專利名稱：全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及全封閉靶核酸擴增物的檢測裝置，更具體地說，涉及利用核酸薄膜層析(試紙條)技術在全封閉的檢測裝置中快速檢測靶核酸序列擴增物的方法，本發明還涉及了在全封閉的快速檢測裝置中應用快速檢測靶核酸擴增物的試劑盒及其在檢測傳染病病原體中的用途。
現有技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是1985年由美國Cetus公司發明的一種利用DNA變性與復性原理在體外DNA聚合酶存在的條件下進行特定DNA片段高效的體外擴增技術。PCR自問世以來，便在國際上引起了極大的反響，以驚人的速度廣泛應用于生命科學的眾多領域，并在疾病診斷和檢驗中得到廣泛的應用，其發明者Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。
近幾年來PCR技術迅速發展，其廣泛應用于醫學、分子生物學、遺傳工程、腫瘤學、法醫學等各個領域。在體外特定的條件下，PCR在數小時內可將單一拷貝的DNA片斷擴增至數百億個拷貝，從而大大提高了特異基因檢測的敏感性。正是由于其具有特異性強、靈敏度高、快速簡便及重復性好等優點，PCR被廣泛應用于臨床醫學及生命科學中特定的基因擴增和檢測，如各種病原體的PCR檢測已成為傳染性疾病診斷的重要手段之一。但由于強大的擴增效率和PCR產物的檢測方法(瓊脂糖凝膠電泳)，極易造成實驗室擴增物的污染，而導致假陽性檢測結果，造成PCR檢驗結果十分混亂，特別在性病基因檢測方面，甚至還帶來一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會和法律問題。PCR技術臨床應用所出現的一系列問題引起衛生部管理層高度重視，因此，對PCR的臨床應用制定了一系列條款和規定，而如何消除PCR假陽性結果則成了科研工作者們要解決的一大難題。
為了防止實驗室擴增物污染所造成的假陽性，國家衛生部規定PCR臨床診斷必須將樣品處理、擴增和檢測在分隔的房間內進行，而且物流是從樣品處理，擴增和檢測一個方向進行，否則擴增后的試管不能進行開放檢測。目前用來防實驗室擴增物污染最為普遍的方法是采用UNG-dUTP系統。該系統是利用UNG(尿苷葡萄糖基酶)能水解含有dUTP的DNA片斷中的尿苷這一特點，將DNA片斷中的U水解，被水解的DNA受熱后從被水解的地方斷裂，失去做模板的功能，從而達到防污染的目的。但使用該系統防污染的先決條件，是整個PCR系統必須從一開始就全部采用dUTP代替dTTP，而且UNG-dUTP系統防污染試劑的價格也使該試劑的使用受到了限制。
熒光定量PCR是近年來發展起來的一項新技術。熒光定量PCR技術既巧妙的利用了PCR技術核酸擴增的高效性，探針技術的高特異性和光譜技術的高敏感性及計量高準確性等優點，同時又克服了普通PCR技術易污染，不能定量，探針雜交靈敏度不高，分離洗脫條件不易控制等不足，在疾病的基因臨床診斷中得到了廣泛的應用。而其最顯著的特點就是全封閉式反應，實時檢測PCR擴增過程，而無需對PCR擴增產物進行后處理，從而徹底克服了傳統PCR技術易污染的缺點，因而成為檢測領域上越來越重要的一種檢測手段，在病原體的臨床檢測中得到了極廣泛的應用。但由于昂貴的儀器及試劑和對操作人員的技術要求較高，此項技術并不適合廣大基層醫院。
如上所述，由于PCR擴增物污染，使PCR的診斷受到了很大的限制。為了避免實驗室污染而造成的假陽性，本申請人結合核酸試紙條快速檢測技術(參見本發明人的另一項專利申請，申請號200610003429.1)，開發出全封閉快速檢測靶核酸擴增物的裝置，稱為全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置。本方法簡單、快速，而且不會造成污染，可以廣泛地應用于生命科學領域，如分子生物學實驗室核酸擴增檢測、臨床診斷、植物和動物疾病的檢測、海關檢疫、法醫學鑒定等核酸擴增物的檢測。
簡而言之，本發明的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置提供了兩個方面的用途第一，提供了一種快速檢測靶核酸擴增物的方法；第二，提供了一種防止核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的方法。
