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專利名稱：使用蛋白酶活化的受體鑒別調節蛋白質-蛋白質相互作用的分子的制作方法
使用蛋白酶活化的受體鑒別調節蛋白質-蛋白質相互作用的分子發明領域本發明涉及用于確定所研究分子間相互作用的材料和方法。更具體地說，本發明涉及確定某特定物質例如一種“受試化合物”是否能調節所研究的兩個或兩個以上特定蛋白質之間的相互作用。確定蛋白質之間相互作用涉及監測報道分子的活化，該報道分子可存在于細胞中、溶液中，或存在于含有一種或多種所研究反應物的人工包裝或單元中，其中報導基的因激活與否取決于調節作用是否發生。這種確定一般是利用轉化或轉染的細胞而實現的。這些轉化或轉染細胞以及用于轉化或轉染細胞的試劑，也是本發明的一個方面。此外，還可采用一種無細胞體系，或一種利用攜帶一種或多種所研究試劑的人工包裝或單元如病毒、病毒樣顆粒、脂質體等的體系。發明背景和相關技術通過受體配體的鑒別而對蛋白質-蛋白質相互作用進行研究是一個令人很感興趣的領域。即使某一特定受體的一個或多個配體是已知的，人們仍希望能鑒別出更有效或更具選擇性的配體。本文將把G-蛋白偶聯受體GPCR，又稱為七跨膜受體(7TMR)，作為一類可以這種方式表征的蛋白質的非排它性實例而進行討論。但是，任何能夠相互作用的蛋白質，如一個代謝途徑或一個級聯的成員，均適用于本分析方法。GPCR是人類已知的最大一類細胞表面受體，因此被認為是本發明的主要應用對象。調節GPCR信號的配體包括激素、神經遞質、肽、糖蛋白、脂質、核苷酸和離子。GPCR也已知為感覺受體，例如光覺、嗅覺、信息素和味覺的受體。由于GPCR具有如此眾多和多樣化的作用，它們是許多積極研究的對象，例如，化學戰防御和生物戰防御應用方面的研究，以及用于治療各種病癥的藥物方面的研究。業已成功地發現許多藥物。例如，Howard等人估計，50%以上的市售藥物對這些受體起作用(Howard, et al. ,Trends Pharmacol. Sci. ,22 132140(2001))ο本文所用的“GPCR”系指GPCR受體超家族的任何成員。這一超家族的特征是具有一個七跨膜域(7TM)結構。這些受體的實例包括但不限于，A類或“視紫紅質樣”受體；B類或“促胰液素樣”受體；C類或“代謝谷氨酸樣”受體；Frizzled和Smoothened相關的受體；粘著受體家族或EGF-7TM/LNB-7TM受體；脂連蛋白受體和相關的受體；以及化學感覺受體，包括嗅覺、味覺、犁鼻和信息素受體。例如，人類的GPCR超家族包括但不限于下列文獻所描述的受體分子:Vassilatis, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 4903 4908(2003) ；Takeda，et al. , FEBS Letters,520 97 101 (2002) ；Fredricksson, et al. , Mol. Pharmacol. ,63 :1256 1272(2003) ；Glusman, et al. , Genome Res. ,11 :685 702(2001)；以及 Zozulya, et al.，Genome Biol.，2 :0018. 1 0018. 12(2001)。簡言之，GPCR功能的一般作用機制如下1)GPCR與配體結合，2)引起構象變化，從而3)激發導致細胞生理學變化的細胞事件級聯。GPCR通過調節一批細胞內蛋白質，如異三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)和β抑制蛋白(iiarrestins)的活性而轉導信號。 在G蛋白的情況下，配體-受體復合物激發鳥嘌呤核苷酸的交換，并使G蛋白的異質三聚體解離為α和β Y亞基。在其它一些情況下，β抑制蛋白可取代G蛋白、抵制G蛋白信號轉導、協同G蛋白信號轉導等。業已觀察到GTP結合的α亞基和β y異二聚體均可調節各種細胞效應蛋白，包括腺苷酰環化酶和磷脂酶C (PLC)。在常規的基于細胞的GPCR分析中，受體活性是通過測定 G蛋白調節的效應物通道的輸出，如由腺苷酰環化酶產生的cAMP的積聚或由PLC活性刺激而導致的分子內鈣的釋放來監測的。由于種種原因，對于某些分析對象，很難研發出常規的基于G蛋白的信號轉導分析方法。首先，例如，不同的GPCR與不同的G蛋白調節的信號轉導途徑偶聯。常規的基于G 蛋白的分析方法依賴于對目標受體的G蛋白特異性的了解，或者此分析方法要求構建細胞體系，迫使目標受體與選定的G蛋白效應物途徑偶聯。其次，由于GPCR超家族是如此之大， 所有細胞都表達許多內源的GPCR(以及其它受體和信號傳遞因子)。因此，除了目標GPCR 之外，測得的效應物途徑也能被內源分子調節。這一現象可能導致假陽性或假陰性結果，例如在試圖鑒別目標GPCR的選擇性調節劑時即是如此。G蛋白活性的調節并不是配體/GPCR結合的唯一結果。參閱如Luttrell，et al., J. Cell Sci.，115 :455465(2002)，以及 Ferguson，Pharmacol. Rev. ,53 :124(2001)。這些文獻評述了一些可能導致GPCR信號衰減或終止的活動。這些終止過程對于防止細胞過度刺激以及在細胞外信號和相應細胞內途徑之間強制建立一種暫時的連接是很有用的。一般而言，激動劑與GPCR的結合將導致該受體分子C端的絲氨酸和蘇氨酸殘基在 GPCR激酶的作用下發生磷酸化。絡合了激動劑的C端磷酸化的GPCR的激動劑然后與抑制蛋白家族成員如α抑制蛋白、β抑制蛋白或β抑制蛋白2相互作用，這些抑制蛋白下調或抑制受體信號轉導。這一結合能抑制受體與G蛋白的偶聯，從而使受體發生內化，然后降解和/或再循環。例如，抑制蛋白的結合，如β抑制蛋白2與磷酸化GPCR的結合，可以不同的方式降低目標GPCR的活性。抑制蛋白抑制其目標活化的最簡單機制就是與GPCR的胞內域結合，從而阻斷異三聚體G蛋白的結合位點并防止細胞外信號激活信號途徑(脫敏作用)。抑制蛋白使用的另一種調節機制是使受體與膜內化機構的元件相連(如網格蛋白介導的內吞作用)，這將引起受體在被膜小泡中內化而與核內體融合。一旦到達核內體，該受體即可被(例如溶酶體)降解，或可再循環至質膜，在此再次被激活。因此，可以說，配體與GPCR的結合“調節” 了 GPCR和抑制蛋白之間的相互作用，因為配體與GPCR的結合導致了抑制蛋白與GPCR的結合，籍此調節其活性。在本文中，當述及相互作用或結合的時候，“調節”或其任何其它形式只是指本發明的兩個蛋白質之間相互作用方式的某些變化，例如，在一種受試化合物或配體存在與不存在的情況下，比較這兩個蛋白質之間如何相互作用。因此，調節僅包括兩個分子的結合。例如，受試化合物的存在可能以某種可檢測的方式或形式加強或增強、減弱、阻斷、抑制、改向、降低或改變兩個蛋白質之間的相互作用，或者受試化合物可促進相互作用的可能性等。在某些情況下，7TMR信號轉導的發生可獨立于G蛋白。因此，當配體與7TMR結合時，是β抑制蛋白而不是G蛋白被募集參與或引發細胞中的信號級聯放大。參閱如Violin & Lefkowitz，Trends Pharm Sciences28 (8)416—422，2007 禾口 DeFea，Br J Pharm 1-12, doi :10. 1038/si. bjp. 0707508，2007，作者總結了兩個始于激活的7TMR的獨立又相互依賴的信號途徑，這些信號途徑可同時涉及G蛋白和β抑制蛋白；或者也可能僅涉及G蛋白或僅涉及β抑制蛋白。因此，例如7TMR的某些已知拮抗劑能激活β抑制蛋白的信號傳遞。普萘洛爾 (Propranolol)是一種β 2腎上腺素能受體(ADRB2)和G蛋白信號傳遞的已知拮抗劑；如實施本發明時所觀察到，它是一種β抑制蛋白信號傳遞的部分激動劑，能激活β抑制蛋白啟動的途徑。響應細胞外刺激的細胞信號傳遞事件通常都是由蛋白質-蛋白質相互作用介導的。因此，蛋白質-蛋白質相互作用對細胞生理學家來說具有非常重要的意義。一種監測這些相互作用的工具涉及使用一種分裂的或序列改變的報道分子活化蛋白質，如煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶。當與相互作用的蛋白質共表達為一種融合構建體時，蛋白酶的分裂部分就重新獲得活性° Wehr, et al. ,"Monitoring Regulated Protein-protein Interactions UsingSplit TEV",Nature Methods, 3 :985-993 Q006)。這一特性已經與轉錄偶聯的報道分子體系結合使用。這一理解導致了測定GPCR的激活和抑制的其它方法。其中一個方法涉及在帶有轉錄機構的完整細胞中監測蛋白質與抑制蛋白之間的相互作用。這一方法的優點是不需要擁有G蛋白途徑方面的知識。參閱Lee等人的美國第7，049，076號專利“測定蛋白質-蛋白質相互作用的方法”。Lee等人教導了一種需要轉錄偶聯報道分子體系的報道分子體系。 按照Lee等人的觀點，當兩個蛋白質相互作用時，一個肽轉錄因子將從第一蛋白上切割下來。第二蛋白是激活報道分子的轉錄因子。該轉錄因子轉移到細胞核而實現一種可檢測的報道分子的轉錄，從而實現報道分子的功能。由于該方法依賴于轉錄，故不能用于例如血小板、人工包裝或單元，如脂質體、蝸形細菌、病毒樣顆粒和病毒顆粒。Oakley, et al. , Assay Drug Dev. Technol. , 1 :2130(2002)以及 Barak 等人的美國第 5，891，646 和 6，110，693 號專利 “Methods Of Assaying ReceptorActivity and Constructs Useful in Such Methods”描述了一些分析方法，其中測量了細胞質中螢光標記的抑制蛋白分子向細胞表面被激活受體的重新分布。這些方法依賴于細胞的高分辨率成像來測量抑制蛋白的重新定位和報道分子的活化。本領域技術人員認識到，這是一個繁雜耗時的程序，可由于所使用的互補性酶片段的親和力和相互作用而導致失敗，這些相互作用可能與所期待的調節劑誘導的相互作用形成競爭。因此，該方法的缺點是酶將獨立于配體結合而自動重新締合，從而導致假陽性結果。希望能有一種更簡單可靠、假陽性結果較少出現并較易適應高通量篩選的分析方法。有關這些內容，已經頒發了各種其它美國專利，并提交了多項專利申請。例如，授予 Bohn 等人的美國第 6，5 , 271 號專利 Inhibition Of^-Arrestin Mediated Effects Prolongs and Potentiates OpioidReceptor-Mediated Analgesia，，介紹了一些蹄選鎮痛藥物的試驗方法，其中測量了對β抑制蛋白結合的抑制作用。已公布的美國專利申請，如 2004/0002119,2003/0157553 和 2003/0143626,以及美國第 6，884，870 號專利描述了涉及 GPCR的不同形式的試驗方法。美國第7，128，915號專利介紹了類似的GPCR技術。上面提到的美國第7，049，076號專利主要介紹GPCR活性或篩選方法，顯示了 GPCR研究的重要性。因此，本發明的一個特點，即提供簡單的分析方法用于監測和/或確定特定的蛋白質-蛋白質相互作用的調節，例如受體介導的生理作用如GPCR介導的細胞響應，能夠令人滿意地處理本領域內的需求，其中所述的蛋白質包括但不限于膜結合蛋白，一般而言包括受體，而GPCR則是一個重要的實例。 發明概要本發明提供了一些方法，以確定受試化合物是否能調節所研究的特定的蛋白質-蛋白質相互作用。蛋白質-蛋白質相互作用是生物學中常見的機制，細胞籍此與其周圍環境相互作用。這是一種細胞外事件，例如一個配體與一個受體結合，能夠產生一種伴隨配體內化或不伴隨內化的內部響應。內化可能涉及兩個或兩個以上的其一部分在膜上或膜外的蛋白質。因此，二聚體、異二聚體或多聚體的形成可能產生一種內部響應。細胞內蛋白質-蛋白質相互作用也可能出現在信號級聯放大中。本發明的一般原理適用于任何類型的蛋白質-蛋白質相互作用。例如，相互作用可以發生于兩個膜結合蛋白之間、一個膜結合蛋白和一個胞質蛋白質之間、或胞質蛋白質之間等。一個實施方案描述了一個胞質蛋白質轉移至另一個細胞器如細胞核，其中報道分子被激活從而產生信號。最好是采用基于細胞的分析方法，但也可使用無細胞的體系，如使用切割物、膜級分、核級分等。