的優選實施方案中，篩選方法包括測定試驗化合物的COX抑制活性。由于本發明人發現了抑制癌癥和抑制磷酸二酯酶5型同工酶(“PDE5”)之間的關系，所以本發明包括測定化合物的PDE5抑制活性。本發明的篩選方法優選還包括測定化合物是否可以抑制細胞培養物中的腫瘤細胞的生長。
在另一個實施方案中，本發明的篩選方法涉及測定化合物的COX抑制活性、測定化合物的PDE5抑制活性以及測定化合物是否可以誘導腫瘤細胞的細胞程序死亡。
通過用該方法篩選化合物，可以比以往更迅速、更精確地鑒定出潛在的有益的且更好的化合物。通過下述詳細說明，其它優點將更加明顯。附圖簡述
圖1說明舒林酸的硫化物衍生物和舒林酸的砜衍生物(a.k.a.exisulind)對純化的環加氧酶活性的影響。
圖2說明試驗化合物B和E對COX抑制的影響。
圖3說明舒林酸的硫化物和exisulind對從培養的腫瘤細胞中純化出的PDE-4和PDE5的抑制作用。
圖4說明舒林酸硫化物對HT-29細胞中環核苷酸水平的影響。
圖5說明化合物B的磷酸二酯酶抑制活性。
圖6說明化合物E的磷酸二酯酶抑制活性。
圖7說明舒林酸硫化物和exisulind對HT-29細胞的細胞程序死亡和壞死的影響。
圖8說明舒林酸硫化物和exisulind對HT-29細胞生長抑制和由DNA片段化確定的細胞程序死亡誘導的影響。
圖9說明化合物E的細胞程序死亡誘導特性。
圖10說明化合物B的細胞程序死亡誘導特性。
圖11說明舒林酸硫化物和exisulind對腫瘤細胞生長的影響。
圖12說明舒林酸硫化物和對照(DMSO)的生長抑制和細胞程序死亡誘導活性。
圖13說明化合物E的生長抑制活性。
圖14說明在小鼠乳腺器官培養中，舒林酸代謝物對前期惡性、腫瘤損傷的抑制作用。優選實施方案的詳述本發明的方法用于鑒定可用于治療或預防腫瘤的化合物，所述化合物沒有常規NSAID的嚴重副作用。
認為癌癥和前期癌是與細胞生長失調有關的疾病。細胞生長涉及許多不同的因素。其中一種因素是細胞增殖怎樣過快，另一種是細胞怎樣快速死亡。根據環境刺激的情況，細胞可通過壞死或細胞程序死亡而死亡。細胞分化是影響腫瘤生長動力學的另一因素。分辨出試驗化合物影響與細胞生長有關的許多因素的哪一方面，對于發現藥物治療的相關靶點是非常重要的。可將以該選擇性為基礎的篩選試驗與確定哪個化合物有生長抑制活性的試驗相結合。
本發明是數個重要發現的產物。首先，本發明人發現合乎需要的腫瘤細胞生長抑制劑誘導通過細胞程序死亡的癌細胞在成熟前死亡(參見Piazza,G.A.et al.,Cancer Research,55(14),3110-16,1995)。其次，本發明人意想不到地發現選擇性地誘導細胞程序死亡而基本沒有COX抑制作用的化合物，也可抑制磷酸二酯酶(PDE)。具體地說，與科學家的研究相反，可治療腫瘤損傷的化合物選擇性地抑制磷酸二酯酶的5型同工酶(PDE5)(EC3.1.4.17)。PDE5是至少7種磷酸二酯酶同工酶中的一種。PDE5是獨特的，即它可選擇性地降解環GMP，而其它類型的PDE是非選擇性的或降解環AMP。優選地，合乎需要的化合物基本上不抑制其它類型的磷酸二酯酶。
本發明優選的實施方案包括測定給定化合物的環加氧酶抑制活性，測定所述化合物的PDE5抑制活性。通過評估試驗化合物的活性與特定截斷值而直接地或通過將受試化合物的活性與用于治療腫瘤損傷的已知化合物的活性加以比較而間接地，來評價試驗化合物治療腫瘤損傷的能力。已知可有效治療腫瘤損傷而不會引起胃刺激的標準化合物是5-氟-2-甲基-1-(對-甲基磺酰基亞芐基)-3-茚基乙酸(exisulind)。其它可用于比較目的的有用的化合物包括已知抑制COX的那些化合物，如消炎痛和舒林酸5-氟-2-甲基-1-(對-甲基磺酰基亞芐基)-3-茚基乙酸的硫化物代謝物(舒林酸硫化物)。其它用于比較目的的有用化合物包括已知抑制PDE5的那些化合物，如1-(3-氯苯胺基)-4-苯-2,3-二氮雜萘(MY5445)。
如果試驗化合物好于exisulind或可與exisulind相比，并且不抑制COX，顯然就可確定該化合物是一種有前途的候選化合物。通常，合乎需要的化合物是抑制PDE5并抑制細胞生長，以及誘導細胞程序死亡，但在藥物學可接受的劑量下不抑制COX的化合物。
文中所用術語“前癌損傷”包括以異常腫瘤形成為代表的綜合征，包括異型增生、組織改變。實例包括結腸、乳腺、前列腺或肺組織內的異型增生，或如異型增生痣綜合征、皮膚惡性黑素瘤的前體等病癥。除異型增生痣綜合征外，實例還包括息肉病、結腸息肉、子宮的前癌損傷(即子宮異型增生)、食管、肺、前列腺異型增生、前列腺內腫瘤、乳腺和/或皮膚以及相關疾病(如actinic keraosis)，不論所述損傷在臨床上是否是可鑒定的。
文中所用術語“癌”或“癌癥”指癌性損傷。實例包括惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌。文中所用術語“腫瘤”和“瘤”指癌性的和前癌性損傷。
文中所用縮寫PG指前列腺素；PS指前列腺素合成酶；PGE2指前列腺素E2；PDE指磷酸二酯酶；COX指環加氧酶；RIA指放射性免疫檢測。
文中所用“PDE5”指表現出cGMP特異性水解酶活性和高cGMP結合親和性的酶和其任何異構體。
在本發明的另一方面，提供了對需要腫瘤治療的患者進行治療的方法，該方法包括鑒定在可藥用劑量下表現出PDE5抑制活性的化合物，給患有對所述化合物敏感的腫瘤的患者施用一種或多種所述化合物。篩選方法提供下列篩選方法和其它方案以有助于理解用于篩選試驗化合物的優選方法，所述方法用于測定所述化合物治療或預防腫瘤，特別是前癌損傷的潛力。1 測定COX抑制活性可用兩種方法中的任一種測定COX抑制作用。一種方法包括將完整HL-60細胞與待篩選化合物接觸，然后測定HL-60細胞分泌PGE2的量。另一種方法包括在存在所述化合物的條件下，測量純化的環加氧酶(COX)的活性。這兩種方法涉及在以前的文獻中描述過的操作方案。