發明內容
概述本發明提供一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法。
本發明提供一種將PCR、恒溫擴增或其它方法擴增的產物應用核酸檢測試紙條的全封閉快速檢測裝置。
具體地說，一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括
a)擴增反應完成后，不打開反應管的管蓋，以免靶核酸擴增產物外泄而造成污染；b)將未開蓋的反應管放入封閉性裝置，將靶核酸擴增物在物理性封閉的環境中由反應管轉移至檢測試紙條上；c)以肉眼可視的形式予以檢測，并判讀結果；和d)檢測后不打開所述封閉性裝置，將其整體廢棄于安全處。
本發明提供一種全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其包括內芯1和外盒15；內芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相應的孔用于放置清洗液泡3和含有擴增物7的反應管11；底座部分5包括帶有液泡穿刺針4的清洗液容納單元21、帶有刀片9的擴增物容納單元22、封閉隔6、玻璃纖維紙8；和帶有試紙條13和透明視窗12的試紙條密封部分14；和外盒15包括手柄蓋16、固定盒推壓部分17、清洗液泡擠壓部分18和透明視窗20。
本發明將利用全封閉式檢測裝置并結合本申請人的核酸快速檢測試紙條檢測技術，檢測擴增產物。這一方法操作簡單、快速、無污染，是對擴增物檢測一個根本性革新。本發明與本申請人的其它技術相結合(切口酶擴增靶核酸序列的方法及用于擴增靶核酸序列的試劑盒，參見本發明人的另一項專利申請，申請號200610057262.7)，可以發展出一種新的核酸快速檢測技術平臺。利用該技術平臺可以對核酸進行定性和半定量檢測，且不會對實驗室和周圍環境產生污染，從而可以更廣泛地應用于臨床疾病的診斷和檢測及其它生命科學領域。
發明內容
詳述本發明將PCR、恒溫擴增或其它方法擴增的產物在全封閉的裝置中應用核酸快速檢測試紙條進行檢測。這種方法除操作簡單、快速外，最重要的是可以避免擴增物對實驗室的污染而造成的假陽性，大大增加了體外診斷試劑的可靠性，是一種全新的檢測方法。這對于病源微生物的檢測具有非常重要的意義，而且也符合國家衛生部門有關的規定。
具體地說，本發明提供一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括a)擴增反應完成后，不打開反應管的管蓋，以免靶核酸擴增產物外泄而造成污染；
b)將未開蓋的反應管放入封閉性裝置，將靶核酸擴增物在物理性封閉的環境中由反應管轉移至檢測試紙條上；c)以肉眼可視的形式予以檢測，并判讀結果；和d)檢測后不打開所述封閉性裝置，將其整體廢棄于安全處。
根據本發明的優選實施方案，在上述方法中，所述的封閉性裝置一旦扣死，則不能再打開，從而防止裝置內可能污染的物品因意外而外泄。
根據本發明的更優選實施方案，在上述方法中，在步驟b)中將反應管和清洗液管在物理性封閉的環境中打開，靶核酸擴增產物由清洗液帶動轉移至檢測試紙條上。
本發明提供一種全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其包括內芯1和外盒15；內芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相應的孔用于放置清洗液泡3和含有擴增物7的反應管11；底座部分5包括帶有液泡穿刺針4的清洗液容納單元21、帶有刀片9的擴增物容納單元22、封閉隔6、玻璃纖維紙8；和帶有試紙條13和透明視窗12的試紙條密封部分14；和外盒15包括手柄蓋16、固定盒推壓部分17、清洗液泡擠壓部分18和透明視窗20。
更具體地說，本發明提供一種全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其包括內芯1和外盒15；內芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相應的孔用于放置清洗液泡3和含有擴增物7的反應管11；底座部分5包括帶有相應于清洗液泡3的液泡穿刺針4的清洗液容納單元21、帶有相應于反應管11的刀片9的擴增物容納單元22、在單元21和22之間的封閉隔6、放置在容納單元21和22中并相連于試紙條13底部的玻璃纖維紙8；和帶有試紙條13和相應于試紙條13的透明視窗12的試紙條密封部分14；外盒15包括手柄蓋16、固定盒推壓部分17、清洗液泡擠壓部分18和相應于透明視窗12的透明視窗20。
