專利名稱：用于診斷結直腸癌的蛋白質標記和所述標記作為所述癌癥類型治療的藥物靶點的用途的制作方法
用于診斷結直腸癌的蛋白質標記和 所述標記作為所述癌癥類型治療的藥物靶點的用途發明背景本發明總的涉及與結直腸癌相關表達的蛋白質，鑒定該蛋白質的 方法，篩選藥物的方法，該藥物影響該蛋白質的表達或活性，以及用 于治療和預防結直腸癌的治療性化合物。發明背景結直腸癌(CRC)是發達國家如US中的第三大癌癥類型，并且是 第二大癌癥相關死亡的原因。對于男性和女性，已經估算產生CRC的 終身風險接近6%。對于篩選，CRC是合適的疾病，因為它是具有長無 癥狀潛伏期的常見惡性疾病，并且如果在早期發現，具有高存活率。 因為累積的證據強烈地表明癌癥由所謂的腺瘤引起，通過檢測腺瘤和 導致除去它們的篩選程序可獲得CRC的預防。結直腸癌(CRC)是用來表示在結腸或直腸中產生的癌癥的術語。 結腸和直腸是消化系統的一部分，消化系統也稱為胃腸道或GI系統。 消化系統處理食物用于能量和除去固體廢物的主要部分(糞便物或糞 便)。食物在咀嚼和吞咽后，通過食道到達胃。食物在胃中得到部分 分解，然后送往小腸，也稱為小的腸道。詞語"小"指的是小腸的直 徑，其比大腸的直徑窄。實際上，小腸是消化系統的最長部分。小腸 繼續分解食物并吸收大部分的營養素。小腸在右下腹連接結腸。結腸 分成三個部分上升的(右側)，橫向的和下降的(左側)。結腸tehn 在左下腹連接直腸。結腸的功能是從食物繼續吸收水和礦物質并作為 廢物的存儲地方。該過程后留下的廢物是糞便，并進入直腸中，直腸 是消化系統的最后一個部分。糞便從直腸通過肛門排出體外。結腸和直腸的壁具有幾層組織。CRC在最內層開始并可以通過一些或全部其他層生長。知道一些關于這些層的知識是重要的，因為結 直腸癌的階段(擴散程度)很大程度上取決于入侵這些層有多深。結腸癌和直腸癌總地稱為結直腸癌(CRC)，具有許多共同的特征，并在 此一起討論。在大多數人中，結直腸癌在數年的時間段內緩慢發展。 在真實的癌癥產生之前，組織或腫瘤的生長通常作為非癌息肉開始， 其最終變成癌癥。息肉在結腸或直腸的內層上產生。特定種類的息肉， 稱為腺瘤息肉或腺瘤，具有成為癌的潛能。存在其他類型的息肉，稱 為增生性和炎性息肉。通常不認為炎性息肉和增生性息肉是癌癥前的。 但是一些醫生認為一些增生性息肉可能是癌癥前的病變或是人更可能 產生腺瘤息肉和癌癥的信號，特別是如果它們生長于右側或升結腸中。 另一種癌癥前情況稱為發育異常。這通常在患病如潰瘍性結腸炎的人 群中看到，潰瘍性結腸炎引起結腸的慢性炎癥。一旦在息肉內形成癌癥，其最終開始生長至結腸或直腸的壁中。 一旦它們在壁中，癌細胞可以生長至血管或淋巴管中。淋巴管是薄的 微小通道，帶走已經移出血管外的胞外流體和白細胞。它們首先排進 附近的淋巴結中，淋巴結是幫助對抗感染的豆形結構。當癌細胞擴散 至血管中時，它們可以移動至身體的遠側部分。將這種擴散過程稱為 轉移。超過95%的結直腸癌是腺癌。這些是排列于結腸和直腸壁內層 的腺細胞的癌癥。在結腸和直腸中也可能產生其他不太常見類型的腫 瘤，如 類癌一這些癌癥產生于腸的專門化激素產生細胞。
胃腸間質瘤一這些腫瘤產生于結腸壁中稱為"Cajal的間質細 胞"的專門化細胞。 一些是良性的(非癌的)；另一些是惡性的(癌 癥的)。盡管這些癌癥可以在胃腸道的任何地方發現，但它們通常在 結腸中。 淋巴腺瘤一這些是免疫系統細胞的癌癥，通常在淋巴結中產生 的，但也可以開始于結腸和直腸或其他器官中。通常在三種特定模式之一中觀察到CRC:散發的，遺傳的或家族的。散發疾病，沒有家族或遺傳的誘因，占據人群中結直腸癌的大約70%。散發結腸癌或CRC在大于50歲的人中是常見的，可能是膳食和 環境因素以及自然老化的結果。低于10%的患者具有結腸癌的遺傳誘因。遺傳的癥狀包括其中結 腸息肉是疾病主要表現的那些和其中它們不是的那些。將息肉病癥狀 細分成家族性腺瘤息肉病和錯構性息肉病癥狀。非息肉病的主要癥狀 包括遺傳的非息肉病結直腸癌(HNPCC) ( Lynch綜合癥I)和癌癥家 族綜合癥(Lynch綜合癥II)。盡管不常見，這些綜合癥提供了對所 有結直腸癌類型生物學的了解。第三和最少了解的CRC產生模式被認為是家族性結腸癌。在受影 響的家族中，結腸癌產生頻率太高以致不能認為是散發的結腸癌，而 且不是與遺傳的癥狀相一致的模式。高達25%的所有結腸癌病例可以 屬于該類別。認為散發結腸癌的分子基礎遵循致癌作用的多步驟模型。該模型 描述了遺傳情況的累積，每個情況給受影響的結腸細胞給予選擇性的 生長優勢。這些改變最終導致不受控制的細胞生長，增殖和無性肺瘤 產生。這些體細胞突變的累積效果是散發CRC的誘因。從該模型得到 四個主要的結論1) 結直腸癌由致癌基因的突變激活和肺瘤抑制基因的滅活引起；2) 惡性轉化需要細胞的至少四個或五個基因的體細胞突變。3) 多遺傳突變的累積而不是突變的次序決定了腫瘤的生物行為， 盡管APC基因的突變通常發生在過程的早期，而p53抑制基因的突變 通常發生在過程的晚期；和4) 結腸癌的致癌過程的特征適用于其他實體腫瘤，如乳癌和胰腺癌。最常遺傳的結腸癌綜合癥是家族性腺瘤息肉病和HNPCC。這些綜 合癥中的每一種是特定種系突變的結果。家族性腺瘤息肉病中，種系 突變通常是APC基因， 一種肺瘤抑制基因。在HNPCC中，醒R基因中的一種產生了突變，最常見的是hMLHl或hMSH2。錯構性息肉綜合癥中的幾種最近已經與種系突變相關聯。 一個實例是Peutz-Jeghers綜合癥，其由STK11腫瘤抑制基因的異常 引起。各種CRC的篩選程序是容易獲得的，包括糞便隱血測試(F0BT)， 軟乙狀結腸鏡，鋇灌腸和結腸鏡檢查。正積極地研究較新的方法，如 仿真結腸鏡檢查和糞便DNA測試。檢測CRC的最佳方法仍然有待研發。與其他篩選形態中的一些相比較時，鋇灌腸(雙重造影鋇灌腸； DCBE)存在潛在的益處，如較低的成本(與結腸鏡檢查相比較)和較 低的工作時間損失。 一些指向DCBE提高的能力，來更好地將損傷定位 于結腸的特定解剖片段，這是使用結腸鏡檢查難以做到的。這對于需 要外科手術的那些是重要的情況。最后，DCBE是安全的測試，具有 25, 000之一的預計穿孔率，以及由25, 000之一穿孔引起的死亡率。 在DCBE不利方面應該考慮這些潛在的益處，與結腸鏡檢查相比較時， 所述不利包括缺乏治療能力，較低的敏感性和患者不舒適性較高。在1988年首次將結腸鏡討論為CRC的平均風險篩選測試，并且從 那時起成為廣泛授讓的篩選方法，甚至是一些協會如美國胃腸研究院 (American College of Gastroenterology)的優選測試。腺瘤轉化成CRC過程中發生的分子情況理解的進展導致產生了檢 測糞便中流出的DNA中突變的測試。糞便中的DNA由細菌和結腸粘膜 的正常脫落物以及息肉和CRC產生。使用分子生物技術擴增糞便中少 量的肺瘤DNA.在近些年來，幾組研究人員已經成功地從CRC患者分 離出糞便中的DNA。基于來自可獲得研究的集合結果，糞便DNA測試 對于6W的入侵性CRC具有整體敏感性，95%的特異性，對于20%晚期 腺瘤具有敏感性。目前不存在關于總人群中糞便DM測試的公開數據。 糞便DNA測試是具有吸引力的，因為它是腫瘤特異性的，非入侵性的， 不需要腸制劑或飲食限制，并具有使用單個糞便收集物檢測整個結腸 長度瘤形成的潛在能力。目前的局限性包括缺乏來自篩選人群的數據， 需要測試精確性來測定需要多少或哪個標記，以及測試的費用。如所述的，目前糞便DNA測試的成本高并遠超過FOBT的。限制測試的腫瘤標記數量可以降低成本，但是這可能是在降低靈敏度的代價下。最近，美國癌癥協會(ACS)的結直腸癌咨詢小組評論了幾種可用 的篩選方法(例如，結腸鏡檢查，糞便隱血測試(F0BT)，免疫化學 糞便測試，膠嚢內鏡等)并推斷唯一推薦的CRC篩選技術是免疫化學 糞便測試，但是對于可以檢測早期腫瘤的改進方法存在強烈的需要 (Levin B等，CA Cancer J Clin. 2003. 53 (1):44-55 )。認識到對于可以用于大規模頻繁(一年一次或一年兩次)篩選的 改進診斷的需要，幾個小組正在對鑒定組織樣品或血液中的診斷標記 進行著工作。例如，最近已經將胸腺素oc鑒定為用于結腸癌活體檢查細胞的潛 在生物標記，使用新的色謙技術結合SELDI質謙。用于預后的另一個 潛在標記是硫氧還蛋白-1 ，因為它在組織樣品中的表達水平與結腸癌 的階段非常相關。已經表明血清胸苷磷酸酶為預測可切除CRC患者中 發生造血性轉移的新標記。單克隆抗體也已經用于檢測CD105蛋白(血 管生成的調節劑)及其配體TGF P的血漿水平并且提出CRC患者的預 后。然而，目前所用測試的共同特征是其相對低的預測價值，使得它 們需要補充其他程序，如生物活體檢查和/或內窺鏡檢查。考慮到現有 篩選方法的缺陷，可以推斷為了非常高置信度的診斷需要多個蛋白標 記。治療CRC的最常用方法是通過外科手術除去肺瘤，或通過化療和 放療。氟尿嘧啶(5-FU)和甲酰四氫葉酸(LV)常用于化療中，并且 最近已經引入多種新的試劑，包括伊立替康(CPT-ll)和奧沙利鉑， 這些導致治療的提高。新的時代正在開始，其中治療離開化療，并用 新的特定靶向劑來替代.最近使用這些試劑(如抗血管生成藥物，酪 氨酸激酶抑制劑和表皮生長因子阻斷劑)完成的或正在進行的臨床測 試已經提供了鼓舞人心的初步數據。如從以下引用的現有技術中可看出的一樣，已知蛋白質組分析能 夠鑒定各種蛋白質及其與CRC的相關性。這些蛋白質，就它們自身而言，可以得到上調或下調，是患者中CRC的指示劑。這些蛋白質中一 組的調節模式也可以作為CRC的指示劑。這些蛋白質可以用作治療CRC 或治療自身的目標。W005015224公開了診斷結直腸癌的方法，包括步驟a)提供從 個體獲得的液體樣品，b)在適于所述結合劑和RLA-O之間的復合物形 成的條件下，將所述的樣品接觸60S酸性核糖體蛋白P0 (RLA-0)的 特定結合劑，和c)使(b)中形成的復合物含量與結直腸癌的診斷相 關聯。WO04090550公開了使用幾個蛋白質標記診斷人樣品中結直腸癌 的方法，標記包括60S酸性核糖體蛋白PO (RLA-O)。這些標記的不 同表達模式表示個體患有結直腸癌和/或預示結直腸癌患者的疾病階 段。已經通過蛋白質芯片技術使用質傳測試來自健康個體和診斷為結 直腸癌個體的各種組織和血清樣品鑒定了標記。W004079368公開了鑒定癌細胞中表達的蛋白質(包括HSP90)的 特定蛋白質組方法。已經通過結直腸腫瘤樣品中表達的上調來鑒定每 個標記。使用借此從供體組織的冷凍部分回收蛋白質的方法，可以得 出選定組的正常結腸組織和選自患者的晚期結直腸癌的蛋白質特征， 基于最佳腫瘤組織學和細胞性從新鮮冷凍組織庫選擇供體組織。W000055633公開了鑒定結直腸癌中涉及的特定表達特征和核酸， 以及該表達特征和核酸在結直腸癌診斷和預后中的用途。通過蛋白質 組技術，如質譜測試，2D凝膠電泳測試等來實現鑒定。該參考文獻進 一步公開了鑒定和使用調節CRC的候選試劑和/或目標的方法。W002078636公開了用于檢測和/或治療CRC的方法和組合物.更 具體地，該參考文獻公開了結直腸癌相關的蛋白質和編碼該蛋白質的 核酸，這表示用于結直腸癌檢測的細胞標記和用于結直腸癌治療的分 子目標。W004021010公開了診斷結腸和胃癌的方法，通過測量患有這些疾 病患者組織中的各種表達水平。通過以下方法來測定表達水平，如 (a)檢測結腸癌相關基因的mRNA， ( b )檢測由結腸癌相關基因編碼的蛋白質，和(C)檢測由結腸癌相關基因編碼的蛋白質的生物活性，W004071267公開了煙酏胺N-曱基轉移酶(N醒T )在結直腸癌診斷 中的用途。此外，公開了從得自個體的糞便樣品診斷結直腸癌的方法， 通過測量該樣品中的N醒T。 NNMT的測量，例如，可以用于結直腸癌的 早期檢測或診斷中。WO05015234公開了蛋白質SAHH ( S-腺苷同型半胱氨酸水解酶)在 結直腸癌診斷中的用途。此外，特別涉及從得自個體的液體樣品診斷 結直腸癌的方法，通過測量該樣品中的SAHH, SAHH的測量，例如，可 以用于結直腸癌的早期檢測或診斷中。之前，已經證明了蛋白質組研究在鑒定這樣的標記中的成功是有 限的。W09842736和WO9843091公開了通過臨床樣品的蛋白質組分析 鑒定的特定差異表達的蛋白質標記，按照通過除去基質細胞和結締組 織污染物來富集肺瘤上皮細胞的費力方法。然而，最近，鑒定的鼠正 常和肺瘤結腸組織的蛋白質組比較在蛋白質表達模式中沒有統計學顯 著差異(Core等，Electrophoresis 21: 1772—81， 2000 )。