專利名稱：生物化學物質的分析方法
技術領域：
本發明涉及生物化學物質的分析方法。另外，本發明涉及釆用把作
分析裝置,
背景技術：
從前，為進行生物化學物質的高靈敏檢測而釆用熒光法。在此前進 行的采用放射性同位素的方法相比，由于操作容易，不需要對放射能的 安全對策，故其被快速取代。熒光法，可以舉出對作為檢測對象的生物 化學物質直接標記熒光體的方法與間接標記的方法。以熒光免疫檢查 為例，對作為檢測對象的生物化學物質直接標記熒光體，把該熒光標記 過的生物化學物質固定在固相上，用該抗體捕捉、加以檢測屬于前者。 所謂互相竟爭法也含在該分類中。后者，可以舉出對同樣的生物化學物 質具有親和性的某種抗體進行熒光標記，進行二次反應的夾層分析法等。
另一方面，化學發光法一直在發展。當采用化學發光法時，由于不 能把激發光的散射作為背景光測量，故可以實現更高靈敏度的測量。在 化學發光的場合，當作為檢測對象的生物化學物質直接或間接標記酶 時，可以舉出標記熒光體的場合。在前者的情況下，優選使用過氧化物 酶或堿性磷酸酯酶。所謂酶聯免疫吸附測定法屬于此分類。把捕捉了 以微型板壁等作為對象的生物化學物質的抗體加以固定，添加含檢測 對象物質的溶液。溶液中的檢測對象物質通過抗體被捕捉在壁面上， 洗去多余的溶液。往其中添加對作為檢測對象物質的酶標記抗體，等到 該酶標記抗體結合在檢測對象物質上時，洗去多余的溶液。最后，裝入 含有與酶反應的發光試劑的溶液，檢測產生的發光。當標記熒光體時， 例如，當作為HPLC檢測器應用時，對從HPLC流出的各熒光標記過的分 子，使與化學激發劑進行混合反應，被標記過的熒光體發生激發，檢測 發出的化學光。
作為多項目檢測設備，可以舉出結合了探針的珠陣列在細管中的 技術(下面稱作珠陣列)(例如，專利文獻l)。另外，使用微流路，把對象 物質捕捉在固相上的分子被結合的檢測設備也有報告(例如，專利文獻 2)。
專利文獻1:特開平11-243997號公報 專利文獻2:特開平11-075812號公報
發明內容
關于化學發光或生物發光等發光檢測法，與熒光法比較，由于從對 象得到的每單位時間的光子數少，故必需采用高靈敏度測量體系，增加 測量時間等措施。
關于珠陣列， 一般對檢測對象物質進行焚光標記，該焚光標記物質 對珠上的探針的捕捉加以熒光檢測。有反應速度快的優點，另一方面， 來自激發光的散射光或從珠材質產生背景光的可能性存在。另外，對珠 陣列采用發光檢測時，由于每單位時間產生的光子數少，故必需確保絕 對靈敏度，有人設想從珠的發光，通過相鄰的珠表面反射，從相鄰的珠 發光那樣進行測量的"串擾"。即使使用微流路，把對象物質捕捉在 固相上的分子被結合的檢測設備中，有可能產生來自發光的散射光及 反射光。
如上所述，本發明的課題是，使用微流路在把對象物質捕捉在固相 上的分子被結合的檢測設備中，利用溶液的流動以高靈敏度實現定量 的發光檢測法。另外的課題是，在珠陣列的場合，防止珠間的發光串擾。 本發明提供一種生物化學物質的分析方法，其特征在于，該法具有: 結合在固相上的探針，與把標記過的檢測對象物質捕捉在探針上的工 序，或把未被標記的檢測對象物質捕捉在探針上并加以標記的工序；通 過液流供給發光試劑的工序；對上述發光試劑與上述標記的反應的部
位附近進行光學檢測的工序。
這里的所謂固相，意指至少一部分上固定了探針的固相。作為固相 可以采用粒子(珠)、流路的壁面、流路內設置的突起以及線狀構件等。
作為固相的材料，例如，可以舉出塑料、金屬、無機化合物。作為
塑料，可以舉出聚乙烯、聚甲基苯乙烯等苯乙烯類樹脂；聚丙烯、聚乙 烯、聚環烯烴等聚烯烴類樹脂；聚碳酸酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙 酯等聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯等聚曱基丙 烯酸酯等(曱基)丙烯酸類樹脂；聚氟代烯烴等氟類樹脂；二甲基硅氧 烷、二乙基硅氧烷等硅酮類樹脂。作為金屬，可以舉出鐵、不銹鋼、銅、 或這些的合金。作為無機化合物，例如，可以舉出玻璃、陶資、半導體 等。固相材料不限于這些，既可以由1種材料構成，也可以由多種材料 構成。從探針對固相的容易性、背景低、容易得到考慮，聚苯乙烯是最 優選的。
本發明中使用珠時，作為珠直徑，0. 1 u m~ 6mm是優選的，更優選 0. 5 n m~ lmm，尤其優選0. 75 u m~ 500 u m，最優選1. 0 u m~ 100 u m。另 外，放入珠的配管，采用與所用珠的直徑對應的配管，為珠的直徑2倍 以下是所希望的。