附
圖1說明了本發明的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置的結構。
在本發明的優選實施方案中，全封閉檢測裝置還包括位于相應于反應管11的孔與底座5之間的密封圈10，以確保相應于反應管11的孔與底座5的接觸是吻合的、密封的，從而確保擴增物不會倒流回固定盒部分2。
在本發明的另一個優選實施方案中，全封閉檢測裝置還包括采用三層上下交替的封閉隔6以確保擴增物不會倒流，而與單向流動的清洗液混合后被試紙條13所吸收。
在本發明的另一個優選實施方案中，全封閉檢測裝置還包括其中外盒15構成一個全封閉的環境，并且在實驗過程中，一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內可能污染的物品因意外而外泄。
在本發明的更優選實施方案中，全封閉檢測裝置還包括位于相應于反應管11的孔與底座5之間的密封圈10，以確保相應于反應管11的孔與底座5的接觸是吻合的、密封的，從而確保擴增物不會倒流回固定盒部分2；采用三層上下交替的封閉隔6以確保擴增物不會倒流，而與單向流動的清洗液混合后被試紙條13所吸收；和其中外盒15構成一個全封閉的環境，并且在實驗過程中，一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內可能污染的物品因意外而外泄。
附圖2說明了本發明的優選全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置的結構。
由于整個操作過程是在全封閉的狀態下進行，以物理隔絕的方式防止擴增物對實驗室的污染，所以可以提高體外診斷試劑的準確性。
本發明全封閉檢測裝置的具體操作步驟和檢測機理如下(1)將擴增后未打開的反應管11放置在固定盒部分2的反應管孔中(清洗液泡3已預先放置在清洗液泡管孔中)；(2)將固定盒部分2放入外盒15中，密封圈10保證反應管孔處與底座5的接觸是吻合的、密封的；(3)合上檢測裝置的手柄蓋16；(4)推壓檢測裝置的蓋子16，直至蓋子蓋緊并扣死，此時在固定盒推壓部分17的擠壓下，底座的刀片9將含有擴增物7的反應管11割破；而在清洗液泡擠壓部分18的作用下，底座的清洗液泡穿刺針4將塑料清洗液泡在底部穿破；(5)通過玻璃纖維紙8的毛細管現象，擴增產物7和清洗液被吸附到試紙條13的樣品墊中；(6)液體在樣品墊中移動、混合并緩慢地移向核酸檢測試紙條底部；(7)混合后的液體通過毛細管現象從試紙條底部緩慢向核酸檢測試紙條頂部移動，檢測反應液與核酸檢測試紙條上的檢測線發生抗原抗體特異反應而完成檢測過程；
(8)靜置10分鐘觀察檢測結果；(9)記錄檢測結果，整體廢棄封閉的檢測裝置于安全處。
附圖3說明了本發明的檢測裝置的操作步驟。
在本發明的優選實施方案中，所述的反應管是PCR反應管。
本發明還提供一種快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括使用上述的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置檢測核酸序列擴增物。
本發明還提供一種防止核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的方法，其包括使用上述的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置檢測核酸序列擴增物。
在最優選的實施方案中，本發明提供了一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括a)擴增反應完成后，不打開反應管的管蓋，以免靶核酸擴增產物外泄而造成污染；b)將未開蓋的反應管放入封閉性裝置，將靶核酸擴增物在物理性封閉的環境中由反應管轉移至檢測試紙條上；c)以肉眼可視的形式予以檢測，并判讀結果；和d)檢測后不打開所述封閉性裝置，將其整體廢棄于安全處；其中所述的封閉性裝置為上述的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，并且在實驗過程中，全封閉裝置一旦扣死，則不能再打開，從而防止裝置內可能污染的物品因意外而外泄。