還公開了以下的研究，關于各種癌組織中的一些標記KuniyasuH. ChiharaY. Kondo H. 0hmori H. Ukai R ( 2003 ) Amphoterin induction in prostatic stromal cells by androgen deprivation is associated with metastatic prostate cancer (前歹'J腺基質細胞中 通過雄激素耗盡的amphoterin誘導與轉移性前列腺癌相關)，Oncol Rep. 10 ( 6 ) : 1863-8; CappelloF. BellafioreM， Palma A， David S. MarcianoV， Bartolotta T. Sciume C， Modica G. Farina F. Zummo G. Bucchieri F. ( 2003 )60KDa chaperonin( HSP60 )is over—expressed during colorectal carcinogenesis (60KDa伴侶素(HSP60)在結直 腸癌形成過程中是超表達的,European Journal of Histochemistry 47 ( 2 ) : 105-10; Yamamoto S. Tomita Y. Hoshida Y. Sakon M， Kameyama M, Imaoka S. Sekimoto M, Nakamori S. Monden M， Aozasa K. ( 2004 )Expression of valosin-containing protein in colorectal carcinomas as a predictor for disease recurrence and prognosis(結直腸癌中含纈酪肽蛋白的表達作為疾病復發和預后的預測劑)，Clinical Cancer Research 10: 651—7。如從以上現有技術的討論可以看出，存在發現診斷腫瘤標記的各 種可能性。最簡單直接方法之一是使用患病的組織本身，但是如本發 明所證明的，現有技術不能鑒定重要的CRC標記蛋白質，如下所討論 的。因此，本發明的主要目的是鑒定現有技術中沒有公開過的CRC相 關的標記蛋白。因此，本發明描述了表1中所列目標蛋白作為CRC標記的用途， 并提供了用于該應用以及用于CRC治療中的方法。發明概述本發明人已經證明了來自正常和腫瘤組織的結腸活檢組織檢查的 代謝標記結合之后的2維凝膠電泳和質謙是鑒定CRC發展中涉及的蛋 白質的有力工具。本發明人已經通過檢測生物樣品中表1的蛋白質的存在鑒定了與 CRC相關的蛋白質。通常，生物樣品選自尿液，糞便，血液，CSF，唾 液，淋巴液和組織。合適地，組織是結腸和/或直腸的上皮組織。從診 斷的觀點可以明顯看出，尿液，糞便，唾液或血液是優選的。應用于這樣的生物材料的蛋白質組分析表明了對蛋白質水平引起 CRC發展的機理以及鑒定CRC診斷或治療中相關蛋白質的了解。與以上引用的現有技術相反，本發明人使用了新鮮的組織樣品， 即，沒有冷凍或另外儲存的樣品，儲存將導致一些獨特的蛋白質標記 的降解。盡快切除組織樣品，將它們立即轉移至細胞培養基中，并用 放射性同位素(例如，16["C]-氨基酸或["S]-甲硫氨酸的混合物)代 謝標記，這確保可以通過現有技術的蛋白質組分析的陳述來檢測標記 間隔過程中表達的任何蛋白質，即使間隔是幾分鐘。如以下詳細討論的，本發明的目標蛋白是有特定用途的，特別是 作為癌癥(特別是CRC)的診斷和預后標記。，它們可以用于輔助診斷疾病進展中 早期癌癥的存在和預測臨床上成功結果的可能性，特別是關于特定的 患者肺瘤對化療劑或化療劑組合物的敏感性或抗性。此外，這些目標 可以用于結直腸癌或其他癌的治療干預，例如，特異性地靶向肺瘤細 胞并降低健康組織中的毒性，和提供了評價候選治療化合物調節來自 結腸，直腸和其他組織的癌細胞的生物活性的能力的方法。因此，本發明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及基于特定腫瘤抗 原的超表達來區分胂瘤細胞和正常細胞，和通過利用肺瘤細胞內這些 抗原的不同表達來瞄準治療。本發明特別涉及與正常細胞內的表達相比較腫瘤細胞內超表達的 一個或多個蛋白質("標記蛋白"或"目標蛋白")的檢測(參見表 1)。本發明進一步提供了瞄準癌癥治療性治療的方法，通過指引治療對抗這些超表達的蛋白質。實現這種瞄準的方法可以包括，但不限于 (i )治療藥物與特異性識別目標蛋白分子結構的目標蛋白或適配子部 分的結合，(ii)使用蛋白質，多肽，表達栽體或DNA疫苗構建體， 通過免疫將宿主免疫系統暴露于目標蛋白或其片段，以便指引宿主免 疫系統對抗其中目標蛋白超表達的腫瘤細胞，(iii)通過小分子配體 調節目標蛋白的生物活性，(iv)利用目標蛋白的生物活性來激活藥 物前體，(v)通過如反義基因剪接，使用小干擾RNA分子，或瞄準編 碼目標蛋白基因中的調控序列或結合這些序列的調節蛋白這樣的方法 來調節細胞中目標蛋白的表達，(vi)目標蛋白與細胞的其他成分， 例如，與小分子配體或免疫球蛋白的物理相互作用的特定調節，以便 發揮治療益處。因此，本發明基于目標蛋白的不同表達提供了各種新 的方法，用于癌癥，包括CRC的診斷，預后和治療。考慮以下的發明 詳述時，本發明的這些和其他多個方面和優勢是本領域技術人員顯而 易見的。白選自下組 表l中限定的蛋白質；和 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%序列同源性。所述修飾可包括，但不限于N，或C， 截斷，剪接變體，酰化，乙酰化，腺苷酰化，ADP-核糖基化碘化，生 物素化，氨基甲酰化，羧甲基化，脫酰胺化，酯化，法呢基化，甲酰 化，谷胱甘肽化，糖基化，幾基化，脂化，甲基化，肉豆蔻酰化，氣 化，棕櫚酰化，磷酰化，異戊二烯化，唾液酸化(sialation)，硬脂 酰化，磺化，硫化，維生素C-和K-獨立修飾，和硒蛋白。然而，由于現有技術公開了 HSP90和60S酸性核糖體蛋白用于檢 測CRC的用途，本發明的主題是基于選自該組的至少再一種標記蛋白 的存在的測定，當所述至少一種標記蛋白是HSP90和/或60S酸性核糖 體蛋白時，該再一種標記蛋白不是HSP90或60S酸性核糖體蛋白。這 還適用于來自表1組A的蛋白質，已知其在CRC組織中得到上/下調。發明詳述第一個方面中，本發明涉及通過2D-凝膠電泳和質譜鑒定的蛋白質。再一方面涉及表l的蛋白質作為CRC標記或指示劑的用途，以及 涉及蛋白質的用途，該蛋白質的存在，不存在或流行程度(preva 1 ence ) 之前與CRC不相關。認為蛋白質表達和蛋白質表達模式的改變對于診 斷，預后和治療應用和目標是重要的標記。本發明的蛋白質可以a)涉及能量轉導和氧化還原電位和糖酵解 酶；b)涉及噤呤/噢咬合成，DNA/RNA合成，RNA加工，氨基酸代謝和 蛋白質合成；c)作為伴侶蛋白；d)涉及分化，凋亡，調控和信號轉 導；e)涉及細胞防御；f)涉及細胞結構；g)涉及激素/神經遞質代 謝；h)或具有其他功能。本發明的第一個方面涉及標記蛋白。標記蛋白選自下組a)表l 的蛋白質；和b)具有與a)中蛋白質至少80%序列同源性的蛋白質。此外，標記蛋白可以選自a)相對于對照在來自所述生物樣品的 蛋白質聚丙烯酰胺凝膠上以顯著較低或顯著較高含量存在的 一種或多 種蛋白質；b)來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上存在而 對照的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上不存在的一種或多種蛋白質；和c) 來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上不存在而對照的蛋白 質的聚丙烯酰胺凝膠上存在的一種或多種蛋白質。術語"對照"的意思對于蛋白質組學領域中的技術人員是顯而易 見的。優選，對照是來于蛋白質凝膠的斑點(具有相同的位置)的I0D% 值，蛋白質來自源自沒有傾向于或患有CRC的人的樣品或來自患有CRC 患者的結腸的健康片段。術語"標記蛋白"意思是包括上述蛋白質， 以及來自用于CRC實驗的其他哺乳動物物種的相似蛋白質。蛋白質的 人形式是特別令人感興趣的。例如，提出人蛋白的大鼠形式可以用作 大鼠實驗模型中CRC的標記。因此，術語"標記蛋白"包括表l中鑒 定的人蛋白的哺乳動物形式。本發明的另一個方面涉及診斷或測定哺乳動物例如人CRC傾向性 的方法，該方法包括測定所述哺乳動物的生物樣品中至少一種標記蛋 白的存在，不存在或表達水平。生物樣品選自尿液，糞便，血液，唾 液，淋巴液和組織，新鮮的血液，糞便，尿液，唾液或結腸上皮組織 是優選的。目前優選的方法包括建立至少一種標記蛋白的提高表達(上調的 標記蛋白)，標記蛋白選自下組:a)表l中限定的，并標記為上調的 蛋白質；和b)是a)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得具有 a)中蛋白質的至少80%序列同源性，當然本發明還涉及建立至少一種 下調標記蛋白的降低表達的方法。在另一個實施方案中，本發明涉及測定人CRC傾向性的方法，該 方法包括a)測定源自人的生物樣品中的至少一種標記蛋白的提高表 達，所迷標記蛋白選自下組i)表1中限定的上調蛋白質，或ii) 是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得具有i)中蛋白質的 至少80%序列同源性，b)測定人的生物樣品中至少一種標記蛋白的降低表達，所述標記蛋白選自下組i)表1中限定的下調蛋白質，或 ii)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得具有i)中蛋白 質的至少80%序列同源性，或c) a)和b)中確定的組合。因此，蛋白質是上調或下調的確定可用作CRC易感性的有用指示 劑。上調和下調的模式也可以用作指示劑。也就是說建立了多于一種 蛋白質的表達水平，并且將一組蛋白質的表達模式用作指示劑。在合適的實施方案中，至少一種標記蛋白選自相對于對照在來自 所述生物樣品的蛋白質聚丙烯酰胺凝膠上以顯著較 腺或顯著較高含量 存在的一種或多種蛋白質，來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺 凝膠上存在而對照的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上不存在的一種或多種 蛋白質，來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺上不存在而對照的 蛋白質的聚丙烯酰胺上存在的一種或多種蛋白質。在另一個實施方案中，本發明涉及治療哺乳動物例如人CRC的方 法，或預防或延遲CRC發作的方法，包括改變至少一個標記蛋白的表 達。該方法優選包括將可以改變表達朝一個或多個蛋白質的控制 (control)退回的化合物給藥于人，蛋白質選自a)表l中限定的 蛋白質；和b)是表1蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得具有 表l蛋白質的至少80%序列同源性；c)具有a)和/或b)中蛋白質相 同功能的蛋白質；d)編碼a) , b)或c)中蛋白質的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)蛋白質的抗體；f)能夠結合a) , b)或c)蛋白質的 核酸片段；和g)能夠結合a)， b)或c)蛋白質的化合物。此外，本發明涉及該化合物用于制造治療或預防CRC藥物的用途。 術語"結直腸癌"或其縮寫"CRC"包括與結直腸癌相關的疾病。關于治療CRC的方法，可以耙向單個蛋白，或可以牝向一組蛋白 用于治療。可以改變這些被靶向蛋白的表達水平，或可以干擾蛋白質 自身，以便改變它們的活性。因此，治療人CRC方法的一個令人感興 趣的實施方案包括改變標記蛋白的表達。在另 一個實施方案中，本發明涉及測定試劑在CRC治療中具有治療效果的可能性的方法，包括測定測試模型暴露于所述試劑之前和之 后的 一種或多種標記蛋白的相對表達水平。此外，本發明涉及測定化合物在CRC治療中的效果的方法，包括 測定一種或多種標記蛋白的蛋白表達水平。再一實施方案中，本發明涉及測定CRC治療中所用化合物的效果 水平的方法，包括測定測試模型暴露于所述試劑之前或之后的一種或 多種標記蛋白的表達水平。此外，本發明涉及測定患病或易患病哺乳動物例如人CRC的性質 或誘因的方法，包括建立至少一種涉及模型的標記蛋白的表達水平。本發明的另 一個實施方案涉及包括編碼標記蛋白的核苷酸序列的 核酸片段，或涉及與該核酸片段或其一部分或與其互補鏈雜交的核酸 片段，本發明還涉及上述核酸片段用于檢測標記蛋白存在的用途。再一實施方案中，本發明涉及能夠結合標記蛋白的抗體。這樣的 抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還涉及該抗體用于檢測 標記蛋白存在的用途。再一實施方案中，本發明涉及用于診斷哺乳動物例如人的CRC或 CRC遺傳傾向性的測試盒，包括a)特異性結合至少一種標記蛋白的 結合工具；或者該結合工具是至少一種所述標記蛋白的抗體，能夠結 合至少一種所述標記蛋白的核酸片段，或能夠結合至少一種所述標記 蛋白的化合物；b)檢測結合工具與至少一種標記蛋白或與至少一種核 酸片段結合的工具，如果存在結合，或者為檢測結合水平的工具，和 c)用于關聯的工具，關聯與所述結合工具的結合，如果存在結合，或 者關聯結合水平，是否表示個體哺乳動物具有顯著較高的患CRC的可 能性或患CRC的遺傳傾向性。