專利名稱：鑒定調節鈉/鈣交換轉運蛋白活性的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及通過無細胞電生理傳感器芯片測定Na+/Ca2+交換(NCX)蛋白活性或活性的調節的無細胞測定法、包含傳感器芯片與NCX蛋白質的試劑盒以及試劑盒的生產方法和用途。
發明概述生命的一種基本要求是區室化——生物膜是實現該原則的天然工具。然而，細胞膜下的結構——脂雙層對大部分離子和化合物都是不可通透的，所述離子和化合物的轉運對于維持細胞和生物的重要功能是必要的。該矛盾的答案在于細胞膜的半透特性——必須穿過膜的溶質由特定膜蛋白轉運。這些轉運蛋白負責建立并維持離子梯度、吸收營養、轉運代謝物、重吸收信號分子和處理有毒和廢棄的化合物。因此，轉運蛋白是潛在的藥物靶標，其允許直接影響本文中的疾病相關的異常。
大部分膜轉運蛋白在進行其轉運循環時改變電荷。該改變可始于帶電底物的移動或始于帶(部分)電荷的蛋白質部分的移動。
監測轉運蛋白相關電流在一些情況下，轉運蛋白相關電流可在生理環境中通過膜片鉗實驗或在人造“黑質膜”中直接監測。在后一種情況下，在兩種緩沖液儲存器(各含有Ag/AgCl電極)間的小孔中產生脂雙層。將蛋白質參入雙層后，生物活性(例如酶活性)可通過例如光活化ATP衍生物觸發。然而，由于其缺乏穩定性，用該系統不能進行快速緩沖液交換實驗，將該體系限制于可光活化的底物。穩定性的缺乏可通過在傳感器表面固定含蛋白質顆粒來克服。該事實為IonGate Biosciences GmbH，Frankfurt/Main的稱為SurfE2R(表面生電事件讀數器)的無細胞電生理學技術的原理，該技術檢測產生的轉運蛋白相關電流。
類似的，還根據本發明，由帶有轉換器的基質和有孔蓋板組成傳感器芯片，形成類似滴定板孔的孔。玻璃或聚合物板作為合適的基質。就玻璃平板而言，轉換器由薄的石印結構的表面被化學修飾的(例如通過硫醇)金膜組成，然而對于修飾的聚合物基質，也可使用厚膜金電極。由于合適基質的范圍，可生產單傳感器芯片以及傳感器條或甚至具有96或384個傳感器的傳感器陣列板。特別是基于聚合物的傳感器具有低成本大規模生產的潛力。具體的實例公開于WO02/074983和DE10244129。
對所有傳感器類型適用的是進行表面修飾后將金表面轉化為電容器并用水溶液充滿孔。該電容器的性質可借助于載流的參考電極如Pt/Pt或Ag/AgCl或氧化銦錫(ITO)或引入與溶液接觸的其他電極確定。另外，傳感器表面非常親水，即對膜碎片和囊泡是粘性的。生電蛋白質保持在它們的天然或天然樣環境，即容易吸附在親水傳感器表面的生物膜片、囊泡或脂蛋白體中，形成區室，其帶有溶液的內部空間與金表面以及孔中周圍溶液電隔離。如果插入小池，芯片的孔(圖2A)限定了流動小室的內部體積，使得傳感器表面上的快速溶液交換成為可能。
從不含研究的蛋白質底物的溶液轉換到含有的研究蛋白質的底物導致上述電容器的可測量的、瞬時充電電流，其通常在100pA到4nA范圍內。
在使用的工作站中，所有進行溶液交換實驗必需的部件適應以PC或以其他方式控制的工作站。在常規系統中，非激活(即不含底物的)的溶液以及激活的溶液儲藏在玻璃瓶中。應用于瓶上的氣壓驅動溶液穿過電機控制的閥門系統并穿過流動小室。另外，可使用自動采樣器以自動化方式處理若干溶液。
Na+/Ca2+交換蛋白(NCX)術語“NCX蛋白質”或“NCX”在本發明上下文中應指下列Na+/Ca2+交換蛋白質列表中任一種單獨或彼此組合NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。特別優選的是NCX1、NCX2和/或NCX3。這類NCX蛋白質可來自任何脊椎動物，特別是哺乳動物物種(例如狗、馬、牛、小鼠、大鼠、犬、兔、雞、類人猿、人或其他動物)。NCX可分離自這類脊椎動物生物的組織探針或可通過能夠表達NCX蛋白質的重組生物材料生產。
術語“生物材料”是指含有遺傳信息并能夠自我復制或在生物系統中復制的任何材料。重組生物材料是通過本領域技術人員公知的重組技術產生、改變或修飾的任何生物材料。
下列參考文獻為克隆具體NCX蛋白質的實例犬Na+/Ca2+交換蛋白NCX1由Nicoll，DA.等克隆(Science.250(4980)562-5，1990；標題Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmalNa(+)-Ca2+exchanger.)。人Na+/Ca2+交換蛋白NCX1由Komuro，I.等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(10)，4769-4773，1992；標題Molecular cloningand characterization of the human cardiac Na+/Ca2+exchanger cDNA)和Kofuji，P.