本申請人的另一項專利(申請號200610003429.1)描述了核酸試紙條檢測的原理和方法。該發明將以免疫反應為基礎的蛋白質試紙條檢測技術改造成核酸診斷試劑，其要點在于將待檢的靶核酸擴增物轉變為具備免疫原性的分子或分子復合物。如此，以免疫反應為基礎的蛋白質試紙條檢測技術基本方法均可應用與核酸試紙條檢測。
將待檢的靶核酸擴增物轉變為具備免疫原性的分子或分子復合物的基本方法是用抗原或半抗原(以下簡稱抗原)標記探針，使標記的特異性探針與待檢的靶核酸擴增物雜交，從而形成具備免疫原性的分子復合物，該復合物即可用與蛋白質試紙條檢測相類似的方法被檢測。
附圖4說明了單探針法核酸試紙條檢測的基本原理。
附圖5說明了核酸擴增物檢測試紙條的基本結構。
該發明提供了用于核酸擴增物檢測的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊27上按順序有樣品墊31、有色顆粒結合物墊32、纖維膜23和吸水濾紙墊24，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設有檢測線25和質控線26，其中有色顆粒結合物墊32上的有色顆粒有抗A抗體包被，檢測線25上有抗B抗體包被，質控線26上有抗A抗體。有色顆粒是膠體金顆粒或乳膠顆粒，纖維膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
有關核酸試紙條快速檢測技術和核酸試紙條結構的詳細說明，參見本申請人的另一項專利，申請號200610003429.1)發明效果核酸擴增反應的最大特點是具有較大的擴增能力與極高的靈敏性，但嚴重的問題是擴增產物極易造成實驗室的污染。極其微量的擴增物污染即可造成假陽性。由于擴增后的產物拷貝量大(一般約為1011拷貝/微升)，加上擴增物是一種小分子的物質，很容易漂浮在空氣中或散落在實驗臺上以及各種實驗用品的表面。當操作稍有不慎(有時是不可避免)，即造成假陽性。而常規PCR擴增反應結束后，必須打開PCR反應管的管蓋，吸出全部或部分擴增產物，進行瓊脂糖凝膠電泳或其它方法檢測。這種開放式的檢測很容易造成實驗室環境的污染。因此如何避免污染或在封閉條件下實現擴增產物的檢測就成為科研工作者們研究的重點。目前除熒光定量PCR外，尚無其它的方法可在全封閉的條件下完成對核酸的檢測過程。
本發明的全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置與常規PCR檢測技術相比，主要有以下優點(1)全封閉檢測。檢測裝置從內到外都是封閉的，達到雙重密封的效果(A)內芯封閉。無需打開擴增反應后的反應管的管蓋，從物理學角度防止了擴增物的外泄，將擴增物污染機會降至最低，從而防止檢測中的假陽性的發生；固定盒的密封孔圈確保擴增物不會倒流回固定盒，從而保證了固定盒的無污染；底座的三重封閉隔同樣保證擴增物不會通過玻璃纖維紙倒流回清洗液泡管底部；(B)外盒封閉。由外殼、手柄蓋、透明視窗組成的外盒構成一個全封閉的環境；并且在實驗過程中一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內的物品的外泄；(2)特異性強由于在擴增反應中不但加入了兩個特異的引物，而且加入了1-2個特異的探針(核酸試紙條快速檢測技術，參見本發明人的另一項專利，申請號200610003429.1，其檢測基本原理見附圖4)，使檢測反應更加特異；(3)保持了擴增后靶核酸擴增物檢測的高靈敏度；(4)操作簡單、快速整個檢測過程只需十到十五分鐘左右的時間，而傳統的瓊脂糖凝膠電泳則至少需要1-2小時；(5)擴增后檢測不需任何儀器設備。
由于該裝置使得核酸擴增產物的檢測和分析均在封閉狀態完成，最大限度地降低常規擴增后核酸檢測法中交叉污染的危險。此方法操作簡單、時間短，同時也降低了檢測成本，使得檢測結果更加快速、可靠。本封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置在臨床檢驗的使用，可以大大增加傳染性疾病診斷的準確性，縮短患者就醫的時間，也可使醫療保健系統總體成本降低。這一裝置由于操作簡單、快速、低廉的成本和防止核酸擴增物對實驗室的污染，對于工作在生命科學領域中需要檢測靶核酸擴增產物的科技人員來說，也將有很大幫助。
