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專利名稱：一種快速檢測食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測食品中藥物殘留的方法，具體地說是涉及一種檢測氟喹諾酮類藥物殘留的方法。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類(FLuoroquinolones，F(xiàn)Qs)為一族人工合成的抗生素，目前被廣泛用于動物和人類的多種感染性疾病的治療，恩諾沙星(Enrofloxacin)即為其中常用的一種。由于FQs殘留除了其毒副作用對人體直接危害外，更為嚴(yán)重的是動物性食品中殘留的較低濃度藥物容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于該類藥物對人類疾病的治療。因此，隨著FQs在養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，其殘留問題已經(jīng)成為目前食品安全問題的典型性表現(xiàn)形式之一，并引起國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。
目前，國外對氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，主要包括微生物法、免疫分析法、液相色譜法及液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法。國內(nèi)的相關(guān)報(bào)道較少，主要以液相色譜法為主，在大量樣品的快速篩檢和現(xiàn)場檢測技術(shù)方面仍屬空白。
1.微生物法微生物法是一種抗菌藥物殘留檢測的快速篩選方法，其缺點(diǎn)是不易篩選到特別敏感的菌株，方法常受到其他抗菌藥物的影響，同時(shí)微生物法不能很好的鑒別同類物質(zhì)中的不同成分，多數(shù)分析周期長，一般不易于短期內(nèi)取得結(jié)果。Okerman等(1998)報(bào)道了用改進(jìn)的歐洲四平皿法(Four-plate Test，F(xiàn)PT)檢測市場上零售肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留，四平皿法雖能檢測高濃度氟喹諾酮類藥物的殘留，但該法的檢測限高于EC所規(guī)定的MRL。
2.液相色譜法(LC法)高效液相色譜法(HPLC)是目前最為常用的色譜方法，目前國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中基本采用該方法為檢測氟喹諾酮類藥物殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法。如Jeffery等(1994)報(bào)道了用HPLC法測定沙拉沙星在海峽鲇魚肌肉中的殘留。Roybsl(1997)報(bào)道了牛奶中沙拉沙星、雙氟沙星、恩諾沙星與環(huán)丙沙星的HPLC檢測法。其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高，檢測限大多低于10ppb，精確度較高(回收率一般大于70％)，穩(wěn)定性也比較好，但該法的前處理較為繁瑣，而且所需的儀器昂貴，對于操作人員的專業(yè)技術(shù)要求也較高，不適用于大量樣品的快速分析和現(xiàn)場檢測。
3.液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS法)LC-MS法是新興的大型儀器檢測方法，其主要特點(diǎn)是檢測靈敏度高，能對微量獸藥殘留組分進(jìn)行檢測，同時(shí)能對獸藥殘留組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。如Turnipseed等(1998)報(bào)道了戳魚肌肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星和雙氟沙星多殘留確證的LC-MS檢測。但該法所需儀器設(shè)備非常昂貴，步驟煩瑣，操作人員要求具有較高技能，一般僅用于殘留的確認(rèn)性檢測。
4.免疫分析方法目前用于氟喹諾酮類藥殘檢測的免疫分析手段主要是酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)。它具有高度的專一性和靈敏度，但是也存在一些缺陷，主要表現(xiàn)為分析程序較為煩瑣，對操作人員專業(yè)技能要求較高；所需設(shè)備集成化程度低，難以實(shí)現(xiàn)小型化和便攜化；大多需要在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，難以進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述方法存在的問題，本發(fā)明提出了一種利用壓電免疫技術(shù)對食品中不同的氟喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測的方法。
本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟(1)首先利用生物免疫技術(shù)，以牛血清蛋白為載體蛋白，結(jié)合氟喹諾酮類藥物偶連形成完全抗原，來制備相應(yīng)的特異性抗體；(2)以制備的特異性抗體為生物敏感材料，將其固定在壓電晶體表面，形成生物識別元件，并測定其基礎(chǔ)頻率F0；(3)配置系列濃度的待測氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將生物識別元件浸入其中充分反應(yīng)后，測定其反應(yīng)后的頻率F1，并求取反應(yīng)前后的頻率差ΔF＝F1-F0；(4)根據(jù)反應(yīng)前后頻率差ΔF與待測成分含量的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)使生物識別元件與未知樣提取液充分反應(yīng)，得到反應(yīng)前后頻率差ΔF；(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到未知樣中被測氟喹諾酮類藥物的含量。