本發明還包括含有一種或多種所研究試劑的人工包裝或單元，如脂質體、病毒樣顆粒等等。本發明改善了以上討論的Lee等人的方法，因為不需要轉錄。因此，能更快地獲得結果，且能從基于細胞或無細胞的體系中獲得結果。以下是關于特別優選的一些實施方案的總說明。這些實施方案僅出于示范的目的，并非意在限制本文所述及權利要求書所定義的本發明之范圍。本發明提供的一個特征包括讓至少一種受試化合物與表達所研究蛋白質的細胞表面接觸。可對受試化合物調節所研究蛋白質如某種受體蛋白質活性的能力進行評估。所研究蛋白質在細胞中的表達可通過用下列物質轉化或轉染某種選定的細胞例如昆蟲或哺乳動物細胞系而引起(1)含有下列組分的一個或多個核酸分子(a)編碼第一目的蛋白的多核苷酸，和(b)編碼報道分子活化蛋白質的多核苷酸，該報道分子活化蛋白質具有對蛋白酶或蛋白酶的活性部分或可激活部分敏感的切割位點，以及( 含有下列組分的一個或多個核酸分子(a)編碼第二蛋白的多核苷酸，當一種調節劑例如一種陽性受試化合物存在時，該第二蛋白與第一目的蛋白之間的相互作用發生變化，以及(b)編碼對核酸(1)編碼的切割位點具有特異性的蛋白酶或蛋白酶的活性部分或可激活部分的多核苷酸。對于調節 (所研究的兩個蛋白質之間)相互作用的分子如陽性受試化合物的評估或分析，可通過在必要時在表達所研究的第一蛋白和第二蛋白的細胞中以及本文所述的報道分子體系中加入報道分子活化蛋白質底物來進行。因此，本發明的一種方法可以是采用一種可重新排序的酶作為所研究的蛋白質-蛋白質相互作用的讀出。作為報道分子或報道分子活化蛋白質所用的可重新排序的激活蛋白質，例如酶，可處于一種非活性狀態，可通過切割來激活，例如可通過與所研究的第二蛋白相關的酶活性來激活。另一個選項包括一種非活性的報道分子活化蛋白質，當所研究的第一蛋白和第二蛋白相互作用時，該蛋白質就被激活。如此，就可以篩選出調節所研究的第一和第二蛋白之間相互作用的化合物。這一體系的一個成就是能夠高通量地鑒別能調節選定的蛋白質-蛋白質相互作用的分子。能夠(單獨或與一個或多個相關分子一起)產生“肽A”這一讀出的酶以一種活性可改變的形式存在。這種活性變化可使酶活化或失活。例如，可在酶中建立一個切割位點使它在切割時失活，例如，可用與所研究的第二蛋白偶聯的第二種酶來使它切割。備選地，切割也可導致激活。可用一個或多個核酸將所選擇的酶構建到所希望的宿主細胞中。例如，一種載體可包含一種多核苷酸，該多核苷酸編碼選定的分子作為非活性酶，其可通過在切割割位點切割非活性酶而被活化。該切割位點可以是天然出現的，但更優選的則是設法將該切割位點加入多核苷酸中，使得它作為一種重排的酶而得以表達。例如， 一個本不屬于該細胞蛋白質的切割位點和/或一個本不屬于該宿主細胞的蛋白質可以被轉染到宿主細胞中。備選實施方案包括通過切割而使酶活化，可以采取除去一個阻斷肽的方式，或可以讓兩個多肽改變構型使它們重新排列而激活酶的活性。因此，一個實施方案的特點是一種活性的多肽，例如一種酶。本文所述的“酶”可通過切割而失活。從特異性方面考慮，也許希望在酶中構建一個能被本不屬于宿主細胞的蛋白酶識別的切割位點。該切割位點可以一種連接成分把“酶”的兩個部分連在一起接頭的形式引入，該接頭可以是一個本來就屬于“酶”的切割位點，例如，帶有切割位點的酶可能來自于另一種細胞類型或另一種物種，且在宿主細胞中不存在，或者切割位點也可通過一個或多個氨基酸的保守取代而產生。保守取代為本領域已知的技術。例如，電荷、大小、芳香性或其它特性都可以被保留以維持活性。此活性不必與序列未經重排的“酶”完全相同，但是必須在切割位點通過切割而加以改變。可在一個酶的兩個部分之間插入一個切割位點。 這一位點的切割可能干擾酶，從而導致失活或可能引起催化活性，例如，通過除去肽上阻斷結合位點或催化位點的部分或讓重排的酶的兩個部分以一種能恢復活性的方式相互作用。因此，在切割位點的切割可能滅活或激活產生讀出的蛋白質。切割可在一種受試化合物存在的情況下實現，例如，當包含一個編碼所研究的第二蛋白的多核苷酸的核酸分子的表達產物與所研究的第一蛋白發生作用時實現，從而引發蛋白酶的活性，該蛋白酶能識別和切割重排的報道分子活化蛋白質中對蛋白酶敏感的切割序列。所研究的第二蛋白與所研究的第一蛋白在第三分子存在或不存在的情況下發生相互作用。此第三分子因此就被認為是調節了多肽A和B之間的蛋白質-蛋白質相互作用。于是，由第三分子例如一種受試化合物調節的蛋白質-蛋白質或肽-肽之間的相互作用(出于討論的目的，蛋白質和肽可互換使用)可被本發明的體系有效地報導。調節蛋白質-蛋白質相互作用的分子(標記為1和2、第一和第二、A和B等的多肽之間，本文中這些短語和術語可互換使用)可由活性的報道分子激活分子來測量，或通過將活性的報道分子活化蛋白質的底物加入表達含有所研究蛋白質的體系的細胞來測量。蛋白質A和B的選擇是一種設計上的選擇，因為已知或懷疑可能相互關聯、相互作用的分子對都可以使用。如本文所討論，一個適當的分子對是帶有G蛋白或β抑制蛋白的 7TMR。另一個實例是一種卷曲的受體和一種散亂的結合蛋白，等等。還有一個實例則是一種在細胞相互作用期間以及細胞相互作用之后起作用的蛋白質。因此，蛋白質A和B在細胞1中。當細胞1被細胞2接觸或與細胞2接觸時，這一相互作用在細胞1中觸發了一種由細胞1引起的活動，該活動由蛋白質A和B的相互關聯、相互作用等現象所揭示，并進一步為本發明的試劑所揭示，產生了一種可察覺和可檢測的信號。另一個實例是使蛋白質A表達在細胞1上，使蛋白質B表達在細胞2上。這一點可通過把G蛋白或β抑制蛋白構建成具有一個胞外域，或把報道分子活化蛋白構建成具有一個胞外域的方式來實現，該胞外域在細胞1被一種配體或候選藥物活化后受到細胞1的作用。或者，兩個細胞上的內源分子也可自發地締合。在另一個實施方案中，蛋白酶和報道分子活化分子被構建成作為胞外域在細胞或單元的表面上表達。在另一個實施方案中，相互關聯、裝配的蛋白質形成一種包含蛋白質A和B的復合結構。本分析方法可用于鑒別那些促進或阻止關聯或裝配的分子。一個實例則是病毒殼體的形成、病毒樣顆粒裝配或核糖體的形成。在G蛋白偶聯受體(GPCR又稱為7TMR，這些術語在本文中可互換使用)的常見機制中，GPCR的激動劑活化導致一個細胞內分子如G蛋白或β抑制蛋白的募集，該分子涉及一種信號途徑，如啟動、終止、增強、抵制等等。因此，G蛋白偶聯受體激酶可作用于被激活的受體，導致受體的磷酸化。磷酸化受體促進β抑制蛋白與受體的結合。對某些GPCR而言，這一機制是相當保守的。在其它一些情況下，活化的受體卻與β抑制蛋白相互作用。為了評估調節蛋白質-蛋白質相互作用如GPCR活化的分子，設計了一種體系來測定蛋白質-蛋白質相互作用并在一種GPCR-重排的報道分子體系中進行了測試。例如，報道分子體系可以是一種螢光素酶/螢光素分析體系。一般而言，報道分子是一種外源分子，即對于宿主細胞或信號機制而言是外來的。這就最大限度地降低了報道分子被宿主細胞活化或在宿主細胞中自發活化的程度，從而也最大限度地降低了信號產生，并因此最大限度地減少了假陽性結果。報道分子活化分子可以是一個帶有域結構的分子，或是一個序列可重排以產生非活性的報道分子活化蛋白質的分子，該蛋白質在操作時有可能具有報道分子的活性。因此，本申請考慮到使用一種潛在的報道分子活化分子。重排的報道分子活化分子最大限度地降低了自發報道分子活化分子的活性，并因此最大限度地減少了假陽性結果。 例如，在酶片段互補分析中，酶片段的親和力可超越所篩選的目標分子、配體或分子的反應動力學，使得酶片段自發重新締合而成為功能分子，從而導致更高的背景值和/或假陽性。 所研究的重排的報道分子活化蛋白質可構建成帶有這樣一個位點，該位點在受到作用時可使重排的報道分子活化分子形成功能分子。此位點可以是蛋白酶位點。此蛋白酶位點最好是一個在宿主細胞中很少存在或不存在的獨特位點，或所研究方法的一個或多個組分所存在的單元。這就提供了另一種手段來避免完整的報道分子活化分子的自發重新締合，從而最大限度地減少假陽性結果。只有當接合的配體最終將蛋白酶引導到非活性的報道分子活化蛋白的附近并使之切割，才能獲得特定的信號，也只有在這個時候，才能實現一種活性信號活化或產生實體。本領域內已知有許多蛋白酶可用于本發明的實踐。例如，病毒來源的蛋白酶可能很有用，因為它們對于完整的宿主細胞來說通常都是外源的。有一項應用包含重排的報道分子活化蛋白質基因，其中螢火蟲螢光素酶的編碼序列被標記在GPCR序列的C 端終點上，β抑制蛋白2(Ar2或Arr2)則與煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶基因連接。在另一個實施方案中，重排的螢光素酶被標記在β抑制蛋白(Ar或Arr)上，TEV基因則被連接到受β抑制蛋白作用或與β抑制蛋白有關的信號途徑下游的一個蛋白上，或被連接到一個受體，如疑為獨立于G蛋白起作用的7TMR上。當設計用來表達上述兩者的質粒在細胞中表達時，調節GPCR-抑制蛋白-2之間相互作用的化合物將Arr2-蛋白酶融合蛋白募集到重排的螢光素酶中的蛋白酶識別位點，然后TEV蛋白酶切割該重排的螢光素酶。受試化合物的效用可通過報道分子活化蛋白重構導致的酶活性變化來測量，在這種情況下，通過作用于一種適當的底物如螢光素，螢光素酶成為活性并能產生可檢測的信號。本發明并不僅限于螢光素酶，甚至不僅限于酶。切割引起的活化是一種已知的現象，如酶原。也可使用非酶報道分子體系。例如，可使用綠色熒光蛋白(GFP)。一種重排的GFP，例如其組成部分重排的GFP，可用作報道分子活化蛋白和報道分子。重排的多肽所包含的蛋白酶如TEV或其它帶有識別位點的蛋白酶的作用可切割重排的報道分子活化蛋白/報道分子，從而允許產生信號的重排。GFP的優勢在于其本身就是一種可檢測的報道分子信號分子。或者，可在報道分子中引入一些不會明顯干擾信號的切割位點。蛋白質-蛋白質相互作用所導致的切割會使報道分子信號減弱。可在報道分子構建體中引入多個切割位點。可用蛋白質三級結構來指導熟練技術人員，將切割位點放在最適合的位置。例如， 當多肽的兩個部分緊密接觸時，以擾動序列的方式分開這兩個部分預期將會降低或消除活性。當切割時，預期此兩部分會相互作用，從而恢復活性。所研究的第一蛋白可以是一種跨膜受體之類的膜結合蛋白，例如GPCR。跨膜受體的實例包括β -腎上腺素能受體(ADRB》、精氨酸加壓素受體2 (AVPR2或Ν2~)、血清素受體 Ia(HTRlA)、m2蕈毒堿乙酰膽堿受體(CHRM2)、趨化因子(C-C基序)受體5 (CCR5)、多巴胺 D2受體(DR^)、κ -阿片樣物質受體(OPRK)，或α Ia-腎上腺素能受體(ADRAlA)等等。膜結合受體在本領域內眾所周知。應當理解，在所有情況下，本發明并不限于作為本發明實例而描述的特定實施方案。例如，作為一種酪氨酸激酶的胰島素生長因子-1受體(IGF-IR) 之類的分子，以及通常不是膜結合的蛋白，如雌激素受體I(ESRl)和雌激素受體2(ESR2)， 均可用于本發明。與蛋白質B締合的蛋白酶或蛋白酶之一部分可以是煙草蝕刻病毒核包涵物A(TEV)蛋白酶。TEV有一個七殘基識別位點，因而比具有較小的統計學上更常見的識別位點的蛋白酶更具特異性。其它蛋白酶也適用于本發明。例如，具有5殘基識別序列的腸激酶和)(a因子蛋白酶，具有6殘基識別序列的凝血酶和PureAct 或CleanCut ，以及具有 7殘基識別序列的!^rescission 也是可用于本發明的蛋白酶。本發明并不限于使用任何特定的蛋白酶。但是，該蛋白酶必須在某一位點切割，從而產生或改變來自受體的信號。激活報道分子的蛋白質可為任何能作用于底物而產生可檢測信號的酶。例如，酶可直接或間接地增加或減少熒光或化學發光，或可導致顏色變化。報道分子底物可以是一種生物物質，如蛋白質，或可以是一種化學物質，其反應被報道分子酶所催化。所研究的第二蛋白可以是一種抑制性蛋白質，如抑制蛋白。抑制蛋白通常響應配體/受體相互作用而與GPCR相互作用以調節活性。細胞可以是一種真核生物細胞或一種原核生物細胞。報道分子可以是一種外源成分，如β半乳糖苷酶或螢光素酶。為了簡化起見，將“報道分子酶” 用作報道分子活化分子、報道分子活化體、報道分子調節分子、報道分子調節蛋白質或報道分子活化蛋白質的等同物，并作為一種能改變報道分子輸出的分子之簡稱。例如，報道分子酶可以酶學方式造成報道分子信號的變化，也可以酶學方式或非酶學方式導致信號的變化，如熒光信號的變化。本領域熟練技術人員了解能調節或激活報道分子信號的各種報道分子體系和蛋白質。