作為一個封閉式核酸擴增物檢測的通用技術平臺，本發明的方法及其裝置可以廣泛用于傳染病病原體臨床檢測，突發性公共衛生事件的戰略性技術儲備，農牧業和食品工業，海關檢驗檢疫，環境檢測，生物武器檢測，人類遺傳病檢測，婚前、產前檢查及優生優育和法醫鑒定和血緣鑒定等領域。
常見的病原體包括細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、寄生蟲等。
封閉式核酸擴增物檢測裝置不僅可以鑒別這些病原體，而且可以鑒別它們的亞型、有毒菌株、突變株和抗藥性等。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可作為突發性公衛事件的戰略性技術儲備。國家已投入巨資建立全國性的傳染病預防和控制系統，診斷烈性傳染病的快速診斷試劑將作為這些中心的常規儲備，以便在突發性公衛事件發生時可迅速鑒別病原體，有效控制。這方面的檢測對象包括例如禽流感、SARS、霍亂、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血熱等。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于食品工業，食物中毒常有發生，因此對牛奶、飲料、肉類制品等的出廠前檢驗很有必要。如霉菌，大腸桿菌，沙門氏菌，肉毒桿菌等。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于農業，對主要農作物的有害微生物的鑒別診斷，將產生巨大的經濟和社會效益。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于牧業，在牲畜、魚類和家禽的疾病診斷方面有廣闊的市場。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于海關進出口檢疫。這也是一個穩定而可靠的市場。例如外貿進口，為防止境外有害微生物、病蟲卵、轉基因產品傳入我國。需要有一套完整、靈敏、可靠的快速診斷系統。例如外貿出口，向進口國提供一套完整的檢疫資料，將大大地促進我國農牧業、林業、食品工業等產品的外貿出口，減少貿易糾紛。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于對土壤、水源、空氣等環境有害微生物的檢測及鑒別。一套簡便、靈敏、快速的現場檢驗方法對環境檢測具有重要意義。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于檢測生物武器。各國都在發展檢測生物武器的技術，我國也應及早準備。常見的生物武器病原體有霍亂、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血熱以及人工改造過的細菌和病毒等。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于檢測基因突變。現代分子遺傳學已經證明人類的絕大多數疾病在不同程度上都與基因有關。根據單核苷酸多態性(SNP)的研究，每個人的基因組型都不一樣。因此對各種疾病的易感性和對藥物的敏感性也不一樣。由此提出了“個性化醫學”。如重要疾病易感性預測。根據每個人的基因型決定他對藥物的敏感性和耐受性，精確給藥等。常見的基因突變引起的疾病有上百種，包括基因缺失，基因易位等基因突變。本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于開發人類遺傳病系列診斷產品，以滿足這個巨大的市場需求。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于婚前檢查，產前檢查，優生優育等。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于犯罪現場血液、精液、毛發及其它樣品的DNA鑒定，以及犯罪嫌疑人DNA的鑒定。