1.A．PGE2分泌按照本領域已知的方法，評估本發明的化合物，以確定其是否可抑制前列腺素E2(PGE2)的生產。例如。通過采用用于PGE2的酶免疫檢測(EIA)試劑盒(如從Amersham,Arlington Heights,IL USA購買的)測量細胞分泌的PGE2。適宜的細胞包括產生豐富PG的那些細胞，如HL-60細胞。HL-60細胞是在成熟粒細胞中，用DMSO分化的人早幼粒細胞。(參見Collins,S.J.Ruscetti,F.W.,Gallagher,R.E.and Gallo,R.C.,“Normal Fuctional Characteristics of Cultured Human PromyelocyticLeukemia Cells(HL-60)After Induction of Differentiation ByDimethylsulfoxide”,J.Exp.Med.,149:969-974,1979)。在用鈣離子載體A23187刺激后這些分化的細胞產生PGE2(參見Kargman,S.,Prasit,P.and Evans,J.F.,“Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase”,J.Biol.Chem.,266:23745-23752,1991)。HL-60細胞可從美國典型培養物保藏中心得到(ATCC:CCL240)。在37℃,5％CO2下，它們可在補加有20％熱滅活胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中生長。為了誘導骨髓分化，將細胞與1.3％DMSO接觸9天，然后洗滌并將之以3×106細胞/ml重懸在Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液中。
在存在所需濃度的受試化合物的條件下，于37℃將分化的HL-60細胞(3×106細胞/ml)保溫15分鐘。然后用A23187(5×10-6M)對細胞刺激15分鐘。按上述測量分泌到外部培養基中的PGE2。
1.B 純化的環加氧酶已經報道有兩種不同形式的環加氧酶(COX-1和COX-2)可調節前列腺素合成。已知COX-2代表COX的可誘導形式，而COX-1代表構成形式。采用按Boopathy&Balasubramanian所述(“Purification AndCharacterization Of Sheep Platelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.,239:371-377,1988,該文獻引入本文作為參考))從公羊精囊純化的COX-1，通過Mitchell等描述的方法(“Selectivity of NonsteroidalAnti-inflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and InducibleCyclooxygenase”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11693-11697,1993，該文獻引入本文作為參考)可測量COX-1的活性。按Mitchell等所述(1993，同上文)，用從羊胎盤中純化的COX-2可測量COX-2的活性。
用本領域已知的方法可測定藥物的環加氧酶抑制活性。例如，Boopathy&Balasubramanian(1988，同上文)描述了一種方法，其中在37℃將前列腺素H合酶1(Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan)與100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、輔因子(如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氫醌、0.625μM血紅蛋白和1.25mM CaCl2,在100mMTris-HCl中，pH7.4)和待測藥物一起保溫20分鐘。保溫后，用三氯乙酸終止反應。通過加入硫代巴比土酸和丙醛終止反應后，可在530nm通過分光光度計測量酶活性。
顯然，相對于其較大的PDE5抑制活性而言，表現出最小COX-1和COX-2抑制活性的化合物不是完全不合乎需要的。
1.C．分析結果通過比較在存在和不存在試驗化合物的條件下環加氧酶的活性，來確定抑制量。在約100μM的濃度下殘留的或沒有COX抑制活性(即低于約25％)，表明應進一步評估所述化合物用于治療腫瘤的用途。對于需進一步考慮其潛在用途的化合物，優選其IC50濃度應大于1000μM。
2．測定磷酸二酯酶(PDE5)抑制活性用從任何腫瘤細胞系如HT-29或SW-480分離的酶，或重組HS-PDE5，或測量完整細胞中環核苷酸水平，通過對磷酸二酯酶的抑制作用來篩選化合物。
2.A．酶檢測用本領域已知的方法，如用放射性3H環GMP(cGMP)(環3’,5’-鳥苷單磷酸)作為PDE5酶的底物來測定磷酸二酯酶活性。(Thompson,W.J.Teraski,W.L.,Epstein,P.M.,Strada,S.J.,Advances in Cyclic NucleotideResearch,10:69-92,1979，該文獻引入本文作為參考)。簡言之，在共400μl體積中，將確定底物3H-cGMP比活性的溶液(0.2μM；100,000cpm；含40mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2和1mg/ml BSA)與待測藥物混合。將混合物與從HT-29細胞分離出的部分純化的PDE5一起在30℃保溫10分鐘。例如通過將反應混合物煮沸75秒鐘來終止反應。在冰上冷卻后，加入100μl 0.5mg/ml蛇毒(可從Sigma得到的O.Hannah蛇毒)，然后在30℃保溫10分鐘。然后通過加入例如1ml 100％甲醇來終止反應。將檢測樣品施加到陰離子色譜柱(1ml Dowex，來自Aldrich)上，用1ml 100％甲醇洗滌。然后用閃爍計數器測量背景和柱洗滌物中的放射性量。通過計算藥物處理反應中的放射性量，然后與對照樣品(不含試驗化合物的反應混合物)進行比較來確定PDE5抑制的程度。