等(Am.J.Physiol.263(Cell Physiol.32)C1241-C1249，1992；標題Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissuesa study using thecloned human cardiac Na-Ca exchanger)克隆。人Na+/Ca2+交換蛋白NCX2由Li，Z.等克隆(J.Biol.Chem.269(26)17434-9，1994；標題Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+exchanger)。大鼠Na+/Ca2+交換蛋白NCX3由Nicoll，DA.等克隆(J.Biol.Chem.271(40)24914-21.1996；標題Cloning of a third mammalianNa+-Ca2+exchanger，NCX3)。人Na+/Ca2+交換蛋白NCX3由Gabellini，N.等克隆(Gene.2981-7，2002；標題The human SLC8A3 gene and thetissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3 isoforms)。
鈉/鈣交換蛋白為從不同細胞去除Ca2+的重要機制。在心臟中，它排出通過Ca2+通道進入的Ca2+以起始收縮。其與心血管疾病的關聯在例如Hobai，JA & O’Rourke，B(2004)Expert Opin.Investig.Drugs，13，653-664中說明。因此，制藥工業已發展了抑制NCX的化合物，如Iwamoto，T.等(2004)J.Biol.Chem.，279，7544-7553中所述。如Hinata，M.等(2002)J.Physiol.545，453-461中通過電生理學方法所示，Na+/Ca2+交換蛋白對每個反方向移動的Ca2+生電轉運三到四個Na+。NCX能夠將細胞質Ca2+濃度([Ca2+]內)維持在比細胞外Ca2+濃度([Ca2+]外)低三到四個數量級。然而，凈Ca2+轉運的方向依賴于Na+的電化學梯度。對Na+和Ca2+轉運已提出了同時和連續轉運模型，大量證據傾向于后者。
本領域技術水平公知NCX蛋白質的活性可通過活細胞測定。對該目的而言，蛋白質必須在細胞中表達且細胞必須增殖。這類系統已由AxxamS.r.l.(Mailand，Italy)在“Pharmaconference 2003”in Pontresina on PosterNr.P25中公開(標題Application of FLIPR platform to study K+dependent Na+/Ca2+exchangers)。這些依賴于K+的Na+/Ca2+交換蛋白與NCX蛋白質是不同的，因為它們已從眼組織中分離，顯示不同的轉運機制并且未發現在心組織中表達。已知其他測量方法用于在細胞中或細胞測定中電化學測定Na+/Ca2+同向轉運體系。這類體系的缺點在于蛋白活性必須在復雜的生物學背景下測定，所述背景含有可能干擾將使用的測定法的所有類型大分子的混合物。Na+和Ca2+流出和流入電流由若干和不同的蛋白質驅動。從而關于單一蛋白質的測量被大背景破壞。沒有該缺點的方法為在蛋白質-脂質體中電化學測定Na+/Ca2+同向轉運系統的方法(Eisenrauch，A.等；J.Membrane Biology(1995)145151-164；標題Electrical Currents generated by a partially purified Na/Ca exchangerfrom lobster muscle reconstituted into liposomes and adsorbed on blacklipid membranesactivation by photolysis of Ca2+)。該方法的明顯缺點將是不會發生溶液快速交換。
本發明的體系通過將蛋白質固定在細胞背景外的裝置，允許快速溶液交換來避免關于NCX蛋白質的這類缺點。然后通過測量電流確定蛋白質活性。另外，快速溶液交換是可能的。
因此，本發明的一個主題涉及用于測定NCX蛋白質活性的測定法，其中包含NCX蛋白質的傳感器芯片通過洗滌、非激活和激活連續地逐步處理，然后當從非激活變為激活處理時測量電流。
術語“傳感器芯片”是指無細胞電生理傳感器芯片，如WO02/074983中所述，特別是所述PCT申請的權利要求書和/或圖1和/或圖2(包括圖中的說明)所述，如未在本發明中另作說明，本文將其引用作為參考。
具體的，該測定法包括允許有效制備含NCX蛋白質的膜的方案、用于有效制備含NCX蛋白質的傳感器芯片的方案及允許測量NCX活性的溶液交換方案。