可以修飾編碼第一蛋白的核苷酸序列以增加與第二蛋白的相互作用。此類修飾包括但不限于將第一蛋白C端區域的全部或部分核苷酸序列用編碼一個比原序列對第二蛋白具有更高親和力的氨基酸序列的核苷酸序列來取代。例如，該C端區域可被編碼AVPR2、 AGTRLI、F2RLl、CXCR2/IL-8b或CCR4的C端區域的核苷酸序列所取代。此類修飾在本領域內是眾所周知的，是本發明一個任選的特征。本發明的方法可包括讓多種受試化合物與多種細胞樣品或單元接觸。每種樣品都可與一種或多種受試化合物接觸。在另一實施方案中，一個細胞或單元帶有兩個不同的分子，而這些分子的胞外域又帶有不同的報道分子活化分子，兩者均與β抑制蛋白相互作用。篩選過程可通過測定報道分子的活性來完成，例如通過監測樣品中的酶活性來確定是否有任何化合物或化合物混合物調節特定的蛋白質-蛋白質相互作用。該方法可包括讓每個樣品與單一的受試化合物接觸，讓每個測試樣品與受試化合物的混合物接觸，或組合這兩種方式。可利用本發明來測試或篩選能抑制化合物與蛋白質A之間的結合的化合物。例如，一項分析可包括蛋白質A的一種已知的配體，也可鑒別和/或鑒定調節配體與蛋白質之間的結合的化合物，如同競爭分析法。對照樣品可用于每次分析，或與樣品一起進行平行分析。在某些實施方案中，本發明提供了一種方法來確定一種受試化合物是否能調節所研究的許多蛋白質之間的一種或多種相互作用。這些實施方案一般具有以下特征讓一種受試化合物與用下列物質轉化或轉染的一些細胞樣品接觸(a)含有下列組分的第一核酸分子(i)編碼第一蛋白的多核苷酸和編碼蛋白酶切割位點的多核苷酸序列，(ii)編碼在細胞中激活報道分子的蛋白質的多核苷酸；以及(b)含有下列組分的第二核酸分子(i)編碼第二蛋白的多核苷酸，該第二蛋白在所研究的受試化合物存在的情況下與第一蛋白的相互作用有待測量，(ii)編碼蛋白酶或編碼對切割位點的切割具有特異性的多肽的多核苷酸。在多個樣品中，第一蛋白可與其它第一蛋白不同。然后，該方法包括在多個樣品中的一個或多個樣品中確定報道分子的活性，從而確定對所研究的蛋白質之間一種或多種相互作用的調節。在每個樣品中，第二蛋白可以是不同的，也可以是相同的。所有樣品可合并在一個共同的容器中，每個樣品可包含不同的第一和第二蛋白對。或者，每個樣品也可在不同的容器中測試。某一給定樣品中的報道分子可與其它樣品中的報道分子不同。受試化合物的混合物可包含一種生物樣品或存在于一種生物樣品中，如腦脊液、尿液、血液、血清、膿、腹水、 滑液、組織提取物、植物或草藥提取物，或滲出液。在其它實施方案中，本發明提供了一種用以下物質轉化或轉染的重組細胞(a) 包括下列組分的核酸分子(i)編碼第一蛋白的多核苷酸，( )編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位點的多核苷酸，以及(iii)編碼激活細胞中報道分子的蛋白質的多核苷酸；以及(b)含有下列組分的核酸分子(i)編碼第二蛋白的多核苷酸， 該第二蛋白在所研究的受試化合物存在的情況下與第一蛋白的相互作用有待測量，以及 (ii)編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽的多核苷酸，所述蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽具有對對所述切割位點特異的蛋白酶活性。該核酸分子之一或兩者都可穩定地整合進宿主受試細胞的基因組。該細胞還可以是用報道分子轉化或轉染的。第一蛋白可以是一種膜結合蛋白，如跨膜受體，例如GPCR。代表性的跨膜受體包括 ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK 或 ADRA1A。如上所述，蛋白酶或蛋白酶之一部分不限于煙草蝕刻病毒核包涵物蛋白質A酶， 而可以是激活報道分子活化蛋白質的任何蛋白質，且可以是任何能作用于底物而產生一種可用的或可檢測的信號的酶。第二蛋白可以是一種抑制性蛋白質。細胞可以是真核生物細胞或原核生物細胞，一般而言，用于篩選藥物的目的時，優選是真核生物細胞。以與藥物的最終目標類似的方式糖基化的細胞則尤為優選。該細胞可以是培養的或改造的以提供所需的糖基化特征。使用與建議的最終目標之糖基化性質不匹配的原核生物細胞對于篩選和鑒定可以是有用的。報道分子可以是外源的，例如β半乳糖苷酶、GFP或螢光素酶。可以修飾編碼第一蛋白的核苷酸序列以增加與第二蛋白的相互作用，例如通過用編碼一個比原序列對第二蛋白具有更高親和力的氨基酸序列的核苷酸序列來取代第一蛋白C端區域的全部或部分核苷酸序列。該C端區域可被一個編碼例如AVPR2、AGTRLI、F2RLl、CXCR2/IL-8b或CCR4的C 端區域的核苷酸序列所取代。作為一個實施方案，本發明包括提供一種分離的核酸分子，包括(i)編碼蛋白質的多核苷酸，(ii)編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位點的多核苷酸，以及(iii)編碼激活細胞或其它分析體系中報道分子的蛋白質的多核苷酸。該蛋白質可以是一種跨膜受體之類的膜結合蛋白，例如GPCR。代表性的跨膜受體包括ADRB2、 AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRAlA。蛋白酶或蛋白酶之一部分可以是煙草蝕刻病毒核包涵物蛋白質A酶。如上所述，激活報道分子的蛋白質可為任何與一種底物反應而產生信號的蛋白質，不需要限制于本文所討論的TEV實例。本發明的這一實例或其它實例不應被視為是將本發明限制于特定的實施方案。在某些實施方案中，本發明的特點是一種包含分離的核酸分子的表達載體，該核酸分子包含如下組分(i)編碼蛋白質的多核苷酸，( )編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位點的多核苷酸，以及(iii)編碼能激活細胞中報道分子的蛋白質并進一步與啟動子有效連接的多核苷酸。在某些實施方案中，本發明的特點是分離的核酸分子，其包含(i)編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質在受試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用有待測量，以及(ii)編碼對所述切割位點具有特異性的蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽的多核苷酸。該蛋白質或其它蛋白質可以是一種抑制性蛋白質，如抑制蛋白。本發明某些實施方案的特點還在于含分離的核酸分子的表達載體，該核酸分子包含以下組分(i)編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質在受試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用有待測量，以及(ii)編碼對所述切割位點具有特異性的蛋白酶、蛋白酶的一部分的多核苷酸，且所述核酸可進一步與啟動子有效連接。另一個實施方案的特點是一種由分離的核酸分子的表達所產生的融合蛋白，該核酸分子包含以下組分(i)編碼蛋白質的多核苷酸，(ii)編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位點的多核苷酸，以及(iii)編碼一個能激活細胞中報道分子的蛋白質并進一步與啟動子有效連接的多核苷酸；或一個包含以下組分的分離的核酸分子(i)編碼蛋白質的多核苷酸，該蛋白質在所研究的受試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用有待測量，以及(ii)編碼對所述切割位點具有特異性的蛋白酶、蛋白酶的一部分的多核苷酸。在其他實施方案中，本發明的描述了試劑盒，用于測定一種受試化合物是否能調節所研究的特定蛋白質-蛋白質相互作用。該試劑盒包括以下一個或幾個組成部分，且各部分相互分離(a)包含編碼第一蛋白的多核苷酸的核酸分子，(i)編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位點的多核苷酸，( )編碼能激活細胞中報道分子的蛋白質的多核苷酸，以及(b) —個包含以下組分的核酸分子(i)編碼第二蛋白的多核苷酸，該第二蛋白在受試化合物存在的情況下與第一蛋白的相互作用有待測量，(ii)編碼對所述切割位點具有特異性的蛋白酶或蛋白酶的一部分的多核苷酸；以及任選地，還可包括使(a)和(b)保持分離的手段。該試劑盒還可包括使用說明。或者，該試劑盒還可包括改造的細胞以表達所研究的兩個融合蛋白的任意一個或兩者。第一蛋白可以是一種膜結合蛋白，如跨膜受體。跨膜受體的一個具體類型是GPCR。 一種具體的跨膜蛋白質是GPCR。代表性的跨膜受體包括ADRB2、AVra2、HTRlA、CHRM2、CCR5、 DRD2、OPRK或ADRA1A。蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽可以是煙草蝕刻病毒核包涵物蛋白質A酶。激活所述報道分子的蛋白質可以是例如任何作用于一個可檢測的、對切割活化有反應的報道分子活化分子的蛋白酶。該報道分子可為任何由切割產物產生可檢測信號的分子。第二蛋白可以是一種抑制性蛋白質，如抑制蛋白。該試劑盒還可進一步包括單獨的編碼報道分子活化基因的分離核酸分子。報道分子激活子可以例如是一種 β半乳糖苷酶或螢光素酶。可以修飾編碼所述第一蛋白的核苷酸序列以增加其與第二蛋白的相互作用，例如通過用編碼一個比原序列對第二蛋白具有更高親和力的氨基酸序列的核苷酸序列來取代所述第一蛋白C端區域的全部或部分核苷酸序列。所述C端區域的核苷酸序列可被編碼例如AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8B以及CCR4的C端區域的核苷酸序列所取代。應該考慮到，相對于本文所述的任何其它方法或組合物，本文所述的任何方法或組合物都是可實施的。在權利要求書和/或本說明書中，冠詞“一個”當與“包含” 一詞聯用時，可表示“一個”的意思，但也可以表示“一個或更多”、“至少一個”以及“一個或一個以上”的意思。當以略微不同的措詞描述對應的組分時，它們并不意味著是區別各項實施方案，整體而言，各種不同的措詞是廣義地描述對應的成分。當與下面的說明和附圖一起考慮時，將能夠更好地理解本發明的這些和其它實施方案。應當理解，下面的說明雖然指出了本發明的各種實施方案及其許多具體細節，但是這些內容僅僅是為了示范之目的，而不是限制本發明。在不偏離本發明的精神實質前提下， 可在本發明的范圍內進行許多替換、修改、添加和/或重排，而且本發明包括所有這樣的替換、修改、添加和/或重排。附圖簡要說明所附的附圖構成本發明說明書的一部分，被包括在此以進一步顯示本發明某些方面的特點。在閱讀本文提供的關于特定實施方案的詳細說明時，通過參閱所附的一個或一個這些附圖將能更好地理解本發明。