為了增強(qiáng)步驟(2)中形成的生物識別元件對于大分子蛋白的結(jié)合能力，在制備前利用蛋白A對壓電晶體進(jìn)行衍生活化。
本方法中所述的生物識別元件是可以重復(fù)使用的，再生的方法是分別用堿和酸浸泡并用雙蒸水洗滌。
與其它測定方法相比較，本方明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)石英壓電晶體諧振器被稱為“微天平”，適宜條件下可以對于10μg/kg以下的目標(biāo)成分產(chǎn)生明顯的頻率變化，同時(shí)它保留了免疫分析所特有的特異性，因此具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以滿足痕量殘留的檢測要求；(2)有效縮短了分析時(shí)間，操作更為簡便快速，同時(shí)降低了測定過程對于實(shí)驗(yàn)室條件以及操作人員專業(yè)技能的依賴性；(3)由于識別元件可重復(fù)使用，分析成本可有效降低；(4)檢測設(shè)施及操作過程的集成化程度較高，便于攜帶組裝，能夠適用于不同場所，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場分析或在線檢測，尤其適合現(xiàn)場大量樣品的快速篩選處理。
(5)儀器平臺為通用型，通過生物識別元件的調(diào)整和更換，可應(yīng)用于多種氟喹諾酮類藥殘的分析檢測。


圖1是本發(fā)明用于檢測恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2是本發(fā)明用于檢測諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3是HPLC檢測恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4是HPLC檢測諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1～2豬肉中恩諾沙星和諾氟沙星殘留的快速檢測1、抗體的制備首先配制磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4，簡稱PBS)取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO42.0g，加雙蒸水至1000mL，過0.22μm膜，室溫保存。
取3mg恩諾沙星或諾氟沙星，10mg N-羥基琥珀酰胺，10mg 1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺，依次加入到1.5mL溶有6mg牛血清白蛋白并含有33％DMF(v/v)的PBS中，在室溫下振蕩過夜，然后將反應(yīng)物用PBS透析后，冷凍干燥，產(chǎn)物即為完全抗原，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 將1mg完全抗原與1.0mL生理鹽水和1.0mL福氏完全佐劑混合后對新西蘭兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，14天后第二次免疫，劑量與方法同第一次，福氏完全佐劑換成福氏不完全佐劑，以后每隔2周進(jìn)行一次免疫。第四次免疫，用純?nèi)斯た乖苯幼⑸涠夓o脈。7天后心臟取血，離心取血清，冷凍干燥后即得到所需要的多克隆抗體，-80℃貯存?zhèn)溆谩?br> 2、生物識別元件的制備取基頻10MHz的兩面鍍金電極的壓電晶體，在10mg/ml 3，3-二硫代丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(簡稱DTSP)的二甲亞砜(簡稱DMSO)溶液中活化反應(yīng)2小時(shí)，取出，用DMSO和雙蒸水分別洗滌晶體片2-3次，干燥后備用。以PBS配置蛋白A溶液(2mg/ml)，取50μl均勻涂抹于晶體片表面，4℃下衍生反應(yīng)2小時(shí)，最后將2mg/ml的抗體(PBS溶解)涂抹于晶體表面，4℃下過夜反應(yīng)，PBS洗滌2-3次后置于4℃下自然干燥，儲存?zhèn)溆谩?br> 3、食品樣品的預(yù)處理稱取5g樣品置于50ml離心管中，加入適量的無水硫酸鈉(一般約1-4g，可根據(jù)樣本含水量情況自行調(diào)整)，反復(fù)振搖以盡量脫除其中水分，再加入30ml乙腈，勻漿，離心(5000r，5min)，將上清液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入10ml正己烷，振蕩分層，將下層轉(zhuǎn)移至蒸餾瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1ml，氮?dú)獯蹈?，加?ml甲醇-水溶液(1∶1)，溶解殘?jiān)?，過0.2μm的膜，得到樣品提取液。
4、建立壓電免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線將干燥的免疫識別元件連接到頻率檢測儀上檢測其頻率，穩(wěn)定值作為基本頻率F0。然后直接浸入不同濃度沙星的標(biāo)準(zhǔn)液中(pH6.5)，在37℃恒溫反應(yīng)25分鐘，用PBS洗滌干燥，直至頻率穩(wěn)定為止，記錄頻率值F1。求出頻率變化值ΔF(ΔF＝F1-F0)。以ΔF為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)沙星液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，如圖1和2所示。
