專利名稱：使用hplc定量測定具體組成肝素或低分子量肝素的方法
技術領域：
本發明的實施方案為檢測分級分離的肝素或未分級分離的肝素的樣品中具有1-6脫水結構或乙酰化糖類的成分或對其進行定量的方法。
肝素為糖胺聚糖族的生物活性劑，提取自天然來源并且具有抗凝和抗血栓形成特性。它們特別用于治療術后靜脈血栓形成。
為了從肝素源中產生低分子量肝素(LMWH)，必須將較長的肝素多糖鏈打斷成較短的低分子量鏈。這一過程可以通過化學或酶的解聚來進行。結果可以為約5,000Da的LMWH多糖鏈的平均分子量。LMWHs，如未分級分離的肝素通過結合沿多糖鏈中的某些分布的特定戊多糖序列上的ATIII來抑制凝固。
每個經批準的產品的LMWH制造商均使用不同的解聚方法。除非兩個制造商使用相同的方法，否則這種方法的差別產生具有不同化學結構的LMWHs和由此的不同藥理學活性和不同的經批準的臨床應用適應征。所得的LMWHs因用于其制備的解聚方法的不同而在結構上存在差異(R.J.Linhardt等，Seminars in Thombosis and Hemostatis1999；25(3 Supp.)5-16)。結果是LMWHs比肝素更具有不均勻性。每種不同的方法對多糖鏈產生了獨特和高度復雜的結構修飾。這些修飾包括鏈長和鏈序列以及結構指紋的差異。因此，不同的LMWHs可能具有不同的藥理學特性和不同的經批準的臨床適應征。
依諾肝素鈉購自Aventis并且在美國以依諾肝素鈉注射劑形式銷售，商標為Lovenox(在某些其它國家中為Clexane)。一般來說，通過對來源于豬腸粘膜的肝素芐基酯進行強堿降解獲得依諾肝素鈉。例如，其結構的特征在于該鏈非還原端上的2-O-磺基-4-烯吡喃糖基糖醛酸基和還原端上的2-N，6-O-二磺基-D-葡糖胺。平均分子量約為4500道爾頓。分子量分布為＜2000道爾頓 ≤20％2000-8000道爾頓≥68％＞8000道爾頓 ≤18％
在制備依諾肝素鈉的過程中，存在葡糖胺的6-O-脫硫酸鹽，導致形成稱作“1，6脫水”的衍生物(國際專利申請WO 01/29055)，如下所示 這種類型的衍生物僅對末端葡糖胺為6-O-硫酸化的寡糖鏈獲得。
末端被1，6-脫水鍵修飾的寡糖鏈的百分比為依諾肝素鈉的寡糖混合物的結構特征，并且應能夠測定它。基于現有的知識，依諾肝素鈉中15％-25％的成分在其鏈的還原端上帶有1，6-脫水結構。
本發明的一個實施方案由此提供了用于分析未分級分離的肝素和分級分離的肝素的方法。本文所用的“分級分離的肝素”指的是任意進行解聚的肝素，例如低分子量肝素(LMWH)，包括依諾肝素鈉和正在依據引證Lovenox/Clexane(依諾肝素鈉注射劑)作為列舉藥物的申請尋求管理機構批準的任意LMWH。
在一個實施方案中，本發明的分析方法如下通過肝素酶的作用使檢測的樣品解聚，如果合適，然后還原獲得的解聚物，且然后通過高效液相色譜法進行分析。
如上所述方法由此的特征在于分析解聚物以便檢測末端被1，6-脫水鍵(“1，6-脫水基”)修飾的寡糖鏈的存在。
在相關的實施方案中，首先使用肝素酶，例如肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)，例如使用各自以0.5個單位/ml存在的肝素酶的混合物使檢測的樣品完全解聚。(這些酶由Grampian Enzymes集團銷售)。