圖1顯示本發明之一個實施方案的示意圖，其中調節劑4與一個與蛋白酶相連的蛋白質1結合，導致該蛋白質與第二蛋白2相互作用，該第二蛋白與一個報道分子調節劑3 相連，如一個重排的非活性調節蛋白質。調節劑4代表一種能調節蛋白質-蛋白質相互作用的化合物。在本實例中，Ar或抑制蛋白2與一個非活性的重排的報道分子調節或活化蛋白質3融合。蛋白酶7與蛋白酶1相連。在報道分子調節蛋白質3的兩個片段之間顯示了一個切割位點8。當與附在蛋白質1如7TMR上的調節劑4相互作用后而發生蛋白酶切割時，報道分子活化蛋白質的活性被重構，最終產生了一個如燈泡6代表的可檢測信號。圖2是本發明一種蛋白質-蛋白質相互作用分析方法的一個圖解。一個帶有細胞內蛋白酶22的膜結合蛋白21與調節劑4相互作用。一個與蛋白質23相連的非活性報道分子帶有一個非活性報道分子3或報道分子激活子3。當發生相互作用時，與蛋白質21相連的蛋白酶22使該重排的報道分子活化蛋白質23在切割位點發生切割，從而在調節劑4 與蛋白質21接合時，使報道分子活化蛋白質3的蛋白質部分重排成5。該報道分子激活子從而實現了報道分子或報道分子激活子3的重組，以引起或激活一個報道分子。圖3顯示一個實施方案的示意圖，其中兩個跨膜蛋白質相互作用。分子4引起(調節)了兩個膜蛋白質(例如至少一個受體蛋白質)之間的相互作用。圖中，蛋白酶22，如 TEV(圖1中的7)，與蛋白質1相連并被帶到與第二個膜蛋白質33相連的重排的報道分子激活子融合蛋白3的附近。由于蛋白質1、33接近而在切割位點8處發生的蛋白質水解導致了報道分子活化蛋白質3的活化5。圖3還可以看成是顯示調節報道分子同二聚體或異二聚體形成之分子的鑒定技術應用的圖解。圖中蛋白質1和33為膜結合蛋白。蛋白質1和33被構建成各自包含一個蛋白酶22或一個被蛋白酶22激活的報道分子3。調節相互作用的分子4與蛋白質1和/ 或33結合。當1和33相互作用時，蛋白酶22作用于報道分子激活子3，從而產生一個改變的信號。異二聚化可擴展至包括常規的同二聚化。例如，1和33可以是同一報道分子的兩個拷貝，但所不同的是與蛋白酶或報道分子的結合。如別處所述，報道分子和報道分子激活子這兩個術語經常可以互換使用，以描述本發明不同的實施方案。圖4顯示了一個涉及細胞內蛋白質的蛋白質-蛋白質相互作用的實例。蛋白質41 是一個與激活子22如TEV融合的核激素受體。一個重排的報道分子活化分子43位于細胞核40中。利用一種具有細胞核定位肽序列功能的基本多肽，可將報道分子定位在該細胞核中。在與配體如激素(此處未顯示)結合時，NHR融合體41轉移位置至細胞核中，并在細胞核中與報道分子體系相互作用。圖5顯示由細胞中的TEV蛋白酶在重排的螢光素酶融合蛋白中重新產生的螢光素酶活性可通過修飾蛋白酶的切割位點來控制。因此信噪比是可以控制的。此處顯示了兩個構建體，ADRB2是β 2腎上腺素能受體，Luc234-550和2-233是由Χ(即帶有可變的C端氨基酸的TEV切割位點)連接的螢光素酶的兩個片段。例如，X可為絲氨酸S、精氨酸R、或纈氨酸V。當兩個構建體都出現在一個細胞中時，在哺乳動物細胞中從重排的螢光素酶融合蛋白中觀察到了重構的螢光素酶活性。對TEV切割的敏感性取決于切割位點的具體殘基。此處和別處的RLU表示相對發光(或光)單位。本實驗中未使用配體。圖6顯示在一個基于GPCR-重排的螢光素酶細胞分析中，激動劑誘導的螢光素酶活性，該分析使用與重排的螢光素酶連接的ADBR2受體，該重排的螢光素酶帶有不同的TEV 蛋白酶切割位點，在TEV切割位點X位置為R (左圖)，在X位置為V (右圖)。TEV蛋白酶與抑制蛋白融合。每張圖的χ-軸顯示零值(無激動劑)和10 μ M激動劑。圖7顯示在共瞬時轉染和部分瞬時轉染體系中基于GPCR-重排的螢光素酶細胞分析中，螢光素酶活性依賴于劑量的響應。在左圖中，蛋白酶切割位點構建體的纈氨酸被用在 CHO細胞中。ADRB2-luc和Arr-TEV構建體均被瞬時共轉染。在右圖中，用與ADRB2融合且含有R的螢光素酶構建體穩定地轉染細胞，然后再用Arr-TEV構建體對細胞進行瞬時轉染。圖8顯示備選的GPCR-重排的螢光素酶分析。表達構建體帶有與報道分子激活子結合的ADRB2，和與蛋白酶結合的抑制蛋白2。這些構建體都被瞬時轉染到HEK 293細胞中。 反應動力學在圖中以1小時(▲)和5小時(■)反應培養表示。圖9顯示一個在X位點帶有V并被受體ADRB2-TEV瞬時轉染的穩定表達抑制蛋白/重排的酶構建體的HEK細胞系(左圖)的生成，以及一個穩定表達Arr-lUC234S233并被受體-TEV構建體瞬時轉染的CHO細胞系的生成。圖10顯示在穩定表達抑制蛋白/重排的酶構建體且被ADRB2-TEV瞬時轉染的HEK 細胞中，關于激動劑(異丙腎上腺素)(■)、部分激動劑(▲)、拮抗劑加異丙腎上腺素 (▼)、拮抗劑( )以及一種非特異內源受體(·)響應的Per-Luc分析。圖11顯示V2 (加壓素受體2、激動劑和反向激動劑的GPCR Per-Luc分析評估。用抑制蛋白/重排的螢光素酶構建體穩定轉染的HEK細胞被V2-TEV構建體瞬時轉染，并被激動劑、8AVP、精氨酸加壓素誘導(左圖)。當這些細胞用反向激動劑分析時，觀察到了劑量依賴性，信號由抑制蛋白介導，而不是由G蛋白介導(右圖)。圖12顯示ADRB2的幾項基于β抑制蛋白的分析。在右圖中，按制造商的說明用 ADRB2瞬時轉染DiscoveRX HEK細胞，并用一種拮抗劑(普萘洛爾)(■)、激動劑(異丙腎上腺素)(▲)以及兩者的組合(·)測試(左邊)，右邊則用激動劑(■)、反向激動劑 (A)以及兩者的組合(·)測試。將右邊的分析結果與本發明對拮抗劑、異丙腎上腺素激動劑以及兩者組合的響應的分析結果進行了對比。左邊本發明的分析提供了更大的區分能力和更高的比活性。圖13顯示V2的基于β抑制蛋白的分析。圖中，V2反向激動劑(SR121463)誘導了一種獨立于G蛋白而依賴于抑制蛋白的信號。圖14顯示了幾種表達構建體，它們包含一個基本上是全長、但不是螢光素酶的完整拷貝的重疊，它們按本文講授的方法連接以形成一種重排的螢光素酶。CMV是巨細胞病毒啟動子。Luc2-456和Luc234-550基本上是全長的螢光素酶片段。在本例中，GS是一個由甘氨酸和絲氨酸組成的肽接頭。TEV切割位點在C-端有一個纈氨酸。圖15顯示一個監測細胞內蛋白質-蛋白質相互作用的分析實例。雷帕霉素 (Rapamycin)是一種免疫抑制藥物，可與雷帕霉素結合的蛋白質(FKBP12或FKBP)以及雷帕霉素哺乳動物目標(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素(FRB)結合域同時結合。mTOR是一種包含雷帕霉素結合域151的鼠絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，雷帕霉素結合域151是雷帕霉素IM 的哺乳動物目標。FKBP 152是具有雷帕霉素結合位點的12kDa Π(506-結合的蛋白質。TEV 蛋白酶與mTOR的雷帕霉素結合域即FRB 151融合。重排的報道分子活化蛋白質則與FKBP 152，即FKBP12的雷帕霉素結合域融合。雷帕霉素巧4與FRB 151和FKBP 152反應、介導與它們的結合并使它們接近，導致重排的報道分子的活化。圖16顯示一種分析的構造，其中蛋白質A 21和B 23是兩個膜結合受體，它們在與配體結合時自發地發生二聚化(從左至由)或解離(從右至左)。此分析方法可監測兩個受體之間自發的相互作用或誘導的相互作用，其中一個受體或兩個受體與一個相同或不同的配體結合。或者，蛋白質A21和B 23可自發地發生二聚化，或不必與一個配體或調節劑(未顯示)結合。在這一實施方案中，蛋白酶和融合蛋白的重排的報道分子激活子部分被表達在細胞表面或人工包裝或單元的外表。本分析方法也可以構造成監測相互作用受體的破壞，如由信號衰減、減小或消失所表明的破壞，無論這種破壞是自發的還是由一個或多個分子介導的。圖17顯示一種細胞分析，其中蛋白質A 171和B 172存在于不同的細胞中，這些細胞可能結合、鄰接或相互作用等等。同樣，A 171或B 172可以帶有蛋白酶177或重排的信號活化蛋白質173。該分析可檢測兩個細胞上兩個標記受體之間的自發相互作用或誘導相互作用，以作為細胞-細胞之間相互作用或鄰近的證據，其中一個受體或兩個受體與一個相同或不同的配體結合。在這一實施方案中，蛋白酶177和融合蛋白的重排的報道分子激活子部分173在細胞表面或人工包裝的外表表達。活化的重排的報道分子175產生于蛋白質A 171和B 173的相互結合。或者，所研究的受體融合和細胞內蛋白質融合可存在于同一細胞中，所監測的誘導事件、配體等則表達在第二個細胞上或就是第二個細胞。本分析方法也可以構造成監測相互作用的受體和細胞的破壞，如隨著細胞的分離由信號衰減、減小或消失所表明的破壞，無論這種破壞是自發的還是由一個或多個分子介導的。一些代表性實施方案詳述本發明的分析方法檢測蛋白質-蛋白質相互作用，而無需事先了解調節該相互作用的化合物或由該相互作用引起的細胞途徑方面的知識。該分析方法可檢測膜蛋白質之間的相互作用，如同二聚體或異二聚體的形成。該分析方法可檢測膜蛋白與細胞質蛋白之間的相互作用。該分析方法可檢測兩個細胞質蛋白質的相互作用。該分析方法可檢測到蛋白質向細胞內空間或細胞內細胞器的易位。該分析方法可檢測兩個細胞或包裝或單元之間的相互作用。蛋白質A或B可與一種可能對蛋白質-蛋白質相互作用并非必不可少的配體、 輔因子或其它化合物、分子或物質結合。如本領域技術人員所知，術語“序列”在遺傳工程、核酸和蛋白質領域中有多種用法，在某個句子、段落、概念、想法、一節文字等上下文中可能具有不同的含義。例如，一個序列可代表一個多肽的特定的氨基酸殘基列表(一級結構)，或代表一個多核苷酸的核苷酸堿基列表。在另外的上下文中，序列可能指的是廣義的復合分子，如一個指整個分子而無需知道一級氨基酸結構的多肽序列。基因序列可與基因為同義詞且指的是多核苷酸本身或整體。序列可以指單個多肽或多核苷酸，也可以指它們的一部分。因此，當使用“序列有效連接”這樣的說法時，即表示單個基因、結構域或轉錄單元可以某種功能形式被連接或結合在一起，從而能夠表達所述結合或連接的單個基因、結構域、轉錄單元等。這些序列也可以是一個特定的表達基因或蛋白質的組成部分，如具有多個功能部分或結構域的蛋白質的結構域。如本領域內已知，所研究的多核苷酸可以是DNA或RNA，或兩者的混合物。在本發明的實踐中制造和使用這些多核苷酸的方法在本領域內是已知的。例如，圖4顯示對于細胞核激素受體調節后活性的分析。由于報道分子活化蛋白質和任選地一種可檢測而可作為報道分子的分子的重排，細胞核激素受體向細胞核的轉運引起或激起一個信號，例如作為對活化蛋白質例如螢光素酶的活性的響應而出現的熒光改變或熒光的存在。生成的信號可為任何可檢測的變化，如強度的變化或激發/發射參數的變化。化學發光是另一種常見的報道分子信號。本領域熟練技術人員將會理解，一個蛋白酶或一個重排的報道分子都可被構建成具有細胞核和其它目標多肽。這樣的目標多肽可包含堿性氨基酸。兩者在目標區域產生相互作用時，信號將得到調節。對于GPCR而言，本分析方法是特異的、靈敏的，且不需要事先知道特定G蛋白偶聯方面的知識。該分析方法不受內源GPCR的影響，可用來鑒別分子、包括激動劑、拮抗劑以及 (某些受體)的反向激動劑。本發明的分析方法是對Lee等人的方法的改進，避免了對轉錄擴增的需求。本發明提供了一個更迅速和更直接的讀數。本發明提供了一種比Lee等人的更簡單、更可靠的分析體系，其部分原因是本體系不需要將試劑轉移至細胞核并在其后轉錄擴增信號。因此，讀數可接近受體調節事件。本發明不像Lee等人的方法那樣，需要細胞核。事實上，本發明的一種應用就是檢測分泌的蛋白質。細胞質中的報道分子和蛋白酶均可激活(或失活)來自分泌的伴侶蛋白質的信號。 另一個實施方案是用于去核細胞，或人工細胞、包裝或單元。對于能調節任何蛋白質-蛋白質相互作用的分子的鑒別，本發明尤其有用。 DiscoveRX 分析是一項使用β抑制蛋白的分析，要求兩個相互作用的蛋白質組分在所有時間都保持在一起，用以產生信號。大多數先前的GPCR分析均基于G蛋白信號，如FLira和 cAMP分析法。任何影響Ca++或cAMP水平的分子都易產生假陽性信號。另一方面，本發明的方法快速、可靠且成本低廉，同時獨立于可能影響靈敏度和特異性的酶組分結合或G蛋白信號。本發明通過使蛋白質A(或蛋白質B)與報道分子活化蛋白質(報道分子調節蛋白質/分子或報道分子活化蛋白質/分子是與其相當的)融合而提供了一種分析或篩選任何蛋白質-蛋白質相互作用的手段。該手段的一個實例就是含有蛋白水解切割位點的重排的酶。蛋白質B與蛋白酶融合。蛋白質A和蛋白質B的相互作用可以是組成型的或由第三個分子誘導的。本領域熟練技術人員可使用本發明的分析方法來鑒別增強或干擾蛋白質-蛋白質相互作用的分子。或者，蛋白質A可與一種蛋白酶融合，蛋白質B則可與一種報道分子活化蛋白質融合。本發明的報道分子活化蛋白質是潛伏的，可在與第二蛋白的蛋白酶作用時被激活。一種令人感興趣的做法就是產生一個報道分子活化蛋白質，該報道分子活化蛋白質是重排的分子，被構建為包含蛋白酶切割位點。當切割時，報道分子活化蛋白質的部分可結合、裝配以及諸如此類以產生一個活性的報道分子活化多肽或裝配。這一活性的，例如酶學上活性的報道分子活化蛋白質然后可作用于適當的底物如報道分子，從而產生可檢測的信號。例如，當該重排的、非活性分子是螢光素酶時，當切割而形成生物上活性的螢光素酶時， 此螢光素酶可作用于適當的底物如螢光素，以產生可檢測的信號，在本例中即為發光。在另一個實施方案中，報道分子活化蛋白質是報道分子。因此，這可被看作是報道分子活化蛋白質在切割時發生的自活化。一個實例是GFP，GFP在切割時發生重排并產生一個獨立于報道分子體系的可檢測信號；如當報道分子激活子為螢光素酶時，該報道分子體系為一種提供螢光素的試劑。重排的報道分子活化基因可構建成為活性的或非活性的形式。