專利名稱：幼魚或魚受精卵的dna鑒定性別的方法
技術領域：
本發明屬于魚類胚胎和早期發育研究、發育毒理學研究、環境毒理學研究和環境監測領域，具體涉及一種受精卵(胚胎)或幼魚的DNA提取并鑒定性別的方法。
背景技術：
魚類是發育生物學、遺傳學、毒理學及環境監測等諸多學科和領域的重要試驗生物。其中，青鳉魚是一種用于研究性別分化機理很好的實驗動物。但是在胚胎和幼魚發育早期，青鳉魚的性別是很難從形態和顏色確定的。一直以來，青鳉魚的早期胚胎發育研究，特別是性別分化研究是通過性逆轉建立YY染色體型雄魚和XX染色體型雌魚繁殖產生單一XY染色體型雄性受精卵(胚胎)和幼魚，或建立XX染色體型雄魚和XX染色體型雌魚繁殖產生單一XX染色體型雌性受精卵(胚胎)和幼魚進行研究的。但是這種方法在培養性逆轉親魚的過程中要施加大量激素，現在的研究證明親代受到激素污染會對后代胚胎和幼魚的正常發育有影響。因此這種方法對研究魚類的正常發育可信度受到質疑。特別是在研究環境內分泌干擾物質(EDCs)對魚類早期性別分化和發育影響時，使正常試驗結果的可靠性大大降低。因此建立一種能夠從單卵中同步提取RNA和DNA，用RNA研究基因表達狀況，DNA鑒定性別的系統方法是非常有必要的。雖然現在生物技術中，RNA和DNA的提取方法有很多，但是大多需要時間較長，程序復雜，且效率不穩定。Trizol試劑以其簡便、快捷的特點成為現在提取RNA的首選。Trizol試劑的配方(按1L配制)水飽和酚380mL 38％(pH 4.8-5.2)；異硫氰酸胍118.16g終濃度0.8M；硫氰酸銨76.12g，終濃度0.4M；3M乙酸鈉溶液33.4mL(pH 5.0)，終濃度0.1M；甘油50mL 5％。但是目前Trizol試劑提取DNA的方法十分麻煩，效果不穩定，很難滿足試驗的要求。
發明內容
本發明針對目前Trizol試劑提取DNA的方法所存在的問題，提出一種提取幼魚或魚受精卵DNA并鑒定性別的新方法，可實現單個魚卵或一條幼魚的RNA和DNA的同步提取，然后采用DNA進行PCR反應鑒定性別，其準確性高。
一種幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，步驟包括(1)將單個魚卵或幼魚在Trizol試劑中勻漿；(2)在勻漿液中加入氯仿，混勻，低溫高速離心，分離RNA和DNA；(3)用Trizol試劑提取RNA后，剩余有機相中加入DNA提取緩沖液，混勻，50℃-75℃溫浴后，低溫離心10-15分鐘，呈現上下兩層上層水相，下層有機相；
(4)取上層水相加入核酸共沉劑，加入無水乙醇，離心，去除上清，酒精清洗，NaOH溶液溶解，調pH至8.0-8.4，即得到單個魚卵或魚苗的DNA溶液；(5)將提取的DNA溶液作為模板DNA，加入PCR引物進行PCR反應，PCR反應完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現條帶的為XY型雄魚，未出現該條帶為XX型雌魚。
DNA提取緩沖液(DNA Extraction Buffer，DEB)各組分濃度為3.5-4M異硫氰酸胍，0.1-0.5M硫氰酸銨，20-50mM檸檬酸鈉，1M Tris。
核酸共沉劑制備糖元經過DEPC(焦碳酸二乙酯)處理一段時間后，加乙醇沉淀；再經過Trizol處理純化，得到的無RNA酶和DNA酶的糖元即是一種核酸共沉劑。
PCR引物(青鳉魚專用)為引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’反應液為常規。PCR反應過程中預變性的溫度為94-97℃。
本發明的優點與技術效果較好的分離不同發育階段的單個魚胚胎和幼魚的RNA和DNA，RNA可用于檢測不同發育時期的基因表達狀況，DNA用于鑒定性別。本發明對Trizol試劑提取DNA的方法進行了革新，使組織樣品RNA和DNA的提取得以同步進行。本發明為從基因表達角度研究青鳉魚的早期胚胎發育提供了基本方法，使通過單個受精卵基因表達變化來檢測環境內分泌干擾物質的工作能夠進行。本發明單卵和幼魚性別鑒定準確性達到100％。