另一方面，本發明的封閉式核酸擴增物檢測裝置可用于血緣鑒定，基因身份證，人群基因數據庫等方面。
如下實施例進一步補充說明本發明的技術方案，但并不構成對本發明的保護范圍的限制。
實施例實施例1淋球菌為例的靶核酸PCR擴增物檢測1.PCR擴增
KCl(500毫摩)2微升Tris-HCl(pH 8.3，100毫摩) 2微升MgCl2(20毫摩) 2微升dNTP(2毫摩) 2微升Forward Primer(Biotin標記，2微摩) 2微升Reverse Primer(2微摩) 2微升Reverse FITC標記探針(2微摩) 2微升淋球菌 4000個Taq DNA Polymerase 0.5單位總量20微升95℃5秒60℃15秒72℃15秒共60循環2.檢測●將含有擴增物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已預先放置在清洗液泡管孔中)；●將固定盒扣緊，放入檢測裝置中；●合上檢測裝置的手柄蓋；●推壓檢測裝置的手柄蓋直到蓋緊并扣死；●10分鐘后判讀結果；●記錄檢測結果，整體廢棄封閉的檢測裝置于安全處。
實施例1檢測結果見附圖6。附圖6顯示陽性樣品在檢測線(T線)呈紅色，陰性樣品無色。陽性樣品和陰性樣品在質量控制線(C線)處均顯色，表明結果有效。
實施例2以淋球菌克隆DNA為模板恒溫擴增(切口酶擴增靶核酸序列的方法及用于擴增靶核酸序列的試劑盒，參見本發明人的另一項專利申請，申請號200610003429.1)靶核酸產物的檢測1.反應條件
管1反應緩沖液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mMMgCl2，10mM dithiothreitol，pH [email protected]℃) 1微升兩對引物P1，2/S1，25微摩/0.5微摩/ 2微升超純水5微升模板淋球菌質粒(1千拷貝/微升) 2微升共10微升95℃，5分鐘變性，然后自然冷卻至室溫管2反應緩沖液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mMMgCl2，10mM dithiothreitol，pH [email protected]℃) 1微升dNTP2毫摩 2微升標記的探針2微升牛血清蛋白100納克/微升2微升切口酶N.BstNB I 10個單位/微升 0.5微升Bst DNA聚合酶 8個單位/微升0.25微升超純水2.25微升共10微升管1加上相應的管2混勻，在54℃金屬浴放置30分鐘 95℃，5分鐘變性，然后自然冷卻至室溫后檢測。
2.檢測●將含有擴增物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已預先放置在清洗液泡管孔中)；●將固定盒扣緊，放入檢測裝置中；●合上檢測裝置的手柄蓋；●推壓檢測裝置的手柄蓋直到蓋緊并扣死；●10分鐘后判讀結果；●記錄檢測結果，整體廢棄封閉的檢測裝置于安全處。
實施例2檢測結果見附圖7。附圖7顯示陽性樣品在檢測線(T線)呈紅色，陰性樣品無色。陽性樣品和陰性樣品在質量控制線(C線)處均顯色，表明結果有效。
實施例3.Leber’s病線粒體DNA G11778A單核苷酸多態性的檢測與分型Leber’s遺傳性視神經病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一種母性遺傳的雙眼視神經疾病。1988年W.allace等人首先報告線粒體DNA(mtDNA)第11778核苷酸位點原發性突變(G→A)可引起LHON。迄今發現和本病相關的mtDNA位點突變已有25個，在近年的報告中3460或14484等原發性位點突變的LHON及原發和繼發突變并存的LHON患者，其臨床表現類似11778位點突變者，臨床醫生很難根據其臨床表現進行鑒別，因此分子生物學基因檢查成為鑒別不同病因的Leber’s病的首選方法。鑒于對于線粒體G11778A位點分型對于Leber’s遺傳性視神經病的診斷意義，應用本專利新發明的SNP封閉式核酸擴增物檢測裝置對G11778A位點多態性進行檢測。具體實施如下1.取樣被檢者外周靜脈抗凝血(凍存)5μl，應用杭州優思達生物技術有限公司所生產的微量DNA快速提取試劑盒進行核酸提取，用以基因擴增。