通常，使用的NCX蛋白質為如上所述的哺乳動物來源的，特別是人來源的。NCX蛋白質選自NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特別是NCX1、NCX2和/或NCX3。在優選的實施方案中，NCX蛋白質為人NCX1蛋白。這類NCX蛋白質可通過本領域技術人員公知的重組方法制備(下文中稱為“重組NCX蛋白質”)或從天然組織探針中收集(下文中稱為“天然NCX蛋白質”)。
在優選的實施方案中，傳感器芯片含有帶金結構的borofloate玻璃基質(basic body)。傳感器芯片還可優選地被硫醇層覆蓋并具有一層或若干層絕緣層。這樣的傳感器芯片(例如具有圓形金結構(直徑1-3mm)和接觸區的Borofloate玻璃芯片)可從IonGate Biosciences GmbH，Industriepark Hchst，D 528，D-65926 Frankfurt am Main，Germany購得。
特別優選的方案如下例如10-30μl含NCX膜碎片點樣并循環(circulate)在傳感器芯片上并優選在4℃溫育至少12小時。在優選的實驗案例中，NCX蛋白質為人NCX1蛋白。裝有蛋白質的傳感器芯片的電容優選為100nF cm-2左右且電導率G1s優選在10nS cm-2左右。該測定法的原理為不存在抑制劑時和隨后存在抑制劑時檢測NCX蛋白質的電活性。為此，用一系列激活NCX的溶液沖洗NCX傳感器芯片。通常存在檢測抑制劑是否可逆的可能性。在這種情況下，使用抑制劑后，將溶液改變回無抑制劑的條件。在實驗前，將芯片的溶液儲存器用下列優選的溶液充滿洗滌緩沖液40mM KCl、100mM NaCl、4mM MgCl2、30mM HEPES/NMG pH 7.4；非激活溶液140mM KCl、4mM MgCl2、30mM HEPES/NMG pH 7.4；激活溶液140mM KCl、4mM MgCl2、30mM HEPES/NMG pH 7.4、0.5mM CaCl2。為了在有抑制劑時測量，所有三種溶液含有相同濃度的抑制劑。從非激活到激活溶液的改變導致引起負電流的NCX激活，其衰減至基線。如果三個測量周期中NCX信號的平均振幅不變，將溶液換為含抑制劑溶液并重復相同的方案。然后可將溶液換回無抑制劑條件，以檢測抑制劑是否可逆。
術語“電流”在本發明上下文中是指響應用激活溶液代替非激活溶液的峰電流，包括但不僅限于最大峰電流。電流振幅在10到100ms內上升，然后在2秒內較慢衰減。電流的極性可以是正或負的，取決于轉運的離子的極性和/或蛋白質偏移部分的極性和它們轉運或移動穿過區室膜或進入區室的矢量方向。用非激活溶液代替激活溶液或用洗滌溶液代替非激活溶液產生的電流在NCX活性測定時未納入考慮。選擇流動速率和時間間隔，使響應激活溶液替換非激活溶液的電流保持不被由其他替換步驟刺激的電流響應偏壓。
用非激活溶液替換洗滌溶液將優選地引起跨含有NCX蛋白質的膜的Na+梯度。此后，用激活溶液(即含Ca2+溶液)替換非激活溶液將選擇性地激發NCX活性。接著以相反順序替換溶液將傳感器芯片還原為初始狀態。
洗滌傳感器芯片一般是指在含鈉、不含鈣的緩沖液(洗滌液)中溫育傳感器芯片，優選地引起囊泡區室中Na+的蓄積。另外，跨膜建立Na+梯度優選通過用非激活溶液替換洗滌溶液進行，從而將傳感器芯片暴露于Na+濃度的快速變化中。NCX激活優選通過用激活溶液替換非激活溶液進行，從而將傳感器芯片暴露于Ca2+濃度的快速變化中。
在另一優選的實施方案中，本發明涉及測定NCX蛋白質活性的測定法，其中第一次溶液替換通過用非激活溶液替換洗滌溶液進行，和/或第二次溶液替換通過用激活溶液替換非激活溶液進行，和/或第三次溶液替換通過用非激活溶液替換激活溶液進行，和/或第四次溶液替換通過用洗滌溶液替換非激活溶液進行。
本發明還涉及用于鑒定調節NCX蛋白質活性的化合物的測定法(篩選測定法)，其中a]提供含有NCX蛋白質的傳感器芯片；b]提供洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液；c]提供洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液，其中所有這三種溶液另外含有在所有三種溶液中濃度相同的化合物；d]用來自b]的洗滌溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗滌溶液連續逐步處理來自a]的傳感器芯片；e]當將d]中的非激活溶液改變為激活溶液時，測定電流；f]用來自c]的洗滌溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗滌溶液連續逐步處理來自e]的傳感器芯片；g]當將f]中的非激活溶液替換為激活溶液時，測定電流；從而證明在e]的電流與g]的電流強度不同時，NCX蛋白質活性的調節。
步驟d]、e]、f]中的連續逐步處理可以連續流動或幾乎連續流動進行。
NCX蛋白質活性的修飾可由刺激或抑制NCX蛋白質活性組成。