在另一個實施方案中，本發明涉及測定物質效果的方法，該方法 包括使用哺乳動物，例如人，其已經使用本發明的方法建立為具有患 CRC的可能性或患CRC的遺傳傾向性高的個體，該方法包括將物質給 藥于個體并測定該物質的效果。本發明人預期測定患病或易于患病的人的CRC的性質或誘因的方法包括建立表l蛋白質關于模型的表達水平，該模型用來了解疾病和 潛在的治療。在化合物的測試中，關于試劑的活性或目標的知識對于理解所述 試劑的治療活性是有用的并有助于改進所述的治療。本發明人的研發產生了測定化合物在CRC治療中的效果的方法， 包括測定一種或多種標記蛋白的表達水平，并涉及測定CRC治療中所 用化合物的表達水平或活性水平的方法，包括測定測試模型暴露于所 述試劑之前和之后的 一種或多種標記蛋白的表達水平。本發明非常重要的實施方案涉及藥物組合物，其包括a)能夠調 節核酸片段表達的物質，該核酸片段編碼標記蛋白的至少一部分；b) 標記蛋白；c)標記蛋白的衍生物，同源物或模擬物；d)標記蛋白的 抗體；e)能夠結合標記蛋白的核酸片段；和/或f)能夠結合標記蛋 白的化合物。藥物組合物可以用作藥物，如用于治療或預防CRC。 應當注意到預期多于一種標記的任意組合的檢測將使得分析成為 CRC相關疾病的更可靠的指示。因此，包括測定兩種標記組合的存在， 活性，濃度和/或表達水平的診斷或測定CRC傾向性的方法是優選的， 強烈優選三種或多種標記(例如，至少4, 5， 6或7種標記)。預期 多于一種標記蛋白的檢測能提高診斷的特異性和靈敏性，因此提高診 斷測試的價值。還相似地建議了使用多于一種(例如，至少2， 3， 4， 5， 6或7 種化合物)根據本發明的化合物(例如，多于一種化合物選自根據 本發明的多肽，核酸片段或抗體)的治療，所述組合的化合物能夠影 響多于一種標記蛋白的水平，將使疾病的治療更有效。在這點上，可 能甚至預期只使用 一種化合物的治療將影響多于一種標記蛋白的表 達。本發明中的術語"多肽"將具有其通常的意思。即任何長度的氨 基酸鏈，包括全長蛋白，寡肽，短肽及其片段，其中通過共價肽鍵連 接氨基酸殘基。術語"多肽"，"肽"，"氨基酸序列"和"蛋白質"可交替使用。可以通過磷酸化，曱基化，硫酸化(sulphylated)，糖基化或通 過添加任何形式的脂質或脂肪酸，泛素或任何其他側基或通過含有其 他氨基酸或任何其他形式的修飾(其中存在200多種已知的)在化學 上或生物化學上修飾蛋白質。這些修飾發生在蛋白質的特定位點，并 且一個位點的特定修飾可以與相同蛋白質上不同位點的相同修飾具有 不同的效果。它們在細胞中是可逆的，例如它們在細胞中用于開啟或 關閉酶，因此蛋白質可以以各種形式存在一每個具有用于每個蛋白質 功能的相關活性。此外，可以分裂多肽，例如，處理其N-或C-端來除 去信號肽，或者可以剪接mRNA來除去內部序列，翻譯時，其將形成改 變的蛋白質。可以在蛋白質數據庫如EXPASY中找到這些中許多的實 例，并且存在日益增長范圍的工具來預測這些修飾及其功能(參見 http: 〃www.expasy.ch)。因為估計人類中的每個蛋白質平均被修飾 10-20次，預期在此鑒定的大部分蛋白質以這種或那種方式得到修飾。因此，每個多肽可以通過特定的氨基酸來表征并且由特定的核酸 序列來編碼。將理解這樣的序列包括通過重組或合成方法產生的類似 物和變體，其中這樣的多肽序列已經通過置換，插入，添加或刪除重組多肽中的一個或多個氨基酸殘基而得到修飾，并且在此處所述的任 何生物測試中仍然是免疫原性的，置換優選為"保守的"。保守置換是本領域技術人員公知的。優 選，考慮屬于相同組的氨基酸(非極性(G， A， P， I， L和V)，極性 -不帶電荷的(C, S， T, M， N和Q)，極性帶電荷的(D， E, K和R) 和芳香族的(H， F, W和M)。在這些組中，氨基酸可以相互置換，當 然其他置換也是可以的。每個多肽由特定的核酸序列編碼。將理解這樣的序列包括其類似 物和變體，其中這樣的核酸序列已經通過置換，插入，添加或刪除一個或多個核酸殘基(包括插入一個或多個內含子(小的或大的)而得 到修飾。置換優選是密碼子使用中的沉默置換，這不會導致氨基酸序 列的任何改變，但是可以引入來提高蛋白質的表達。在本文中，術語"基本上純的多肽"意思是含有至多25%重量與 其天然相連的其他多肽物質的多肽制劑(優選更低百分比的其他多肽 物質，例如，至多20%,至多15%，至多10%,至多5%和至多1%)。 優選基本上純的多肽是至少96%純，即，多肽構成制劑中存在的總多 肽物質的至少96%重量，并且優選更高的百分比，如至少97%,至少 98%,至少99%,至少99. 25%,至少99. 5%和至少99. 75%。尤其優選多 肽片段是"基本上純形式，，的，即，多肽片段基本上無任何其他與其 天然相連的蛋白質，即，無任何其他來自哺乳動物的蛋白質。這可以 通過制備本發明的多肽來實現，通過本領域技術人員已知的宿主細胞 中的重組方法，或通過固相或液相肽合成的公知方法合成多肽片段， 例如，通過Merrifield所述的方法(Merrifield， R. B. Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21: 412,1962和J. Am. Chem. Soc. 85:2149/1963 ) 或其改進方法，或通過從電泳凝膠中回收來制備本發明的多肽。 ——^語"蛋白質"還包括上述多肽的衍生物，類似物和模擬物。這 樣的衍生物，類似物和模擬物優選與產生其的多肽具有相同的活性， 例如，相同種類的酶活性。衍生物，類似物或模擬物可以具有比親本 多肽較低水平的活性，相同的水平，或優選，較高的活性水平。術語"至少一種"(例如，至少一種化合物或至少一種標記蛋白)包括整數1，2，3， 4，5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14，15，16, 17， 18,19，20，21,22,23,24,25，26，27，28，29，30，31, 32， 33，34，35,36，37，38，39,40，41，42，43，44，45，46， 47， 48，49，50,51，52，53,54，55,56，57，58，59，60，61, 62， 63， 64， 65和66,應當理解可以使用單個標記蛋白，但在本 發明的方法中使用多于一種的標記蛋白可能是有利的，也就是說建立 多于一種蛋白的表達水平，并將一組蛋白的表達模式用作指示。顯而 易見隨著組中數目的增加，提高了鑒定的可靠性。"肽模擬物(peptidomimetic)"是模擬肽的生物活性但在化學 性質上不再是肽的分子。嚴格的定義是肽模擬物是不再含有任何肽 鍵(即，氨基酸之間的酰胺鍵)的分子。然而，術語肽模擬物有時候用來描述性質上不完全是肽的分子，如假肽(pseudo-peptide)，半 肽(semi-peptide)和類肽(peptoid)。不管是完全或部分非肽的， 根據本發明的肽模擬物提供了反應性化學部分的空間排列，其與肽模 擬物所基于的肽中活性基團的三維排列極其相似。作為該相似活性位 點幾何排列的結果，肽模擬物對生物系統具有作用，其與肽的生物活 性相似。本發明包括肽模擬物組合物，其是模擬根據本發明的生物活 性肽的活性的類似物，即肽模擬物可用于治療CRC相關疾病。優選本發明的肽模擬物在三維結構和生物活性上與上述所列的肽或活性位點 基本上相似。或者，模擬物可以是"反模擬物(antimimetic)"。換句話說， 適于并阻斷蛋白質活性位點的分子，或結合結合位點或與其他生物分 子相互作用的位點的分子，使得干擾蛋白質的功能。目前大多數藥物 是這種類型的。本發明包括能夠與本發明的多肽相互作用的這種反模 擬物。使用給定肽的模擬物比肽本身具有明顯的優勢，因為肽通常呈現 出兩個不利的特征(l)生物利用率差；和(2)作用的持續時間短。 肽模擬物給予了明顯的繞過這兩個主要障礙的路徑，因為關注的分子 足夠小，使得是口服活性的并具有長的作用持續時間。還存在與肽模 擬物相關的顯著成本節約和提高的患者順應性，因為它們與肽的非腸 道或經粘膜給藥相比較，可以口服給藥。此外，肽模擬物的生產比肽 便宜得多。最后，與肽相關的穩定性，儲存和免疫反應性的問題在肽 模擬物中沒有遇到過。因此，上述的肽可以用于研發這樣的具有相似生物活性并因此具 有相似治療功效的小化學化合物。研發肽模擬物的技術是常規的。因 此，可以通過非肽鍵替代肽鍵，使肽模擬物采用與最初的肽相似的結 構，并因此具有與最初的肽相似的生物活性。此外，也可以用其他相 似結構的化學基團替代氨基酸的化學基團來進行修飾。通過光鐠學， 晶體學和/或計算機輔助分子建模測定最初肽的三級結構來輔助肽模擬物的研發。這些技術幫助研發比最初肽更高效和/或更高生物利用率和/或更穩定的新組合物(Dean(1994), BioEssays， 16: 683-687; Cohen和Shatzmiller (1993)， J.Mol. Graph. 11: 166-173; Wiley和 Rich (1993)， Med. Res. Rev. ， 13: 327-384; Moore(1994)， Trends Pharmacol. Sci. ， 15: 124-129; Hruby(1993), Biopolymers， 33: 1073-1082; Bugg等(1993)， Sci. Am. ， 269: 92-98，在此全部引入作 為參考文獻)。 一旦鑒定出一種潛在的肽模擬化合物，即可將其合成(參見Finlay等(1983) ， Cell, 57: 1083-1093和Fujiwara等(1993)， Cancer Res. ， 53: 4129-4133,在此引入作為參考文獻)。因此，利用上述方法，本發明提供了與上述多肽相比較，呈現出 提高的治療活性的化合物。本發明包括通過上述方法獲得的肽模擬化 合物，其具有上述肽的生物活性及相似的三維結構。本領域技術人員將清楚肽模擬物可以產自上述修飾肽的任何一種或者產自具有超過一 種上述修飾的肽。此外，將清楚除了作為治療化合物的用途以外，本 發明的肽模擬物可以進一步用于研發更有效的非肽化合物。術語"核酸片段"和"核酸序列"等理解為任何核酸分子，包括 DNA， RNA， LNA(鎖定的核酸分子)，PNA， RNA， dsRNA和RM-DNA雜 合體。還包括含有非天然產生的核苷的核酸分子。該術語包括任何長 度的核酸分子，例如，10至10000個核苷酸，這取決于用途。當核酸 分子用作如DNA治療中的藥物或用于生產根據本發明的多肽的方法中 時，優選使用編碼至少部分多肽的分子，具有約IO至約IOOO個核苷 酸的長度，將該分子任選地插入栽體中。當核酸分子用作探針，引物 或用于反義治療中時，優選使用長度為10-100個核苷酸的分子。根據 本發明，可以使用其它長度的分子，例如，具有至少12， 15， 21， 24, 27， 30, 33， 36， 39， 42， 50， 60， 70， 80， 90， 100， 200, 300， 400， 500或1000個核苷酸(或核苷酸衍生物)，或具有至多10000， 5000， 4000， 3000， 2000， 1000， 700， 500， 400， 300， 200, 100， 50， 40， 30或20個核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)。應當理解這 些數字可以自由組合來產生各種范圍。結合雜交條件使用時的術語"嚴謹"和本領域中的定義相同，即，在不超過核酸片段熔點(Tm)下的15-20r的溫度下進行雜交，參照 Sambrook等，Molecular Cloning; A Laboratory manual (分子克隆； 實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratories, NY， 1989， pll.45 11.49。優選，條件為"高度嚴謹的"，即核酸片段熔點(Tm)下5-10 匸。在本發明中，優選雜交條件是嚴謹的。在整個說明書中，除非文 中另外要求，術語"包括"或其變形如"含有"或"包含"，將理解 為表示包括所述要素或整體或者是一組要素或整體，但不排除任何其 它要素或整體或者一組要素或整體。術語"序列同一性"(或"序列同源性")指的是兩個相等長度 的氨基酸序列之間或兩個相等長度的核酸序列之間同源程度的定量測 量。如果待比較的兩個序列不是等長的，必須將它們以帶有缺口的插 入或者在蛋白質序列末端切斷的方式排列成最可能的匹配。可以按照 (Nref-Ndif)*100/Nref計算序列同一性，其中Ndif為比對時兩個序 列中不同殘基的總數，其中Nref為序列之一的殘基數。因此，DNA 序列AGTCAGTC與序列MTCAATC之間具有75%的序列同一性(Ndif -2 和Nref-8)。將缺口計為不同的特定殘基，即DNA序列AGTG C與DNA 序列AGTCAGTC之間具有75%的序列同一性(Nd f=2和Nref=8 )。