例如，在研發這一技術的時候，構建了一種GPCR-非活性的重排螢光素酶融合物，其中螢光素酶氨基酸序列的次序被改變。原來的N端片段被移到了 C端，原來的C端片段被移到了 N端，一個蛋白酶識別位點被用于融合這兩個次序改變了的片段。GPCR-非活性的重排螢光素酶融合蛋白與 β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白之間的相互作用導致非活性的重排螢光素酶的切割，以及一種重構螢光素酶活性的產生。采用備選策略，本發明人構建了一個GPCR-活性的重排螢光素酶融合構建體，其中將一個蛋白酶識別位點引入到原來次序的螢光素酶序列，而沒有顯著地影響螢光素酶活性。GPCR-活性的重排螢光素酶融合蛋白與β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白之間的相互作用導致活性的重排螢光素酶的切割，并產生兩個非活性的螢光素酶片段，結果導致了活性喪失，信號也因此變小或喪失。報道分子活化蛋白質可從基于重排的蛋白質的報道分子中選擇，如Gaussia螢光素酶；水母螢光素酶；β內酰胺酶；β半乳糖苷酶；以及熒光蛋白質，如包含蛋白水解切割位點如TEV切割位點的綠色熒光蛋白質(GFP)或DsRed蛋白質等。雖然“酶”是作為一個通用術語使用的，報道分子活化蛋白質本身卻并不限于“酶”，而是指任何能夠使信號發生變化的報道分子活化蛋白質。例如，結合或螯合一個熒光蛋白就可能產生一種足夠的信號變化，而無需改變分子結構的化學反應。作為本發明的一個特點，熟練的分子生物學家或蛋白質化學家可使用不同的斷開點和不同的重疊區域以降低或增加蛋白酶活性、基本螢光素酶活性或重構的螢光素酶活性來構建重排的螢光素酶變體。參閱 Rachel B. Kapust，et al. Biochemical & Biophysical Research Communications,294(2002)949-955。蛋白酶是本領域人士所熟知的，可從各種各樣的來源選擇，如細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲、哺乳動物等。生物體需要蛋白酶來處理肽，因此，生物世界提供許多各種各樣的適用于本發明的蛋白酶。對于一種所需的酶而言，適當切割位點的選擇通常可以從文獻中或產品目錄中查到。這樣的蛋白酶切割位點是各種長度的寡肽，如兩個氨基酸、三個氨基酸、 四、五、六、七、八、九、十個或更多個氨基酸等。重排的報道分子活化蛋白質也可以用備選的蛋白酶切割位點取代或連接到一個或多個在切割后能夠轉化為活性酶的非活性酶原前體。例如，酶原前體的切割位點可被修飾成對一種能識別與野生型序列不同的序列的酶敏感。或者，還可以修飾切割位點以獲得特別希望的效果，如更高的特異性，對切割更敏感等。也可以用一種帶有蛋白酶切割位點的活性酶來完成分析，該活性酶在切割后轉變成非活性酶。這一特點具有某種簡單性，因為多種具有不同特異性的蛋白水解酶可根據需要而作用于活性酶，不需要或僅需要極少的重新構建。哺乳動物細胞，如HEK293、C0S_7、NIH3T3等，以及酵母細胞可用來建立蛋白質-蛋白質相互作用重排報道分子活化蛋白質的分析。也可使用無細胞的體系。此類無細胞體系包括裂解物、膜制備物、病毒儲備液、病毒樣顆粒、脂質體、血小板、膜制備物、蝸形菌 (cochleates)、其它人工制備的基于脂質的單元或包裝，它們刺激生物膜而形成一種能夠封閉、附著、攜帶、包含一個生物實體如跨膜蛋白質的結構。生物體如轉基因生物體也可用于本分析方法，或能夠提供可用于本分析方法的細胞或試劑。本發明的分析方法還提供一種可檢測的報道分子。該報道分子是所研究的報道分子活化蛋白質的底物。因此，在重排的螢光素酶的情況下，適合的報道分子是螢光素，它在螢光素酶作用下，能產生一種可檢測的發光信號。報道分子也可以是細胞內的，從而可提供一種避免細胞裂解的分析方法。例如，融合到麥芽糖結合蛋白質(MBP)羧基端的GFP 當MBP信號序列存在時是不發螢光的。當MBP信號肽被除去后，就可以觀察到熒光。參閱 Feilmeier et al. ,J Bacteriol 182 (14) 4068-4076，2000。因此，如本文所教導，蛋白酶切割位點可被引入到MBP信號肽的下游，以產生一種可使用活細胞的分析。本分析方法可利用重排的螢光素酶或熒光蛋白質來監測蛋白質相互作用復合體的亞細胞位置和位移。圖4是這樣一個實施方案的圖示。本發明涉及一些方法，用于確定所研究的物質是否調節以下蛋白之間的相互作用i)第一蛋白，如膜結合蛋白，例如一種受體，如跨膜受體，與ii)第二蛋白，如一種細胞內分子、另一種跨膜蛋白質等，例如抑制蛋白家族的成員。一種方法涉及細胞的共轉化或共轉染，該細胞可以是原核或真核的且包含兩個構建體。第一構建體包括編碼以下物質的第一核酸(a)第一蛋白，如跨膜受體和(b)蛋白酶的一個切割位點，以及(C)編碼一個能活化報道分子的蛋白質的第二核酸。第二構建體包括(a) —個編碼第二蛋白的核酸，該第二蛋白與第一蛋白的相互作用被測量和/或被測定，以及(b) —個編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性并作用于第一構建體切割位點的多肽的核酸。在某些實施方案中，一個或更多這樣的構建體可穩定地整合到細胞中。本發明一個實施方案的一些特點如圖1所示。簡言之，獲得一個表達所研究第一蛋白的細胞。所研究的蛋白質可包括蛋白水解部分，或者該蛋白水解部分可在結合或釋放結合的配體時與復合體結合。作為對配體結合狀況變化的反應，一種非活性的酶與肽部分連接，所述肽部分結合所研究的第一蛋白。在本實施方案中，蛋白酶與非活性酶的接近使得酶活性如螢光素酶活性發生重構。重構的活性影響蛋白質-蛋白質相互作用的報導。圖1所示的實例顯示一個跨膜蛋白質、一個TEV切割酶、一個重排的螢光素酶和一種螢光素酶底物，如螢光素。此例中的蛋白質“A”可以是抑制蛋白。所研究的第一蛋白可以是GPCR。螢光素酶的N端和C端可重排并與TEV蛋白酶切割位點連接，以產生一種非活性的重排的螢光素酶。所示的重排的螢光素酶與β抑制蛋白2融合。蛋白質A可與蛋白酶融合。蛋白質B可與一個非活性的重排的報道分子活化蛋白質融合。蛋白酶識別和切割位點(被一個融合到蛋白質A的蛋白酶識別)被插入重排的報道分子活化蛋白質。蛋白質A和蛋白質B被例如調節蛋白質A和蛋白質B相互作用的第三個分子帶到彼此接近的位置。重排的非活性報道分子活化蛋白質被附近的融合蛋白酶水解，導致重排的非活性報道分子活化蛋白質的兩個片段融合，從而重新產生活性的報道分子活化蛋白質活性。報道分子活化蛋白質的活性可用適當的試劑、裝置，使用一種適當的報道分子如螢光素使用市售的試劑和試劑盒來進行評估。作為蛋白質A的GPCR可與TEV蛋白酶融合。或者，GPCR也可與重排的報道分子活化蛋白質融合。圖1中，一個與GPCR結合的分子導致β抑制蛋白與GPCR的相互作用。重排的螢光素酶內的切割位點被與蛋白質A連接或在蛋白質A附近的TEV蛋白酶水解而產生螢光素酶蛋白質片段。這些片段重構成活性的螢光素酶，可利用一個適合的能測量螢光素酶活性的報道分子，如細胞中或裂解產物中的螢光素來檢測或推斷其存在。該方法可對受體蛋白質如與G蛋白或β抑制蛋白發生作用的GPCR產生特異的信號。圖1所示的一般方法通常適用于GPCR，因為β抑制蛋白的募集是一種常見的現象。但是，任何相互作用、結合或締合等或懷疑有相互作用、結合、締合等的分子對均可用于本發明的實踐。一個示范性的方法采用β抑制蛋白信號途徑且不需要事先了解具體G蛋白偶聯的知識，因為此分析方法對GPCR或對所涉及的G蛋白并非是特異的。因此，此分析方法對孤兒GPCR來說很理想，因為其中的G蛋白偶聯途徑未知。該方法產生立即的和生理學相關的讀數，而無需像美國(Lee等人的)第7，049，076號專利那樣進行轉錄擴增。這些材料和方法也使得能夠監測G蛋白獨立的現象。在這種情況下，可用重排的報道分子活化蛋白質來標記β抑制蛋白。一個懷疑或已知與β抑制蛋白相互作用的分子可用適當的蛋白酶，如顯示對β抑制蛋白有偏向性的GPCR來標記。相對于酶片段互補分析(如DiscoveRX PathHunter β抑制蛋白分析)，本發明具有優勢，因為在酶片段互補分析中，相互作用的配偶體必須接合或在一起，以確保酶片段的互補。另一方面，在本發明的方法中，一旦因試劑接近而發生蛋白質水解，就生成了活性的報道分子激活子，不需要蛋白質相互作用配偶體保持結合狀態即可獲得有意義的分析。編碼這個第一融合蛋白的核酸和其它肽組分可被引入宿主細胞。此類細胞改造在本領域內是眾所周知的。各種肽的核酸可構建成單一的分子，也可先后或同時引入。例如， 某些構建體可以整合進宿主染色體，以獲得穩定的轉染，所使用的材料和方法是本領域內已知的。在另一個備選體系中，所研究的兩個蛋白質可以在無配體或受試化合物存在情況下相互作用。配體和受試化合物可導致兩個蛋白質離解，改變構象，或減少或抑制其相互作用。在這種情況下，細胞中游離的、具有功能活性的蛋白水解酶的水平在一種陽性受試化合物存在的情況下就會降低，導致水解程度減少，報道分子活化蛋白的活性也明顯降低。在一個典型的實施方案中，抑制蛋白是在激動劑存在情況下與跨膜受體結合的第二蛋白；但是，應該理解，由于受體只是一種類型的蛋白質，此分析并不依賴于受體分子的使用，激動劑結合也不是能夠發生的唯一相互作用。任何能與第二蛋白相互作用的蛋白質都可以用，盡管人們感興趣的是跨膜蛋白質，因為受體暴露于調節劑時，它們引起細胞、器官和組織反應，所述調節劑加速細胞結合的受體進入活性狀態。此外，激動劑與受體的結合并不是可分析的唯一結合類型。反向激動劑也可以用本分析方法進行分析。可以按照本發明的方法測定拮抗劑本身，也可以測定不同的拮抗劑和/或激動劑的相對強度。本發明的其它細節，包括制造和使用本發明主題內容的具體方法和技術將在下面描述。如同本文所述的方法，作為本發明特點的產品也可以簡單地予以描述。例如，在 “三部分構建體”中，即一種含有編碼以下組分的序列的構建體i) 一種蛋白質，ii)切割位點，以及iii)報道分子活化蛋白質；該蛋白質可以是例如細胞內蛋白質或膜結合蛋白，如跨膜受體，例如GPCR家族的一個成員。該切割位點可為任何可水解的位點，其水解可在蛋白質-蛋白質相互作用的配偶蛋白質的蛋白酶作用下實現。切割可直接產生報導，或者切割也可使報道分子活化蛋白質進行重排，從而從另一個分子產生報導。第三部分則可以是一種蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽。可以修飾這些序列，使得它們編碼的蛋白質的C端與第二蛋白有更好、更強的相互作用。例如，此類修飾可包括用AVPR2、AGTRLI, F2PLI、CCR4、CXCR2/IL-8等的C端編碼區取代該蛋白質如GPCR的C端編碼序列。基因序列可以重新編碼以優化宿主細胞中所研究的蛋白質的翻譯。活化報道分子的蛋白質可以是一個在細胞質內或細胞器如細胞核內作用的蛋白質，或者也可以是一個引發級聯反應而引起另一蛋白質起作用的分子。本領域熟練技術人員對此類級聯反應很了解，因為它們是已經過深入研究的細胞事件。例如，易位信號，如一個細胞核易位序列可被整合至報道酶中。定位序列在本領域內為人們所熟知。第二個構建體，如上所述，包括一個編碼與第一蛋白作用的蛋白質的區域，導致某種可測量的現象。該蛋白質可以是一種激活子、競爭者、抑制劑、或一種產生協同響應的組分等等，或者更廣義地說，就是第一蛋白的“調節劑”。抑制蛋白家族的成員是范例，尤其當第一蛋白為GPCR時更是如此，但是，其它蛋白質編碼序列也可以使用，尤其是當第一蛋白不是GPCR時更是如此。這些兩部分構建體的第二部分編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽，該多肽切割由第一個構建體編碼的報道分子活化蛋白質，以生成能直接或間接地產生一種可檢測信號的報道分子活化蛋白質。但是，這些作為范例的實施方案并不限制本發明，如下文另一些實施方案中所討論的，例如，作為一種設計上的選擇，蛋白酶可以融合到蛋白質A或蛋白質B中。宿主細胞本文中所用的術語“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”可互換使用。宿主細胞也可以指一種可從其獲得裂解物的源細胞。所有這些術語還包括其后代，即任何和所有的后代。 應當理解，由于有意或無意的突變、選擇或分化，所有后代并不是完全相同的。