在發光檢測體系中，使發光底物的送液時間與測量時間 一 致進行 測量，可以實現高靈敏度。在這里，發光底物利用從到達固相，例如，珠 上的酶的時間至短時間內呈現大的發光峰的現象。通過觀測該峰的部
分，以高精度分離信號與噪聲，進行以高靈敏度進行測量是可能的。另 外，釆用邊流入發光試劑邊測量發光的方法，發光試劑處于經常供給的
狀態，由于酶附近的發光試劑濃度不衰減，故可以抑制發光強度的衰減 穩定地進行長時間測量。通過長時間加合高峰后的信號，也可以以高靈 敏度進行穩定測量。當檢測對象物質多，捕捉的酶的密度高時，可以抑 制通過流動供給發光試劑的發光試劑周邊濃度的下降，故可以進行高 精度測量。另外，在用光電子倍增管進行掃描加以測量的體系中，設置 狹縫，通過把測量對象珠的大小與狹縫的關系進行適當設定，提高分辨 能力，故可進行高精度測量。為了判斷珠的信號，必需識別多個峰，空間
分辨能力必需達到某種程度。從含測定帶區域影響的考察結果可知， 與測量時間等對應的適當的狹縫寬度等有限制。另外，還可以釆用的方 法是，在作為測量對象的珠彼此之間保持間隙，采用大的狹縫寬度，提 高靈敏度并且進行珠的識別。
本發明中的發光檢測體系，包括化學發光檢測體系與生物發光檢 測體系。所謂化學發光，意指通過化學反應被激發的分子返回至基態時，
作為能量放出光的現象；所謂生物發光，意指通過使用螢火蟲或細菌的 熒光素酶等生物酶,使發光物質氧化等化學反應進行發光的現象，廣義 上說有時屬于化學發光的范疇。作為化學發光檢測體系，可以舉出以魯 米諾/過氧化氫作底物的過氧化物酶的化學發光，以作為二氧雜環丁烷 衍生物的金剛烷基甲氧基磷酰基二氧雜環丁烷(AMPPD)作為底物的堿 性磷酸酯酶的化學發光；通過雙-2， 4， 6-三氯苯基乙二酸酯(oxlate ) (TCP0)等過草酸酯衍生物/過氧化氫/8-苯胺基萘磺酸(ANS)等熒光色 素類的堿性磷酸酯酶的化學發光等的檢測體系，作為生物發光檢測體 系，例如，可以舉出以ATP/熒光素/鎂離子作為底物的螢的熒光素酶的 生物發光檢測體系；對葡糖-6-磷酸脫氫酶以葡糖-6-磷酸/NAD作底物 生成的NADH，采用細菌熒光素酶與NADH-FMN-氧化還原酶的發光反應 的檢測體系；對丙酮酸激酶以ADP與磷酸烯醇丙酮酸作為底物生成的 ATP，用螢的熒光素-熒光素酶的發光反應的檢測體系等。
作為防止珠之間的發光串擾的課題，不涉及測量的光學設定，對于 高靈敏度的多項目檢測是重要的。解決該課題的手段之一，在作為測量 對象的多個珠之間設置具有遮光性材料的珠。另一解決該課題的手段 是，使含發光試劑的溶液折射率接近珠的折射率。當含發光試劑的溶液 與理想地配制珠材料，具有實質上相同的折射率時，在珠表面不產生光 反射，故可以防止珠間的光反射，即串擾。解決該課題的另一手段是， 在測量裝置與珠陣列之間插入偏振片。珠表面上的發光，由于發光底物 向無規方向發光，當考慮不發生偏光時，相鄰的珠反射的串擾，由于s 波與p波反射率的不同而發生偏光。因此，通過插入偏振片，串擾成分 可被重點遮蔽，結果是產生串擾成分減少。
作為分析方法之一例，其特征在于，具有向收納至少一部分上結 合了探針的固相的流路，供給含有已被標記的檢測對象物質或未被標記 的檢測對象物質的液體的工序；
把上述已被標記的檢測對象物質捕捉在上述探針上的工序或把未 被標記的檢測對象物質捕捉在探針上并加以標記的工序；
通過液流向上述流路供給用于發光反應的試劑的工序；
對上述用于發光反應的試劑與上述標記反應的部位附近進行光學 檢測的工序。
作為分析試劑盒之一例，其特征在于，具有細管；固定探針并且 收納在上述細管中的第1粒子；含有遮光性物質并且收納在上述細管中 的第2粒子；用于發光反應的試劑。
作為分析裝置之一例，其特征在于，具有用于向收納至少一部分 上固定了探針的固相的細管導入和/或導出液體的送液部； 用于收納試樣的第l容器； 用于收納用于發光反應的試劑的第2容器；和 用于對上述固相的任意部位進行光學檢測的檢測部， 上述第1容器和上述第2容器與上述送液部連結。 按照本發明，在通過多項目進行發光檢測的檢測設備中，可以有效 實現高靈敏度的定量發光法。特別是采用珠陣列時，珠之間具有更加防 止發光串擾的效果。
另外，采用多項目進行發光檢測時，在每塊微型板等各個孔內添加 試劑的方式，可采用以前的方式進行。當為珠陣列時，與這些體系相比， 由于含對象物質的溶液及發光物質等可以分別流動，故不需分注等操 作，可實現簡便而均勻的反應。另夕卜，與微型板不同，反應區域由于不用 壁等隔開每個項目，故可采用少的試劑量進行發光檢測。
附圖的簡單說明
圖1是本發明一實施方式的流程圖。 圖2是本發明一實施方式的模擬圖。