5、信號檢測以及分析計(jì)算樣品提取液調(diào)節(jié)pH6.5，將晶體片浸入其中，同上述方法檢測并記錄頻率變化值ΔF，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中沙星的濃度。
5、識別元件的再生方法反應(yīng)后的晶體片在1.2mol/l的NaOH溶液中浸泡30-45分鐘，雙蒸水沖洗，再在1.2mol/l的HCl中浸泡10-20分鐘，可除去晶體片表面的反應(yīng)物，用雙蒸水沖洗干燥后備用。
對照例1～2用高效液相色譜法(HPLC)檢測恩諾沙星和諾氟沙星高效液相色譜為安捷倫1100，色譜柱為Eclipxdb-C18 4.6mm×150mm，熒光檢測器，Ex＝285nm，Em＝460nm。主要工作條件為流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(v/v，13∶87，pH＝3.0)，流速0.8mL/min，柱溫為40℃。工作曲線如圖3和4所示。
實(shí)施例3本發(fā)明檢測效果及其與HPLC法的比較表1HPLC法對于加標(biāo)豬肉的檢測效果(n＝3)

表2本發(fā)明對于加標(biāo)豬肉的檢測效果(n＝3)

表3兩種方法對于市售豬肉樣本的檢測結(jié)果(n＝3)

目前國內(nèi)外對于食品中氟喹諾酮類藥殘的要求，根據(jù)不同藥物品種和不同食品類型存在差異，但最低檢出限一般要求在50μg/kg以上。表1-3表明，對于25μg/kg以上濃度的藥物殘留，本發(fā)明的平均回收率高于75％，RSD在10％以內(nèi)，而且與目前公認(rèn)的HPLC檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性。這表明，該方法的主要性能，如準(zhǔn)確度和精密度等，完全可以滿足實(shí)際檢測的要求；但檢測時(shí)間只需要25-30分鐘，明顯少于HPLC；操作較為簡便，不需要大型、昂貴的儀器設(shè)備，非常適合于現(xiàn)場大量樣品的快速篩選處理。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法，其特征在于包括以下步驟(1)首先利用生物免疫技術(shù)，以牛血清蛋白為載體蛋白，結(jié)合氟喹諾酮類藥物偶連形成完全抗原，來制備相應(yīng)的特異性抗體；(2)以制備的特異性抗體為生物敏感材料，將其固定在壓電晶體表面，形成生物識別元件，并測定其基礎(chǔ)頻率F0；(3)配置系列濃度的待測氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將生物識別元件浸入其中充分反應(yīng)后，測定其反應(yīng)后的頻率F1，并求取反應(yīng)前后的頻率差ΔF＝F1-F0；(4)根據(jù)反應(yīng)前后頻率差ΔF與待測成分含量的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)使生物識別元件與未知樣提取液充分反應(yīng)，得到反應(yīng)前后頻率差ΔF；(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到未知樣中被測氟喹諾酮類藥物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在制備生物識別元件前，利用蛋白A對壓電晶體進(jìn)行衍生活化，增強(qiáng)其對于大分子蛋白的結(jié)合能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于未知樣中的氟喹諾酮類藥物在測定前需要進(jìn)行提取純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的生物識別元件是可以再生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的檢測方法，其特征在于生物識別元件的再生方法是分別用堿和酸浸泡并用雙蒸水洗滌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法，該方法利用生物免疫技術(shù)，以牛血清蛋白為載體蛋白，結(jié)合氟喹諾酮類藥物制備相應(yīng)的特異性抗體；將制備的特異性抗體固定在壓電晶體表面，形成生物識別元件；配置系列濃度的待測氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將生物識別元件浸入其中充分反應(yīng)后，測定其反應(yīng)后的頻率；根據(jù)反應(yīng)前后頻率差與待測成分含量的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；使生物識別元件與未知樣提取液充分反應(yīng)，得到反應(yīng)前后頻率差；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到未知樣中被測氟喹諾酮類藥物的含量。本發(fā)明具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以滿足痕量殘留的檢測要求；操作簡便快速，有效縮短了分析時(shí)間，可應(yīng)用于多種氟喹諾酮類藥殘的分析檢測。
文檔編號G01N27/327GK1731167SQ200510044229
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者曹立民, 林洪, 隋建新, 劉春娥, 李振興, 江潔 申請人:中國海洋大學(xué)