宿主細胞可經工程改造以表達一種可篩選的或可選擇的標記物或報道分子，后者在受到第一個構建體的報道分子活化蛋白質作用時，會發出一種信號，其中第一個構建體的報道分子活化蛋白質是由作為第二構建體的融合蛋白之一部分的蛋白酶所切割。可篩選的標記物或報道分子可以任何方式引入宿主細胞或分析體系。無數的細胞系和細胞培養物都可用作宿主細胞。例如，可從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)獲得很多宿主細胞，ATCC是一個保存活培養物和遺傳材料的機構。根據載體骨架特征和需要的結果，本領域熟練技術人員可確定適當的宿主細胞。例如，質粒或粘粒可被引入原核生物宿主細胞中以復制許多載體。可用于載體復制和/或表達的細胞類型包括但不限于細菌，如大腸桿菌(如大腸桿菌菌株 RR1、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X 1776 (ATCC No. 31537)、大腸桿菌W3110 (Γ， lambda、原養型，ATCC No. 273325)、DH5 α、JM109和KC8)，芽孢桿菌如枯草桿菌；以及其它腸細菌如鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、各種假單孢菌，以及一些市售的細菌宿主如 SURE Competent Cells 和 S0L0PACK Gold Cells (STRATAGENE ，LaJolla)。在某些實施方案中，細菌細胞如大腸桿菌LE392可作為噬菌體病毒的宿主細胞使用。用于載體復制和/或表達的真核宿主細胞的實例包括但不限于HeLa、NIH3T3、 Jurkat、293 (HEK)、COS、CH0、Saos以及PC12。其它細胞，如酵母細胞和昆蟲細胞，如Sf9細胞，也是適合的。根據使用目的，本領域熟練技術人員可以選擇他或她希望使用的宿主細胞。本領域熟練技術人員知道，有許多來自各種細胞類型和生物體的宿主細胞可供使用。類似地，病毒載體(包括噬菌體)可與真核或原核宿主細胞，尤其是允許載體復制或表達的細胞結合使用。宿主細胞不必為一個永生化細胞系。宿主細胞可來自干細胞培養物或原代細胞培養物，如造血干細胞、血管、上皮、平滑肌、脾臟、T細胞、B細胞、單核細胞等。宿主細胞可以是轉基因的，如包含另一生物體的遺傳物質。Lee等人的方法中不能使用的細胞也可用于本發明的分析方法，因為本發明的方法不需要活性轉錄。例如，去核細胞如紅細胞或血小板均可用于本發明。在本發明的分析中，宿主細胞意在包括人工包裝和單元，如脂質體和病毒樣顆粒。 這樣的結構通常模仿或模擬一個細胞或其部分，產生一種帶有由薄膜或其它結構與外部完全或部分隔離的內部空穴的封閉結構。如上所述，這樣的人工制備的包裝和單元包括脂質體、蝸形菌、病毒樣顆粒、病毒等。蛋白質本發明考慮使用任何兩種已知或懷疑具有物理相互作用的蛋白質。在某些實施方案中，蛋白質以融合蛋白的形式存在或構建成以融合蛋白的形式存在，第一蛋白融合到一個潛伏的或非活性的報道分子活化多肽上，第二蛋白融合到一個能夠識別第一融合蛋白上切割位點的蛋白酶上，第一融合蛋白的切割釋放出報道分子活化多肽或使其具有活性。至于所研究的第一蛋白，它可以是一種天然出現的膜結合蛋白，或通過構建使之成為膜結合蛋白。例如，第一蛋白可以是跨膜受體如GPCR，或任何其它所研究的跨膜受體， 包括但不限于受體酪氨酸激酶、受體絲氨酸/蘇氨酸激酶、細胞因子受體等等。此外，眾所周知，蛋白質的某些部分將和全長的第一蛋白以同樣的方式起作用，這樣的第一蛋白的活性部分、如分子外結構域或跨膜結構域，都屬于本文蛋白質的定義之內。本發明可用于分析與任何蛋白質的相互作用，而不限于僅分析膜結合的受體，如 GPCR，這對于本領域熟練技術人員來說是很顯然的。例如，其它類別的跨膜受體的活性，包括但不限于受體酪氨酸激酶(RTKs)，如IGF1R，如上皮成長因子受體(EGFR)、ErbB2/HER2/ Neu或相關的RTK ；受體絲氨酸/蘇氨酸激酶，如轉化生長因子- β (TGF β )、激活蛋白或骨形成蛋白(BMP)受體；細胞因子受體，如白細胞介素、紅細胞生成素、G-CSF、GM-CSF或腫瘤壞死因子(TNF)的干擾素家族的受體；瘦蛋白受體；以及其它通常不必是膜結合的受體，如雌激素受體I(ESRl)和雌激素受體2(ESM)。在每種情況下，該方法可能涉及用一種經修飾的受體多核苷酸來轉染細胞，該多核苷酸指導嵌合的或融合的蛋白質的表達，包括所研究的受體、蛋白酶切割位點和報道分子活化多肽。該細胞可用第二種多核苷酸，如一種載體共轉染，該載體指導嵌合的或融合的蛋白質的表達，包括一種與能識別并切割第一蛋白切割位點的蛋白酶融合的相互作用蛋白質。第一個和第二個多核苷酸可被包括在單一的分子內，從而避免了共轉染。在RTK的情況下，如EGFR，這一相互作用蛋白質可由含有多肽如磷脂酶C(PLC)的SH2(Src同源域幻或含有轉化蛋白質1 (SHCl)的Src同源2域組成。在受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的情況下，如TGFii、激活蛋白和BMP受體，這一相互作用的多肽可以是Smad蛋白或其一部分。在細胞因子受體的情況下，如干擾素α、干擾素β或干擾素 Y受體，這一相互作用的蛋白質可以是一種信號轉導和轉錄激活(STAT)蛋白，例如但不限于乂3丨1或乂3丨2 ；或Janus激酶(JAK)蛋白，Jakl、Jak2或Tyk2 ；或其部分，等等。該轉染細胞可包含一個受報道分子活化蛋白作用的報道分子。然后進行了一項分析，其中用一種受試化合物對該轉染細胞處理一定的時間，在測試末期，測量了報道分子的活性。如果受試化合物激活所研究的報道分子，則會激發所研究的受體和相互作用的蛋白質之間的相互作用，導致蛋白酶切割位點的切割和報道分子活化蛋白質的活化，結果使報道分子活性產生了可測量的變化或增加。其它可能的蛋白質對包括抗體-抗原、酶-底物、二聚化蛋白質、信號轉導級聯組分，復合結構的組分，如核糖體或病毒，不同細胞上細胞間相互作用分子，如抗原呈遞細胞和用于響應的免疫細胞，如τ細胞、B細胞、NK細胞、樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞等等，以及本領域所知的其它蛋白質對。至于哪一個蛋白質，如A或B結合到哪個蛋白質或從哪個蛋白質解離，蛋白酶和具有蛋白酶識別位點的蛋白質是可交換的。報道分子報道分子可以是響應活性報道分子活化分子的活性而改變外觀或功能并產生一種可檢測信號或可容易地監測以便跟蹤這些變化的任何分子。這些術語旨在寬松地應用。 報道分子活化蛋白質一旦被活化(或在某些可能的實施方案中被失活)，將在報道分子中產生一種可檢測的變化。這種變化的檢測可用來確定例如一種受試化合物是否已調節了蛋白質-蛋白質相互作用。其它非酶報道分子活化蛋白質也可以使用，只要能產生一種可檢測信號即可。因此，某些已知的報道分子活化蛋白質，如半乳糖苷酶、過氧化物酶、螢光素酶等，都可以使用。某些已知的報道分子，如半乳糖苷酶底物、過氧化物酶底物、螢光素酶底物、GFP等，也可以使用。蛋白酶和切割位點蛋白酶是已被很好鑒定的酶，可在特定的位點切割其它蛋白質。一個蛋白酶家族， 即kr/Thr蛋白酶家族，可在絲氨酸和/或蘇氨酸殘基處切割。其它蛋白酶包括半胱氨酸或硫醇蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、氨肽酶、二肽酶和三肽酶、羧肽酶和肽基肽酶。 這些酶的選擇由本領域熟練技術人員決定，且不必限制于本文所述的分子。眾所周知，酶具有催化域，這些催化域可用來取代全長的蛋白酶。這些內容也包含在本發明之中。一個特定的實施方案就是煙草蝕刻病毒核包涵物A蛋白酶(TEV)，或其活性部分。正如本領域熟練技術人員所理解，蛋白酶的其它特定的切割位點也可使用。蛋白質的修飾在本分析方法的一些實施方案中，第一蛋白可加以修飾以增強其與作用蛋白質的結合。例如，已知某些GPCR在受到配體刺激時，其與抑制蛋白的結合更為穩定或具有更大的親和力，這種增強的相互作用是由分離的域，如C端尾部絲氨酸和蘇氨酸殘基簇介導的(Oakley, et al, J. Biol. Chem.，274 :32248-32257,1999and Oakley, et al.，J. Biol. Chem.，276 :19452_19460，2001)。利用這一實例可以清楚地理解，受體編碼序列本身可被修飾，以增加膜結合蛋白如受體與其所結合蛋白質之間的親和力。這些變化的范例是膜結合蛋白如7TMR的C端區域的修飾，其可能涉及利用與結合蛋白質有更高親和力但不影響受體結合功能的另一個受體之對應的區域來取代其一個部分。此外或備選地，也可修飾第二蛋白以增強其與第一蛋白的相互作用。例如，本分析方法可摻入點突變、截短或第二蛋白的其它變體，如抑制蛋白，已知抑制蛋白能更穩定地或以獨立于磷酸化的方式與激動劑占據的GPCR結合(Kovoor, et al.，J. Biol. Chem.，274 6831-6834，1999)。這樣的改變可用本領域已知的方法實施。分析法形式在幾個實施方案中，本發明提供一種簡單的方式來評估表達在同一細胞、單元或反應混合物中的兩個蛋白質之間的相互作用。第一個構建體可包括一個編碼第一個多肽的序列，該序列連接至一個編碼蛋白酶、蛋白酶部分或具有蛋白酶活性的多肽之切割位點的多核苷酸，其本身也連接至一個編碼報道分子酶的多核苷酸。“連接至”這一術語描述了這樣一種情況，其中所述的序列被融合而形成一個單獨、完整的可讀框，該可讀框可翻譯成一個包含所有元素的單一多肽。這些可以但不必被另外的核苷酸所分離，那些核苷酸可能編碼，也可能不編碼另外的蛋白質或肽。被插入重組細胞中的第二個構建體可同時包含一個編碼第二蛋白的多核苷酸以及蛋白酶、蛋白酶部分或編碼蛋白酶活性的多肽。這些基本要素綜合起來，當與一種其對目標蛋白質相互作用的影響待測的候選試劑相組合時，就形成了一種基本的分析法形式。但是，通過同時采用不同的報道分子，本發明還可以用于分析一種以上的膜結合蛋白如受體，每種受體因一種本文所述的不同種類的蛋白質的活化而被激活。例如，這可通過混合用不同受體構建體和不同報道分子活化蛋白質轉染的細胞來實現，或者也可以對每種受試受體融合不同的酶，并在用受試化合物處理時測量每種報道基因的活性。例如，可能希望確定所研究的分子是否激活第一個受體，并且希望確定是否應該預期作為與第二個受體相互作用的結果而出現副作用。在這種情況下，可能會涉及例如編碼第一個受體和第一個受體活化蛋白質，如IacZ的第一細胞系，編碼第二個受體活化蛋白質和第二個受體，如 GFP的第二個細胞系。在那種情況下，如本發明所實施的，GFP可以重排。可以將兩個細胞系混合，并加入所研究的化合物，然后尋找對一個細胞系的陽性結果，對另一個細胞系則沒有影響。本發明的備選形式既涉及只檢驗一對相互作用的蛋白質的分析，也涉及本文所說的“多重”分析。這類分析可以多種方式進行，但在所有情況下，都是同時分析一對以上的蛋白質。這可通過提供一個以上的細胞樣品來實現，每個樣品均被轉化或轉染，以分析每一對相互作用的蛋白質。可將不同的轉化細胞合并在同一個容器中并同時測試，或可將每種不同的轉化體放在不同的孔中再加以測試。或者，可對細胞進行處理使之帶有多種標記的第一蛋白，如基于跨膜的蛋白質，以確定一種配體或候選分子是否能激活一種以上的受體。本文所述的用于多重分析的細胞可以相同，但并非必須相同。類似地，每個樣品中所用的報道分子體系可以相同，但并非必須相同。當樣品放入容器如微陣列的孔后，可對照容器中多對相互作用的蛋白質篩選一種或多種化合物。圖10顯示用本分析方法所得的常見結果。在低濃度或高濃度時(取決于調節作用是否是抑制或活化)，受試化合物可能會沒有作用。隨著受試化合物濃度的降低或升高， 調節作用可能會發生變化。如圖10所示的劑量反應曲線可用于評估調節作用。單一的點也可予以評估。例如，該單一點可以是一個與對照或背景不同的預先確定的值。該預先確定的值是通過積累一定的數據或對“正常”受試者的樣品做多次測定，獲得帶標準誤和標準差的樣品群體平均值，從而通常在統計的基礎上確定的。可以用某個常數作為預先確定的不同值。一般而言，將使用比值，如至少偏離對照樣品10%，但更經常是用對照樣品的倍數，如在另一次分析中預先確定的對照值的大約ι. 5、2、2· 5、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000 或更多(或其倒數)倍。表明調節的預先確定的閾值通常是由本領域熟練技術人員根據情況的提示或需要，考慮情況提示或要求的平衡1型和2型誤差后計算得到的。試劑盒本文所述的任何組合物及其任何組合均可以試劑盒的形式提供。因此，試劑盒將包括適當容器中的一種或多種組分，如本發明的載體或細胞，以及可按照本發明使用的任何其它試劑。該試劑盒可包括一種或多種經適當等分的本發明組合物。試劑盒的組分可以水性介質或以凍干形式或以溶質在一種適當溶劑中的濃縮液形式提供。試劑盒的容器一般至少包括一個小瓶、試管、容量瓶、瓶子、注射器或其它容器，其中可裝入或已經裝入一種組分， 且最好是已經適當等分。在試劑盒包括一種以上組分的情況下，該試劑盒通常還包括第二個、第三個或其它額外的容器，分別容納其它組分。但是，也可將多種組分的各種組合裝在一個單一的容器中，如小瓶中。另外，還可提供適當的稀釋劑。本發明的試劑盒通常還包括封裝試劑容器的手段，以供商業銷售。這樣的容器可包括注射成型或吹塑成型的塑料或泡沫容器，以保存所需的試劑瓶以及說明書。當試劑盒的組分是以一種和/或多種液體溶液的形式提供時，該液體溶液可以是一種水性溶液，如特別有用的無菌水溶液。但是，試劑盒的組分也可以干粉的形式或附在固體支持體上的形式提供。當試劑和/或組分以干粉的形式提供時，可通過在干粉中加入一種適當的溶劑而進行重新配制。可以想見，該溶劑，如無菌水或適當的鹽水或緩沖液，也可裝在另一個容器內。