2.B．環核苷酸測量另外，通過在與待篩選化合物接觸的腫瘤細胞中cGMP的增加來反映化合物抑制PDE5的能力。用放射性免疫檢測(RIA)，通過檢測被處理細胞提取物中環GMP的量來確定PDE5的量。用該方法，將HT-29或SW-480細胞鋪板，并使之生長至匯合。然后將試驗化合物以約200μM-約200pM的濃度與細胞培養物一起保溫。約24-48小時后，將細胞與培養基分開，然后溶解細胞。用0.2N HCl/50％MeOH終止反應。取樣進行蛋白質檢測。用陰離子交換色譜，如Dowex柱，從細胞的酸/醇提取物中純化環GMP。按照公開的方法如用溶于三乙胺中的乙酸酐(Steiner,A.L.Parker,C.W.,Kipnis,D.M.,J.Biol.Chem.,247(4):1106-13,1971，該文獻引入本文作為參考)干燥并乙酰化cGMP。用放射性免疫檢測法(Harper,J.Brooker,G.,Advances in Nucleotide Research,10:1-33,1979，該文獻引入本文作為參考)確定乙酰化cGMP的量。在存在抗血清和適宜緩沖液的條件下，將衍生的環GMP的碘化配體(酪氨酸甲酯)與標準或未知物一起保溫。可用環核苷酸-半抗原指導的技術產生抗血清。抗血清來自用琥珀酰-cGMP-白蛋白結合物注射的羊，并以1/20,000稀釋。如前述(Seibert,A.F.,Thompson,W.J.,Taylor,A.,Wibourn,W.H.,Bamard,J.and Haynes,J.,J.Applied Physiol.,72:389-395,1992，該文獻引入本文作為參考)使用標準曲線進行劑量插入和誤差分析。
另外，可將培養基酸化、冷凍(-70℃)并分析cGMP和cAMP。
除觀察到由所需的試驗化合物引起的cGMP含量的增加外，還觀測到cAMP含量的降低。已觀察到特別理想的化合物(即可在腫瘤細胞內選擇性誘導細胞程序死亡，而在正常細胞內基本上無該作用的化合物)遵循與PDE5抑制相一致時間過程，該化合物最初的作用導致cGMP含量在數分鐘內增加。其次，用理想的抗腫瘤化合物處理腫瘤細胞可導致cAMP含量在24小時內減少。對藥物作用的細胞內靶正在進行進一步的研究，但目前的資料支持，cGMP含量最初的增加以及隨后cAMP含量的降低均發生于與理想化合物接觸的腫瘤細胞的細胞程序死亡之前。
兩種環核苷酸間比例的變化是評估試驗化合物PDE5抑制活性的更精確的方法，而不是僅僅測量cGMP的絕對值、僅僅測定PDE5抑制作用、或僅僅測定cGMP的絕對值。在未用抗腫瘤化合物處理的腫瘤細胞中，cGMP含量/cAMP含量的比值為0.03-0.05(即300-500 fmol/mg蛋白質cGMP含量/6000-8000fmol/mg蛋白質cAMP含量)。在與合乎需要的抗腫瘤化合物接觸后，由于環GMP最初的增加以及隨后環AMP的降低，而使比率增加數倍(優選增加至少約3倍)。
具體地說，特別理想的化合物使處理過的腫瘤細胞內，最初的cGMP增加到大于約500fmol/mg蛋白質的cGMP水平。另外，特別理想的化合物使處理過的腫瘤細胞內，隨后的cAMP含量降低到約4000fmol/mg蛋白質的水平。
為了測定環AMP的含量，使用與用于cGMP相似的放射性免疫檢測技術。簡單地說，用陰離子交換色譜從細胞的酸/醇提取物中純化環核苷酸、按照公開的方法干燥、乙酰化所述的環核苷酸，然后用放射性免疫檢測法定量分析。將衍生的環AMP和環GMP的碘化配體在存在特異抗血清和適宜緩沖液的條件下與標準物或未知物保溫。
通過測定完整細胞中環核苷酸的更新或積累可確定環核苷酸的含量。為了測量完整細胞中的cAMP，按照公開的方法(Whalin M.E.,R.L.Garrett Jr.,W.J.Thompson,and S.J.Strada,“Correlation of cell-free braincyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intactbrain slices”,Sec.Mess.and Phos.Protein Research,12:311-325,1989，該文獻引入本文作為參考)使用3H-腺苷預標記。該方法測量被標記的ATP到環AMP的流量，并根據具體的方法，可用其估算完整細胞腺苷酸環化酶或環核苷酸磷酸二酯酶的活性。按照公開的方法(Reynolds,P.E.,S.J.Strada and W.J.Thompson,“Cyclic GMP Accumulation in pulmonarymicrovascular endothelial cells measured by intact cell prelabeling,”LifeSci.,60:909-918,1997，該文獻引入本文作為參考)，采用完整細胞預標記，環GMP積累量太低而無法研究。
2.C．組織樣品檢測還可測定組織樣品中試驗化合物的PDE5抑制活性。從與試驗化合物接觸的主體中收集組織樣品，如哺乳動物(優選大鼠)肝。簡言之，在500μl 6％TCA中將組織樣品勻漿。取出已知量的勻漿物進行蛋白質分析。將剩余的勻漿物在冰上放置20分鐘以使蛋白質沉淀。接著在4℃，將勻漿物以15,000g離心30分鐘。回收上清液，除去沉淀。用5倍體積的水飽和的乙醚將上清液洗滌4次。在每次洗滌前棄去上層醚層。在speed真空器中干燥含水醚提取物。干燥后，將樣品冷凍以備進一步使用，或立即使用。將干燥的提取物溶解在500μl檢測緩沖液中。用酶免疫檢測(EIA)，如Biotrak EIA系統乙酰化方法(可從Amersham,ArlingtonHeights,IL,USA得到)，通過檢測環核苷酸的量來測定PDE5抑制的量。另外，也可采用上文詳述過的RIA方法。