2.聚合酶鏈反應(PCR)為排除基因組中假基因對線粒體基因擴增的干擾，需要進行兩次擴增，以第一擴增產物為模板進行二次擴增，然后利用第二次擴增產物進行SBE。
引物 0.2微摩第一次擴增引物Nd4P_out_F5’TCACTCTCACTGCCCAAAA 3’Nd4P_out_R5’GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3’第二次擴增引物Nd4P_in_F5’CTTCACCGGCGCAGTCATTC 3’Nd4P_in_R5’AGGCGAGGTTAGCGAGGCTT 3’dNTP 0.2毫摩緩沖液MgCl23微摩KCl 50微摩Tris-HCl(PH 9.0) 10微摩氚核-100 1.0％
Taq DNA聚合酶0.8單位總體積為20微升PCR反應程序如下第一對引物 第二對引物 產物大小801bp(第一對引物)182bp(第二對引物)3.降解第二次PCR反應中剩余的dNTP模板上述PCR產物 20微升緩沖液Bis Tris-Propane50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩熱敏磷酸酶1單位總體積為30微升反應程序37℃，15分鐘熱敏磷酸酶滅活80℃，20分鐘.
4.單堿基延伸(檢測G和A)模板上述dNTP降解后的PCR產物30微升延伸引物 0.1微摩
5’FITC-TCAAACTACGAACGCACTCACAGTC 3’(正向)生物素-ddGTP/生物素-ddATP 0.5微摩緩沖液Tris-HCL(pH 9.5) 26毫摩MgCl26.5毫摩熱測序酶 0.5單位總體積為40微升SBE反應程序如下95℃→60秒72℃→90秒5.檢測●將含有SBE反應物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已預先放置在清洗液泡管孔中)；●將固定盒扣緊，放入檢測裝置中；●合上檢測裝置的手柄蓋；●推壓檢測裝置的手柄蓋直到蓋緊并扣死；●10分鐘后判讀結果；●記錄檢測結果，整體廢棄封閉的檢測裝置于安全處。
封閉式核酸擴增物檢測裝置檢測SNP結果見附圖8，由附圖8的結果可以看出，在被檢者線粒體ND4基因11778位點發生突變，由G轉變為A，與測序結果一致。
權利要求
1.一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括a)擴增反應完成后，不打開反應管的管蓋，以免靶核酸擴增產物外泄而造成污染；b)將未開蓋的反應管放入封閉性裝置，將靶核酸擴增物在物理性封閉的環境中由反應管轉移至檢測試紙條上；c)以肉眼可視的形式予以檢測，并判讀結果；和d)檢測后不打開所述封閉性裝置，將其整體廢棄于安全處。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的封閉性裝置一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內可能污染的物品因意外而外泄。
3.權利要求1或2所述的方法，其中在步驟b)中將反應管和清洗液管在物理性封閉的環境中打開，靶核酸擴增產物由清洗液帶動轉移至檢測試紙條上。
4.一種全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其包括內芯(1)和外盒(15)；其中內芯(1)包括固定盒部分(2)和底座部分(5)，其中固定盒部分(2)有相應的孔用于放置清洗液泡(3)和含有擴增物(7)的反應管(11)；底座部分(5)包括帶有液泡穿刺針(4)的清洗液容納單元(21)、帶有刀片(9)的擴增物容納單元(22)、封閉隔(6)、玻璃纖維紙(8)；和帶有試紙條(13)和透明視窗(12)的試紙條密封部分(14)；和外盒(15)包括手柄蓋(16)、固定盒推壓部分(17)、清洗液泡擠壓部分(18)和透明視窗(20)。
5.一種全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其包括內芯(1)和外盒(15)，其中內芯(1)包括固定盒部分(2)和底座部分(5)；其中固定盒部分(2)有相應的孔用于放置清洗液泡(3)和含有擴增物(7)的反應管(11)；底座部分(5)包括帶有相應于清洗液泡(3)的液泡穿刺針(4)的清洗液容納單元(21)、帶有相應于反應管(11)的刀片(9)的擴增物容納單元(22)、在單元(21)和(22)之間的封閉隔(6)、放置在容納單元(21)和(22)中并相連于試紙條(13)底部的玻璃纖維紙(8)；和帶有試紙條(13)和相應于試紙條(13)的透明視窗(12)的試紙條密封部分(14)；和外盒(15)包括手柄蓋(16)、固定盒推壓部分(17)、清洗液泡擠壓部分(18)和相應于透明視窗(12)的透明視窗(20)。