圖3是本發明一實施方式的裝置模擬圖。
圖4是本發明一實施方式的發光測量例與發光試劑送液計時的概 略圖。
圖5是本發明一實施方式的裝置模擬圖。
圖6是本發明一實施方式的發光測量例與發光試劑送液計時的概 略圖。
圖7是本發明一實施方式的裝置模擬圖。
圖8是本發明一實施方式的光學系統掃描與數據的關系模擬圖。 圖9是本發明 一實施方式的狹縫寬度與信號波形的關系模擬圖。 圖IO是本發明一實施方式的裝置模擬圖。 圖11是本發明一實施方式的發光串擾模擬圖。 圖12是本發明一實施方式的發光串擾與遮光性珠的效果模擬圖。 圖13是本發明一實施方式的發光串擾與溶液的折射率調整的效 果模擬圖。
圖14是本發明一實施方式的溶液的折射率用丙三醇調整的反射 率曲線圖。
圖15是本發明一實施方式的發光串擾與丙三醇70%溶液的效果模 擬圖。
圖16是本發明一實施方式的裝置模擬圖。
圖17是本發明的實施例1、 2的實驗裝置模擬圖。
圖18是本發明的實施例1的測定結果圖。
圖19是本發明的實施例2的測定結果圖。
圖20是本發明的實施例3的實驗裝置模擬圖。
圖21是本發明的實施例3的測定結果圖。
符號說明
IOI:毛細管、102:帶抗體的珠、103:不帶抗體的珠、104:抗甲胎 球蛋白抗體、105:曱胎球蛋白、106: HRP標記抗甲胎球蛋白抗體、107: 發光試劑、108:發光、109:含甲胎球蛋白的樣品溶液、IIO:洗滌用緩 沖液、lll:含HRP標記抗曱胎球蛋白抗體106的溶液、112:洗滌用緩
沖液、113:含發光試劑的溶液、114:光測量器、121:珠陣列、121a: 珠陣列、121b:珠陣列、121c:珠陣列、121d:珠陣列、122:毛細管、122a: 連接部、122b:連接部、122c:連接部、123:注射器、124:注射器泵、 125:毛細管、126:閥、127:容器、131:光學纖維、132:與PMT連接的 連接器、133:PMT、 134:管線、135:電腦、136:粒子(珠)止動器 (stopper) 、 137:連接部(內部密封連接器)、141:珠陣列、142:光學 纖維束、143:與PMT連接的連接器、144:檢測區域、151:珠陣列、152: 物鏡、153:成像鏡、154:狹縫、155:PMT、 156:光學體系、157:管線、 158:電腦、201:珠陣列群、202:送液系統、203:溶液保持部及連接切 換部、204:照相機鏡頭、205:CCD照相機、206:管線、207:電腦、208: 測量部分、211:發光珠、212:預計不發光的珠、213:毛細管、214:含 發光試劑的水溶液、221:遮光性珠、231:直接向著光學系統的光線、 232:向相鄰的珠的光線、233:調整折射率的溶液、241:偏振片。
具體實施例方式
圖l是本發明第1實施方式的分析方法的概略流程圖。其詳細內 容依次介紹如下。最初，作為工序(A)，對具有捕捉作為檢測對象的生物 化學物質的抗體，固定在固相上的流路的設備，導入含有檢測對象物質 的樣品溶液。樣品導入前，抗體未作任何捕捉。其次，作為下一工序(B)， 是把導入的樣品溶液中的檢測對象物質捕捉在固相上抗體的工序。此 時既可連續進行樣品溶液的送液，也可停止送液等待進行反應。然后， 作為其后的工序(C)，是洗去剩余的樣品溶液，洗滌設備內部的工序。通 過洗滌設備內部，作為檢測對象的物質，實質上僅存在于用抗體捕捉的 部位。然后，作為其后的工序(D),是把含有對檢測對象物質具有親和性 引起發光的酶加以標記的抗體溶液導入設備內部，與檢測對象物質反 應的工序。該工序是間接標記檢測對象物質的工序。作為其后的工序 (E)，其是把與檢測對象物質未反應的固相上未被捕捉的剩余酶標記的 抗體加以洗去，洗滌設備內部的工序。通過洗滌設備內部，其后引起發 光的酶，實質上存在于檢測對象物質的部位，即捕捉了作為檢測對象的
生物化學物質的抗體，僅存在于固定固相的部位，在其他場所不引起發
光。作為其后的工序(F)，與酶反應的發光試劑，流至設備內部，從抗體 附近測量發光的工序。引起發光的酶，僅在捕捉檢測對象物質處存在， 所以固定了捕捉檢測對象物質的酶的固相附近的發光，來自檢測對象 物質的存在。發光量反映了作為檢測對象的物質捕捉量，進而反映樣品 溶液中的檢測對象物質量或濃度。作為最后的工序(G)，把測量得到的 來自發光的測量信號，作為檢測結果進行處理的工序。通過該工序，從 得到的發光強度推測出檢測對象物質量。