本發明的主題由此為用于分析未分級分離的肝素或分級分離的肝素的方法，包括下列步驟(a)通過肝素酶的作用使樣品解聚；(b)如果合適，還原解聚物；(c)通過高效液相色譜法分析步驟(a)或(b)的樣品。
在一個實施方案中，本發明的主題為如上所述方法，其中肝素酶為肝素酶1(EC 4.2.2.7.)，肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物形式。
然后處理由此制備的解聚物以便減少非1，6-脫水形式的還原端(專利申請WO01/72762中所述產品)。在一個實施方案中，用在乙酸鈉中的NaBH4溶液處理解聚物以便減少非1，6-脫水形式的還原端。最終，為了能夠對下述的二糖類1和2進行定量，可以通過還原劑，諸如，NaBH4的作用還原使用肝素酶解聚的低分子量肝素的樣品。
本發明的主題由此為如上所述方法，其中隨后還原解聚的肝素。
本發明的主題還在于如上所述方法，其中所述還原劑為NaBH4。還可以使用其它硼氫化物的堿金屬鹽，諸如鋰或鉀鹽。
本發明的檢測方法能夠清楚地區分依諾肝素鈉與其它不含“1，6-脫水”衍生物的低分子量肝素。相反，本發明的方法能夠確定低分子量肝素不具有依諾肝素鈉的物理化學特征并且由此在性質上不同。
例如，本發明的方法應用于樣品的工序間控制過程中的工業化方法中，以便提供制備依諾肝素鈉的標準化方法并且獲得均勻批量。
在酶解聚和可選的還原端還原后，依諾肝素鈉的1，6-脫水衍生物以4種主要形式存在，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1。
本發明的主題由此還在于如上所述方法，其中在解聚反應過程中獲得的1，6-脫水殘基包括如下部分 二糖 1二糖 2 二糖 3 四糖 1末端二糖單元上含有1，6-脫水端并且在所述末端二糖的糖醛酸上不帶有2-O-硫酸鹽的寡糖類或多糖類被肝素酶完全解聚并且為二糖1和2的形式。另一方面，當末端糖在糖醛酸上含有2-O-硫酸鹽并且當它為甘露糖胺形式時，1，6-脫水衍生物為四糖1形式(耐肝素酶的形式)。
三糖1(參見下文)也可以存在于混合物中。它來源于另一個產生如下結構的降解過程(在依諾肝素鈉的化學解聚過程中觀察到的剝離現象)。
三糖 1混合物中的其它成分并非是依諾肝素鈉的惟一特征。當然存在肝素鏈的8種基本二糖類。這8種基本二糖類特別由Sigma公司銷售。
通過本發明的方法鑒定混合物中的其它二糖類二糖ΔIISgal和ΔIVSgal，它們具有作為其來源的-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的堿2-O-脫硫酸化物，從而形成2半乳糖醛酸。它們通常并不存在于肝素的原始結構中(U.M.Desai等，Arch.Biochem.Biophys.，306(2)461-468(1993))。
含有3-O-硫酸化葡糖胺類的寡糖類耐肝素酶裂解并且保持以四糖類的形式存在。
就大部分低分子量肝而言，肝素提取自豬粘膜并且這些主要的四糖類以如下形式為代表。
這些四糖類耐酶解聚并且反映出對抗凝血酶III具有親合性的序列。如下標記這些四糖類ΔIIa-IIsglu和ΔIIa-IVsglu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，J.Biol.