當來自e]的電流大于來自g]的電流時，證明了活性的刺激。
當來自e]的電流小于來自g]的電流時，證明了活性的抑制。
該方案的優選實施方案已在上文、下列實施例和權利要求書中描述。
本發明還涉及包含下列部分的試劑盒a]含有NCX蛋白質的傳感器芯片、b]洗滌溶液、c]非激活溶液、d]激活溶液。
該試劑盒優選的實施方案也已在上文、下列實施例和權利要求書中描述。
本發明還涉及上述試劑盒的生產，其中生產傳感器芯片，生產NCX蛋白質，將生產的NCX蛋白質固定在傳感器芯片表面上，生產洗滌溶液，生產非激活溶液，生產激活溶液并將含有NCX蛋白質的傳感器芯片、洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液組合為一個試劑盒單元。
該試劑盒單元可由一個或若干個包含例如給使用者的說明書的部分組成。
本發明還涉及如上所述試劑盒用于鑒定修飾(＝抑制或激活)NCX蛋白質的活性的化合物或用于測定NCX1蛋白質活性的用途。
本發明還涉及測定NCX蛋白質活性的測定法，其中將包含含有吸附的NCX蛋白質的膜的傳感器芯片暴露于至少一種NCX底物(例如Ca2+或Na+)的濃度快速變化中。
下列附圖和實施例將更詳細地描述本發明而不限制保護范圍。
圖1圖1顯示含有人NCX1cDNA序列的載體pVL1393的多核苷酸序列。相應的可讀框通過顯示相關的氨基酸序列來標記。所示序列對應于SEQ IDNO.1。含人NCX1 cDNA的pVL1393的DNA已經保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；Mascheroder Weg 1b；D-38124 Braunschweig)，保藏號為DSM 16588。
SEQ ID NO.1pVL1393的多核苷酸序列保藏的生物材料DSM 16588含人NCX1 cDNA的pVL1393的DNA。
DSM ACC2670Flp-In-T-Rex-293-NCX1。
保藏根據布達佩斯條約規定通過將生物材料移交給DSMZ(DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；MascheroderWeg 1b；D-38124 Braunschweig)完成。
圖2A)帶金結構和流體區室的3mm生物傳感器芯片。
B-D)生物傳感器夾層結構裝配圖解；B)金表面；C)具有化學接頭和脂質的涂層；D)膜的吸附。
圖3A)重組表達的Na+/Ca2+交換蛋白的離子轉運活性誘導的充電電流。
B)用本發明的無細胞電生理傳感器芯片獲得的Na+/Ca2+交換蛋白抑制劑的IC50。所有的誤差作為平均標準誤(SEM)列出。
實施例1.產生哺乳動物細胞系使用Flp-InTMT-RexTM表達系統(Invitrogen Corporation，1600Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California 92008，USA)完成穩定轉染細胞系的快速產生。為此，將編碼(人)心臟鈉鈣交換蛋白的cDNA(NCX-1，即SLC8A1 PDB-entry NM 021097)克隆進Flp-InTMT-RexTM表達載體(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，PostBox 6482 Carlsbad，California 92008，USA)然后轉染進HEK-293細胞中。細胞在標準條件(37℃，補充有8％CO2的空氣)下在添加10％胎牛血清(Biochrom AG，Post Box 46 03 09，12213 Berlin，Germany)、50mg/ml潮霉素(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482Carlsbad，California 92008，USA)和10mg/ml殺稻瘟素(InvitrogenCorporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California92008，USA)的D-MEM(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California 92008，USA)中培養。
每3到4天傳代細胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液(Biochrom AG，Post Box46 03 09，12213 Berlin，Germany)脫附細胞。制備膜之前至少12到24小時，用1μg/ml多西環素(Doxicycline)(Beckton Diccinson Bioscience Clontech，1290 Terra Bella Avenue Mountain View，CA 94043，USA)處理細胞以促進NCX表達。