圖2是把第1實施方式的概略表示作為固定檢測物質的固相附近 的模擬圖。對送液裝置及測量裝置的全部圖像說明如下。在本實施方 式中，作為具有抗體固定在固相的流路的設備，示出使用珠陣列的例 子。珠陣列的概略部分放大圖如圖2(1)所示。作為用于形成流路的細 管，采用毛細管101。在毛細管101的內部，排列結合了捕捉檢測對象 的抗體的珠102與未結合抗體的珠103。本實施方式中的檢測對象，例 如為甲胎球蛋白105，例如，抗甲胎球蛋白抗體104被固定在珠102上。 毛細管的內徑例如是150微米，珠102， 103的直徑例如是100微米， 材質例如是聚苯乙烯。圖2(2)示出導入含甲胎球蛋白105的樣品溶液 109的模擬圖。這里的樣品溶液假定為50uL，溶液的體積流量每分 10y L。接著，如圖2(3)所示，示出甲胎球蛋白105在珠102上的抗甲 胎球蛋白抗體被捕捉的狀況。采用珠陣列，向狹窄的空間強制流入溶液, 借此產生湍流，結果是固液間的反應速度升高。由于該效果變得更高， 故邊流入樣品溶液109邊進行甲胎球蛋白的捕捉。如下面所示，送液例 如采用注射器泵，把樣品溶液往復送液使反應。關于送液裝置，只要能 送液的裝置任何一種均可以使用。其他的送液的裝置，也可以采用蠕動 泵等。反應時間，例如20分鐘。圖2(4)示出樣品溶液109用洗滌緩沖 液110洗滌的模擬圖。作為洗滌緩沖液IIO，例如，使用含鹽的磷酸緩 沖液(pH7. 4)，采用用30秒流過100"L的條件進行洗滌。除上述緩沖 液外，還可以采用碳酸緩沖液、MES(2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸)緩沖液、 三羥基氨基甲烷(下面稱作Tris)-乙二胺四醋酸(下面稱作EDTA)緩沖 液、Tris-EDTA-硼酸緩沖液、硼酸緩沖液等通常使用的緩沖液的任何 一種均可以采用。另外，所添加的鹽，可以采用氯化鈉、氯化鉀、氯化 銨、醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨等鹽。釆用這種洗涂，在珠102上未捕捉 的甲胎球蛋白105,從珠陣列設備中洗去。
圖2 (5)示出，例如，把含HRP (西洋辣根氧化酶)標記的抗甲胎球蛋 白抗體106的溶液lll，導入珠陣列的模擬圖。作為標記，采用HRP，但 在本發明中也可以釆用HRP以外的標記酶或酶以外的標記物。作為本 發明中使用的標記酶，例如，可以舉出過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡 糖氧化酶、p-D-半乳糖苷酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、蔗糖酶、腺苷三 磷酸(下面稱作ATP)酶、熒光素酶、水母發光蛋白等。
HRP標記的抗甲胎球蛋白抗體106的濃度假定為100ng/ml，溶液 111的體積達到50ii L，體積流量達到每分10n L。HRP標記的抗甲胎球 a抗甲胎球蛋白105反應，結果被捕捉在珠102上。圖2(6)示出，HRP 標記的抗曱胎球蛋白抗體溶液lll，用洗滌緩沖液112洗滌的模擬圖。 作為洗滌緩沖液112，例如，使用含鹽的磷酸緩沖液(pH7. 4)，以30秒鐘 流過100 uL的條件洗滌。通過該洗滌，珠102上未捕捉的剩余的HRP 標記的抗甲胎球蛋白抗體106，從珠陣列設備中洗去。
最后，圖2(7)示出，使含有用于發光反應的試劑107的溶液113流 至珠陣列，測量發光108的模擬圖。作為用于發光反應的試劑107，當 用酶標記時，含有與所用酶對應的底物。作為底物，例如，可以舉出魯米 諾、二氧雜環丁烷、過草酸酯、葡萄糖、p-D-半乳糖、葡萄糖-6-磷 酸、光澤精、抗壞血酸磷酸酯、腺苷三磷酸、熒光素或這些的衍生物、 鈣離子等。另外，用于發光反應的試劑，也可以采用過氧化氫、叔丁基 氫過氧化物等包含烷基氫過氧化物的過酸等氧化劑、碘氧苯等含有氧 的添加劑氧化劑。用于發光反應的試劑，還可以含有發光增敏劑。作為 發光增敏劑，例如，可以舉出4-硪苯酚、4-溴苯酚、4-氯苯酚、4-苯基 苯酚、苯酚吲哚、2-氯-4-苯基苯酚、4-(2'-噻吩基)苯酚、4-(2'-苯并 噻唑基)苯酚、4-[4'-(2'-甲基)噻唑基]苯酚、4-[2'-(4'-甲基)噻唑基〗 苯酚、4-(4'-噻唑基)苯酚、4-(2'-苯并噻唑基)苯酚、4-[4'-(2'-(3'-
吡啶基)噻唑]苯酚、吩噻嗪-N-丙基磺酸鹽、3-(10-吩噻。秦基)-n-丙基 -磺酸鹽、3-(10-吩噻溱基)-丙基磺酸鹽、對-羥基苯丙酸等苯酚衍生 物、6-羥基苯并噻唑、4-(4-羥基苯基)噻唑等噻唑衍生物，二乙基苯胺等。