Chem.；270(7)，4780-4787(1993))。
使用肝素酶裂解的混合物中的最終成分為葡糖絲氨酸末端ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.Sugahara等，J.Biol.Chem.；270(39)，22914-22923(1995)；K.Sugahara等；J.Biol.Chem.；267(3)，1528-1533(1992))。后者一般幾乎不存在于依諾肝素鈉中(參見實施例5中的NMR)。
本發明在另一個方面中提供了檢測1，6-脫水基團的方法。在一個實施方案中，所述方法包括分離解聚后獲得的各種寡糖類并且可選地用還原劑，諸如NaBH4處理。
可以通過HPLC(高效液相色譜法)對本發明的各種寡糖類進行分離。在一個實施方案中，HPLC為陰離子交換色譜法。在相關的實施方案中，陰離子交換色譜法為強陰離子交換色譜法(SAX)。
本文所用的術語“強陰離子交換色譜法”(SAX)包括在約pH 2-12范圍內維持恒定的凈正電荷的任意樹脂上進行的陰離子交換色譜法。在本發明的某些實施方案中，強陰離子交換色譜法使用應用季銨交換基團官能化的固相支持物。例如，可以使用具有約5um顆粒大小的柱，諸如SpherisorbSAX(Waters Corp，Milford MA)，可以使用約25cm的柱長和約1mm-約4.6mm的柱直徑。
所用的設備可以為能夠形成洗脫梯度并且安裝了適合于選擇性檢測乙酰化糖類的合適的UV檢測器的任意色譜儀。在本發明的一個實施方案中，所述UV檢測器為二極管陣列，它能夠產生所述成分的UV光譜并且能夠產生因所記錄的2個不同波長處的吸收度之間的差異而產生的復雜信號。這類二極管陣列檢測器能夠進行乙酰化寡糖類的特異性檢測。在相關的實施方案中，使用可透過達200nm的UV區的HPLC流動相。在該實施方案中，不使用基于NaCl的常用流動相，它們存在需要被動色譜儀以抵抗氯化物的腐蝕能力的額外缺陷。可以按照本發明該實施方案使用的流動相包括，但不限于基于高氯酸鈉、甲磺酸鹽或磷酸鹽的流動相。在一個實施方案中，流動相為甲磺酸銨的水溶液。
本發明的主題由此還在于如上所述通過陰離子交換色譜法進行的分析方法，其中使用可透過約200nM-約400nM的UV區的流動相。
在某些實施方案中，在約2.0-約6.5的pH下進行強陰離子交換色譜分離。在相關實施方案中，使用約3左右的pH。例如，可以通過向在pH＝3下具有緩沖能力的流動相中添加鹽來控制pH。在本發明的某些實施方案中，使用在pH 3具有大于高氯酸鹽的緩沖容量的鹽，諸如磷酸鹽。典型的色譜分離條件如下所示流動相溶劑ANaH2PO4，2.5mM，通過添加H3PO4達到pH 2.9溶劑B在1N NaH2PO4中的NaClO4，2.5mM，通過添加H3PO4達到pH 3.0洗脫梯度可以如下T＝0分鐘％B＝3；T＝40分鐘％B＝60＝T＝60分鐘％B＝80按照使用的柱選擇合適的溫度，例如約40℃-約50℃，和泵流速。
通過SAX色譜法純化樣品的其它方法為本領域技術人員所公知。例如，SAX法描述在下列文獻中K.G.Rice和R.J.Linhardt，Carbohydrate Research 190，219-233(1989)；A.Larnkjaer等，Carbohydrate Research，266，37-52(1995)；和專利WO 90/01501(實施例2)。將這些參考文獻的全部內容引入本文作為參考。
本發明的另一個方面為檢測未分級分離的肝素或分級分離的肝素中發現的具體基團的方法。
在一個實施方案中，該方法增加了肝素或LMWH基團的UV檢測的特異性。當未乙酰化多糖類在指定pH下均具有相當類似的UV光譜時，能夠通過取在所選的2個波長處吸收度之間的差異作為信號，以便抵消未乙酰化糖類的吸收性選擇性檢測乙酰化糖類。
正如下文通過實施例解釋的，可以將202nm和230nm選作檢測和參比波長并且可以記錄202-230nm的信號。本領域技術人員可以理解可以按照本發明使用的波長的選擇取決于流動相的pH(調整幾個nm可能是必不可少的，以便處于最佳pH下)。
在本發明中可以使用可以同時在兩個或多個波長處測定吸收度的任意UV檢測器。在本發明的一個實施方案中，使用來自AgilentTechnologies公司的DAD 1100檢測器。在該實施方案中，一方面在234nm處，而另一方面在202-230nm處進行雙重檢測。附
圖1中解釋了乙酰化寡糖類的選擇性檢測原理，其中將硫酸化二糖ΔIs的UV光譜與乙酰化二糖ΔIa的UV光譜進行比較。
本發明的主題由此還在于如上所述分析方法，其中該檢測方法能夠選擇性檢測乙酰化糖類。
在某些實施方案中，所述分析方法使用了通過SAX色譜法進行分離的方法并且通過測定所選的兩個波長處的吸收度之差，以便抵消未乙酰化糖類的吸收性來選擇性檢測乙酰化糖類。
上述4個1，6-脫水殘基的定量要求色譜系統在涉及混合物中所有其它成分時的足夠選擇性。然而，就ΔIIa而言，難以拆分一般共同洗脫的兩種二糖1和2，尤其是當后者以其兩種α和β異頭物的形式存在時。