或者，序列同一性可以通過BLAST程序來計算，如BLAST程序(Person W.R和D.J. Lipman ( 1988 ) PNAS USA 85: 2444-2448 ) (www, ncbi. nlm. nih, gov/BLAST/ ),或在ExPasy站點(op. sit.)獲得BLAST 程序。在本發明的一方面中，可以用帶有缺省參數的序列比對方法 ClustalW進行比對，如Thompson J.等，Necleic Acids Res 1994 22: 4673—4680中所述的，http: 〃www2. ebi.ac.uk/Clustalw,或者， 使用來自GCG包的版本8的GAP測定兩個核酸序列之間的同源性程度， 使用用于DM的標準懲罰GAP權重5. 00，長度權重0. 300， Gribskov 和Burgess中所述的基質，Nucl. Acids Res. 14(16); 6745-6763(1986 )，使用來自GCG包(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison， Wis. 53711， USA)的版本8的GAP測定兩個氨基酸序列之間的同源性程度，使用用于蛋白質的標準懲罰GAP權重 3.00，長度權重0.100， Gribskov和Burgess中所述的基質，Nucl. Acids Res. 14 (16) ; 6745-6763 ( 1986 )。序列同源性的優選最小百分比為至少70%,如至少80%，至少85%, 至少90%,至少91%,至少92%,至少93°yi，至少94%，至少95%，至少 96%，至少97%,至少98%，至少99%和至少99. 5°y4。本發明還涉及本發明的多肽或核酸用作治療疫苗的用途，如 Lowry, D.B.等，1999， Nature 400: 269-71舉例說明的文獻中所述 的。在免疫測試中與本發明的多肽特異性反應的單克隆或多克隆抗 體，或所述抗體的特異性結合片段，也是本發明的一部分。可以通過本領域技術人員已知的方法生產抗體。可以在哺乳動物 中產生多克隆抗體，例如，通過一次或多次注射根據本發明的多肽， 并且如果需要，可以一次或多次注射佐劑。可以通過Kohler和 Milstein在Nature, 256: 495 ( 1975 )中首次描述的雜交瘤方法或如 美國專利No. 4， 816， 567中所述的重組DNA方法生產根據本發明的單克 隆抗體。例如，也可以使用McCafferty等在Nature, 348: 552-554 (1990)中描述的技術從噬菌體文庫中分離出單克隆抗體。文獻中描 述了生產抗體的方法，例如美國6, 136, 958。在診斷，治療或測試中，可以單獨使用本發明的抗體、核酸片段 和/或多肽，也可以作為組合物中的成分。這樣的組合物是本領域的技 術人員已知的，并且包括其中本發明的抗體、核酸片段或多肽結合， 優選共價結合至少一種其它分子如標記(例如，放射性或熒光素)或 栽體分子的組合物。本發明進一步涉及使用上述化合物治療性和/或預防性處理CRC 相關疾病患者的方法。本發明的方法包括步驟a)將本發明的一種或多種化合物摻入合 適的藥物栽體中；和b)將摻入栽體中的治療有效量或預防有效量的 化合物給藥于患者。術語"合適的藥物栽體"指的是藥物領域中已知的任何栽體，用 于將化合物給藥于患者，根據本發明可以使用任何合適的藥物栽體， 只要沒有引起相容性問題。可以通過非腸道注射，如靜脈內，肌內或動脈內，來實現給患者 給藥有效劑量。這些化合物也可以口服或經皮給藥，或者通過本領域 技術人員已知的任何其它方法，如通過吸入器或真噴霧器。口服是目 前優選的。如在此所用的，術語"治療有效量"指的是治療性處理患者需要 的本發明的一種或多種化合物的含量。這樣的處理適于診斷為患有CRC相關疾病的患者。相似地，術語"預防有效量"指的是預防性處 理患者需要的本發明的一種或多種化合物的含量。這樣的處理適于如 下患者，例如，還沒有建立CRC相關疾病的任何臨床癥狀.在確定患 者處于產生CRC相關疾病的風險后盡快開始預防性處理將是有利的， 例如，通過具有改變水平的標記來測定CRC的傾向性。本領域的技術人員將會了解，給定化合物的劑量，給藥路徑和治 療持續時間不僅依賴于化合物的類型及其在治療該疾病中的效果，而 且還依賴于被治療的個體，要考慮這樣的因素，如患者體重，用于治 療患者的其它治療方法和患者的情況、臨床反應和耐受力。本領域技 術人員通過評定這些和其它相關因素可以確定劑量、給藥和持續時間。本發明提供了人CRC-介導蛋白，即，鑒定為CRC產生過程中涉及 或受影響的蛋白質。將CRC-介導蛋白表征為這樣的蛋白，它的表達在 CRC產生過程中相對于不存在CRC產生下的表達得到了改變。本發明 從人結腸/直腸活檢組織切片檢查和上皮細胞蛋白的2-維凝膠數據庫 鑒定了 CRC-介導蛋白，CRC-介導蛋白包括保護性CRC-介導蛋白和有害 的CRC-介導蛋白。本發明提供了通過使用2-維凝膠鑒定的人CRC-介導蛋白，2-維凝 膠能比較對照和癌上皮細胞來鑒定哪個蛋白質應答，鑒定在細胞應答 中起作用的蛋白質。連接分析可以用來限定蛋白質的功能基團及其調 節作用(例如，通過激酶磷酸化或其他翻譯后修飾)。本發明提供了基本上純化的保護性CRC-介導蛋白("保護性蛋 白")，其特征為能夠保護處于產生疾病風險中的患者對抗CRC的產 生，或緩解或減輕患有CRC的患者的CRC癥狀。本發明的保護性蛋白 可以直接作用來保護對抗CRC，或可以通過誘導或提高第二種保護性 蛋白的合成或通過降低或抑制有害蛋白的合成來間接作用。本發明進 一步包括與人CRC-介導蛋白的全長氨基酸序列具有至少80%,優選至 少90%,更優選至少95%和最優選至少98%同一性的氨基酸序列，例如， 通過比較序列信息來測定百分比同源性或同一性，使用GAP計算機程 序，版本6. 0,從University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)可獲得.GAP程序使用Needleman和Wunsch ( 1970 )的比 對方法，J. Mol. Biol. 48: 443，按照S邁ith和Waterman (1981) 修訂的，Adv. Appl. Math. 2: 482。簡而言之，GAP程序將相似性限 定為相似的比對符號(即，核苷酸或氨基酸)的數目除以兩個序列較 短的符號總數。用于GAP程序的優選缺省參數包括(l)一元比較基 質(含有對于相同的為1和對于不同的為0的值)以及Gribskov和 Burgess ( 1986 ) Nucl. Acids Res. 14: 6745的權重比較基質，如 Schwartz和Dayhoff (編輯)所述的，(1979 ) Atlas Of Protein Sequence And Structure (蛋白質序歹'和結構圖集)，National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2)每個缺口3. 0 的懲罰，和每個缺口中每個符號另外的0.10懲罰；和(3)對于末端 缺口沒有懲罰。本發明進一步包括編碼本發明CRC-介導蛋白的多核苷酸序列，包 括DNA， cDNA， PNA和RNA序列。還可以理解在此還包括編碼全部或部 分CRC-介導蛋白的所有多核苷酸，只要它們編碼具有CRC-介導活性的 多肽。這樣的多核苷酸包括天然產生的，合成的和有意操縱的多核苷 酸。例如，這樣的多核苷酸可以接受定向突變。本發明的多核苷酸序 列還包括反義序列。反義序列包括用修飾的寡核苷酸合成的序列。本 發明的多核苷酸包括作為遺傳密碼的結果而簡并的序列。存在20個天然氨基酸，其中大部分是由多于一個的密碼子指定的。因此，本發明包括所有簡并核苷酸序列，只要CRC-介導多肽的氨基酸序列是由功能 上未改變的核苷酸序列編碼的。有害CRC-介導蛋白("有害蛋白")的特征在于提高患者產生CRC 或提高患者產生CRC的風險。二維凝膠電泳(2-DGE )是特別有效的分離蛋白質混合物的工具(例 如，Andersen等，(1995 )Diabetes 44: 400-407; John NE等，Diabetes (2000 ); 49: 1819-29。 Christensen等，Autoimmunity. ( 2000); 32: l-15和Mose Larsen等，Diabetes. ( 2001 ) ; 50: 1056-63 )。 將細胞蛋白提取物置于凝膠上，首先通過電荷，然后通過大小分離出 單個蛋白質。結果是多如1， 000至5， 000個點的特征圖，每個通常構 成單個蛋白質。通過增大凝膠大小，通過使用放射性標記方法，銀染 提高靈敏度，以及將凝膠厚度降低至1.5mm和更小，來提高分辨率。 可以通過在覆蓋窄pH范圍(例如，1.5， lpH單位或更低)的第一維 凝膠上跑膠來獲得分辨率的進一步提高。如以下實施例中所述的，可 以通過質傳來鑒定從2D凝膠回收的單個蛋白質，來獲得胰蛋白酶分離 模式以及每個肽精確的分子量。然后將這些觀察到的值用來在DNA和 蛋白質數據庫中搜索，來測定是否存在與之前鑒定的蛋白質的匹配。 可以從已知蛋白質測定同一性或從與已知蛋白質的高同源性來推斷。將2D電泳用來分離和鑒定在CRC產生過程中呈現出改變合成的蛋 白質點時，從凝膠切除鑒定的蛋白質點，并用胰蛋白酶消化來產生肽。 從凝膠回收肽并接受質鐠(基質輔助激光解吸/電離質鐠-MALDI)，并 將所得到的MS-特征圖對著公眾序列數據庫中找到的所有序列的計算 機化MS-特征圖，以及對著適當的序列信息進行分析。如果獲得與之 前克隆的序列的任何匹配，收集關于相應的基因和所編碼的蛋白質的 信息。當鑒定的CRC-介導蛋白與之前克隆的蛋白質不相匹配時，可以 通過本領域已知的方法將蛋白質微測序來獲得部分氨基酸序列信息。 還可以通過例如納米電噴霧串聯質鐠將蛋白質(以足夠量獲得時)部 分測序，其中在氣相中將特定的肽片段化，并將片段的分子量用來產生部分氨基酸序列。
一旦可獲得部分序列信息，那么除了之前提到的那些，還可以在cDNA或EST (表達的序列標記物)數據庫中搜索。基于從數據庫搜索或氨基酸測序獲得的結果，構建特定的和簡并 的引物并用來篩選人結腸和/或直腸上皮文庫或將通過PCR的第一鏈 cDNA用來克隆相應cDNA的部分序列。然后將獲得的序列用來獲得全長編碼區域，通過5' -race PCR 或通過常規雜交篩選技術，接著是重組蛋白的表達(Karisen等， (1991 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8337-8341; Karisen等，(1994 ) 在Insulin secretion and pancreatic bata-cell research (胰 島素分泌和跌腺P-細胞研究)，Flatt， P. R.等，Smith-Gordon, USA; 笫64章，pp. 1-9; Karisen等，(1995 ) Diabetes 44: 757-758 )。可以以本領域技術人員已知的各種方式來分離CRC-介導蛋白，包 括從生物材料純化，以及從重組DNA表達(參見上文)。常規方法步 驟包括提取，沉淀，色鐠，親和色鐠和電泳。例如，可以通過離心收 集表達CRC-介導蛋白的細胞，或使用合適的緩沖劑，裂解，并通過柱 色譜，例如，在DEAE-纖維素，磷酸纖維素，多核糖胞啶酸-瓊脂糖， 羥磷灰石上，或通過電泳或免疫沉淀，來分離蛋白質。或者，可以通 過使用特異性抗體的免疫沉淀來分離CRC-介導蛋白。本發明提供的測試方法可用于篩選能夠影響CRC-介導蛋白表達 并因此影響人CRC產生的化合物。 一種篩選能夠影響一種或多種CRC-介導蛋白表達的藥物的模型是將懷疑具有有益效果的化合物(包括反 義寡核苷酸)給予培養物中的細胞。有用的細胞特別是結腸或直腸產 生的細胞。然后可以通過2D凝膠電泳測定測試化合物對蛋白質表達的 作用。另一個篩選模型是使用處于產生CRC風險的哺乳動物的體內方 法。簡而言之，將具有提高的CRC風險(例如，CRC傾向性大鼠或小 鼠)的哺乳動物暴露于測試化合物，并測定暴露于測試化合物對CRC 產生的作用。可以在產生階段的整個過程中監控CRC的產生，通過測定一種或多種CRC-介導蛋白的表達并比較疾病發作的時間和疾病不產生下的 表達和時間。測定一種或多種CRC-介導蛋白的表達包括CRC-介導蛋白 自身，翻譯后的修飾產物，和/或CRC-介導蛋白降解產物。在一個實 施方案中，通過測量測試樣品中CRC-介導蛋白表達的水平來測定CRC-介導蛋白的激活。合適的測試樣品包括體液，如血液，尿液，糞便， 結直腸組織或腦脊液，或源自這些的流體，如血漿或血清。在特定的 實施方案中，通過蛋白質印跡分析測量測試樣品中蛋白質表達的水平。 通過凝膠電泳將樣品中存在的蛋白質分級，轉移至膜上，并用標記的 蛋白質特異性抗體來探測。在另 一個特定的實施方案中，通過RNA印跡分析來測量CRC-介導 蛋白表達的水平。從測試樣品分離多腺苷酸化[多(A)+]mRNA。通過電 泳將mRNA分級，并轉移至膜上。用標記的cDNA來探測膜。在另一個 實施方案中，通過施用于表達的mRNA的定量PCR來測定蛋白表達。