實施例下面給出一些說明本發明實施方案的特定實施例，但是，不應認為本發明僅限制于這些實施例。實施例1圖1顯示一個實施方案，它包括一個重排的非活性螢光素酶，該非活性螢光素酶的活性由于TEV蛋白酶對所包含的TEV蛋白酶識別位點的作用而得以重構。如圖所示，第一蛋白與一個蛋白酶融合。實施例1的設計是，用TEV蛋白酶的活性來重構重排的螢光素酶的活性作為第二蛋白的實施方案。如圖所示，第二蛋白與一種非活性重排的報道分子活化蛋白質即螢光素酶融合。一個與所研究蛋白質融合的蛋白酶所識別的蛋白酶識別和切割位點被插入重排的報道分子活化蛋白質。第一蛋白和第二蛋白被調節第一蛋白和第二蛋白之間相互作用的第三個分子帶到彼此相近的位置。重排的非活性報道分子活化蛋白質被附近的融合蛋白酶水解導致重排的非活性報道分子活化蛋白質的切割，形成兩個片段，從而重新產生活性的報道分子活化蛋白質。報道分子活化蛋白質的活性可用適當的試劑和裝置來評估。重排的螢光素酶通過重排螢火蟲螢光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸234至550而構建，并被一個TEV蛋白酶識別位點ENLYFQX(SEQ ID NO 3)中斷。在這一位點的切割導致重排的螢光素酶的重構活性。X的位置可為任何決定TEV蛋白酶識別親和力和切割效率的氨基酸。改變X已顯示可調節TEV的酶動力學。識別序列中其它位點的類似的氨基酸取代也能改變酶動力學。調節動力學有利于優化諸如篩選過程中的培養時間和影響信/噪參數的背景活性。重排的螢光素酶(luc234X233，其中X是TEV七肽切割位點N端的具體氨基酸，SEQ IDNO 3)然后被融合到一個GPCR即ADRB2的C端，從而產生 GPCR-重排的螢光素酶ADRB2-luc2;34X233，即表達質粒。實施例2通過使煙草蝕刻病毒蛋白酶A與β抑制蛋白2的C端融合，構建了人類β抑制蛋白2-TEV融合質粒。利用適當的模板由PCR生成了所有的DNA片段。GPCR_luc234X233融合基因被亞克隆在具有新霉素選擇標記的pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)，Arr-TEV融合基因被亞克隆在具有博來霉素(zeocin)選擇標記的pcDNA3. 1(+) (Invitrogen Cat. #43-0018)中。實施例3利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-luc234R233(實施例1)和Arr-TEV質粒 (實施例2)共轉染CHO-Kl細胞。轉染48小時后，細胞用或不用10 μ M ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理2小時，向細胞中加入了并用適當的發光讀出儀記錄了裂解物的相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光活性增加了三倍以上。圖5顯示加入或不加入Arr2_TEVp時GPCR/重排的螢光素酶的表達。圖中所示的數據中，構津體被引入到細胞中，佰是,轉染的細胞沒有接觸仵何調節劑。因此,數據表明， 當切割位點含有絲氨酸時,有一㈣自發的活件，佰是當X是R或V時,基本上沒有背景噪咅 m現。如圖6中所指m的，當表汰Rggv切害ι附點的細胞蔣觸激云Mi耐，觀惠到了π向良圖 7顯示瞬時和穩定表達GPCR-1UC234V233和/或Arr-TEV的細胞中螢光素酶活性的依賴劑量的響應。實施例4圖8顯示，5小時或1小時的培養時間已足以分析蛋白質-蛋白質相互作用。圖中清楚地顯示了劑量響應關系。通過使煙草蝕刻病毒蛋白酶A與ADRB2的C端融合并用zeocin選擇標記 (Invitrogen Cat #43-0018)將融合的基因插入 pcDNA3. 1 (+)，從而構建了 ADRB2-TEV 融合基因表達質粒。利用本領域已知的適當模板通過PCR生成了所有的DNA片段。通過使重排的螢光素酶luc234X233與β抑制蛋白2的C端融合，構建了 β 抑制蛋白2-重排的螢光素酶(Arr-luc234X233)融合基因表達質粒。TEV蛋白酶切割位點是 ENLYFQ/X, (Rachel B. Kapust, et al. Biochemical & Biophysical Research CommunicationsJ94(2002)949-955)，其中E和Q—般是不變的，其中X可為任何氨基酸， 盡管G和S是在該切割位點常見的氨基酸。切割發生在Q和X殘基之間。X可決定切割的效率。在某些實施方案中，TEV螢光素酶切割位點被包括在重排的螢光素酶中。利用簡單的常規實驗可改善背景和信/噪比。例如，經發現，在某些應用中，在TEV的X水解位點用纈氨酸代替甘氨酸可降低背景。使用一種新霉素選擇標記(Invitrogen)在pcDNA3. 1 (+)中克隆了融合的融合基因。利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-TEV和Arr_luc234V233質粒共轉染HEK293細胞，其中TEV識別序列為ENLYFQV(SEQ IDNO 12)。轉染48小時后，用不同濃度的ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理細胞1小時和5小時，然后向細胞中加入 Bright-GL0TM(Promega)，并在EnVison II 上記錄了相對發光單位。用異丙腎上腺素培養 1小時和5小時后，觀察到了劑量依賴的發光活性。實施例5圖9左邊顯示，穩定表達Arr-luc2;34V233以及瞬時表達ADRB2-TEV融合蛋白的 HEK293細胞中配體誘導的螢光素酶活性。右邊顯示，CHO細胞中抑制蛋白報道分子活化蛋白質構建體的穩定表達和7TMR-蛋白酶融合物的瞬時表達。在HEK293或CHO細胞中，產生了表達GPCR-luc2;34R233或Arr-TEV的穩定細胞系。 在一個12孔板上用Lipofectamine以每種DNA 20ng/孔對HEK293和TranIT-CHO細胞進行轉染。在per-luc分析中，通常使用384孔板。其它板形式也是可接受的形式。將穩定表達GPCR-luc234R233或Arr-TEV的CHO細胞以每孔10，000個細胞接種在一個用組織培養物處理過的表面384孔白色分析板(BectonDickinson)上。第二天，細胞用濃度為10 μ M至0.7pM的激動劑處理(在無血清的細胞培養基中按3 1系列稀釋)。使用Steady-Glo Luciferase AssaySystem(Promega)來測量螢光素酶的活性。經過2小時激動劑處理后，抽掉培養液并向每孔中加入25 μ 1螢光素酶分析試劑。相對發光單位(RLU)用Perkin Elmer 公司的多標簽讀數儀EnVision讀取。數據用PRISM軟件繪圖并分析。 通過選擇對新霉素的耐受性而生成穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。耐受新霉素的基因存在于Arr-luc234V233表達質粒載體pcDNA3. 1中。實施例6圖9右邊顯示CHO細胞系中異丙腎上腺素對劑量的響應。在CHO細胞中，產生了表達GPCR-luc234R233或Arr-TEV的穩定細胞系。利用 TransfectIT-CHO轉染試劑盒(Mirus Bio, Madison, WI)在一個12孔板上以每孔每種DNA 1 U g進行轉染。從轉染物中按照對新霉素和zeomycin的選擇性收獲了單個菌落。利用適當的市售的轉染試劑盒，用ADRB2-TEV質粒轉染了 Arr-luc234V233穩定表達細胞。用異丙腎上腺素培養瞬時表達ADRB2-TEV和穩定表達Arr-luc_234V233的細胞2 小時，然后向細胞中加入Bright-GLO 螢光素酶試劑。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性。實施例7圖10顯示用GPCR Per-Luc分析對激動劑、部分激動劑、拮抗劑以及非特異性內源受體響應的評估。利用Lopofectamine 2000 轉染試劑(Invitrogen)以 ADRB2-TEV 質粒轉染了穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。轉染48小時后，用不同濃度的已知激動劑異丙腎上腺素；部分激動劑BRL37344 (Sigma-Aldrich)、拮抗劑ICI118551 (ICI)、帶有200nM異丙腎上腺素的拮抗劑ICI118551，以及HEK293內源EDG受體的激動劑SlP (鞘氨醇-1-磷酸酯) 培養細胞2小時，然后向細胞中加入Bright-GLO 螢光素酶試劑。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性，如圖10所示。該分析的EC50和IC50值與FLII3R和cAMP分析所得的值類似。HEK293細胞中的內源受體EDG及其配體SlP不影響螢光素酶活性，而其它分析，如FLira和cAMP卻產生陽性信號。激動劑異丙腎上腺素產生了一種響應。部分激動劑BRL37344產生了一種逐漸變化的響應。拮抗劑ICI18551抑制了異丙腎上腺素，但是單獨沒有活性。因此，本發明的分析方法是特異的，如圖10(與其它可比的數據結合考慮)所示，產生較少的和較低的假陽性信號。實施例8圖14顯示一個實施例，其中利用一個TEV蛋白酶識別位點ENLYFQX并用V作為X， 通過將螢火蟲螢光素酶N端氨基酸2到456克隆到C端氨基酸234到550的后面，從而構建了一個重排的螢光素酶。該重排的螢光素酶(luc234V456)被融合到GPCR即ADRB2的C 端，以產生GPCR-重排的螢光素酶構建體，ADRB2-luc234V456表達質粒。利用適當的模板通過PCR生成了所有的DNA片段。用一種新霉素選擇標記 (Invitrogen)在 pcDNA3. 1 (+)中克隆了 ADRB2_luc234V456 融合基因。利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-luc234V456和Arr-TEV質粒共轉染 CH0-K1細胞。轉染后48小時，用或不用IOyM ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理細胞2小時，向細胞中加入了 Bright-GLO 或Steady-GLO (Promega)并用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。針對不同劑量的異丙腎上腺素，觀察到了重構的螢光素酶活性。根據對新霉素的耐受性而選擇穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。耐受新霉素的基因存在于Arr-luc234V233表達質粒載體pcDNA3中。