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專利名稱：一種用于快速檢測大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米生物膜領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)的微生物分析需要針對性選擇培養(yǎng)基以富集樣品中的病原體數(shù)量，這樣從送樣到實驗室出結(jié)果需要4-8天，耗時較長，而微生物的繁殖往往在1-2天內(nèi)就可能形成爆發(fā)的態(tài)勢，因此急需可以顯著降低分析時間、減少使用成本及有效阻止或減少食源性疾病爆發(fā)的快速診斷檢測技術(shù)。目前，食源性疾病的快速診斷檢測技術(shù)主要是基于免疫學(xué)測定的橫向流格式(the lateral flow format)診斷，雖然快速，但需要的病源樣品量(0. Iml)檢測限較高，約為41og cfu/ml，同樣需要對病原體的數(shù)量進(jìn)行富集，因而耗時。電紡是將融化態(tài)的高聚物通過針頭在高電壓的靜電力作用下形成納米纖維收集在極性碟上，形成高表面積的纖維。電紡纖維目前多用于皮膚移植，骨骼支架，藥物傳送，及過濾材料和包裝材料等。目前，關(guān)于電紡纖維作為生物傳感器應(yīng)用的研究報道很少，盡管它的大比表面積、材料的牢固性非常適于做為傳感器的載體，固定較多的生物親和分子(如抗體)。典型的電紡纖維常用惰性材料如尼龍制備，它可以提供機(jī)械強(qiáng)度但不能傳遞生物分子相互反應(yīng)的信號，因此，需將惰性的電紡纖維用攜帶電荷的導(dǎo)電聚合物改性，形成可以固定抗體的導(dǎo)電聚合膜，微量的抗原與抗體反應(yīng)則導(dǎo)致支撐膜的電化學(xué)特性發(fā)生變化，其變化可用電化學(xué)方法測定，制備成病源樣品量少且快速的免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法。用本發(fā)明的納米生物膜可以在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測限在 10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種納米生物膜，該納米生物膜采用以下步驟制得(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/ L-0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% -4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。一種納米生物膜的制備方法，包括如下步驟(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/ L-0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% -4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。所述納米纖維膜的制備優(yōu)選為尼龍6甲酸溶液的質(zhì)量濃度為16%-24%，裝入注射器，控制溶液在18kv的高壓下以0. lmL/h的流速噴出，溶液在高壓靜電作用下甲酸揮發(fā)， 尼龍6形成納米纖維附著在鋁碟成膜。所用設(shè)備是購買的現(xiàn)有設(shè)備，如永清華源生物材料科技有限公司的型號為SS-I型的靜電紡絲設(shè)備。所述納米纖維膜中的納米纖維的平均直徑為94. llnm-209. 49nm。另外，本發(fā)明還提供了所述納米生物膜在快速檢測大腸桿菌方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢是本發(fā)明的納米生物膜可以用于快速檢測大腸桿菌的存在，操作簡單，檢測耗時短， 可在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測限在10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說明。實施例1 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為20%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 40mol/L苯胺鹽酸溶液40°C反應(yīng)90min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合60min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，室溫干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以3% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)30mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬用電表連接，組成簡單的傳感器。將培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)1天的大腸桿菌hcherichia coli K-12稀釋至濃度為10CFU/mL，先用萬用電表測定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加IOyL 稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置20min，再測定納米生物膜的電阻，此時電阻約降低至原生物膜電阻的20%。實施例2 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 35mol/L苯胺鹽酸溶液38°C反應(yīng)85min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合45min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，室溫干燥得到聚苯胺_尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)15mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬用電表連接，組成簡單的傳感器。將培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)1天的大腸桿菌hcherichia coli K-12稀釋至濃度為104CFU/mL，先用萬用電表測定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加20 μ L 稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置lOmin，再測定納米生物膜的電阻，此時電阻約降低至原生物膜電阻的90%。實施例3 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液43°C反應(yīng)95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，室溫干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬用電表連接，組成簡單的傳感器。將生菜葉用蒸餾水?dāng)嚢枨逑矗匆河么判粤Ｗ痈患竽c桿菌，先用萬用電表測定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加20 μ L稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置lOmin，再測定納米生物膜的電阻，如果洗液含有大腸桿菌， 電阻降低至原生物膜電阻的10-90% ；如果不含，則電阻基本保持不變；如果含假單胞菌 Pseudomonas，則電阻升高。
權(quán)利要求
1.一種納米生物膜，其特征是，該納米生物膜采用以下步驟制得(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/L-0. 45mol/L 苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，干燥得到聚苯胺_尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2%-4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米生物膜，其特征是，所述納米纖維膜的制備為將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液裝入注射器，控制溶液在18kv的高壓下以0. lmL/h的流速噴出，溶液在高壓靜電作用下甲酸揮發(fā)，尼龍6形成納米纖維附著在鋁碟成膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述納米生物膜，其特征是，所述納米纖維膜中的納米纖維的平均直徑為 94. llnm-209. 49nm。
4.一種納米生物膜的制備方法，其特征是，包括如下步驟(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/L-0. 45mol/L 苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2%-4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1-3之一所述納米生物膜在快速檢測大腸桿菌方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于快速檢測大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法，該納米生物膜的制備包括納米纖維膜的制備、聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成和抗體的標(biāo)記。用本發(fā)明納米生物膜可以在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測限在10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。
文檔編號G01N33/569GK102520170SQ20111039680
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者易翠平 申請人:長沙理工大學(xué)