表達NCX-1的Flp-In-T-Rex-293-NCX1細胞系以DSM ACC2670保藏于DSMZ(Deutsche Gesellschaft von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。
2.產生昆蟲細胞系使用Bac3000表達體系(EMD Biosciences，Inc.，Novagen Brand，441Charmany Drive，Madison，WI 53719，USA)完成瞬時轉染的細胞系的快速產生。為此將編碼(人)心鈉鈣交換蛋白的cDNA(NCX-1，即SLC8A1PDB-entry NM_021097)克隆進Bac3000表達載體(EMD Biosciences，Inc.，Novagen Brand，441Charmany Drive，Madison，WI 53719，USA)。根據生產商規程產生病毒后，使用三倍超量的病毒原種轉染Sf9昆蟲細胞。細胞在標準條件(27℃)下合適的培養基中保持培養。轉染后3天收集膜。原種細胞培養物根據生產商規程保存。
特別地，該方法可如下進行2.1共轉染制備重組病毒為了共轉染，應制備約10μg高度純化且無菌的質粒DNA。為了為共轉染提供細胞，建立6孔板用于每個轉染以及陽性和陰性對照。每個孔中接種無血清培養基中1×10e6個Sf9細胞。通常允許細胞貼壁一小時。細胞貼壁時可制備轉染混合物，其由15μl來自Novagen
的BacVector3000、30μl Cellfectin(InVitrogen)、0.4μg重組供體質粒DNA pVL_NCX1和添加至50μl的蒸餾水組成。培育時間為室溫下20分鐘。該時段后每種混合物加入0.5ml培養基。如果細胞已貼壁，去除舊培養基并將轉染混合物滴加入孔中。27℃培育4小時后加入1ml新鮮培養基(含10％血清)并隨后在27℃再次培育4-5天。
2.2噬菌斑純化以分離單克隆重組病毒克隆5天后收集共轉染平板的上清液(稱為病毒原種VS0)。為了通過噬菌斑篩選鑒定重組病毒，建立每孔1×10E-6 Sf9細胞的另一六孔板。細胞應沉降至少30分鐘。同時將病毒以10E-3、10E-4、10E-5、10E-6和10E-7的稀釋度稀釋至1ml等分試樣。細胞良好附著在平板上后吸去培養基。向6孔板的每個孔中快速加入1ml稀釋的病毒。將平板轉移至搖動平臺上并緩慢搖動至少2小時。此時制備低熔點瓊脂糖的覆蓋瓊脂糖(臨使用前)。使用下列混合物添加20％胎牛血清的1份2X Grace′s培養基和1份溶于雙蒸水的3％SeaPlaque瓊脂糖。瓊脂糖在微波爐中完全熔化。將1∶1混合物置于38℃水浴中。此時從孔中吸出所有培養基并向每孔中加入1ml覆蓋混合物，使其從孔的遠端壁上滑下并滑至平板上。覆蓋細胞后，將平板在通風廚中30分鐘。之后向每孔中加入1ml培養基以防止干涸。將平板置于27℃，98％濕度控制的培養箱中至少3天。
之后6孔板的每孔用1ml 1％中性紅(neutral red)溶液染色噬菌斑。將平板放回培養箱至少4小時。在此期間，噬菌斑將開始顯示為染色細胞中的透明點。用無菌的巴斯德吸管挑取一個(或更多)噬菌斑并轉移進25cm2T-瓶中，總共2e6個Sf9細胞和有5％FCS的4ml培養體積。在27℃培育5-6天。收集培養物上清液(所謂的病毒原種VS1)并用于下一步驟確定病毒效價。
2.3.用于確定病毒效價的噬菌斑測定與2.2.下描述的方法相同。
計數噬菌斑并通過使用下列等式計算效價(例如計數20個噬菌斑)
效價(pfu/ml)＝2×10e7pfu/ml(噬菌斑形成單位/ml)2.4.大規模(即1L)擴增重組病毒對于病毒擴增通常使用0.1的M.O.I.(感染復數)，這意味著10個Sf9細胞1個病毒的比例。由于病毒具有繼發感染周期的可能性，擴增時間應為約7天。在這期間，病毒將指數擴增且細胞培養物的生活力可降低到20-30％。為了產生高病毒效價，推薦補充5％FCS和使用具有無氣泡通氣的super-spinner培養容器。一周后收集培養物上清液(所謂的病毒原種VS2)。這是更大體積的病毒原種，其足夠進行若干表達研究并可在4℃避光下保存若干月(高達一年)。
2.5.表達重組蛋白質NCX1對于所有的表達實驗推薦3的M.O.I(比例3個病毒顆粒對1個Sf9細胞)和27℃下72小時的培育時間。
3.膜/蛋白質制備通過從周圍環境(瓶或身體)表面機械分離從天然組織或重組表達體系收獲細胞。通過細胞破裂和隨后的離心步驟和/或蔗糖梯度離心制備膜碎片。
特別地，該方法可如下進行3.1昆蟲細胞膜/蛋白質制備通過離心收獲細胞后在液氮中快速冰凍來自Sf9懸浮培養物的約2g濕重的細胞并保存在-80℃用于進一步制備。