易于驗證對兩種二糖1和2的鑒定，因為它們在室溫下在通過添加NaOH達到pH 13的ΔIIs的水溶液中和幾小時內形成。然而，如果使用雙重檢測，那么易于鑒定乙酰化寡糖ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
一方面，峰分裂的原因為異頭物形式，并且在較低程度上，就ΔIIs、ΔIIIs和ΔIs而言并非存在葡糖胺甘露糖胺差向異構化，此時，它們位于寡糖鏈的末端位置上。
在本發明的某些實施方案中，通過經NaBH4的作用還原預先用肝素酶解聚的低分子量肝素樣品對二糖1和2進行定量。
α異頭物+β異頭物這種還原具有通過使末端寡糖環開放消除αβ正位異構的優點。因為消除了正位異構，所以獲得的色譜圖更為簡單。此外，ΔIIa的還原減少了其在柱上的保留并且易于檢測二糖1和2。
附圖2和3中所述色譜圖的實例清楚地解釋了這些現象和該方法的優點。
附圖簡述附圖1解釋了乙酰化寡糖類的選擇性檢測，其中將硫酸化二糖ΔIs的UV光譜與乙酰化二糖ΔIa的UV光譜進行比較，其中x-軸代表波長(nm)，而y-軸代表吸收度(mAmps)。
附圖2表示使用NaBH4還原前后用肝素酶解聚的依諾肝素的色譜分離(細黑的信號在234nm處的UV；粗黑的信號在202-234nm處的UV at)，其中x-軸為洗脫時間(分鐘)，而y-軸代表吸收度(mAmps)。
附圖3表示使用NaBH4還原前后用肝素酶解聚的肝素的色譜分離(細黑的信號在234nm處的UV；粗黑的信號在202-234nm處的UV at)，其中x-軸為洗脫時間(分鐘)，而y-軸代表吸收度(mAmps)。
實施例實施例用于解釋本發明的各種特征。本領域技術人員可以理解本發明并不限于如下典型的實施方案。
實施例1酶解聚的一般性描述下面是對如何進行酶解聚的一般性描述并且可以用于本發明。
在室溫下通過下列步驟將酶解聚進行48小時將含有所檢測的20mg/ml依諾肝素鈉的50ul溶液、在pH 7.0下的含有2mM乙酸鈣和1mg/ml BSA的200ul 100mM乙酸/NaOH溶液與50ul 3種肝素酶的儲備溶液混合。將肝素酶貯存在-30℃下。肝素酶為緩沖溶液形式并且每種肝素酶的滴度為0.5IU/ml(該緩沖溶液的組成濃度為0.01mol/l并且補充了2mg/ml牛血清清蛋白(BSA)的pH 7的KH2PO4水溶液)。
通過添加使用前即刻制備的10ul在100mM乙酸鈉中的30g/lNaBH4溶液對使用肝素酶解聚的60ul產品進行還原。
實施例2按照實施例1的一般性描述獲得的二糖3的NMR在D2O中的質子光譜，400MHz，T＝298K，以ppm計的δ3.34(1H，dd，J＝7和2Hz，H2)，3.72(1H，t，J＝8Hz，H6)，3.90(1H，m，H3)，4.03(1H，s，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.23(1H，t，J＝5Hz，H3′)，4.58(1H，m，H2′)，4.78(1H，m，H5)，5.50(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1′)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4′)]。
實施例3按照實施例1的一般性描述獲得的四糖1的NMR在D2O中的質子光譜，400MHz，T＝298K，以ppm計的δ3.15(1H，s，H2)，3.25(1H，m，H2″)，3.60(1H，m，H3″)，3.70-4.70(14H，未拆分的復合物，H3/H4/H6，H2′/H3′/H4′/H5′，H4″/H5″/H6″，H2/H3)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1′和H1″)，5.45(1H，m，H1)，5.56(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)實施例4按照實施例1的一般性描述獲得的三糖1的NMR
在D2O中的光譜，600MHz，T＝298K，(以ppm計的δ)3.28(1H，m)，3.61(1H，t，7Hz)，3.79(1H，t，7Hz)，3.95(1H，d，6Hz)，4.00(1H，s)，4.20(1H，m)，4.28(2H，m)，4.32(1H，d，4Hz)，4.41(1H，s)，4.58(1H，s)，4.61(1H，s)，4.90(1H，寬峰s)，5.24(1H，s)，5.45(1H，s)，5.95(1H，s)。
實施例5按照本發明獲得的ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser的NMR。
在D2O中的光譜，500MHz(以ppm計的)3.30(1H，t，7Hz)，3.34(1H，t，8Hz)，3.55(1H，t，7Hz)，3.60(1H，t，7Hz)，3.63-3.85(10H，m)，3.91(2H，m)，3.96(1H，dd，7和2Hz)，4.02-4.10(3H，m)，4.12(1H，d，2Hz)，4.18(1H，m)，4.40(1H，d，6Hz)，4.46(1H，d，6Hz)，4.61(1H，d，6Hz)，5.29(1H，d，3Hz)，5.85(1H，d，3Hz)。