觀察到了響應激動劑的螢光素酶活性。實施例9圖13顯示V2反向激動劑的劑量依賴性。本實施例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染了穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。轉染48小時后，使用不同濃度的經標準方法分析被認為是拮抗劑的化合物SR121463(sanofi Recherche, Toulouse, FR)培養細胞2 小時。將Bright-GLO 螢光素酶加入細胞。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性。隨著SR121463(更適當地定義為反向激動劑)量的增加，發光水平也增加。本分析中，反向激動劑表現出激動劑的行為，如同其它反向激動劑一樣。現已了解，反向激動劑可阻斷V2G蛋白質的信號通路，而促進β抑制蛋白介導的MAPK的活化 (Azzi et al.，PNAS，2003，100 :11406-11411)。因此，本發明的這一分析方法可表明G蛋白偶聯受體獨特的活性構象。相反，在經典的分析體系中，GPCR的反向激動劑表現出拮抗劑的行為。這是因為反向激動劑可能結合到并穩定了 GPCR的G蛋白信號的非活性構象。但是，某些反向激動劑既能穩定GPCR的非活性形式進行G蛋白信號傳遞，也能促進將β抑制蛋白募集到GPCR以活化β抑制蛋白信號途徑。實施例10圖6顯示激動劑誘導的螢光素酶活性。本實施例中，通過重排螢火蟲螢光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸 234至550而構建重排的螢光素酶，中間被一個TEV蛋白酶識別位點ENLYFQX隔開。位置X 可以是任何氨基酸。已知這一位置的氨基酸決定TEV蛋白酶的識別親和力和切割效率。然后，該重排的螢光素酶(luc234X233)被融合到GPCR即ADRB2的C端，以產生GPCR-重排的螢光素酶，即ADRB2-lucluc234X233表達質粒。通過使煙草蝕刻病毒蛋白酶A與β抑制蛋白2的C端融合而構建了人類β抑制蛋白2-TEV融合質粒。利用適當的模板通過PCR生成了 DNA片段。用新霉素選擇標記 (Invitrogen)，將 GPCR_luc234X233 融合基因在 pcDNA3. 1 (+)中亞克隆，用 zeocin 選擇標記，將 Arr-TEV 融合基因在 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen Cat. #43-0018)中亞克隆。利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV質粒共轉染 CH0-K1細胞。轉染48小時后，用或不用10μΜ ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理細胞2小時，向細胞中加入Bright-GLO 或Steady-GLO (Promega)并用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光活性增加了三倍以上。實施例11圖12顯示了使用本發明(左面)和另一種測定法(右面)的激動劑、拮抗劑、和反向激動劑的結果。兩個圖顯示了激動劑、拮抗劑和反向激動劑的區別和逆效應。本發明的方法提供了很好的比活性。實施例12圖7顯示帶有ADRB2-重排的螢光素酶和Arr-TEV的CHO細胞。左圖的 ADRB2-luc234V233數據經過處理包含TEV識別位點ENLYFQV。利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-luc234V233和Arr-TEV質粒共轉染CHO-Kl細胞。轉染48小時后，用不同濃度的ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理細胞2小時，向細胞中加入Bright-GLO 或 Steady-GLO (Promega)并用適當的發光讀出儀記錄相對發光。實施例13圖7的右面總結了使用帶有不同切割位點的穩定轉染細胞的數據。結果和左面的類似。因此，具有不同切割位點的兩種GPCR-螢光素酶構建體對激動劑均有響應。實施例14圖6顯示比較X為R和X為V時的激動劑誘導的信號活性。結果是類似的，表明 X通常可以改變。本實施例中，通過重排螢火蟲螢光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸233至550而構建重排的螢光素酶，中間被一個TEV蛋白酶識別位點ENLYFQ/X隔開。位于X的可以是任何決定TEV蛋白酶識別親和力和切割效率的氨基酸。顯示了 V和R。該重排的螢光素酶(luc234X233)被融合到GPCR即ADRB2的C端，以產生GPCR-重排的螢光素酶，即 ADRB2-lucluc234X233 表達質粒。本實施例中，通過使煙草蝕刻病毒蛋白酶A與β抑制蛋白2的C端融合而構建了人類β抑制蛋白2-TEV融合質粒。利用適當的模板通過PCR生成了所有的DNA片段。 使用新霉素選擇標記，GPCR-luc234X233融合基因亞克隆在pcDNA3. 1(+) (Invitrogen) 中，使用zeocin選擇標記，Arr-TEV融合基因亞克隆在pcDNA3. 1(+)中Qnvitrogen Cat. #43-0018)。利用適當的市售的轉染試劑盒，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV質粒共轉染 CHO-Kl細胞。48小時后，用或不用ΙΟμΜ ADRB2激動劑處理細胞2小時，向細胞中加入了 Bright-GLO (!Iomega)并用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光活性增加了三倍以上。實施例15圖11左面顯示瞬時表達V2-TEV的細胞中8-AVP激動劑的結果。本實施例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染穩定表達Arr-luc2;MV233的HEK293細胞。48小時后，用不同濃度的激動劑8-AVP(Arg8加壓素，一種已知的V2加壓素受體的激動劑)培養細胞2小時，并向細胞中加入Bright-GLO 螢光素酶試劑。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性。實施例16利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染了穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。48小時后，用不同濃度的反向激動劑培養細胞2小時， 并向細胞中加入Bright-GLO 螢光素酶試劑。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性。本分析中，反向激動劑表現出激動劑的行為。現已了解，某些反向激動劑可阻斷 V2G-蛋白質的信號通路，而促進β抑制蛋白介導的MAI3K的活化(Azzi et al.，PNAS，2003，100 :11406--11411)。因此，本分析可以評估G蛋白偶聯受體的獨特的活性構象。實施例17圖11右面顯示通過促進β抑制蛋白與V2受體的相互作用，V2反向激動劑產生的依賴于劑量的螢光素酶活性。本實施例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染穩定表達Arr-luc234V233的HEK293細胞。48小時后，用不同濃度的反向激動劑培養細胞2小時，并向細胞中加入Bright-GLO 螢光素酶試劑。在EnVison II上記錄劑量依賴的螢光素酶活性。本發明的其它特點對于本領域熟練技術人員而言是很清楚的，無需在此贅述。本領域技術人員可進行各種修改而不偏離本發明的精神和范圍。本文引用的所有文獻均通過引用以其整體納入本文。
權利要求
1.一種鑒定調節第一蛋白質和第二蛋白質之間相互作用的化合物的方法，該方法包括i)提供與一種非活性報道分子活化蛋白質連接的第一蛋白質以及與一種蛋白酶連接的第二蛋白質，其中所述蛋白酶能夠切割所述報道分子活化蛋白質中的切割位點，從而活化所述報道分子活化蛋白質 )提供所述化合物，以及任選地報道分子；iii)允許所述蛋白酶切割所述切割位點；以及iv)監測來自所述活化的報道分子活化蛋白質或所述報道分子的報道分子信號，所述報道分子的信號被所述報道分子活化蛋白質的活性改變；其中報道分子信號的改變表明發生了所述蛋白質-蛋白質相互作用。
2.權利要求1所述的方法，其中所述報道分子活化蛋白質是一種報道分子。
3.權利要求1所述的方法，其中第一蛋白質與所述報道分子活化蛋白質形成融合蛋白。
4.權利要求1所述的方法，其進一步包括提供一種已知調節蛋白質-蛋白質相互作用的分子，其中所述化合物調節所述分子與所述蛋白質-蛋白質相互作用的相互作用。
5.權利要求1所述的方法，其中所述報道分子活化蛋白質是酶。
6.權利要求1所述的方法，其中所述報道分子活化蛋白質是引起報道分子熒光變化的蛋白質。
7.權利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白質是一種膜蛋白質。
8.一種分析體系，其包括i)包含潛伏報道分子活化蛋白質的第一蛋白質；以及 )包含蛋白酶的第二蛋白質；以及任選地iii)報道分子，其信號被所述報道分子活化蛋白質改變；其中所述潛伏報道分子活化蛋白質是通過所述蛋白酶引起的切割而激活的，并且所述第一蛋白質與第二蛋白質的締合允許所述報道分子活化蛋白質發生切割。
9.權利要求8所述的體系，其中所述報道分子活化蛋白質是所述報道分子。
10.權利要求8所述的體系，其中所述報道分子是通過所述報道分子活化蛋白質的多肽片段的重排而被活化或失活的。
11.權利要求8所述的體系，其中所述第一蛋白質、第二蛋白質或兩者均為膜蛋白質。
12.權利要求11所述的體系，其中所述膜蛋白質是一種受體蛋白質。
13.權利要求12所述的體系，其中所述受體蛋白質是一種七跨膜受體(7TMI )。
14.權利要求8所述的體系，其中所述蛋白酶具有至少有4個氨基酸的識別序列。
15.權利要求8所述的體系，其中所述蛋白酶具有至少有5個氨基酸的識別序列。
16.權利要求8所述的體系，其中所述蛋白酶具有至少有6個氨基酸的識別序列。
17.權利要求8所述的體系，其中所述蛋白酶具有至少有7個氨基酸的識別序列。
18.權利要求8所述的體系，其中所述蛋白酶是煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶。
19.權利要求8所述的體系，其中所述報道分子是螢光素。
20.權利要求8所述的體系，其中所述報道分子是熒光蛋白。
21.權利要求20所述的體系，其中所述報道分子是綠色熒光蛋白(GFP)。
22.權利要求11所述的體系，其中所述第一蛋白質和第二蛋白質是膜蛋白質。
23.權利要求8所述的體系，其中所述第一蛋白質、所述第二蛋白質或兩者均為細胞質蛋白質。
24.權利要求23所述的體系，其中所述第一和第二蛋白質是細胞質蛋白質。
25.權利要求8所述的體系，其中所述第二蛋白質包含所述報道分子。
26.權利要求25所述的體系，其中所述報道分子蛋白質是一種重排的報道分子蛋白質，其通過與所述第一蛋白質接觸而活化或失活。
27.權利要求8所述的體系，其中締合需要所述第一蛋白質或所述第二蛋白質易位至細胞區室或細胞器。
28.權利要求27所述的體系，其中所述第一蛋白質或第二蛋白質向細胞核的易位導致報道分子信號的變化。
29.權利要求8所述的體系，其中所述報道分子或所述蛋白酶包含靶向細胞核的多肽。
30.權利要求四所述的體系，其中所述靶向多肽包含堿性氨基酸。
全文摘要
分析方法和體系利用蛋白質-蛋白質相互作用所導致的酶切割來調節(激活或失活)報道分子。
文檔編號G01N33/58GK102187225SQ200880110461
公開日2011年9月14日 申請日期2008年8月28日 優先權日2007年9月4日
發明者蔡濟東, P·S·懷特, P·韋森瑟, H·埃辛德雷羅 申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司