2.D．分析結果通過比較在存在和不存在試驗化合物的條件下PDE5的活性來確定抑制量。PDE5活性的抑制表明所述化合物可用于治療腫瘤。在濃度為10μM或該濃度以下，抑制活性明顯大于基準exisulind的，優選大于50％的顯著抑制活性表明應進一步評估所述化合物是否有抗腫瘤特性。優選PDE5的IC50值應小于50μM，這樣就可以進一步考慮所述化合物的潛在用途。
3．確定化合物是否可減少腫瘤細胞的數量在另一實施方案中，本發明的篩選方法還包括確定所述化合物是否可降低腫瘤細胞的生長。根據所試驗的組織，可使用各種細胞系。例如這些細胞系包括SW-480-結腸腺癌；HT-29-結腸腺癌；A-427-肺腺癌；MCF-7-乳腺癌；和UACC-375-黑素瘤系；以及DU145-前列腺癌。用這些細胞系得到的細胞毒性數據表明了對腫瘤損傷的抑制作用。這些細胞系的特征是非常清楚的，而且美國國家癌癥研究所將這些細胞系用于新的抗癌藥物的篩選。
3A．在HT-29細胞系中的腫瘤抑制作用可用從ATCC(Bethesda,MD)得到的HT-29人結腸癌細胞系測量化合物抑制腫瘤細胞生長的能力。已將HT-29細胞表征為相關結腸腫瘤細胞培養物模型(Fogh,J.,and Trempe,G.In:Human Tumor Cells in Vitro,J.Fogh(eds.),Plenum Press,New York,pp.115-159,1975)。在95％空氣和5％CO2的濕潤空氣下,將HT-29細胞保持在補加有5％胎牛血清(GeminiBioproducts,Inc.,Carlsbad,CA)和2mM谷胺酰胺以及1％抗菌病-抗生素的RPMI培養基中。總之，將HT-29細胞以500細胞/孔的密度鋪在96孔微滴定板中，在加入化合物前于37℃保溫24小時。每次確定細胞數用6個重復。培養6天后，通過加入冷的三氯乙酸至10％的終濃度來固定細胞，然后按照Skehan,P.,Soreng,R.,Scudiero,D.,Monks,A.,McMahon,J.,Vistica,D.,Warren,J.T.,Bokesch,H.,Kenney,S.,and Boyd,M.R.,“New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screening,”J.Natl.Cancer Inst.82:1107-1112,1990(該文獻引入本文作為參考)所述，用sulforhodamine B(SRB)比色蛋白質斑檢測法測量蛋白質水平。
除SRB檢測法外，也可用其它許多方法測量生長抑制并可用其代替SRB檢測法。這些方法包括在錐蟲藍染色后計數活細胞、用BrdU或放射性標記的胸苷對能夠進行DNA合成的細胞進行標記、活細胞的中性紅染色、或活細胞的MTT染色。
3.B．分析結果在100μM或更低劑量下大于50％的顯著的腫瘤細胞生長抑制表明所述化合物可用于治療腫瘤損傷。優選確定IC50值并用于比較。該值等于所需藥物相對于對照對腫瘤細胞生長的抑制達到50％的濃度。優選IC50值應小與100μM，這樣就可進一步考慮該化合物可能可用于治療腫瘤損傷。
4．確定化合物是否誘導細胞程序死亡在第二種實施方案中，本發明的篩選方法還包括確定所述化合物是否可誘導腫瘤細胞培養物的細胞程序死亡。
可通過以形態學和生物化學標準來描述兩種不同的細胞死亡壞死和細胞程序死亡。壞死伴隨有胞質膜通透性的增加；細胞膨脹以及質膜在數分鐘內破裂。細胞程序死亡的特征是膜起泡、胞質濃縮以及內源核酸內切酶激活。
其中，細胞程序死亡是真核細胞死亡的最常見形式。它天然發生在組織更新和器官和四肢的胚胎發育過程中。通過細胞毒T淋巴細胞和中性殺傷細胞、離子化照射和特定的化療藥物也可誘導細胞程序死亡。人們認為不適當的細胞程序死亡調節在包括癌癥、AIDS、老年性癡呆等的許多病理學疾病中起了重要作用。可用在上述條件下保持的腫瘤細胞培養物篩選誘導細胞程序死亡的化合物。用試驗化合物進行的細胞處理包括匯合前或匯合后的培養，并以不同濃度處理2至7天。在培養物的粘附和“飄浮”區中，均測量細胞程序死亡的細胞。通過除去上清液、胰蛋白酶消化粘附的細胞并在離心洗滌步驟(10分鐘，2000rpm)后合并這兩種制備物來集合上述的兩種區。在文獻中已描述了用舒林酸和相關化合物處理腫瘤細胞培養物以達到顯著量細胞程序死亡的方法。(參見Piazza,GA.,et al.,Cancer Research,55:3110-16,1995，該文獻引入本文作為參考)。新的特征包括收集飄浮的和粘附的細胞，確定最佳處理時間和觀察到細胞程序死亡的劑量范圍，確定最佳細胞培養條件。
4.A．細胞程序死亡的形態學觀察用試驗化合物處理后，在用吖啶橙和溴化乙錠標記后，通過熒光顯微鏡檢測培養物的細胞程序死亡和壞死情況。已由Duke&Cohen(“Morphological And Biochemical Assays Of Apoptosis,”CurrentProtocols In Immunology,Coligan et al.,eds.,3.17.1-3.17-16,1992，該文獻引入本文作為參考)描述了測量細胞程序死亡細胞數的方法。
例如可通過胰蛋白酶消化和用PBS洗滌3次來收集飄浮的和粘附的細胞。可將細胞樣品等份離心。將沉淀重懸在培養基和含用PBS制備的吖啶橙和溴化乙錠的染料混合物中，然后緩慢混合。然后可將所述混合物置于顯徽鏡載玻片上并觀察之。