例如，采用HRP標記酶時，用于發光反應的試劑，作為底物，可以采 用魯米諾或其衍生物，或光澤精/過氧化氫等氧化劑；作為發光增敏劑， 可以采用4-碘苯酚、4-[4'-(2'-甲基瘞唑基]苯酚、4-[2'-(4'-曱基) 噻唑基]苯酚、4-(4'-瘞唑基)苯酚、4-[4'-(2'-(3'-吡啶基))瘞唑]苯 酚、4-(2'-瘞吩基)苯酚、吩蓉。秦-N-丙基磺酸鹽、苯酚靛酚等，優選采 用4-[4'-(2'-甲基)蓬唑基]苯酚或4-[2'-(4'-甲基)噢唑基]苯酚。
在本發明中，還可以采用其他標記物、用于發光反應的試劑的組合 物。可以舉出，例如作為化學發光檢測體系，作為標記酶采用葡糖氧化 酶、作為用于發光反應的試劑，采用葡萄糖/雙-2，4， 6-三氯苯基草酸酯 (TCPO)等過草酸酯衍生物/8-苯胺基萘磺酸(ANS)等熒光色素、或葡萄 糖/異魯米諾/微過氧化物酶(m-POD)的體系；作為標記酶，采用堿性磷 酸酯酶(ALP)、作為用于發光反應的試劑，采用金剛烷基甲氧基磷酰基 苯基二氧雜環丁烷(AMPPD)等二氧雜環丁烷衍生物的體系；作為標記酶: 采用3-D-半乳糖酶，作為用于發光反應的試劑，采用鄰-硝基苯基
0-半乳糖/半乳糖脫氫酶〃人0+/^011、或葡萄糖/葡萄糖氧化酶 (GOD) /異魯米諾/m-POD、乳糖/ GOD/TCPO/ANS體系；作為標記酶，采用 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，作為用于發光反應的試劑，采用葡萄糖-6-磷酸 /MD (P) +/MD (P) H體系；作為標記酶，采用蔗糖酶，作為用于發光反應 的試劑，采用蔗糖/光澤精/OH-體系等。作為生物發光檢測體系，可以舉 出，作為標記酶，采用熒火蟲熒光素酶，作為用于發光反應的試劑，采用 ATP/熒光素/鎂離子的體系；作為標記酶，采用ALP，作為用于發光反應 的試劑，采用熒光素-0-磷酸酯/ATP體系；作為標記酶，釆用乙酸激酶， 作為用于發光反應的試劑，采用乙酰基磷酸酯/醇脫氫酶(ADP)/熒光素 /熒光素酶的體系；作為標記酶，采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，作為用于 發光反應的試劑，采用葡萄糖-6-磷酸/NAD/細菌熒光素酶/NADH-FMN-
氧化還原酶的體系；作為標記酶，采用丙酮酸激酶，作為用于發光反應 的試劑，釆用ADP/磷酸烯醇丙酮酸/熒火蟲熒光素/熒光素酶的體系 等。
含有用于發光反應的試劑107的溶液113的體積流量定為每分鐘 10uL，連續流動10分鐘以上。發光108，系HRP標記的抗甲胎球蛋白 抗體106上的HRP與用于發光反應的試劑107反應而產生的，故發光僅 在珠102附近發生。即，HRP，通過用于捕捉檢測對象的珠上固定的抗 體、該抗體上捕捉的檢測對象、在該檢測對象上捕捉的HRP標記的抗 甲胎球蛋白抗體106，結合在珠上，在作為標記的HRP附近引起發光， 結果，在一種珠102表面的附近發生。該發光108，用光測量器114測 量。關于光測量器114的詳細情況將在下面介紹。
圖3是第1實施方式的裝置概略圖。以圖2中說明的珠陣列121 作為中心，其兩側配管為毛細管125與毛細管122。珠陣列的一側，通 過毛細管122，與注射器123連接。通過注射器泵124動作，抽吸注射 器123的活塞，結果是可向珠陣列121內部送液。在珠陣列121的另一 端，配置毛細管125，其前端部通過閥126，與多個容器127連接。對該 多個容器127的每個，分別放入圖2的前段說明中介紹的樣品溶液、洗 滌緩沖液、HRP標記抗體溶液等，也可用作廢液貯槽。對各個容器127 的存取，通過操作閥126來進行。在珠陣列121中的發光，通過光學纖 維131進行測量。光學纖維131的一個端部，通過圖中省略記栽的XY 臺，與珠陣列121中的發光珠相鄰地設置。另外，光學纖維131的另一 個端部，通過PMT(光電倍增管)的連接器132，與PMT133連接。通過該 設定，用光學纖維131集光的珠陣列121的發光，導至PMT133進行測 量。來自PMT133的信號，通過導線134輸出至數據處理裝置的電腦 135。在該電腦135進行數據處理。
圖4(A)是第1實施方式的發光測量結果例，圖4(B)是此時的發光 試劑送液時間及送液量的概略圖。從時間Q開始測量，在這個時點，由 于還未傳送發光試劑溶液，故不測量發光。信號強度推移至背景水平， 達到一定值。在發光試劑導入開始時，含發光試劑的溶液以每分10nL
的體積流量送液，以后連續送液。因發光引起的信號強度，記錄一旦達 到高的峰后馬上降低。降低后的發光強度非常緩慢地衰減。該最初的 高的峰的峰寬度達到1秒左右或更低。該時間的特異峰的出現，是與發 光有關的特異現象。采用原來的方法時，發光試劑放入容器后，固定在 發光測量裝置中測量發光，該時間的特異峰未能觀察到。邊使用于發光 反應的試劑流動邊在引起發光的部位測量發光，借此，可以檢測該時間