6.權利要求4或5的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其還包括位于相應于反應管(11)的孔與底座(5)之間的密封圈(10)，以確保相應于反應管(11)的孔與底座(5)的接觸是吻合的、密封的，從而確保擴增物不會倒流回固定盒部分(2)。
7.權利要求4或5的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其還包括采用三層上下交替的封閉隔(6)以確保擴增物不會倒流，而與單向流動的清洗液混合后被試紙條(13)所吸收。
8.權利要求4或5的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，其中外盒(15)構成一個全封閉的環境，并且在實驗過程中，一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內可能污染的物品因意外而外泄。
9.權利要求4或5的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置，還包括位于相應于反應管(11)的孔與底座(5)之間的密封圈(10)，以確保相應于反應管(11)的孔與底座(5)的接觸是吻合的、密封的，從而確保擴增物不會倒流回固定盒部分(2)；采用三層上下交替的封閉隔(6)以確保擴增物不會倒流，而與單向流動的清洗液混合后被試紙條(13)所吸收；和其中外盒(15)構成一個全封閉的環境，并且在實驗過程中，一旦扣死，則不能再打開，從而防止盒內可能污染的物品因意外而外泄。
10.一種快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括使用權利要求4-9之一的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置檢測核酸序列擴增物。
11.一種防止核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的方法，其包括使用權利要求4-9之一的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置檢測核酸序列擴增物。
12.權利要求1-3之一的方法，其中所述封閉性裝置為權利要求4-9之一的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置。
13.權利要求1-3或10-12之一的快速檢測靶核酸擴增物的方法或權利要求4-9之一的全封閉靶核酸擴增物快速檢測裝置在傳染病病原體檢測、食品工業、農業、牧業、海關檢疫、基因突變檢測和DNA單核苷酸多態性(SNP)鑒定方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種防止靶核酸擴增物交叉污染，避免假陽性的快速檢測靶核酸擴增物的方法，其包括a)擴增反應完成后，不打開反應管的管蓋，以免靶核酸擴增產物外泄而造成污染；b)將未開蓋的反應管放入封閉性裝置，將靶核酸擴增物在物理性封閉的環境中由反應管轉移至檢測試紙條上；c)以肉眼可視的形式予以檢測，并判讀結果；和d)檢測后不打開所述封閉性裝置，將其整體廢棄于安全處本發明還涉及全封閉靶核酸擴增物的檢測裝置本發明還涉及了在全封閉的快速檢測裝置在傳染病病原體檢測食品工業農業牧業海關檢疫基因突變檢測和DNA鑒定方面的應用。
文檔編號G01N21/00GK1888902SQ200610109620
公開日2007年1月3日 申請日期2006年8月11日 優先權日2006年8月11日
發明者顧家永, 余慶豪, 尤其敏, 胡林 申請人:杭州優思達生物技術有限公司
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