實施例6定量的原理通過標準化面積的百分比方法測定使用還原的溶液獲得的色譜法中1，6-脫水物的含量。
將不飽和糖醛酸的摩爾吸收系數定為恒定值并且由此多糖的響應因子與其分子量成正比。
在本發明的方法中，獲得了廣泛可接受的推定，即包含在混合物中的所有不飽和的寡糖類均具有相同的摩爾吸收度，等于5500mol-1.cm-1。
將兩種共同洗脫的1，6-脫水殘基，即二糖1和2彼此進行積分。
因此，能夠測定起始未分級分離的肝素或分級分離的肝素中解聚混合物的所有成分的重量百分比，例如，諸如1，6-脫水衍生物或乙酰化糖衍生物這類成分。就相當于峰7、8、13和19的4種1，6-脫水衍生物，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1而言，獲得了如下的重量百分比
面積8、面積13和面積19相當于峰7、8、13和19各自的面積。這4種化合物各自的摩爾質量分別為443、443、545和1210。∑MwX·面積x相當于色譜圖中每個峰的面積與相應產物的摩爾質量之比。
如果Mw為所研究的低分子量肝素的平均質量，那么按照下列方式獲得以1，6-脫水環終止的寡糖鏈的百分比 類似地，可以測定選自未分級分離的肝素和分級分離的肝素的物質樣品中其它成分的重量百分比。
確切分子量由色譜圖上所有鑒定的峰決定(參見表1)
表1
下面是相當于附圖2和3峰編號的糖類的名稱1ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser24-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡糖基鈉鹽3ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-CH2-COOH44-脫氧-[α]-L-蘇型-己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃葡糖二鈉鹽
54-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖基鈉鹽64-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基二鈉鹽74-脫氧-[α]-L-蘇型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-p-D-吡喃葡糖二鈉鹽(二糖1)84-脫氧-α-L-蘇型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖二鈉鹽(二糖2)94-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-a-D-吡喃葡糖基二鈉鹽104-脫氧-α-L-蘇型-己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-吡喃葡糖三鈉鹽114-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基三鈉鹽124-脫氧-2-O-磺基-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1o4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖基三鈉鹽134-脫氧-2-O-磺基-[α]-L-蘇型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1-4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-p-D-吡喃葡糖三鈉鹽(二糖3)144-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(144)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基三鈉鹽154-脫氧-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)五鈉鹽164-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基四鈉鹽174-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基)六鈉鹽184-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六鈉鹽194-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖，六鈉鹽(四糖1)204-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇鈉鹽214-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-p-D-葡糖醇二鈉鹽224-脫氧-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-a-D-葡糖醇二鈉鹽234-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-葡糖醇二鈉鹽244-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇二鈉鹽254-脫氧-α-L-蘇型-己烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-葡糖醇三鈉鹽264-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三鈉鹽274-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-葡糖醇三鈉鹽28-4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-葡糖醇三鈉鹽294-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-[α]-D-葡糖醇)五鈉鹽304-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三鈉鹽314-脫氧-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基-糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-[α]-D-葡糖醇)六鈉鹽324-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六鈉鹽(使用NaBH4還原的形式)。
使用的縮寫IdoAα-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸；GIcAβ-D-吡喃葡糖基糖醛酸；ΔGlcA4，5-不飽和酸4-脫氧-[α]-L-蘇型-己烯吡喃糖基糖醛酸；GalD-半乳糖；Xyl木糖；GIcNAc2-脫氧-2-乙酰氨基-[α]-D-吡喃葡糖；GIcNS2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖；2S2-O-硫酸鹽；3S3-O-硫酸鹽；6S6-O-硫酸鹽。
不脫離本發明實質或幾本屬性的其它具體形式可以包括在本發明中。
權利要求
1.用于對選自未分級分離的肝素和分級分離的肝素的物質樣品中成分的量進行定量的方法，包括(a)通過酶方法使所述樣品解聚；和(b)通過高效液相色譜法檢測步驟(a)的解聚樣品中的成分的量。
2.如權利要求1中所述方法，其中使用至少一種肝素酶進行所述酶方法。
3.如權利要求1中所述方法，其中使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物進行所述酶方法。
4.如權利要求1中所述方法，其中所述分級分離的肝素為依諾肝素鈉。
5.如權利要求1中所述方法，其中步驟(b)中使用的高效液相色譜法為陰離子交換色譜法。
6.如權利要求1中所述方法，其中步驟(b)中使用的高效液相色譜法為強陰離子交換色譜法(SAX)。
7.如權利要求6中所述方法，其中使用SpherisorbSAX柱進行所述強陰離子交換色譜法。
8.如權利要求1中所述方法，其中在可透過具有約200nm-約400nm波長的UV光的流動相中進行高效液相色譜法。
9.如權利要求1中所述方法，其中在流動相中進行高效液相色譜法，所述流動相包括至少一種選自高氯酸鈉、甲磺酸鹽和磷酸鹽的鹽。
10.如權利要求1中所述方法，其中在包括高氯酸鈉鹽的流動相中進行高效液相色譜法。
11.如權利要求6中所述方法，其中在約2.0-約6.5的pH下進行所述強陰離子交換色譜法。
12.如權利要求6中所述方法，其中在約3的pH下進行所述強陰離子交換色譜法。
13.如權利要求1中所述方法，其中所述流動相包括維持在約pH3.0下的高氯酸鈉溶液。
14.如權利要求1中所述方法，其中解聚的樣品包括至少一種選自如下的寡糖鏈
15.如權利要求1中所述方法，其中解聚的樣品包括至少一種寡糖鏈，其末端被1，6-脫水鍵修飾。
16.如權利要求15中所述方法，其中至少一種寡糖鏈選自如下
17.如權利要求4中所述方法，其中解聚的樣品包括至少一種選自如下任一種的1，6-脫水殘基
18.如權利要求17中所述方法，其中至少一種1，6-脫水殘基在15％-25％樣品的重均分子量的范圍。
19.如權利要求1中所述方法，其中在步驟(b)的解聚樣品中檢測的成分為乙酰化糖類。