的特異的峰。通過測量該時間的特異峰，可瞬時進行S/N的高速測量。 另外，作為該結果是，可用少的發光試劑量進行測量。另外，也可以高靈 敏度的測定。另外，邊使用于發光反應的試劑流動邊測量發光的方法中， 由于發光試劑處于經常供給的狀態，酶附近的發光試劑濃度不發生衰 減，故可以抑制發光強度的衰減，穩定地進行長時間測量。通過長時間 加合高的峰后的信號，也可以以高靈敏度進行穩定測量。例如，把從 PMT133的輸出，以取樣間隔1微秒取得，該數字數據用電腦135加合， 與進行1點取樣相比，可以得到SN比高的結果。當信號衰減少而可以 忽視時，可以認為與加合的點數的1/2相乘的結果成比例，SN比提高。 當檢測對象物質捕捉多、酶密度高時，通過流動供給發光試劑，可以抑 制發光試劑周邊濃度的降低，故可進行高精度測量。
該時間出現特異峰的現象，可解釋、理解如下。在發光試劑導入的 最初時間，由于此前的峰上的酶的周邊沒有的發光試劑一口氣擠壓酶 的周邊，故發光加大。此瞬間，酶的周邊發光試劑濃度，與導入的發光試 劑濃度相同，實質上最大。當一旦開始反應時，在珠表面附近的薄的液 膜區域，發光試劑被消化，發光試劑濃度降低。因此，一旦達到峰值時的 發光強度降低。此后，伴隨著流動所運送的發光試劑擴散到先前的薄液 膜的速度與表面的發光試劑被消化的速度達到平衡時，結果是可以觀 察到幾乎一定的發光強度。含發光試劑的溶液流動時，與溶液不流動的 停止場合相比，由于該薄的液膜的厚度小，擴散距離短，是有利的。當然， 由于通過邊流動邊逐漸供給發光試劑，故也可以防止通過發光試劑的 消化引起的發光試劑的體積濃度降低，即使長時間測定也有利。當然， 一旦在發光試劑流入后，也可以停止發光試劑溶液的送液，可以實現發
光的檢測。當在該場合導入發光試劑時，通過與發光測量同時進行，可 以實現有利的測量。
在本實施方式中釆用珠陣列，但又不限于采用珠陣列。捕捉了作為 檢測對象的生物化學物質的探針固定在固相上的流路，在具有該流路 的設備中，通過測量該探針的固定區域附近來進行發光檢測的體系，一 般可以采用。另外，在本實施方式中，可釆用抗體固定的珠，進行蛋白質 的夾層分析，但又不限于此。
固定的探針，一般是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸 (PNA)、另外，具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嗜啶、鳥噤呤、尿苷、肌苷 的人工核酸，或核酸衍生物，只要是這些或肽、糖肽、蛋白質、糖蛋白 質、多糖或化學合成聚合物等能補足互補分子的物質，就是優選的，但 又不限于這些。
采用核酸探針時，適于對核酸檢測，另外采用蛋白質作為探針時， 也可用于抗體檢查、抗原檢查等，例如，適于食品變應性檢查、變應性 特異IgE檢查、感染癥檢查、化學物質特定檢查、污染物質檢查等。 另外，糖-外源凝集素反應或、受體等也可用作探針。也可利用DNA-蛋 白質的相互作用進行探針的設計，另外，對酶-底物反應，例如對生物素 -抗生物素蛋白反應等也適應。
圖5示出第2實施方式的裝置概略。與圖3說明的裝置相比，變更 了珠陣列和光學纖維發生。圖5所示的珠陣列141，相當于圖2所示的 珠陣列121形成多個(在這里為4個)連接的形狀，各個珠部分，全部設 置在口徑大的光學纖維束142正下方。光學纖維束142的口徑，與作為 測量對象的珠配置的區域同等或比它大是優選的，至少在該構成中，該 光學纖維束142的口徑是，與對應于l個珠陣列中的測定項目的珠外 徑、即探針被固定化的檢測對象珠外徑(多數情況下，多個珠外徑加合 的總長度)同等或比它大。因此，可以準確檢測作為測量對象的珠。連 接部分122a、 b、 c的內體積，假定分別為約lOuL。相當于珠陣列121 的各自珠陣列121a、 b、 c、 d中，分別含有固定了各自不同的抗體，例 如抗甲胎球蛋白抗體、抗CA19-9抗體、抗CEA抗體、抗PSA抗體的珠。 光學纖維束142通過光學纖維束與PMT連接的連接器143，與PMT133 連接。其他與圖2的裝置設定同樣。