圖1本發明新方法與傳統方法提取10mg青鳉魚肝臟中DNA的效果比較1表示本方法提取DNA的效果；2表示某公司Trizol試劑提供DNA提取方法的效果；本方法提取效率顯著高；圖2本發明對11尾成熟雄魚和11尾成熟雌魚的性別驗證效果圖，結果表明本方法的鑒定結果與實際情況完全相符(以青鳉魚為例)；圖3本發明對隨機取來的24粒孵化5天的受精卵進行的性別鑒定結果。
具體實施例方式
首先進行核酸共沉劑制備，將普通肝糖元進行無RNA酶和DNA酶處理，具體的制備方法為將糖元經過DEPC處理8個小時以上；然后加乙醇沉淀；再經過Trizol處理純化，可得到無RNA酶和DNA酶的糖元。該糖元用作核酸共沉劑。
然后，進行DNA提取緩沖液(DNA Extraction Buffer，DEB)各組分濃度為3.5-4M異硫氰酸胍，0.1-0.5M硫氰酸銨，20-50mM檸檬酸鈉，1M Tris。
采用本發明方法的實施例一將一個5天的青鳉魚受精卵用液氮速凍，然后將其用200微升Trizol試劑迅速勻漿；將勻漿液轉移至1.5毫升離心管中；再用100微升Trizol試劑清洗勻漿器3次，清洗液合并入勻漿液。再加入100微升氯仿，混勻2分鐘；4℃12000g離心15分鐘。呈現上下兩層1.收集上層水相并轉移至一無RNA酶和DNA酶的1.5毫升離心管中，加100微克糖元(無RNA酶和DNA酶)混勻，加入300微升異丙醇混勻，4℃ 12000g 10min離心沉淀RNA，倒掉上清液，75％DEPC水配制的酒精清洗RNA，4℃ 12000g 5min，吸去酒精，空氣中干燥5分鐘(至酒精揮發完即可)，加20微升DEPC水溶解RNA。2.向下層有機相中加入DNA提取緩沖液150微升，混勻，55℃溫浴，4℃ 12000g 15min離心15分鐘。收集上層水相轉移至一新的1.5毫升離心管中，加入100微克核酸共沉劑，混勻。加入無水乙醇，混勻。4℃ 12000g離心10分鐘，去除上清，保留沉淀。75％酒精清洗兩遍?？諝庵懈稍?分鐘(至酒精揮發完即可)，NaOH溶液溶解DNA，調pH至8.4。該DNA可用于PCR檢測。參考圖1，本方法提取DNA效率比現有技術顯著提高。
采用上述方法制得的基因組DNA作為模板，進行PCR反應。PCR反應液配制5微升10×Taq buffer；25mM Mg2+；4微升dNTP(各2.5mM)；1.5單位Taq酶；1微升引物1(20μM)；1微升引物2(20μM)。加滅菌蒸餾水至50微升。
引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’PCR反應條件預變性96℃，30秒40個循環96℃，10秒；60℃，1分鐘延伸72℃，6分鐘PCR反應完成后。
參考圖2、參考圖3，按照此實施例提取DNA，并進行PCR反應后，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，850bp出現條帶者為XY型(雄魚)，未出現者為XX型(雌魚)。對24粒孵化5天的受精卵進行的性別鑒定結果，雌雄分別為1212?！岜硎綳Y型雄性，♀表示XX型雌性。
采用本發明方法的實施例二將一條孵化2天的青鳉魚幼魚用液氮速凍，然后用200微升Trizol試劑迅速勻漿；將勻漿液轉移至1.5毫升離心管中；再用100微升Trizol試劑清洗勻漿器3次，清洗液合并入勻漿液。再加入100微升氯仿，混勻2分鐘；4℃ 12000g離心15分鐘。呈現上下兩層1.收集上層水相并轉移至一無RNA酶和DNA酶的1.5毫升離心管中，加100微克糖元(無RNA酶和DNA酶)混勻，加入300微升異丙醇混勻，4℃ 12000g 10min離心沉淀RNA，倒掉上清液，75％DEPC水配制的酒精清洗RNA，4℃ 12000g 5min，吸去酒精，空氣中干燥5分鐘(至酒精揮發完即可)，加20微升DEPC水溶解RNA。2.向下層有機相中加入DNA提取緩沖液150微升，混勻，75℃溫浴，4℃ 12000g 15min離心10分鐘，收集上層水相轉移至一新的1.5毫升離心管中，加入50微克核酸共沉劑，混勻。加入無水乙醇，混勻。4℃ 12000g離心10分鐘，去除上清，保留沉淀。75％酒精清洗兩遍?？諝庵懈稍?分鐘(至酒精揮發完即可)，NaOH溶液溶解DNA，調pH至8.0。該DNA可用于PCR檢測。