冰上解凍細胞沉淀并轉移至冰預冷的緩沖液(0.25M蔗糖、5mM TrispH 7.5、2mM DTT，每50ml一片完整的蛋白酶抑制劑混合物片劑(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany))中。
通過細胞破裂制備膜碎片。通過氮細胞破碎方法使用Parr CellDisruption Bomb(Parr Instrument Company，Illinois，USA)或通過Dounce勻漿方法使用Dounce Homogenisator(7ml，來自NovodirectGmbH，Kehl/Rhein，Germany)將細胞勻漿，并將混懸液在4℃和680g離心10分鐘。收集上清液并再次在SW41甩平式轉頭上以4℃和100000g離心。
將沉淀重懸于約2ml的5mM Tris pH 7.5中。將懸浮液用(5mM Tris中)87％蔗糖調節到56％。然后建立以底部2ml 56％級分開始，然后是3ml 45％蔗糖，3ml 35％和2ml 16％蔗糖的蔗糖梯度。
再次在4℃和100000g離心2.5小時(或甚至更多)并用巴斯德吸管小心吸取梯度條帶并收集在有5ml 100mM NaCl、1.5mM EDTA、40mMHepes pH 7.5的新管中。
然后進行另一離心步驟30min 150000g，4℃。
產生的沉淀重懸于100mM NaCl、1.5mM EDTA、2mM DTT、40mMHepes pH 7.5、10％丙三醇。
4.傳感器芯片制備芯片包含NCX蛋白質，在所有情況下蛋白質粘附或附著在芯片上。這可通過例如疏水的、親水的、離子的或共價的力發生。
這種測定的傳感器芯片由例如帶有金結構的borofloate玻璃基質組成。該裝置可進一步被硫醇層覆蓋并具有一個或若干個絕緣層。
在優選的實施方案中，帶有金結構的borofloate玻璃用硫醇層和脂質膜覆蓋，所述脂質膜由60重量單位的1，2-二植烷?；?Diphytanoyl)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(AVANTI 850 356)和1重量單位的十八胺(FLUKA)溶于800重量單位的正癸烷(詳細地50μl PC(AVANTI銷售的己烷或CHCl3中原液20mg/ml+10μl十八胺(5mg/ml己烷中))用氮蒸發，并吸收進400μl正癸烷中)組成。為此，將傳感器芯片與30μL硫醇溫育15分鐘然后用異丙醇洗滌(3×70μL)并真空干燥。若干小時后將2μL脂質+30μL DTT-緩沖液(2mM，1.542mg DTT/50mL Puffer C)移液到傳感器芯片上部并溫育20分鐘。為了產生功能性傳感器芯片，將10μL目的膜+120μLDTT-Puffer混和并在冰上以30s間斷超聲粉碎2×10單位(0，5/30)。然后將緩沖液從傳感器芯片上去除并用30μL含膜緩沖液代替，將緩沖液上下吸打并在4℃儲藏至少12小時。
5.溶液交換方案為了測定NCX蛋白質的活性，將其用洗滌、非激活和激活溶液連續處理并在從充電改變到激活處理時測量電流。用充電溶液(少鈉、無鈣的緩沖溶液)替換預溫育溶液(含鈉、無鈣緩沖溶液)誘導跨含NCX蛋白質膜的Na+梯度。此后，用激活溶液(含Ca2+溶液)替換所述溶液觸發NCX活性。隨后以相反順序替換溶液將傳感器芯片還原為原始狀態。
生物傳感器系統的緩沖液容器A、B和C分別用“激活”緩沖液(30mMHEPES/NMG pH 7.4，140mM KCl，4mM MgCl2，0.5mM CaCl2)、“非激活”緩沖液(30mM HEPES/NMG pH 7.4，140mM KCl，4mM MgCl2)和“洗滌”緩沖液(30mM HEPES/NMG pH 7.4，40mM KCl，100mM NaCl，4mM MgCl2)充滿后，將對照劑裝在傳感器支架上并用所有的緩沖液沖洗系統以從整個流體系統去除氣泡。然后將空的或無效的(blind)傳感器用預載有含NCX1 HEK膜碎片的基于標準玻璃的傳感器替換(3mm直徑的化學修飾金表面；IonGate Biosciences GmbH，Frankfurt/M.，Germany)。通過流體系統(包括傳感器流動小室)的液體轉運通過對緩沖液容器加壓來實現。
通常在200mbar超壓下進行測量，產生約300μl s-1的流速。為了測量其活性，含NCX蛋白質的膜用“洗滌”、“非激活”和“激活”溶液連續處理。用“非激活”溶液替換“洗滌”溶液誘導跨含NCX蛋白質膜的Na+梯度。此后，用激活溶液替換“非激活”溶液觸發NCX活性并在從“非激活”變為“激活”處理時測量從而誘導的電流。隨后以相反順序替換溶液將傳感器芯片還原為原始狀態。通過控制軟件定義順序，其中“洗滌”緩沖液流過傳感器表面0.5s，然后是“非激活”緩沖液(2.0s)，“激活”緩沖液(2.0s)，“非激活”緩沖液(2.0s)和“洗滌”緩沖液(2.0s)。整個順序中，數字化電流響應(2000個樣品s-1)并存為數據文件。對于劑量應答實驗，將抑制劑分別溶解在“激活”、“非激活”和“激活”緩沖液中。所有的化學品為分析級或更高。