20.如權利要求19中所述方法，其中通過從在乙酰化，而不是非乙酰化糖吸收的波長處測定的吸收度中扣除在既包括乙酰化，又包括非乙酰化糖類吸收的波長處測定的吸收度來選擇性檢測乙酰化糖類。
21.如權利要求19中所述方法，其中所檢測的乙酰化糖類選自乙酰化寡糖類ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
22.依諾肝素鈉樣品中的1，6-脫水殘基的定量方法，包括(a)使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物使所述樣品解聚；和(b)通過高效液相色譜法檢測步驟(a)的解聚樣品中1，6-脫水殘基的量。
23.如權利要求22中所述方法，其中1，6-脫水殘基的量占樣品平均寡糖分子量的15％-25％。
24.用于對選自未分級分離的肝素和分級分離的肝素的物質樣品中成分的定量方法，包括(a)通過酶方法使所述樣品解聚；和(b)還原步驟(a)的解聚樣品；(c)通過高效液相色譜法檢測(b)的還原樣品中成分的量。
25.如權利要求24中所述方法，其中使用至少一種肝素酶進行所述酶方法。
26.如權利要求24中所述方法，其中使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物進行所述酶方法。
27.如權利要求24中所述方法，其中通過接觸還原劑對步驟(a)的解聚樣品進行還原。
28.如權利要求27中所述方法，其中所述還原劑為NaBH4或硼氫化物陰離子的堿金屬鹽。
29.如權利要求24中所述方法，其中分級分離的肝素為依諾肝素鈉。
30.如權利要求27中所述方法，其中所述還原步驟還原了非1，6-脫水形式的依諾肝素鈉的還原末端。
31.如權利要求24中所述方法，其中步驟(c)中使用的高效液相色譜法為陰離子交換色譜法。
32.如權利要求24中所述方法，其中步驟(c)中使用的高效液相色譜法為強陰離子交換色譜法(SAX)。
33.如權利要求32中所述方法，其中使用SpherisorbSAX柱進行強陰離子交換色譜法。
34.如權利要求24中所述方法，其中在可透過具有約200nm-約400nm波長的UV光的流動相中進行高效液相色譜法。
35.如權利要求24中所述方法，其中在包括選自高氯酸鈉、甲磺酸鹽和磷酸鹽的至少一種鹽的流動相中進行高效液相色譜法。
36.如權利要求24中所述方法，其中在包括高氯酸鈉鹽的流動相中進行高效液相色譜法。
37.如權利要求32中所述方法，其中在約2.0-約6.5的pH下進行強陰離子交換色譜法。
38.如權利要求32中所述方法，其中在約3的pH下進行強陰離子交換色譜法。
39.如權利要求24中所述方法，其中所述高效液相色譜法使用了包括維持在約pH 3.0下的高氯酸鈉溶液的流動相。
40.如權利要求28中所述方法，其中所述解聚樣品包括至少一種選自如下任一種的寡糖鏈 ；其中該寡糖鏈為其還原形式。
41.如權利要求24中所述方法，其中所述解聚樣品包括至少一種末端被1，6-脫水鍵修飾的寡糖鏈。
42.如權利要求41中所述方法，其中所述至少一種寡糖鏈選自如下的任一種
43.如權利要求29中所述方法，其中所述解聚樣品包括1，6-脫水殘基的混合物，所述1，6-脫水殘基包括
44.如權利要求43中所述方法，其中1，6-脫水殘基的混合物占樣品重均分子量的15％-25％。
45.如權利要求24中所述方法，其中步驟(b)的解聚樣品中檢測的成分為乙酰化糖類。
46.如權利要求45中所述方法，其中通過從在乙酰化，而不是非乙酰化糖吸收的波長處測定的吸收度中扣除在既包括乙酰化，又包括非乙酰化糖類吸收的波長處測定的吸收度來選擇性檢測所述糖類。
47.如權利要求45中所述方法，其中所檢測的乙酰化糖類選自乙酰化寡糖類ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
48.依諾肝素鈉樣品中的1，6-脫水殘基的定量方法，包括(a)使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物使所述樣品解聚；(b)還原步驟(a)的解聚樣品；和(c)通過高效液相色譜法檢測步驟(b)的還原樣品中1，6-脫水殘基的量。
49.如權利要求48中所述方法，其中1，6-脫水殘基的量占樣品重均分子量的15％-25％。
全文摘要
分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于通過肝素酶的作用使檢測的樣品解聚，且然后如果合適，還原獲得的解聚物且然后通過高效液相色譜法進行分析。
文檔編號G01N30/00GK1934135SQ200580009444
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月22日 優先權日2004年3月24日
發明者P·穆里耶, C·維斯科夫 申請人:艾文蒂斯藥品公司
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