再一方面中，本發明提供了鑒定能夠抑制或降低內源有害蛋白表 達的化合物的方法，以及通過給藥治療有效量的能夠抑制或降低內源 有害蛋白表達的化合物來預防和/或治療CRC的方法。本發明的CRC-介導蛋白還可以用于篩選調節CRC-介導蛋白活性 的試劑。因此，在一方面中，本發明的特征方法用于鑒定調節CRC-介 導蛋白活性的試劑，通過用測試試劑培養表達CRC-介導蛋白的細胞并 測量測試試劑對CRC-介導蛋白合成，磷酸化，功能或活性的作用。當 通過磷酸化激活CRC-介導蛋白時，用CRC-介導蛋白培養測試試劑，使 用Y -〖"P];或["P] -標記的ATP(或其他單-核苷酸)，或["P];或["P〗-磷酸鹽(磷酸)或["S]-甲硫氨酸，并測定磷酸化率，在另一個實施方案中，用細胞培養測試試劑，該細胞已經用CRC-介導蛋白多核苷酸表達載體轉染了 ，并通過RNA印跡分析測量測試試 劑對CRC-介導蛋白轉錄的作用。再一實施方案中，使用CRC-介導蛋白的抗體，通過蛋白質印跡分 析測量測試試劑對CRC-介導蛋白合成的作用。再一實施方案中，通過用測試試劑，["P]-ATP (或上述的其他放射性化學物質)和CRC-介導蛋白途徑中的底物培養CRC-介導蛋白來測 定試劑對CRC-介導蛋白活性的作用。將所有實驗對用["S]-甲硫氨酸 正常標記的細胞進行比較，來測定蛋白質表達的調節。通過本領域已 知的方法測定底物磷酸化的速率。術語CRC-介導蛋白活性的調節包括 激動和拮抗。本發明特別可用于篩選抑制有害蛋白活性的試劑。這樣 的試劑可用于治療或預防CRC。本發明提供了通過給藥治療有效量的保護性CRC-介導蛋白來預 防和/或治療人CRC的方法。優選，哺乳動物是處于CRC風險中的人。在本發明的藥物篩選測試中，將鑒定的保護性或有害CRC-介導蛋 白用于鑒定能夠影響它們表達的測試化合物。因此鑒定的測試化合物 是用于預防，緩解或延遲處于風險中患者的CRC發作的候選治療劑。影響CRC-介導蛋白表達的測試治療化合物可以是，但不限于，選 自核酸，化合物，蛋白質，元素，脂質，抗體，糖，同位素，碳水化 合物，成像劑，脂蛋白，糖蛋白，酶，可檢測探針和抗體或其片段中 的至少一種，或其任意組合物，可以和標記抗體一樣將其可檢測地標 記，如在此所述的。這樣的標記包括，但不限于，酶標記，放射性同 位素或放射性化合物或元素，熒光化合物或金屬，化學發光化合物和 生物發光化合物。在本發明的藥物篩選測試中通過其誘導或提高保護性蛋白表達的 能力來鑒定治療化合物，使得防止或延遲處于產生CRC風險中患者的 疾病發作。還可以通過其防止或降低有害蛋白表達的能力來鑒定候選 治療化合物，使得防止或延遲處于產生CRC風險中患者的疾病發作。作為治療化合物的治療核酸可以對目標細胞具有但不限于至少一 種以下的治療效果抑制有害蛋白質DNA序列的轉錄；抑制有害蛋白 質RNA序列的翻譯;抑制對應于有害蛋白的RNA或DM序列的逆轉錄； 抑制蛋白質的翻譯后修飾；誘導對應于保護性蛋白的DNA序列的轉錄； 誘導對應于保護性蛋白的RNA序列的翻譯；誘導對應于保護性蛋白的 RNA或DNA序列的逆轉錄；核酸翻譯為蛋白質或酶；以及將核酸引入 用于治療核酸組成型或瞬時表達的目標細胞的染色體中。治療核酸的治療效果可以包括，但不限于關閉缺陷基因或處理其表達，如反義 RNA或DNA;抑制病毒復制或合成；基因治療，如表達編碼治療蛋白的 異種核酸或校正缺陷蛋白；修飾RNA，如hnRNA， mRNA, tRNA或rRM 的缺陷或表達不足；編碼藥物或藥物前體，或酶，該酶在表達CRC-介 導蛋白或肽的病理或正常細胞中產生作為藥物或藥物前體的化合物； 以及任何其他已知的治療效果。本發明中還包括的是通過提供編碼保 護性CRC-介導蛋白的多核普酸的基因治療。本發明進一步包括通過給 藥有效量的抑制有害CRC-介導蛋白體內表達的多核苷酸來預防CRC的 方法。在本發明的治療方法中，將治療化合物長期或快速給藥于人患者。 任選，將保護性蛋白長期給藥，結合有效量的以不同于治療化合物的 途徑作用的化合物。本發明的治療方法可以結合其他CRC的治療方法或結合處理這類 癌癥的方法。如以下實施例中所述的，將源自CRC患者和健康對照人員的結腸 的人上皮細胞在標準培養條件下培養。在標準細胞培養條件下孵育20hr后，在["S]-甲硫氨酸存在下將 細胞標記4小時。從細胞和培養基中分離蛋白質。通過2-D凝膠電泳 和質譜來分析蛋白質樣品。對于分析凝膠，用于鑒定改變表達水平的蛋白質，在每個實驗中 使用結腸上皮細胞進行單個實驗。這允許構建每個培養條件的合成圖 像。因此，通過這種方式的對照和癌細胞之間的比較和統計分析使得 可以鑒定癌細胞中以及分泌至培養基中的一組蛋白質，這些蛋白質與 對照情況相比較得到顯著上調或下調。實驗提出以下的實施例，以便給本領域技術人員提供怎樣制備和使用 本發明的蛋白質，基因和測試的完整公開和描迷，并且不意在限制發 明人認為的發明范圍。已經進行了努力來確保所使用數字的精確性(例如，含量，溫度等)，但應當說明一些實驗的誤差和偏差。除非另外指出，份數為重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝 氏度數，并且壓力是處于或接近大氣壓。實施例一結直腸癌介導的蛋白質的表征 試劑用于裂解緩沖液和平衡緩沖液的化學物質是脲(ICN Biomedicals)，硫脲(Fluka) ， chaps (Sigma) ， DTT (Sigma)， SDS( Serva )。 Dulbecco， s改良Eaglr培養基(D-MEM)( 41966-029/052 ) 和Hank， s平衡鹽溶液(HBSS ) ( 14175-053 )來自GIBC0TM。用于DNA 酶/RNA酶緩沖液的RM酶A (cat. no. RAF LS005650 )和DNA， s I (cat.no.DPFF LS006330 )來自Worthington。用于測定同位素引入 的閃爍液體來自Canberra Packsrd。固定的pH-梯度條帶pH4-7， pharmalytes 3-10 (代碼No. 17-0456-01 ) ， IPG緩沖液6-11 (代碼 No. 17-6001-78 )和[35S]-甲硫氨酸來自Amersham Pharmacia Biotch。 用于二維凝膠的丙烯酰胺來自Genomic Solutions,用于蛋白質測定 的染料試劑(Bio-Rad蛋白質測試，目錄No500-50006 )和N， N，-亞 甲基-雙-丙烯酰胺來自BioRad。結直腸正常/癌組織從Vejle醫院獲 得，作為正常的治療外科手術程序的一部分。材料收集外科手術取出后立即將標本轉移至病理部門。在那里打開標本并 從腫瘤/正常粘膜取出樣品并轉移至含有轉運介質(D-MEM,其已經滲 析了人血清，lg葡萄糖/L和抗生素青霉素/鏈霉素，但是其中沒有甲 石克氨酸，保持在371C)的不同試管中。活檢組織標記從Vejie醫院在371C轉運介質中轉運人結腸活檢組織(正常/癌 癥)，并使用HBSS漂洗3次。然后以lmn^切片活檢組織并將一些轉移移至標記介質中(已經滲析了人血清，lg葡萄糖/L, ["S]-甲硫氨 酸的D-MEM)。將剩下的活位組織放入液氮中并存儲在-80X:。在37 n標記24小時后，從每個孔中收集用過的放射性培養基，并將用過的 培養基轉移至標記的1.5mLEppendorf管中。然后在37^培養器中培 養培養基。將活檢組織在HBSS中洗滌兩次；然后收集洗滌溶液，用于 離心來收集松散的細胞和組織。此后，去除HBSS，并將活檢組織轉移 至盤中空而干燥的孔中，并再次轉移至水冷勾漿器中。蛋白質提取將100nl DNA酶/RNA酶緩沖液(25jLig/ml RNAse A溶液，25 n g/ml DNAse I溶液，30mMNaCl， 20mMTris. HC1 ( pH7. 5 ) ， 5mMCaCh， 5mM MgCl2)加入含有活檢組織的冰冷勻漿器中并勻質30秒鐘。在5 至10分鐘后，再次勻質。該過程重復30分鐘直到所有組織勻化。取 出150 jil勻漿放入干凈的管中。使用100 nl H力洗滌勻漿器，并吸 移兩次，將水也取出至管中。將試管放入液氮中并充滿氮氣。此后將 試管放入冷凍干燥器中過夜。將300 m1裂解緩沖液(7m脲，2m疏 脲，2%CHAPS， 0. 4%DTT， 1% v/v pharmolite 3-10， IPG緩沖液6-11) 加入管中并在室溫振蕩過夜。蛋白質和CPM測定將適于使用裂解緩沖液的Bradford方法(Bradford MM. 1976 ) 用于測定樣品中的蛋白質濃度。 一式三份，通過將10jil裂解緩沖液 加入一系列含有O, 5， 10和40jig標準蛋白(BSA)的一次性塑料比 色jiL中來制備標準曲線。將仏0加入每個比色皿中直至1600pl的總 體積，將每個樣品的10 m 1 —式三份加入比色皿中的1590 hi 1 H20中， 然后將400 ji 1染料試劑加入每個比色皿中并徹底混合。在加入染料試 劑30分鐘內測量每個樣品在595nm處的吸收值。然后通過標準曲線測 定蛋白質濃度(Fey SJ等，1997 )。使用如下的方法測定引入蛋白質中的同位素。 一式兩份取每個樣品的5jLil上清液并加入45pl 0. 02WBSA中。在微試管中混合后，加 入lml 10。/。w/vTCA并在4t:放置30分鐘來沉淀蛋白質。然后使用HAWP 濾器(HAWP 0200， Millipore， Bedford, MA， USA)通過吸濾收集沉 淀物，濾器用10% w/v TCA中的1% BSA預先潤濕。用吹風機干燥濾器 并轉移至閃爍管中。然后加入4ml閃爍液體并放置至少2h。然后使用 閃爍計數器計數樣品(Canberra Packard 2000 ) (FeySJ等，1997 )。凝膠電泳在18cmlPG4-7條帶上的笫一維中分離蛋白質。用于IPG4-7條帶 復水緩沖液是裂解緩沖液。將所有樣品加至200jnl，將這施加至IPG 條帶并放置18小時以再次膨脹。此后，加入更多的lOOpl裂解液并 在其中洗涂樣品，放置5. 5小時(Adelina Rogowska-Wrzesinka等， 2001 )。將5xl()6CPM裝栽于每個凝膠上。在Multiphor II上進行聚焦，在201C使用總Vh50， 000 (線性遞 增梯度，0V至600V,持續2:15h， 600V至3500V，持續8h，然后保持 在3500V，持續9: 25小時)。聚焦一結束就將條帶在平衡緩沖液(6M 脲，30%甘油，2% SDS， 1%DTT， 50mM Tris-HCl pH8. 8 )中振蕩15分 鐘并存儲在-80iC。在裝栽于第二維之前，將條帶在新鮮的平衡緩沖液 中再平衡15分鐘。在第二維中，在垂直的Investigator 2-D電泳系統(Millipore) 上使用12. 5% w/v丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺雙丙烯酰胺比例200: 1 ) 進行SDS PAGE凝膠電泳。將凝膠在201C在恒定電流設置下跑膠過夜。 將跑膠緩沖液再循環。蛋白質模式觀察和計算機分析在兩維凝膠電泳分離后，將凝膠在濾紙上直接干燥，暴露于磷成 像儀平板(AGFA)10天，并在AGFAADC70讀出器(Morstel， Belgium) 中閱讀。然后在邊角用放射性墨水將凝膠標記并暴露于薄膜(AGFA, GurixRP2) 25天，以便制備切割掩模和蛋白質鑒定(NawrockiA等，2001 )。使用Bioimage 2-D分析儀(基于UNIX的)分析從ADC70磷成像 儀獲得的2D凝膠模式。對所有凝膠使用相同的參數發現了斑點邊界。 在一些情況中，人工校正邊界(例如，分開對于程序太近以致于難于 區別的斑點)。作為斑點邊界內所有像素值的總和(集成光密度，IOD) 來測量蛋白質表達(Nawrocki A等，2001 )。作為一個凝膠中所有斑 點的總百分比"I0D)給出(Adelina Rogowska-Wrzesinka等，2001 )。 將所有圖像與參照圖像(來自之前的分析)相比較。將超過5個圖像 中存在的而在參照圖象中不存在的斑點添加至參照圖像的校正位置 上。摘錄每個斑點的匹配數和9il0D并將所有數據和之前的數據放在 一起。將數據分成兩組正常細胞和癌細胞。計算每個組中每個斑點 的標準偏差，并將每個斑點的正常和癌癥組織之間的標準偏差平方的 比較結果用于接下來的student' s t-檢驗。對每個斑點計算兩個組之間的student' s t檢驗來揭示表達顯著 不同的蛋白質(顯著水平99%, p=0. 01)。然后選擇顯著不同的蛋白 質。制備性凝膠對于隨后通過質鐠鑒定蛋白質，除了 3xl06 CPM/凝膠[35S]-甲硫 氨酸標記的蛋白質，裝栽300 ng/凝膠冷蛋白質來跑制備性IPG4-7凝 膠，使用相同的梯度和程序。在第二維后，將制備性凝膠干燥并暴露 于X-射線薄膜10天(Adelina Rogowska-Wrzesinka等，2001 )。蛋白質鑒定將展開的X-射線薄膜置于干燥的凝膠上，使用拐角上的標記來定 位目標蛋白。放置透明膜來重新定位蛋白質并且除去X-射線膜時用作 切割掩模。然后從凝膠直接切除蛋白質。