4.B．通過DNA片段化分析細胞程序死亡通過測量已用試驗化合物處理的細胞中，DNA片段化的增加來定量測量細胞程序死亡。測光的EIA(Cell Death Detection ELISAokys,Cat.No,1,774,425,Boehringer Mannheim)是可購買到的，其用于體外定量確定胞質組蛋白相關-DNA-片段(單和寡聚核小體)。Boehringer Mannheim檢測法是基于分別使用小鼠抗DNA和組蛋白單克隆抗體的夾心酶免疫檢測原理。這樣可以特異性地確定細胞溶解產物中胞質部分的單和寡聚核小體。
按照制造商的說明，用下列方法測量細胞程序死亡。將樣品(細胞溶解產物)放在鏈霉親和素包被的微滴定板(MTP)中。隨后，加入抗-組蛋白-生物素和抗DNA過氧化物酶結合物的化合物，保溫2小時。在保溫過程中，抗組蛋白抗體與核小體的組蛋白組分結合，同時經其生物素化，將免疫復合物固定在鏈霉親和素包被的MTP上。另外，抗-DNA過氧化物酶抗體與核小體的DNA組分發生反應。通過洗滌步驟除去未結合的抗體后，通過在免疫復合物中保留的過氧化物酶來確定核小體的量。用ABTS7(2,2’-疊氮基-[3-乙基苯并噻唑烷-磺酸酯])作為底物進行光測定以確定過氧化物酶。
例如，將SW-480結腸腺癌以10,000細胞/孔的密度鋪在96孔MTP上。然后用試驗化合物處理細胞，然后在37℃保溫48小時。保溫后，離心MTP，除去上清液。然后將各孔中的細胞沉淀重懸在溶解緩沖液中30分鐘。然后將溶解產物離心，然后將上清液等份(即胞質部分)轉移到鏈霉親和素包被的MTP中。小心不要振蕩在MTP中溶解的沉淀(即含高分子量的、未片段化的DNA的細胞核)。然后分析樣品。
在給定的濃度確定各試驗化合物的刺激倍數(FS=ODmax/ODveh)，作為細胞程序死亡反應的標志。也可通過評估試驗化合物的一系列濃度來確定EC50值。
4.C．分析結果細胞程序死亡的統計學顯著增加(即在100μM的濃度下大于2倍的刺激)是化合物可用于治療腫瘤損傷的另一標志。對于需進一步評估的有可能用于治療腫瘤損傷的化合物而言，優選其細胞程序死亡活性的EC50應小于100μM。本文將EC50定義為相對于載體處理，對細胞程序死亡的誘導達到50％的濃度。
5 證實-乳腺器官培養模型試驗可通過在乳腺器官培養系統中檢測用上述方法篩選出的試驗化合物抑制前腫瘤損傷發病率的能力，來測試所述化合物的抗腫瘤活性。其他研究人員已將該小鼠乳腺器官培養技術成功地用于研究已知的抗腫瘤劑如NSAID、維生物A類物質、他莫昔芬、硒和某些天然產物的效果，并且該技術可用于證實本發明的篩選方法。
例如，為體外誘導腺體對激素作出反應，可每日聯用雌二醇和黃體酮來治療雌性BALB/c小鼠。殺死動物，麻醉切下胸乳腺，然后使之在補加有胰島素、促乳素、氫化可的松和醛甾酮的生長培養基中培養10天。施用DMBA(7,12-二甲基苯并蒽)以誘導前期惡性損傷的形成。然后使完全發育的腺體得不到促乳素、氫化可的松和醛甾酮，導致腺體退化而不是前期惡性損傷。
將試驗化合物溶解在DMSO中，然后加入用于培養期間的培養基中。在培養期結束時，用10％福爾馬林固定腺體，用礬胭脂紅染色，然后固定在載玻片上。形成乳腺損傷的發病率是帶有乳腺損傷的腺體和不帶損傷腺體間的比值。將用試驗化合物處理的腺體的乳腺損傷的發病率于未處理腺體的進行比較。
通過將腺體的圖象發射到數字盤上來定量測定乳腺損傷所占據的面積范圍。將由腺體覆蓋的面積畫到盤上，作為100％面積。將由各未退化結構覆蓋的空間也畫在數字盤上，然后由計算機進行定量分析。
實驗部分以各種方法對大量試驗化合物進行了測試，以篩選其在腫瘤治療中的潛在用途。這些試驗的結果如下。下文將試驗化合物用字母代碼表示，所述字母所對應的化合物如下A-外消旋-蘇-(E)-1-(N,N’-二乙基氨基乙硫基)-1-(丁-1’,4’-交酯基(olido))-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺酰基亞芐基)-2,3-二氫化茚；B-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧基亞芐基)-3-乙酸；C-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(對氯亞芐基)-3-乙酸；D-外消旋-(E)-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺酰基亞芐基)-1S-2,3-二氫化茚基-N-乙酰半胱氨酸；E-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧基亞芐基)-3-茚基-N-芐基乙酰胺；F-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(對甲基磺酰基亞芐基)-3-茚基-N,N’-二環己基乙酰胺；G-ribo-(E)-1-三唑并-[2’,3’:1＂,3＂]-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺酰基亞芐基)-2,3-二氫化茚；和H-外消旋-(E)-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺酰基亞芐基)-1S-2,3-二氫化茚基-谷胱甘肽。實施例1-COX抑制作用分析按照上文1.B．部分關于COX分析的方法分析參考化合物和試驗化合物的COX抑制活性。圖1表明各種濃度的舒林酸硫化物或exisulind對純化的環加氧酶(1型)活性的影響。如前所述用從公羊精囊中純化的環加氧酶測定環加氧酶活性(Mitchell等，見上文)。計算得出舒林酸硫化物的IC-50值為約1.76μM，而exisulind的IC-50值大于10000μM。這些數據表明，舒林酸硫化物是COX抑制劑而exisulind則不是。使用COX-2同工酶得到了相似的數據。(Thompson等，Journal of the NationalCancer Institute,87；1259-1260,1995)。