圖6(A)是第2實施方式的發光測量結果例的模擬圖，圖6(B)是此 時的發光試劑送液時間及送液量的概略圖。與第1實施方式同樣的反 應同樣進行，在本實施方式中，樣品溶液中例如含甲胎球蛋白、CA19-9、 CEA、 PSA，目的在于檢測它們。HRP標記抗體溶液，釆用含有對4種物 質的HRP標記抗體的溶液。從時間0開始測量，在該時點，由于未傳送 發光試劑，故不測量發光。信號強度推移到如背景水平原樣的一定值。 在發光試劑導入開始時，含發光試劑的溶液以每分lOuL的體積流量 送液，以后連續送液。與第1實施方式同樣，發光產生的信號強度，記錄 一時的高峰。然后，在約l分鐘間隔觀察合計4個峰。這些峰認為分別 為固定抗甲胎球蛋白抗體、抗C-19抗體、抗CEA抗體、抗PSA抗體的 珠附近的發光。由于相當于珠陣列121的珠陣列間配管的內體積為約 10 u L，故可以從含發光試劑的溶液的流速，預測該溶液到達各個珠陣 列的時間，這里的到達時間每個各珠陣列分別錯開約1分鐘，可這樣進 行解釋。因此，采用一臺光檢測器邊送發光試劑邊進行測量，設定不使 該光檢測器移動的裝置，可有效簡便價廉地實現多個項目檢測。
圖7示出第3實施方式的裝置簡圖。采用光學體系掃描進行多項 目檢測的體系來進行。多個項目探針固定珠與探針非固定珠交叉并排 的珠陣列151，與第1實施方式同樣的送液體系連接。珠陣列151的一 側，與通過毛細管122設置在注射器泵124上的注射器123連接。在珠 陣列151的另一端，配置毛細管125，其前端部通過閥126與容器127 連接。各個容器127的存取，通過操作閥126來進行。從珠陣列151 中的多個珠的發光，通過光學體系156掃描分別測量。光學體系156 對珠陣列151作相對移動。物鏡152，例如使用焦點距離9mm、開口數 0. 46的物鏡，成像鏡153例如采用焦點距離180mm的成像鏡。此時的 倍率與焦點距離之比達到20倍。狹縫154設置在通過物鏡152與成像 鏡153設定的光學體系的成像面上。以珠陣列151中的IOO微米珠為 例，在其假像面上形成直徑2mm圖像。狹縫154切取珠圖像，對珠陣列
151的長度方向實質上垂直的方向，具有長度方向的長方形狀。下面的 所謂狹縫的寬度，不是狹縫的實際尺寸，而用乘以倍率的反比例的值表 示。例如，當狹縫寬20微米時，是本來的100>徵米的珠圖像在橫向達到 分割成1/5的狹縫寬度。PMT155設置在狹縫154的緊后面，通過狹縫 154的光被全部接收。在這里，示出受光面使用8mm直徑的PMT的例子。 PMT155通過導線157與作為數據處理裝置的電腦158連接。采用通過 該設定的光學體系156集光的珠陣列151的發光，導入PMT155，用電 腦158輸出信號。
圖8示出第3實施方式中的光學體系掃描與得到的數據的關系的 概略圖。圖8(A)是像面中假想的珠陣列與狹縫的關系概念圖。示出對 珠直徑IOO微米，設定狹縫寬度10微米的例子。長方形狹縫，相當于從 珠圖像切取的部分(圖中白的部分)的發光，通過PMT測量。圖8(B)概 念地示出掃描經過時間對應于珠配置位置的關系，示出其位置與發光 強度的對應圖。含狹縫的光學體系，在珠陣列的長度方向通過掃描，從 珠陣列的珠的發光通過狹縫，作為具有位置分辨能力的波形被測量。如 狹縫寬大，則通過的光量增多，故可以得到高的信號強度，但由于從各 個珠的發光彼此重疊，故難以正確測量。另外，當掃描速度過大時，對 PMT測定帶區域產生影響，波形變鈍。具體地說，與每個珠的掃描時間 相比，當PMT測定帶區域的倒數(可用秒的單位表示)相同或長時，從某 個特定珠的發光，即使用PMT接收光，其信號在與掃描珠時相等或以上 的時間擴展，故珠彼此難以區別。因在，掃描速度優選設定在使測定帶 區域的倒數比每個珠的掃描時間充分小的區域。
圖9是模擬表示第3實施方式中的狹縫寬度與信號波形關系的模 式圖。作為掃描時間，例如，每個珠達到5秒。第3實施方式中表示的 裝置測定帶區域，當為約2. 5Hz時，因帶區域對波形變鈍影響小的例 子。用于發光反應的試劑，邊流入珠陣列中，邊同時用光學體系進行掃 描進行該珠陣列的測量。圖9(A)示出50um的狹縫寬度(珠直徑的50% 左右)。此時，由于狹縫寬度大到某一程度，故可得到大的信號。反之， 當狹縫處于珠一端進行掃描時，由于還可以拾取相鄰的珠的發光，故從
各個珠的發光具有難以正確區分的傾向。圖9(B)示出10um的狹縫寬 度(珠直徑的10%左右)。可區分從各個珠的發光，但由于狹縫寬度變小， 則有信號強度變小，靈敏度降低的傾向。圖9(C)示出大到80y m的狹 縫寬度(珠直徑的80%左右)，并且，在多個珠的排列中，作為發光檢測 對象的珠一個一個地配置的情況。由以上可知，測量中未使用的至少1 個珠進入測量的珠之間，被檢測的珠間距離增加，可以明確進行珠間分 離。另外，加上這樣的珠的配置，進一步加大狹縫寬度，也可以增加信號 強度。即，作為結果，可有效實現高靈敏度高分辨能力的測量。