通過在H20中洗滌從凝膠的 背面除去剩余的白色濾紙并通過真空離心干燥，直至其在表面上變成白色。然后使凝膠在50mM NH4HC03， 5mM CaCl2， 12. 5ng/n L胰蛋白酶 中在41C再次膨脹45分鐘。然后上清液由5-10jaL不含胰蛋白酶的相 同緩沖液替代并使其在37C消化過夜(Fey SJ等，1997 )。在凝膠消 化后，通過MALDI質鐠來分析(Jensen ON等，1998 )。使用胰蛋白 酶自體消化肽來內部校準所獲得的質語(Fey SJ等，1997 )。然后將 它們用于搜索NCBI數據庫，通過MASCOT MS/MS離子搜索(http: //www, matrixscience. com) 將以下的參數用于數據庫搜索，使用較少的改進哺乳動物，胰 蛋白酶消化，甲硫氨酸可能的氧化，允許一個錯失的分裂，沒有蛋白 質質量和pl限制，肽耐受性士 50-70ppm, MS/MS耐受性土O. 5Da，肽 電荷+1，單同位素，MALDI-TOF-TOF是所用的方法。"顯著的"結果可以認為是結合搜索SWISS-PROT數據庫的鑒定并 綜述2D凝膠模式中的蛋白質位置。從NCBI數據庫(http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi db=Protein ) SWISS-PROT數據庫(http: 〃www， ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi db-Protein)和其他參考的出版物引用蛋白質功能。結果在該研究中，標記來自結腸癌患者的正常和癌結腸活檢組織并在 蛋白質提取后通過2DGE分析。從33名患者獲得正常/癌活檢組織，并 且總共使用65個樣品( 一個癌癥樣品受到細菌的污染)。使用IPG4-7 凝膠分析每個樣品的蛋白質組。使用計算機輔助圖像分析，檢測并匹配2， 128個斑點。然后將 ["S]-甲硫氡酸標記的蛋白質2DGE模式分成兩組正常和癌癥。在"正 常"組中存在33個模式，在結直腸癌活體切片組中存在32個模式。
圖1中顯示了凝膠圖像的實例.困1顯示了來自正常人結腸組織(左邊)和結直腸癌活檢組織的 ["S]-甲硫氨酸標記的蛋白質的2DGE模式。正常組織來自65歲女性， 而結直腸癌活檢組織來自59歲男性。此后進行這兩個組之間的比較和統計學分析。298個蛋白質斑點 顯示出兩個組之間的顯著改變。它們全部切割自IPG4-7制備性凝膠， 并接受MALDI質傳。迄今為止，已經鑒定出66個斑點，更多的正在進 行中。在這些斑點中，癌癥中的25個斑點得到上調，癌癥中的41個斑 點得到下調。31個斑點是低密度的(在正常和癌癥組中平均 %IOD<0. 05)。這是全部鑒定的斑點的47%。表明可以鑒定許多弱的斑 點。鑒定蛋白質的位置顯示于圖2中的2DGE模式中，并且在表l中給 出了這些蛋白質的定量。圖2顯示出來自正常人結腸活檢組織的[35-S]-甲硫氨酸標記的蛋 白質的2DGE模式。將IPG4-7梯度用于第一維中的蛋白質分離，并將 12. 5%聚丙烯酰胺的SDS-PAGE用于笫二維中。所有名稱是Swiss-prot 數據庫中鑒定的蛋白質的登錄號。 一些可能是翻譯后修飾蛋白， 一些 可能是較大的蛋白質及其分解片段或翻譯后修飾蛋白， 一些是已經報 道在人結直腸癌中具有不同表達或已經認為是結直腸癌可能的診斷標 記的蛋白質。蛋白質登錄號后的'A， ， 'B， ， 'C，…關聯于表1 中的'A， ，'B， ，'C，…，用于不同的MI0D。可能的翻譯后修飾在多于兩個斑點中發現十種鑒定的蛋白質。其中，將角蛋白l(圖 2中標記為O鑒定為相互之間非常遠的六個斑點。通常認為角蛋白1 是質謙過程中的污染物。因此，這些斑點需要再次分析，它們中的六個鑒定為兩個或具有兩個相互非常接近的行內斑點。 認為這種斑點模式是一種翻譯后修飾的類型，改變了蛋白質的pl，但 是分子量沒有大的改變。圖3顯示了可能的PTM斑點的放大2DGE模式I-網素(9a ); intelectin ( 9b );角蛋白19 (9c) ; Ig oc鏈C片段(9d);肌動 蛋白，細胞質2(9e);纖維蛋白原y鏈前體(9f )例如，I-網素(Q14651 )鑒定為兩個斑點，并且在結直腸癌活檢組織中都是下調的。較中性的一個比較酸性的一個量更大。磷酸化是預測的PTM，并且我們通過2DGE模式中的斑點位置證實了該結論(圖 2和3a，表1)。Intelectin-l ( Q8WWA0 )鑒定為兩個斑點，并且在結直腸癌活檢 組織中都是下調的。N-糖基化是鑒定的PTM (Swiss-prot)(圖2和 3b)。角蛋白，I型細胞骨架19 (P08727 )鑒定為四個斑點，并且在結 直腸癌活檢組織中全部是下調的。其中兩個斑點非常接近(圖2和3c)。 已知角蛋白待磷酸化，因此磷酸化可以是預測的PTM。Ig oc-l鏈C區域(P01876 )鑒定為三個斑點，在結直腸癌活檢 組織中全部是下調的。其中兩個斑點非常接近(圖2和3d)。 Cys-352 是蛋白質修飾位點，在發色團和可接近的半胱氨酸之間反應后形成非 還原的硫醚交聯。肌動蛋白，細胞質2 (P63261 )鑒定為三個斑點。其中相互之間 非常接近(圖2和3e)的兩個在結直腸癌活檢組織中是上調的，另一 個在結直腸癌活檢組織中是下調的。纖維蛋白原Y鏈前體(P02679 )鑒定為兩個斑點，并且在結直腸 癌活檢組織中都是上調的。C-端酪氨酸的硫酸化已經預測為PTM，其可以提高對凝血酶的親和性，凝血酶是引發纖維蛋白原轉化為纖維蛋 白的酶(圖2和3f )。五種蛋白質鑒定為位于相對近的位置的兩個或三個斑點(圖2中 標記的)。它們可能是較大的蛋白質和其分解片段。由于在此使用了 快速樣品制備程序，我們認為這些分解片段是在活檢組織中產生的， 因此是重要的。還將其中三種(P14625, P05787, P08727, P63261 )認為是翻譯 后修飾，其改變了蛋白質的pl，但是分子量沒有大的改變。以上已經討論了 P08727和P63261。內質網素前體(P14625 )鑒 定為結直腸癌活檢組織中兩個上調的和一個下調的斑點(圖2),而 下調的一個在蛋白質混合物Spot C中得到鑒定，因此結直腸癌活檢組織中蛋白質的表達可能是上調的。沒有報道過該蛋白的蛋白質修飾。角蛋白，II型細胞骨架8 (P05787 )鑒定為相互接近的三個斑點， 并且全部三個斑點在結直腸癌活檢組織中是下調的(圖2) 。 Ser-73 的磷酸化在角蛋白絲狀體重新組織中起著重要作用。蛋白質混合物三個斑點鑒定為兩個或三個蛋白質的混合物。 Spot A: P35527和P04264 (序列覆蓋32%和22%)。 SpotB: P13667, P02679和P08238 (序列覆蓋:23%, 33%和24%); Spot C: P14625和P04217 (序列復蓋17%和10%);(圖2) 通常， 一種成分具有更好的覆蓋和更高的匹配值。其他成分可能 是較大蛋白質的分解產物，并且肽質量覆蓋蛋白質序列的片段(Spot B)，或可能它們都是較大蛋白質的分解產物(SpotC)，或可能涉及 一些污染物，如角蛋白(spot A)。在通過隨機的樣品制備過程中不 可能產生這些片段，因為所有選定的斑點在兩組之間具有統計學顯著 改變，兩個組具有總共超過60個樣品。換句話說，這些降解產物是在 組織或癌活檢組織中特異性產生的。蛋白質功能可以通過不同的功能或途徑將鑒定的蛋白質分組。如果沒有特別 提及，所有的數據從Swiss-prot數據庫獲得。在47個蛋白質中，25 個蛋白是結構蛋白，其超過全部鑒定蛋白的一半(53%)。這非常容易 理解，因為在腫瘤產生過程中，可以破壞或改變細胞的正常結構，例 如，可以改變細胞的細胞骨架來影響離子通道。此外，23% (11個) 是細胞代謝中涉及的蛋白質，例如，半乳凝素-1，促泌素和組織蛋白 酶D在凋亡，細胞分化或細胞周期調節中起作用。 一旦胂瘤產生，它 們的表達必定受到影響。5種蛋白是轉運蛋白，對此的一種解釋是細 胞結構的改變，例如，膜，細胞內外一些蛋白運輸的通道受到阻斷， 并且這影響了轉運蛋白的表達。反之亦然。4種蛋白涉及免疫/防御系統。可能是因為一旦免疫系統識別異常的細胞活性，如肺瘤產生，更 多免疫細胞滲透結腸和直腸來阻止它。將具有多功能的一些蛋白如血 清白蛋白放入可以表示其主要功能的組中。對于更多的詳細內容，參見表2。蛋白質與結直腸癌的關系基于之前的科學報道，還可以將鑒定的蛋白質分成四組.已經報道與正常的結直腸組織相比較在人結直腸癌中具有不同 的表達或已經認為是結直腸癌的可能診斷標記的蛋白質。(組A) 已經報道與正常的組織相比較在其他癌癥(即，乳癌)中具有 不同的表達或已經認為是可能的診斷標記的蛋白質。(組B) 已經報道具有與其它疾病相關性的蛋白質。(組C) 關于它們與任何疾病的相關性沒有報道過的蛋白質。(組D) 蛋白質名稱，亞細胞位置，結直腸正常和癌組織中平均9il0D列于 表1中。然后選擇組A (已經報道與正常的結直腸組織相比較在人結直腸 癌中具有不同的表達或已經認為是結直腸癌的可能診斷標記的蛋白質)。將進一步討論該組中每個蛋白質在結直腸癌產生中的功能和作 用。其中，3個是結構蛋白，3個是轉運蛋白和3個蛋白涉及細胞代謝。 5個蛋白在結直腸癌活檢組織中是下調的，4個蛋白是上調的。下調的蛋白 L-網素L-網素是網素的一種異構形式(isoform) ( T-網素是另 一種異構 形式)，網素是人肌動蛋白結合蛋白的家族，其在真核生物進化中是 保守的并在所有正常復制中的哺乳動物細胞中大量表達(Lin CS等， 1993 )。其在造血細胞中表達，在其中可以得到磷酸化并已經發現在 許多類型的非造血來源的惡性人細胞中合成。由于其在實體腫瘤的人 腫瘤細胞中的高表達，L-網素可能在肺瘤發生中起作用或在腫瘤產生的過程中L-網素基因已經被激活(LinCS等，1993 )。已經對人前列 腺，乳房和其他類固醇調節區域進行了一些研究(Lin CS等，1993， Zheng J等，1997 )，并且結果顯示L-網素的表達在癌中是上調的。 可能是激素受體受到了誘導來調節L-網素的表達。已經對源自單個患者的結腸癌細胞系SW480和SW620進行了另一 個實驗。結果表明與早期相比較，L-網素在晚期結直腸癌中是超表達 的(OtsukaM等，2001 )。不幸地，在該研究中沒有進行正常和癌結 直腸細胞之間的比較。令人感興趣地，在我們的研究中，與正常組織相比較，L-網素的 表達在癌組織中是下調的。因為該蛋白在總共超過60個樣品的兩個組 之間具有顯著的改變，不可能任意產生。MOD的平均"癌"/ "正常" 比例是0.55，這同樣是不可忽視的。此可能的解釋是結腸組織中的L-網素表達不同于類固醇調節區域中的，如乳房，前列腺，卵巢等。一 種可能性是它從正常組織至結直腸癌活檢組織是下調的，從癌癥早期 至癌癥晚期是上調的。一種解釋可能是小腸的刷狀緣是正常生長-如果 該生長快于早期腫瘤，其將發生。但是這需要通過對不同階段的癌組 織而不是細胞系的進一 步研究來證明。TransgelinTransgelin是形變敏感性肌動蛋白凝膠化和轉化蛋白，通常在成 纖維細胞和平滑肌中發現(LawsonD等，1997 )。它與肌動蛋白微絲 直接作用，并使其在聚合中快速凝膠化。肌動蛋白結合位點或功能性 凝膠化位點與一簇正電荷的氨基酸殘基相關。Transgelin的活性受到 離子強度的控制。在高離子強度完全失去其能力。其凝膠化活性在低 離子強度通過二聚體或寡聚體的形成而受到控制。在肌動蛋白凝膠的 形成中，其起到了集束或交聯的作用。因為transgelin在正常細胞的 細胞的細胞骨架組織化和激活中起著這樣重要的作用，可以在致癌性 轉化的細胞中發現其下調的表達。在這些細胞中，細胞骨架的重新組 織和異常移動是轉移的重要特征(ShaplandC等，1993 )。已經通過研究許多細胞系中的成纖維細胞transgelin的表達證實了這一點 (Lawson D等，1997 )。已經進行了一些研究來調查人結腸胂瘤細胞系以及源自患者的人 結腸和乳房腫瘤組織中的transgelin表達。結果顯示細胞系和組織中 的transgelin表達丟失或降低(Shields JM等，2002 )。 Transgelin 的丟失在基因表達水平得到調控。它的下調表達直接由Ras激活引起。 這是重要的，因為在全部人癌癥的約30%中存在Ras基因的突變。此 外，在一些腫瘤細胞中，Ras-獨立機制具有相同的功能。換句話說， 我們可以說transgelin的下調與致癌Ras的瞬時表達相關(Shields JM等，2002 )。在我們的研究數據中，與正常結直腸組織相比較，腫 瘤組織中的transgelin得到明顯下調。％I0D的平均"癌"/ "正常" 比例為0.71，并且由于2DGE上顯示的高含量，其應當是用于人結直 腸癌的良好早期診斷標記，可能是在癌癥形成后。此外，由于抗 -transgelin的存在，其可以得到檢測。肝脂肪酸-結合蛋白肝脂肪酸結合蛋白是低分子量蛋白的脂肪酸結合組的成員，其涉 及長鏈生物活性脂肪酸的胞內轉運(Lawire LC等，2004 )。其在肝 細胞和腸細胞中得到特異性表達(Ya邁azaki T等，1999 )。由于其的 脂質結合特征，它在脂肪酸的溶解和胞內分配中起著重要作用。