下列設置用于測量NCX1循環1
5分鐘間斷循環2
5分鐘間斷并添加待分析的化合物循環3
5分鐘間斷循環4
5分鐘間斷并添加另一濃度的相同化合物或另一化合物，等等。
6.實驗根據方案，結合在生物傳感器表面的含NCX的膜碎片暴露于快速Ca+濃度跳變中，引起瞬時充電電流(圖3a)。應再次說明，該實驗結果特別優選實驗前對生物傳感器直接應用囊泡外Na+減少以產生鈉梯度。電流快速衰減的原因是由于轉運蛋白與膜碎片表面的失活和/或電容性偶聯。實際上，穩定的電流為生物傳感器夾層結構充電并從而產生僅允許對有限狀態充電的電場——類似充電電容器的DC電源。
圖3A顯示典型的無細胞電生理NCX生物傳感器在NCX特異抑制劑抑制前(黑線)和后(灰線)的記錄。在所有溶液中不存在或存在10μM抑制劑A時經受快速Ca濃度跳變的生物傳感器分別產生300pA或20pA的NCX峰電流，顯示信號的特異性。應用10μM抑制劑導致NCX特異信號下降90.5％±5.1％(n＝5)。產生的劑量反應曲線在圖3B中顯示。記錄應用0.01、0.1、1、5和10μM濃度抑制劑時的IC50值(n＝5)。50％抑制的值可計算為0.86μM±0.22μM。Hill系數可計算為0.7±0.03。隨后在沒有抑制劑時的實驗產生高達原始信號100％振幅的NCX峰電流，證明抑制劑的可逆性。
在對照實驗中，可通過減少施加的Ca2+跳變和通過使用Ni2+的非特異性NCX1阻滯劑(5mM)減小電流。此外，不表達NCX1的細胞膜在類似的實驗條件下不產生電流。
序列表<110>塞諾菲-安萬特德國有限公司<120>鑒定調節鈉/鈣交換轉運蛋白活性的化合物的方法<130>DEAV 2004/0052<160>1<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>25773<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt60ttcgaaatga gcatttcgct caacttccta gtataaatca acgcaaatac tctattctaa120gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt180ctttcgtgca cattttacaa agggcgcgca accgtgttga taaatgttac gccggttcaa240ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac300tattttctaa gattagacta tacaaaattt tgtggaaacg ccgggctcaa caaacgcatg360gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt420cactgatcgc ttcttctaca cacctggcgt cttgtctatc attttgtttt gggatcataa480ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg540cctcgttatt agctaaattg gttgtgcaga tttataatac taccacacgt aaaaaacgcc600gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata660cgcccggaca atatgttttt ttaagttcat ggaccggtct gaaacggcgg actttcgtat720
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1.用于測定NCX蛋白質活性的體外測定法，其中包含NCX蛋白質的傳感器芯片通過洗滌、非激活和激活連續地逐步處理，然后當從非激活改變為激活處理時測量電流。
2.權利要求1的測定法，其中傳感器芯片包含下列列表中NCX蛋白質的至少一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。
3.權利要求2的測定法，其中傳感器芯片包含哺乳動物來源的NCX蛋白質，優選來自大鼠、小鼠或人的NCX蛋白質。
4.權利要求3的測定法，其中NCX蛋白質為人NCX1蛋白質。
5.權利要求1到4的測定法，其中傳感器芯片為重組NCX蛋白質或天然NCX蛋白質。
6.權利要求1到5的測定法，其中傳感器芯片含有帶有金結構的borofloate-玻璃基質。
7.權利要求1到5的測定法，其中根據權利要求5的傳感器芯片覆蓋有硫醇層并具有一層或幾層絕緣層。
8.權利要求1到7的測定法，其中洗滌傳感器芯片通過洗滌溶液進行。
9.權利要求1到8的測定法，其中第一種溶液替換通過用非激活溶液替換洗滌溶液進行。