圖2說明試驗化合物B和E對COX的抑制作用。按照圖1所用方法，測試化合物的COX活性。數據表明，試驗化合物B和E均不能顯著抑制COX-Ⅰ。
表1一系列化合物的環加氧酶抑制活性參考化合物100μM下的抑制％吲哚美辛 95MY5445 94舒林酸硫化物 97Exisulind ＜25試驗化合物 100μM下的抑制％A＜25B＜25C 87D＜25E＜25按照上文1.B．部分的方法，評估化合物A-E的COX抑制活性，結果如上表1所示。發現化合物C在100μM下對COX的抑制大于25％，因此，不對其進行進一步的篩選。實施例2-PDE5抑制作用分析按照上文2.A．部分的檢測方法分析參考化合物和試驗化合物的PDE5抑制活性。圖3表明各種濃度的舒林酸硫化物或exisulind對PDE-4或PDE5活性的影響，如前所述，所述PDE-4或PDE5從人結腸HT-29培養的腫瘤細胞純化而得(W.J.Thompson等，見上文)。舒林酸硫化物抑制PDE4的IC50值為41μM，抑制PDE5的IC50值為17μM。exisulind抑制PDE4的IC50值為181μM，抑制PDE5的IC50值為56μM。這些數據表明，舒林酸硫化物是和exisulind均抑制磷酸二酯酶活性。兩種化合物均對PDE5同工酶具有選擇性。
圖4表明按照上文2.B．的檢測方法，用培養的HT-29細胞測定的舒林酸硫化物對cGMP或cAMP生產的影響。將HT-29細胞用舒林酸硫化物處30分鐘，然后通過常規的放射免疫分析方法測定cGMP或cAMP。結果表明，舒林酸硫化物使cGMP的水平增加50％以上，其EC50值為7.3μM(上方)。cAMP的水平不受處理的影響，而已知的PDE4抑制劑咯利普蘭可以增加cAMP(下方)。這些數據證明了相對于PDE4而言抑制PDE5的藥理學顯著性。
圖5說明所示劑量的試驗化合物B對磷酸二酯酶的PDE5或PDE4同工酶的影響。計算出的IC50值對于PDE5而言為18μM，對于PDE4而言為58μM。
圖6說明所示劑量的試驗化合物E對磷酸二酯酶的PDE4或PDE5的影響。計算出的IC50值對于PDE5而言為0.08μM，對于PDE4而言大于25μM。
表2一系列化合物的PDE5抑制活性參考化合物 10μM下的抑制％吲哚美辛 34MY544586舒林酸硫化物 97Exisulind 39試驗化合物10μM下的抑制％A ＜25B ＜25C ＜25D36E75按照上文2.A．部分的方法，評估上述表2中化合物的PDE抑制活性。在不抑制COX的化合物中，發現僅化合物E在10μM的濃度下引起50％以上的抑制。如圖11所示，化合物B在20μM的劑量下表現出50％以上的抑制作用。因此，根據單一劑量試驗中所用的劑量水平，可能會篩除某些在稍高劑量下具有活性的化合物。所用的劑量是主觀的，當在某劑量水平下發現活性化合物后，可降低劑量以鑒定更有效的化合物。實施例3-細胞程序死亡分析按照上文4.A．和4.B．部分的檢測方法，分析參考化合物和試驗化合物的PDE5抑制活性。根據4.A．的檢測方法，圖7表明舒林酸硫化物和exisulind對細胞程序死亡和壞死性細胞死亡的影響。將HT-29細胞用所示劑量的舒林酸硫化物或exisulind處理6天。先前曾測定過細胞程序死亡和壞死性細胞死亡(Duke and Cohen,Current Protocols in Immunology,3.17.1-3.17.16,New York,John Wiley and Sons,1992)。數據表明，舒林酸硫化物和exisulind均可以誘導細胞程序死亡而不引起壞死。所有數據均來自同一試驗。
根據4.B．的檢測方法，圖8表明舒林酸硫化物和砜對腫瘤生長抑制和細胞程序死亡誘導的影響(后者通過DNA片段化進行測定)。上圖exisulind的生長抑制(空心符號，右軸)和DNA片段化(實心符號，左軸)。下圖舒林酸硫化物的生長抑制(空心符號)和DNA片段化(實心符號)。生長抑制通過處理6天后的SRB檢測進行確定。DNA片段化在處理48小時后測定。所有數據均來自同一試驗。
圖9表明化合物E誘導細胞程序死亡的特性。將HT-29結腸腺癌細胞用所示濃度的化合物E處理48小時，然后通過DNA片段化分析測定細胞程序死亡。計算出的EC50值為0.05μM。
圖10表明化合物B誘導細胞程序死亡的特性。將HT-29結腸腺癌細胞用所示濃度的化合物B處理48小時，然后通過DNA片段化分析測定細胞程序死亡。計算出的EC50值為175μM。
表3一系列化合物誘導細胞程序死亡的活性參考化合物 100μM下的誘導倍數吲哚美辛＜2.0MY5445 4.7舒林酸硫化物7.9Exisulind＜2.0試驗化合物 100μM下的誘導倍數A＜2.0B 3.4C 5.6D＜2.0E 4.6按照上文4.B．部分的方法，評估化合物A-E誘導細胞程序死亡的活性，結果如上表3所列。化合物B、C和E在100μM的劑量下表現出顯著的誘導細胞程序死亡的活性，大于2.0倍。在這三種化合物中，在該劑量下僅有B和E不抑制COX而抑制PDE5。
測定了一系列磷酸二酯酶抑制劑誘導細胞程序死亡的活性。數據如下表4所示。將HT-29細胞用各種磷酸二酯酶抑制劑處理6天。按照上文4.A.部分的檢測方法用吖啶橙和溴乙啶標記后，按形態學標準測定細胞程序死亡和壞死。數據表明，PDE5對于篩選可誘導HT-29細胞發生細胞程序死亡的化合物是有用的。