采用上述實施例制得的基因組DNA作為模板，配制PCR反應液，進行PCR反應。PCR反應液配制5微升10×Taq buffer；25mM Mg2+；4微升dNTP(各2.5mM)；1.5單位Taq酶；1微升引物1(20μM)；1微升引物2(20μM)。加滅菌蒸餾水至50微升。
引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’PCR反應條件將PCR反應條件變為預變性97℃，10秒40個循環97℃，10秒；60℃，1分鐘延伸72℃，6分鐘PCR反應完成后。
1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以達到與實施例一同樣的效果。
權利要求
1.一種幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，步驟包括(1)將單個魚卵或幼魚在Trizol試劑中勻漿；(2)在勻漿液中加入氯仿，混勻，低溫高速離心，分離RNA和DNA；(3)用Trizol試劑提取RNA后，剩余有機相中加入DNA提取緩沖液，混勻，50℃-75℃溫浴后，低溫離心10-15分鐘，呈現上下兩層上層水相，下層有機相；(4)取上層水相加入核酸共沉劑，加入無水乙醇，離心，去除上清，酒精清洗，NaOH溶液溶解，調pH至8.0-8.4，即得到幼魚或單個魚卵的DNA溶液；(5)將提取的DNA溶液作為模板DNA，加入PCR引物進行PCR反應，PCR反應完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現目的條帶者為XY型雄魚，未出現該條帶者為XX型雌魚。
2.如權利要求1所述的幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，其特征在于核酸共沉劑為無RNA酶和DNA酶的糖元，其制備方法為將糖元經過DEPC處理一段時間后，加乙醇沉淀；再經過Trizol處理純化。
3.如權利要求1或2所述的幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，其特征在于配制DNA提取緩沖液為3.5-4M異硫氰酸胍，0.1-0.5M硫氰酸銨，20-50mM檸檬酸鈉和1M Tris。
4.如權利要求1或2所述的幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，其特征在于PCR反應的引物為引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’
5.如權利要求4所述的幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，其特征在于PCR反應過程中預變性和變性溫度為94-97℃。
6.如權利要求1所述的幼魚或魚受精卵的DNA鑒定性別的方法，其特征在于幼魚或單個魚受精卵首先進行液氮速凍，速凍后用Trizol試劑迅速勻漿。
全文摘要
本發明提供一種青鳉魚受精卵或幼魚的DNA鑒定性別的方法，屬于魚類胚胎和早期發育研究領域。該方法包括單個魚卵或幼魚的RNA和DNA同步提取技術；用Trizol試劑提取RNA后，剩余有機相中加入DNA提取緩沖液，混勻，50℃－75℃溫浴后，低溫離心10－15分鐘，呈現上下兩層，取上層水相加入核酸共沉劑，加入無水乙醇，離心，去除上清，酒精清洗，NaOH溶液溶解，調pH至8.0－8.4，得到單個魚卵或幼魚的DNA溶液；將提取的溶液作為模板DNA，加入性別特異PCR引物，進行PCR反應，PCR反應完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現目的條帶為XY型雄魚，未出現該條帶為XX型雌魚。本發明鑒定準確性高、效果顯著。
文檔編號G01N1/28GK1818623SQ20051001132
公開日2006年8月16日 申請日期2005年2月7日 優先權日2005年2月7日
發明者張照斌, 胡建英, 安偉 申請人:北京大學
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