10.權利要求1到9的測定法，其中第二種替換通過用激活溶液替換非激活溶液進行。
11.權利要求1到10的測定法，其中第三種溶液替換通過用非激活溶液替換激活溶液進行。
12.權利要求1到11的測定法，其中第四種溶液替換通過用洗滌溶液替換非激活溶液進行。
13.用于鑒定調節NCX蛋白質活性的化合物的測定法，其中a]提供含有NCX蛋白質的傳感器芯片；b]提供洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液；c]提供洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液，其中所有三種溶液另外含有在所有三種溶液中濃度相同的化合物；d]用來自b]的洗滌溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗滌溶液連續逐步處理來自a]的傳感器芯片；e]當將d]中的非激活溶液改變為激活溶液時，測定電流；f]用來自c]的洗滌溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗滌溶液連續逐步處理來自e]的傳感器芯片；g]當將f]中的非激活溶液替換為激活溶液時，測定電流；從而在e]的電流與g]的電流強度不同的情況下，證明NCX蛋白質活性的調節。
14.權利要求13的測定法，其中傳感器芯片包含下列列表中NCX蛋白質的至少一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。
15.權利要求14的測定法，其中傳感器芯片包含哺乳動物來源的NCX蛋白質，例如來自大鼠、小鼠或人的NCX蛋白質。
16.權利要求15的測定法，其中NCX蛋白質為人NCX1蛋白質。
17.權利要求13到16的測定法，其中傳感器芯片包含通過重組生物材料產生的NCX蛋白質。
18.權利要求13到17的測定法，其中傳感器芯片由帶有金結構的borofloate-玻璃基質組成。
19.權利要求13到18的測定法，其中根據權利要求16的傳感器芯片覆蓋有硫醇層并具有一層或幾層絕緣層。
20.試劑盒，其包含a]含有NCX蛋白質的傳感器芯片；b]洗滌溶液；c]非激活溶液；d]激活溶液.21.權利要求20的試劑盒，其中傳感器芯片包含下列列表中NCX蛋白質的至少一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。
22.權利要求21的試劑盒，其中NCX蛋白質為哺乳動物來源的，例如來自大鼠、小鼠或人。
23.權利要求22的試劑盒，其中NCX蛋白質為人NCX1蛋白質。
24.權利要求20到23的試劑盒，其中傳感器芯片包含通過重組生物材料產生的人NCX蛋白質。
25.權利要求20到24的試劑盒，其中傳感器芯片由帶有金結構的borofloate-玻璃基質組成。
26.權利要求20到25的試劑盒，其中根據權利要求23的傳感器芯片覆蓋有硫醇層并具有一層或幾層絕緣層。
27.權利要求18到24的試劑盒，其中洗滌溶液包含30±15mMHEPES/NMG pH 7.4±1.0；40±20mM KCl；100±50mM NaCl；4±2mM MgCl2。
28.權利要求20到26的試劑盒，其中非激活溶液包含30±15mMHEPES/NMG pH 7.4±1.0；140±70mM KCl，4±2mM MgCl2。
29.權利要求18到26的試劑盒，其中激活溶液包含30±15mMHEPES/NMG pH 7.4±1.0，140±70mM KCl，4±2mM MgCl2，0.5±0.25mM CaCl2。
30.權利要求20到29的試劑盒的生產方法，其中生產傳感器芯片，生產NCX蛋白質，將生產的NCX蛋白質固定在傳感器芯片表面上，生產洗滌溶液，生產非激活溶液，生產激活溶液并將含有NCX蛋白質的傳感器芯片、洗滌溶液、非激活溶液和激活溶液組合為一個試劑盒單元。
31.權利要求20到30的試劑盒用于鑒定修飾NCX蛋白質活性的化合物的用途。
32.權利要求20到30的試劑盒用于測定NCX蛋白質活性的用途。
33.用于測定NCX蛋白質活性的測定法，其中將傳感器芯片暴露于至少一種NCX底物的濃度快速變化中，所述傳感器芯片包含含有吸附的NCX蛋白質的膜。
34.權利要求33的測定法，其中NCX底物為Ca2+或Na+。
全文摘要
本發明涉及通過無細胞電生理傳感器芯片測定Na
文檔編號G01N33/543GK101036054SQ200580026816
公開日2007年9月12日 申請日期2005年8月10日 優先權日2004年8月19日
發明者H·福勒特, S·蓋伯爾, B·凱萊蒂, W·德爾納 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司
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