表4PDE抑制劑誘導細胞程序死亡的數據抑制劑報道過的選擇性 細胞程序死亡％ 壞死％載體 8 68-甲氧基-IBMX PDE1 2 1米力農PDE3 18 0RO-20-1724PDE4 11 2MY5445PDE5 80 5IBMX 無選擇性 413實施例4-生長抑制分析按照上文3.A．的檢測方法分析參考化合物和試驗化合物的PDE5抑制活性。圖11表明各種濃度的舒林酸硫化物和exisulind對HT-29細胞的生長抑制作用。如圖所示，將HT-29細胞用各種劑量的exisulind(三角)或硫化物(方塊)處理6天。通過上述的sulforhodamine檢測方法(Piazza等，癌癥研究，55:3110-3116,1995)測定細胞數量。硫化物的IC50值為約45μM，砜的IC50值為200μM。這些數據表明，舒林酸硫化物和exisulind均能夠抑制腫瘤細胞的生長。
圖12說明舒林酸硫化物的生長抑制和誘導細胞程序死亡的活性。所示的時間進程試驗包括將HT-29細胞用載體、0.1％DMSO(空心符號)或用舒林酸硫化物、120μM(實心符號)處理。通過錐蟲藍染色后計數活細胞來測定生長抑制(上圖)。通過用吖啶橙和溴乙啶按照上述方法(Dukeand Cohen,Current Protocols in Immunlogoy,3.17.1-3.17.16,New York,John Wiley and Sons,1992)染色后進行形態學鑒定來測定細胞程序死亡(下圖)。數據表明，舒林酸硫化物可以抑制腫瘤細胞生長，并且該作用伴有細胞程序死亡的增加。所有數據均來自同一試驗。
圖13表明試驗化合物E的生長抑制活性。將HT-29結腸腺癌細胞用所示濃度的化合物E處理6天，然后通過SRB檢測來確定細胞數量。計算出的IC50值為0.04μM。
表5一系列化合物的生長抑制活性參考化合物 100μM下的抑制％吲哚美辛 75MY544588舒林酸硫化物 88Exisulind ＜50試驗化合物 100μM下的抑制％A 68B 77C 80D 78E 62按照上文3.A部分的篩選方法，檢測化合物A-E的生長抑制活性，結果如上表5所示。所有試驗化合物均在100μM的單一劑量試驗中表現出超過基準exisulind的活性。
測定了一系列磷酸二酯酶抑制劑的生長抑制活性。數據如下表6所示。將HT-29細胞用各種磷酸二酯酶抑制劑處理6天。按照上文3.A．部分通過SRB檢測方法測定細胞生長。數據表明，PDE5的抑制劑可有效地抑制腫瘤細胞生長。
表6PDE抑制劑的生長抑制數據抑制劑 報道過的選擇性 生長抑制作用(IC50,μM)8-甲氧基-IBMX PDE1 ＞200μM米力農PDE3 ＞200μMRO-20-1724 PDE4 ＞200μMMY5445 PDE5 5μMIBMX無選擇性 ＞100μM為了說明該篩選方法對各種形式腫瘤的效果，用大量細胞系對化合物進行試驗。確定舒林酸硫化物和exisulind對各種細胞系的作用。在下列表7中列出了數據。用SRB檢測法確定IC50值。數據表明這些化合物對許多腫瘤有廣泛的作用，它們在可比的劑量范圍內有效。因此，由本發明鑒定的化合物應該可以應用于治療多種形式的腫瘤。
表7各種細胞系的生長抑制數據
實施例5-在乳腺器官培養模型中的活性圖14說明舒林酸代謝物在乳腺器官培養中，對前期惡性損傷的抑制作用。按照前述(Mehta and Moon,Cancer Research,46:5832-5835,1996)完成乳腺器官培養試驗。結果表明舒林酸和exisulind可有效地抑制前期惡性損傷的形成，而舒林酸硫化物卻無效。所述數據支持下列假設，即對環加氧酶的抑制作用對于所需化合物的抗腫瘤特性不是必需的。
分析為了確定可用于治療腫瘤的化合物，本發明提供了用于比較幾種方法的試驗化合物的試驗數據的基本原理。在本發明范圍內，可按照其用于治療人腫瘤的潛在用途將試驗化合物進行分類。篩選出具有所需效果的那些化合物，以進行更費時費力的動物研究，這是在得到許可開始人臨床試驗前必須進行的。
下列表8中列出了各種試驗化合物和數種方法的定性數據。這些數據表明，exisulind、化合物B和化合物E具有適宜的活性，通過了下列4種檢測COX抑制作用缺乏、PDE抑制作用、生長抑制作用和細胞程序死亡誘導作用。這些化合物在乳腺器官培養物中的活性證實了本發明的效果。篩選方法的定性評估結果為，將化合物E列為最好、然后依次是化合物B和exisulind。
表8 各種化合物的活性圖譜
表8的符號化合物的活性是基于涉及最大活性和效力的一系列試驗的評估。
-無活性+弱活性++中等活性+++強活性++++前所未有的最大活性顯然，參照上述教導，對本發明做出許多修改和改變是可能的。因此，應理解為在所附權利要求的范圍內，用本文具體描述以外的方法也可實施本發明。
權利要求
1．具有治療腫瘤可能性的化合物的鑒定方法，包括測定化合物對環加氧酶(COX)的抑制活性；和測定化合物對PDE5的抑制活性；其中，低的COX抑制活性和高的PDE5抑制活性表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
2．權利要求1的方法，還包括測定化合物是否抑制培養液中的腫瘤細胞的生長；其中對腫瘤細胞生長的抑制進一步表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
3．權利要求1的方法，其中，化合物對COX的抑制活性通過如下方法測定將化合物與純化的環加氧酶接觸；然后測定環加氧酶的活性的變化，如果有變化的話；其中，在約100μM的濃度下對COX的抑制活性低于25％，表明應對所述化合物治療腫瘤的可能性進行進一步的評估。
4．權利要求1的方法，其中，化合物對COX的抑制活性通過如下方法測定將化合物與分泌PGE-2的細胞接觸；然后測定細胞分泌出的PGE-2的減少，如果PGE-2的分泌量有減少的話；其中，PGE-2分泌的減少與前列腺素合成酶活性的降低有關。
5．權利要求1的方法，還包括測定化合物是否誘導腫瘤細胞的細胞程序死亡；其中，對細胞程序死亡的誘導進一步表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
6．權利要求5的方法，還包括測定化合物是否抑制樣品中的腫瘤細胞的生長；其中，對腫瘤細胞生長的抑制進一步表明所述化合物可用于治療腫瘤。