這使 得脂肪酸更易于細胞吸收和胞內加工(Storch J， ThumserAE. 2000 )。 它還涉及脂肪酸介導的信號轉導途徑和基因表達調控。因此，它在一 些重要生理功能如細胞分裂，生長，分化等的控制中起著作用(Lawrie LC等，2004 )。在腫瘤產生和進展的過程中，這些功能全部得到較少 的調控，并在其正常發展的過程中通過人胚胎顯示出最快的生長。Lawrie LC對結直腸癌中的肝脂肪酸結合蛋白表達進行的研究表 明結直腸癌中一致的丟失，并且它的丟失是癌癥發展中的早期亊件 (Lawrie LC等，2004 )。在另一個方面中，在患有源自結直腸癌的肝轉移的患者中，肝切除后肝脂肪酸結合蛋白陽性患者的存活年數高于肝脂肪酸結合蛋白陰性的患者(YamazakiT等，1999 )。這顯示出肝脂肪酸結合蛋白的下 調與腫瘤的發展相關。我們的研究數據精確地顯示出正常結直腸組織至結腸癌組織的相 同下調表達趨勢。并且W0D的平均"癌"/ "正常"比例為0.51。此 外，2DGE上顯示出的蛋白含量相當高。這使其更易于得到檢測。因此， 肝脂肪酸結合蛋白可以是結直腸癌非常好的預后標記。角蛋白，I型細胞骨架20角蛋白20是胃腸道上皮細胞中的細胞骨架蛋白(Schwerer MJ等， 1996 )，其首先在1992年得到檢測(Moll R等，1992 )。它是屬于 中間絲家族的稱為"軟角蛋白"中的一種。軟角蛋白含有多于20多個 成員，并分成兩個主要的組I型(K9-20，酸性)，II型(Kl-8，中 性至堿性)(Zhou Q等，2003 )。在角蛋白家族中，角蛋白20具有不常見的分布，并且迄今為止只 得到很少的研究(Zhou Q等，2003 )。例如，人角蛋白20具有一些 特定的特征.與其他I型角蛋白比較，通常它在保守的oc-螺旋"桿"結構域 中與角蛋白14(最相關的角蛋白)只具有58財目同的氨基酸；(MollR 等，1993 ) 它的分布幾乎完全限于胃，腸上皮，尿路上皮，膀胱，梅克爾細胞等；(Moll R等，1993 ) 它在更分化的腸細胞的表達沿著隱窩絨毛分化軸定位 它缺乏對大部分抗角蛋白抗體的免疫交叉反應性(Zhou Q等，2003 )它的表達隨著高度分化的組織中的分化而提高。已經對角蛋白20 和癌癥之間的相關性進行了許多研究。已經證明了它對于原發性和轉 移性人腺癌的表征是重要的(Wildi S等，1999 )。此外，認為它是 辨別癌原發性來源的輔助標記，尤其是對于分離胃腸道和非胃腸道來源的腺癌(MiettinenM， 1995 )。對結直腸癌細胞系進行的一些其他 研究顯示出與正常結腸樣品相比較，CK20 mRNA在結直腸癌樣品中降 低了 (WildiS等，1999 )。還認為角蛋白20是結直腸癌中亞顯微淋 巴結轉移的標記并通過K-RAS得到證實，K-RAS是約30-40%結直腸癌 中突變的基因(Yun K等，2000)。在我們的研究中，與正常結直腸組織相比較，腫瘤組織中的角蛋 白20是下調的，具有O. 4的％100平均"癌"/ "正常"比例。然而， 檢測到的蛋白質的平均含量相對低，并且難以使用消失的蛋白質用于 診斷，因此只能用于區分腫瘤類型，并可以作為人結直腸癌的輔助診 斷標記。阿樸脂蛋白A-I阿樸脂蛋白A-I是高密度脂蛋白(HDL)的主要結構蛋白，其具有 234個殘基。它屬于可交換阿樸脂蛋白的類別，并含有球狀氨基端結 構域和脂質結合羧基端結構域(Segrest JP等，2000; Marcel YL等， 2003)。其脂質結合特征幫助在分離成組成部分的脂蛋白的能力和循環中 脂質穩定轉運之間形成了微妙的平衡(Marcel YL等，2003 )。這促 進了膽固醇從細胞流出，并且該機制在支持細胞膽固醇體內平衡中起 著重要作用(Segrest JP等，2000)。此外，它結合脂質，激活卵磷 脂，形成與特定受體相互作用的成熟HDL和脂質轉移蛋白的能力可以 影響逆向膽固醇轉運的效率。并且和HDL—起，它們在逆向膽固醇轉 運中的作用決定了 HDL血漿水平和冠心病之間的逆相關(Frank PG等， 2000)。除了冠心病以外，已經報道阿樸脂蛋白A-I在其他疾病中是重要 的，其他疾病如類風濕性關節炎，多發性硬化，全身性紅斑狼瘡和動 脈粥樣硬化(Hyka N等，2001 )。已經表明阿樸脂蛋白A-I在人腸上皮細胞中表達。Normanno進行 的一個研究表明使用Apo A-I RT-PCR測試在健康人或沒有結腸癌的患者中不能檢測到阿樸脂蛋白A-1 mRNA( 4名健康供體和11名患有結腸 癌以外的肺瘤疾病的個體)，而發現少量結腸癌患者是陽性的(NormannoN等，1998 )。在我們的分析結果中，在結直腸癌活檢組 織和"正常，，組中檢測到的蛋白質平均含量非常低，盡管％100的平均"癌"/ "正常"比例非常良好(O. 32)。這可以解釋為什么Normanno 在他的正常樣本中不能檢測到它。同時，Normanno N的研究的樣本數 相對小，并且可以將二十個中的兩個陽性結果認為是偶然的。對結直 腸癌中下調的一種假設是在癌癥發展的過程中，阿樸脂蛋白A-I的丟 失可能碰巧破壞了膽固醇流出的體內平衡，打亂了細胞代謝。但是這 樣的假設需要之后的研究來證實。上調的蛋白 組織蛋白酶D組織蛋白酶D是組織蛋白酶家族的成員，其在胞外基質降解中具 有作用(AdenisA等，1995 )。它是在溶酶體中遍及分布的天冬氨酸 內切蛋白酶。組織蛋白酶D最初在粗面內質網上合成為52kDa前體蛋 白，并且照這樣是沒有酶活性的。通過蛋白水解處理，其分裂成46kDa 活性雙鏈形式(Talieri M等，2004 )。組織蛋白酶D的主要功能是 在酸性pH降解溶酶體中的蛋白質。此外，在一些特異性細胞中，其可 以通過清除無活性的前體來形成活性蛋白質(Liaudet-Coopman E等， 2005)。現今，最多討論的組織蛋白酶作用是與癌癥的關聯。幾個報道已 經表明這種酶的表達與各種器官癌癥患者的預后直接相關.這是因為 其刺激癌細胞增殖的能力。組織蛋白酶D的產生提高了癌細胞的入侵潛能，導致轉移可能性的提高。此外，其可以降解胞外基質并激活一 些其他的已經認為與肺瘤進展相關的蛋白酶，如組織蛋白酶B和L (0h-e H等，2001 ).然而，Liaudet-Coopman E和同亊的研究結果 顯示出通過直接或間接引發未經確認的細胞表面受體，組織蛋白酶D 可以作為替代蛋白酶的胞外基質結合蛋白。它不僅可以刺激癌細胞增殖，而且刺激腫瘤血管生成。此外，認為通過與M6P/IGFII-受體(它 在通過核內體途徑轉運不同配體中的作用是公知的)的相互作用，組 織蛋白酶D促進了胂瘤細胞增殖(Liaudet-Coopman E等，2005 )。 一些其他研究已經表明組織蛋白酶D是誘導型凋亡的關鍵陽性介質， 因此，組織蛋白酶D在凋亡中可能具有雙重作用(Liaudet-CoopmanE 等，2005 )。這與我們的研究數據一致，與正常組織相比較，組織蛋白酶D在 癌組織中是超表達的。MI0D的平均"癌"/"正常"比例非常好(l. 7)， 盡管結直腸癌活檢組織和"正常"組中的蛋白質含量相對低。 一些其 他報道還指出是組織蛋白酶D活性而不是含量與結直腸癌的惡性進展 相關。與含量連續增加相比較，活性從正常粘膜至配對的腫瘤cytocol 是遞增的，不過當腫瘤變得更大時，是遞減的(Tumminello FM等， 1995 )。因此，結合組織蛋白酶D蛋白的含量和活性的改變可以給我 們更清楚的診斷證據。半乳凝素-1半乳凝素-1屬于廣泛分布于活生物體中的結構上相關的蛋白質 的半乳凝素家族。該家族通過具有至少 一個碳水化合物-識別結構域及 其對含P-半乳糖的寡糖的親和性來限定(Danguy A等，2002; Rabinovich GA， 2005)。作為半乳糖結合蛋白，證明了半乳凝素-1是各種細胞類型的有效 促細胞分裂劑，并且已經將許多生長調控現象歸于半乳凝素-1。例如， 通過與細胞P -半乳糖苷配體的相互作用，其可以促進促有絲分裂或細 胞抑制應答。其可以與未知的配體相互作用來抑制許多細胞類型的增 殖，細胞包括與P-半乳糖苷結合無關的正常和腫瘤細胞。此外，盡管 一些腫瘤細胞抵抗這種對生長和轉移的作用，半乳凝素-1在它們周圍 的組織中介導的生長抑制或凋亡可以影響腫瘤細胞的生長和存活 (Scott K等，2004 )。已經報道了在許多人器官中與正常細胞相比較半乳凝素-1在癌細胞中的超表達，器官如膀胱，甲狀腺，結腸等。此外，報道了人結 腸癌的疾病進展過程中細胞質半乳凝素-1的顯著增加。另一個重要的 觀察是半乳凝素-1提高的表達與其表達的胞內位置的改變相關。在腫 瘤的發展過程中，細胞質內它的表達與正常結腸組織中看到的核定位相比較變得逐漸增加(HitteletA等，2003 )。另一個研究還指出結 直腸粘膜中半乳凝素-1超表達與腫瘤進展相關(Sanjuan X等，1997 ), 因此，半乳凝素-l對于結腸癌細胞的惡性行為是關鍵作用(Hittelet A等，2003 )。我們的數據精確地顯示出相同的表達趨勢，具有1.61 的WIOD的平均"癌"/ "正常"比例。因此，半乳凝素-l是相當好的結直腸癌診斷標記。報道了 galictin家族中的另一個成員-半乳凝素-3也涉及結腸癌 的惡性進展，并且可能是更好的臨床診斷標記(Hittelet A等，2003 )。蛋白酶體5型oc亞基蛋白酶體是所有真核細胞的細胞質和核中存在的高度保守的，大 量的多催化(multicatalytic)酶復合物(Zevrski I等，2005; DaltonWS， 2004 )。其主要功能是消除細胞蛋白，不僅除去損壞的和錯折疊 的蛋白，而且除去各種具有重要細胞作用的蛋白，重要細胞作用如細 胞周期的調節，細胞分化，凋亡，應激應答等。報道了超過80%的所 有細胞蛋白受到蛋白酶體的降解(DaltonWS， 2004 )。由于這些底物 在細胞代謝中的關鍵作用，因此蛋白酶體是細胞中的重要成分。對核因子-kb (NF-kB)進行的研究已經證明了蛋白酶體抑制的 效果，其導致其不利底物的穩定和累積。NF-kB是與I-kB(抑制伴 侶蛋白)結合時保留在細胞質中的轉錄因子。當I-KB經受調控的絲 氨酸磷酸化作用時，它在蛋白酶體中降解。 一旦從I-tcB釋放出來， NF-KB轉移至核中，然后它控制涉及細胞分化，生長和凋亡的轉錄基 因。此外，它促進細胞增殖和腫瘤發生。通過蛋白酶體抑制劑的I-k B降解的抑制可以將NF- k B保持在細胞質中，因此防止其與核DNA的 相互作用。因為I- k B磷酸化作用的抑制劑不能夠完全防止細胞增殖，這表明蛋白酶體抑制劑的作用是多目標途徑(Mitchell BS, 2003; Zavrski I等，2005 ) 。 Bortezomib， 一種可逆的硼酸二肽蛋白酶體 抑制劑，是在癌癥臨床測試中測試的第 一種蛋白酶體抑制劑。因此，盡管是新的，蛋白酶體是各種癌癥，包括結直腸癌治療相 當好的目標。對結腸癌細胞系(SW48， SW116)和結腸癌樣本的研究都 證明了蛋白酶體抑制劑可以抑制細胞生長和誘導凋亡(Hochwald SN 等，2003 )。根據之前提及的已知細胞作用，我們研究中的蛋白酶體的上調可 以表示結直腸癌的發展。血'清白蛋白人血清白蛋白是血液中的通用轉運蛋白。它的主要功能是在血流 中攜帶疏水性脂肪酸分子。它還結合許多其他的天然物質和各種藥物 分子。蛋白質由單個多肽鏈構成。它是67% oc-螺旋并且不含有P-片狀 結構。它由三個類似的同源結構域構成，其裝配形成心形分子(HeXM 等，1992 )。由于廣泛的分布及其可能反映出營養狀況和蛋白質攝入的能力 (KnektP等，2000)，認為血清白蛋白與各種疾病，包括癌癥相關。Knekt和同亊進行的一個研究表明較高的血清白蛋白水平與遠端 結腸癌較高的危險系數相關，但與近端結腸或直腸癌不相關。在我們 的數據中，它在結直腸癌中也是上調的，具有1. 82的％100的平均"癌" / "正常"比例。 一種解釋是腫瘤中和腫瘤周圍的高蛋白攝入或其他膳 食因素導致高濃度的血清白蛋白(Knekt P等，2000 )。在九種蛋白中，其中七種具有與之前報道相同的表達趨勢。對于 剩余的兩種蛋白，L-網素和阿樸脂蛋白A-I，沒有報道過結直腸正常 和癌組織之間的表達比較。換句話說，對于結直腸癌的標記，我們的 數據與之前的公開完全一致。除了這9種蛋白，我們已經鑒定了 57種從未與結直腸癌相聯系過的其他蛋白質，并且提出大部分或全部與結直腸癌相關。 基于上述實驗部分得出的結論在由2DGE選擇的全部298種蛋白質中，這些中的125種是上調的， 并因此是潛在的診斷標記。使用2DGE和MS，鑒定出了 66種在正常結 直腸組織和結直腸癌組織之間具有顯著表達差異的蛋白質。之前報道 過這些蛋白質中的九種作為標記，目標或對結直腸具有影響。這證明了 2DGE結合MS技術是發現結直腸癌標記或目標蛋白的杰 出方法。在這些研究中發現并且還發現與結直腸癌相關的9種蛋白質 中，我們的數據與所有之前的觀察相一致并擴充了所有之前的觀察。 不僅是之前已經報道過的九種蛋白，而且鑒定的所有蛋白也可以用于 診斷目的。因此，所獲得的結果在臨床環境中具有非常高的價值.參考文獻Adelina Rogowska-Wrzesinka， Larsen PM Blomberg A. ， Gorg A.， Roepstorff P. ， Norbeck J. 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權利要求