7．權利要求5的方法，其中，PDE的活性通過如下方法測定將化合物與細胞培養液接觸；然后測定細胞內的環GMP濃度；其中，在10μM的濃度下對PDE的抑制活性高于50％，表明應對所述化合物治療腫瘤的可能性進行進一步的評估。
8．權利要求5的方法，其中，PDE的活性通過如下方法測定測定細胞內環GMP/環APM濃度的比；其中，在10μM的濃度下上述比例增加3倍，表明應對所述化合物治療腫瘤的可能性進行進一步的評估。
9．權利要求5的方法，其中，細胞程序死亡通過如下方法測定將化合物與細胞培養液接觸；然后測定化合物是否使胞質中片段化的DNA含量增高；其中，在100μM的濃度下細胞程序死亡增加2倍以上，表明應對所述化合物治療腫瘤的可能性進行進一步的評估。
10．可能用于治療腫瘤的化合物的篩選方法，包括測定化合物的生長抑制活性；測定化合物的PDE5抑制活性；然后篩選出具有生長抑制活性和PDE5抑制活性的化合物。
11．權利要求10的方法，還包括鑒定其生長抑制活性的IC50值低于約100μM的可用于治療腫瘤的化合物。
12．權利要求10的方法，還包括測定化合物是否誘導細胞的細胞程序死亡；然后篩選出誘導細胞程序死亡的化合物。
13．權利要求12的方法，還包括篩選出其細胞程序死亡活性的EC50值低于約100μM的化合物。
14．權利要求10的方法，還包括測定化合物的COX抑制活性；篩選出相對于PDE5抑制活性，COX抑制活性低的化合物。
15．權利要求14的方法，其中，化合物的COX抑制活性通過如下方法測定將化合物與環加氧酶接觸；然后測定環加氧酶的活性的變化，如果有變化的話；其中，環加氧酶活性的降低與前列腺素合成酶活性的降低有關。
16．權利要求14的方法，其中，化合物的COX抑制活性通過如下方法測定將化合物與分泌PGE-2的細胞接觸；然后測定細胞分泌出的PGE-2的減少，如果PEG-2的分泌量有減少的話；其中，PGE-2分泌的減少與前列腺素合成酶活性的降低有關。
17．鑒定化合物的方法，所述化合物可用于向需要對腫瘤進行預防性和慢性治療的患者給藥，該方法包括如下步驟測定化合物對環加氧酶(COX)的抑制活性；測定化合物對PDE5的抑制活性；如果化合物表現出PDE5抑制活性，鑒定可用于患者以治療腫瘤的這些化合物。
18．權利要求17的方法，其中對化合物抑制PDE5同工酶的選擇性進行測定。
19．權利要求17的方法，還包括測定化合物的生長抑制活性；然后，鑒定在表現出基本生長抑制活性的濃度下，磷酸二酯酶的抑制活性基本上大于COX抑制活性的那些化合物。
20．權利要求19的方法，其中，生長抑制活性通過樣品中細胞數量的減少進行測定。
21．權利要求17的方法，其中，生長抑制活性通過樣品中細胞程序死亡的誘導水平進行測定。
22．權利要求17的方法，其中，如果誘導細胞程序死亡的水平基本上大于誘導壞死的水平，則進一步鑒定可用于患者以治療腫瘤的化合物。
23．具有治療腫瘤可能性的化合物的篩選方法，包括測定化合物的PDE5抑制活性并篩選出其抑制活性大于預定值的化合物。
24．權利要求23的方法，還包括測定所篩選出的化合物是否誘導細胞的細胞程序死亡，并進一步篩選出其細胞程序死亡的誘導活性大于預定值的化合物。
25．權利要求24的方法，還包括測定所篩選出的化合物是否抑制前列腺素合成，并進一步篩選出其抑制活性低于預定值的化合物。
26．權利要求24的方法，其中，PDE5活性的測定是通過測定細胞內的環GMP和環AMP，并測定環GMP與環AMP的比是否增加而進行的。
27．具有治療腫瘤可能性的化合物的鑒定方法，包括測定化合物對COX-Ⅰ的抑制活性；測定化合物對PDE5的抑制活性；其中，低的COX-Ⅰ抑制活性和高的PDE5抑制活性表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
28．具有治療腫瘤可能性的化合物的鑒定方法，包括將腫瘤細胞用濃度為約200μM-200pM的待評估化合物進行處理；測定被處理細胞的細胞內cGMP含量；測定被處理細胞的細胞內cAMP含量；其中，被處理細胞的cGMP/cAMP的比值比未經處理的腫瘤細胞的cGMP/cAMP增加約3倍或3倍以上，表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
29．權利要求28的方法，其中被處理細胞的細胞內cGMP含量大于500fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
30．權利要求28的方法，其中被處理細胞的細胞內cAMP含量低于4000fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
31．權利要求30的方法，其中被處理細胞的細胞內cAMP含量低于4000fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治療腫瘤的可能性。
32．潛在地可用于治療腫瘤的化合物的篩選方法，包括將化合物的生長抑制活性與化合物的PDE5抑制活性進行比較；然后篩選出具有生長抑制活性和PDE5抑制活性的化合物。
全文摘要
本發明提供鑒定可用于治療哺乳動物腫瘤的化合物的方法。測定化合物的磷酸二酯酶抑制活性和COX抑制活性。還測定對培養的腫瘤細胞的生長抑制作用和誘導細胞程序死亡的作用。具有磷酸二酯酶抑制活性、生長抑制活性和細胞程序死亡誘導活性但基本沒有前列腺素抑制活性的化合物是治療腫瘤的理想化合物。
文檔編號G01N33/50GK1224761SQ9810204
公開日1999年8月4日 申請日期1998年6月1日 優先權日1997年5月30日
發明者里佛特·帕穆克庫, 加里·A·皮亞扎, W·約瑟夫·湯普森 申請人:細胞途徑公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