1. 診斷哺乳動物如人結直腸癌的方法，該方法包括測定來自所述哺乳動物的生物樣品中至少一種標記蛋白的存在，不存在或表達水平，其中標記蛋白選自下組·表1中限定的蛋白質；和·是表1蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表1的蛋白質具有至少80％的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和/或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不是HSP90，60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
2. 根據權利要求1的方法，其中該方法包括建立至少一種標記蛋 白提高的表達(上調的標記蛋白)，該標記蛋白選自 表l中限定的和標記"上調"的蛋白質；和 是表l中限定蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表 1中限定的蛋白質具有至少80%序列同源性。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中生物樣品選自尿液，糞便， 血液，唾液，淋巴液和組織。
4. 根據權利要求3的方法，其中組織取自結腸和/或直腸。
5. 測定哺乳動物如人結直腸癌傾向性的方法，該方法包括測定來 自所述哺乳動物的生物樣品中至少一種標記蛋白存在，不存在或表達 的水平，其中標記蛋白選自下組 表l中限定的蛋白質；和 是表1蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表1的蛋 白質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少 一種標記蛋白是HSP90, 6 OS酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
6. 測定人結直腸癌傾向性的方法，該方法包括a) 測定來自人的生物樣品中至少一種標記蛋白提高的表達，所述 標記蛋白選自下組i)表l中限定的上調蛋白，和H)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白，使得與i)的蛋白 質具有至少80%的序列同源性；b) 測定來自人的生物樣品中至少一種標記蛋白降低的表達，所述 標記蛋白選自下組i)表l中限定的下調蛋白，和H)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白，使得與i)的蛋白 質具有至少80%的序列同源性；或c) a)和b)中測定的結合。附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
7. 根據權利要求l， 5或6任一項的方法，其中至少一種標記蛋 白選自下組a )相對于對照在來自所述生物樣品的蛋白質聚丙烯酰胺凝膠上以 顯著較低或顯著較高含量存在的一種或多種蛋白質；b )來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上存在而對照的蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠上不存在的一種或多種蛋白質；和c )來自所述生物樣品的蛋白質的聚丙烯酰胺上不存在而對照的蛋 白質的聚丙烯酰胺上存在的一種或多種蛋白質。
8. 治療哺乳動物如人結直腸癌的方法，包括改變至少一種標記蛋 白的表達，該標記蛋白選自下組a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
9. 治療哺乳動物如人結直腸癌的方法，包括將至少一種選自以下 的化合物給藥于人a) 表l中限定的蛋白質；b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性；c) 具有與a)和/或b)中蛋白質相同功能的蛋白質；d) 編碼a) ， b)或c)中蛋白質的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)中蛋白質的抗體；f) 能夠結合a) , b)或c)中蛋白質的核酸片段；和g) 能夠結合a) ， b)或c)中蛋白質的化合物， 附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和/或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
10. 預防或延遲哺乳動物例如人結直腸癌發作的方法，包括將以 下的物質給藥于人a) 表l中限定的蛋白質；b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性；c) a)和b)中限定蛋白質的模擬物；d) 編碼a)和/或b)中蛋白質的核苦酸序列；e) a)和/或b)中限定蛋白質的抗體；f )能夠結合a)和/或b)蛋白質的核酸片段；和/或 g)能夠結合a)和/或b)中限定蛋白質的化合物， 附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
11. 測定試劑在結直腸癌治療中具有治療效果可能性的方法，包 括測定來自以下的一種或多種蛋白在將測試模型暴露于所述試劑之前和之后的相對表達水平a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90, 60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
12. 測定化合物在結直腸癌治療中效果的方法，包括測定來自以 下的一種或多種蛋白的蛋白表達水平a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
13. 測定結直腸癌治療中所用化合物效果水平的方法，包括測定 來自以下的一種或多種蛋白在將測試模型暴露于所述試劑之前和之后 的表達水平a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
14. 測定患有或易患結直腸癌的哺乳動物如人結直腸癌的性質或 誘因的方法，包括建立來自以下的蛋白質相對于模型的表達水平a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性，附帶條件是當至少一種標記蛋白是HSP90，60S酸性核糖體蛋白和 /或來自表1組A的蛋白質時，從該組選擇至少再一種標記蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖體蛋白或來自表1組A的蛋白質。
15. 選自以下的基本上純的蛋白質a) 表l的蛋白質；和b) 與a)中蛋白質具有至少80%序列同源性的蛋白質， 附帶條件是從保護中排除HSP90和60S酸性核糖體蛋白。
16. 包括編碼表1中限定的蛋白質或與其具有至少80%序列同源性的蛋白質的核苷酸序列的核酸片段。
17. 與根據權利要求16的核酸片段或其部分或與其互補鏈雜交的 核酸片段。
18. 根據權利要求16-17任一項的核酸片段用于檢測選自以下的 肽的存在的用途a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性。
19. 能夠結合選自以下的蛋白質的抗體a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性。
20. 根據權利要求19的抗體，其是多克隆抗體。
21. 根據權利要求19的抗體，其是單克隆抗體。
22. 根據權利要求19至21任一項抗體用于檢測選自以下的蛋白 質的存在的用途a) 表l中限定的蛋白質；和b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性。
23. 用于診斷哺乳動物如人結直腸癌或結直腸癌遺傳傾向性的測 試盒，包括a) 結合工具，其特異性結合至少一種選自以下的標記蛋白i) 表l中限定的蛋白質；和ii) 是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與其具有 至少80%序列同源性；或該結合工具是至少一種所述標記蛋白的抗體， 能夠結合至少一種所述標記蛋白的核酸片段，或能夠結合至少一種所 述標記蛋白的化合物；b) 檢測結合工具與至少一種標記蛋白或與至少一種核酸片段結合 的工具，如果存在結合，或者為檢測結合水平的工具，和c) 用于關聯的工具，關聯與所述結合工具的結合，如果存在結合， 或者關聯結合水平，是否表示個體哺乳動物具有顯著較高的患結直腸 癌的可能性或患結直腸癌遺傳傾向性。
24. 測定物質效果的方法，該方法包括使用哺乳動物，例如人， 其已經使用根據權利要求1至7任一項的方法建立為具有患結直腸癌 的高可能性或患結直腸癌遺傳傾向性的個體，該方法包括將物質給藥 于個體并測定該物質的效果。
25. 藥物組合物，其包括a) 能夠調節核酸片段表達的物質，該核酸片段編碼選自以下的蛋 白質的至少一部分i) 表l中限定的蛋白質；和ii) 是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與i)的蛋 白質具有至少80%的序列同源性；b) 選自以下的標記蛋白i) 表l中限定的蛋白質；和ii) 是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與i)的蛋 白質具有至少80%的序列同源性；c) 選自以下的蛋白質的衍生物，同源物或模擬物i)表l中限 定的蛋白質，和ii)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使 得與i)的蛋白質具有至少80%的序列同源性；d) 選自以下的蛋白質的抗體i)表l中限定的蛋白質，和ii)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與i)的蛋白質具有 至少80%的序列同源性；e) 能夠結合選自以下的標記蛋白的核酸片段i)表l中限定的 蛋白質，和ii)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與 i)的蛋白質具有至少80。yi的序列同源性；和/或f) 能夠結合選自以下的標記蛋白的化合物i)表l中限定的蛋 白質，和ii)是i)中蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與i ) 的蛋白質具有至少80%的序列同源性。
26. 根據權利要求25的藥物組合物，用作藥物，如用于治療或預 防結直腸癌。
27. 選自以下的化合物的用途a) 表l中限定的蛋白質；b) 是表l蛋白質的修飾物或衍生物的蛋白質，使得與表l的蛋白 質具有至少80%的序列同源性；c) 具有與a)和/或b)中蛋白質相同功能的蛋白質；d) 編碼a) , b)或c)中蛋白質的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)中蛋白質的抗體；f) 能夠結合a) ， b)或c)中蛋白質的核酸片段；和g) 能夠結合a) ， b)或c)中蛋白質的化合物，用于制造治療或 預防結直腸癌的藥物。
28. 構建表達至少一種蛋白的細胞或細胞系的方法，該蛋白選自 來自表l的蛋白，表l蛋白的修飾物和衍生物，使得與表l的蛋白質 具有至少80%(例如90%或95%)同源性；例如，通過將編碼所述蛋白 的至少一種DM序列引入細胞中，如自身的細胞。
29. 根據權利要求28的構建細胞或細胞系的方法，其中修飾細胞 來避免被免疫系統識別為外源物質。
30. 根據權利要求28的構建細胞或細胞系的方法，其中引入至少 一種調控元件來調節引入的DNA序列的活性。
31. 根據權利要求28的構建細胞或細胞系的方法，其中細胞是結腸上皮細胞，直腸上皮細胞，干細胞或多能性細胞。
32.可通過權利要求28的方法獲得的細胞或細胞系。
全文摘要
本發明涉及診斷哺乳動物如人結直腸癌(CRC)的方法，該方法包括測定來自所述哺乳動物的生物樣品中至少一種標記蛋白的存在，不存在或表達水平。證明了來自正常和腫瘤組織的結腸活檢組織的代謝標記結合之后的2維凝膠電泳和質譜是鑒定CRC發展中涉及的標記蛋白質的有力工具。
文檔編號G01N33/574GK101283280SQ200680037570
公開日2008年10月8日 申請日期2006年8月17日 優先權日2005年8月18日
發明者P·M·拉爾森, S·J·費伊 申請人:Zadec私人有限公司
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