圖10示出第4實施方式的裝置概略圖。與第1到第3實施方式不 同，由于是使用CCD照相機的光學體系，故一次可對多個珠陣列進行測 量。在這里，可以對多個項目采用探針固定的珠與、探針未固定的珠或 遮光性珠交叉并排的珠陣列。珠陣列成束的珠陣列群201為中心，在其 兩側連接送液體系202、溶液保持部(未圖示)及連接切換部203。所謂 送液體系，意指向各個珠陣列具有送液功能的部分，如圖3所示，可以 采用注射器對每個珠陣列進行連接的體系或釆用泵的體系。溶液保持 部及連接切換部203，對容納反應溶液或洗滌液等的容器部分與具有 向此溶液的切換功能的部分，如圖3所示，并排配置容器，分別與閥門 連接的體系等也可以采用。送液體系202、溶液保持部及連接切換部 203都具有使含用于發光反應的試劑的溶液分別流入珠陣列群201中 的功能。該珠陣列群201通過照相機鏡頭204用CCD照相機205進行 測量。照相機鏡頭204，例如，使用F值0.95、焦點距離50mm的鏡頭， 圖像倍率設定在相同倍數。珠陣列中的100微米珠在CCD照相機205 的受光面上以100微米大小投影。CCD照相機205通過線路206與作 為數據處理裝置的電腦207連接，在CCD照相機205中得到的圖像，用 該電腦207顯示被處理的數據。這里使用的CCD照相機，什么樣的照相 才幾都可以采用。
圖11是笫4實施方式中的珠發光的串擾的例子圖。圖ll(A)是圖 像一部分的放大模擬圖，圖ll(B)是表示每個珠觀察到的發光強度的 規格化曲線圖。測定時間假定5分鐘。圖ll(A)反映的是IOO微米聚 苯乙烯(PS)珠的例子。在發光的珠211 (No, 3)的兩側，配置預測不發光 的珠212 (No. 1， 2， 4， 5)。在毛細管213中，含有珠211與212，在其空間 流入含發光試劑的水溶液214。含發光試劑的水溶液214，在該圖11 (A) 中，從左側送液。發光的珠211的發光強度作為100為標準，與光強度 比較的結果如圖ll(B)所示。從該曲線可知，即使是估計未發光的珠， 也測量到發光約3%左右的強度。這對于正確的測定是不希望的。特別 是對于發光強度預測有很大不同的多項目檢測，采用該排列的珠進行 時，只發光小的項目也產生大的誤差。作為從預測不發光的珠測量光的 重要原因，影響最大的是從發光珠211的發光，照射預想不發光的珠 212，通過散射及折射的情況進行測量的串擾現象。
圖12是關于第4實施方式中的珠的發光串擾，把遮光性珠夾在中 間時的例子圖。圖12(A)示出其結構。把遮光性珠221插在發光珠211 與不發光珠212之間。在這里，作為遮光性珠221，是遮光性物質混合 的粒子，例如可以利用100微米的Mn02粒子混合在聚苯乙烯中而制成 的珠。另外，也可以采用把黑、藍、紅等著色粒子或著色膠乳、金屬粒 子、顯示遮光性的物質加以混合，或用其他材質的物質包含的粒子等顯 示遮光性的物質的任何材質的物質。最優選的是光的透過性顯著低的 黑色粒子，對材質不限。即，如用聚苯乙烯包含黑色粒子，則可以提供既 保持遮光性又具有用于最佳固定化的表面。圖12(B)是圖像的放大模 擬圖，圖12(C)表示對每個珠觀察到的發光強度加以標準化的圖。測定 時間假定為5分鐘。通過夾住該遮光性珠221，則No. 1位置的珠發光 強度從2. 8%大幅降至0. 9%,而No. 5位置的珠發光強度從3. 2%大幅降 至1. 2%。遮光性珠221，遮住發光珠211的發光，具有使串擾量降低的 效果。
本實施方式中使用的采用魯米諾類發光，發光波長約420nm，作為 遮光性珠的材料特性，只要能遮住該波長的材料就沒有問題。人們考慮 采用混合了鐵素體的塑料珠、混合黑色顏料的塑料珠或蒸鍍金的珠等。 另外，在這里，對僅夾住1個IOO微米珠的體系進行了考察，但又不限于 此，例如，30微米或其以下的遮光性珠也采取幾個，即使在這樣體系內
也可期待同樣的效果。
圖13是關于第4實施方式中珠發光的串擾，模擬表示溶液折射率 調整時的效果圖。圖13(A)是未進行折射率調整時的模擬圖。從發光 珠211的發光，可以舉出直接向著光學體系的方向的光線231與向著相 鄰珠的光線232。例如，含有用于發光反應的試劑的水溶液214的折射 率在1. 33附近，如以珠的材質聚苯乙烯為例，其折射率為1. 58。因此， 向著相鄰珠的光線232，在珠212的表面受散射或折射的影響，因此，作 為向著光學體系方向的結果是，可以觀察到作為向不發光的珠212的 串擾。圖13(B)是理想的進行折射率調整時的模擬圖。溶液233的折 射率，當調整至與聚苯乙烯相同的折射率時，向著相鄰珠的光線232在 珠212表面不受散射或折射的影響。因此，通過散射或折射產生的串擾 可抑制到0。即，溶液形成與珠的折射率相近似的折射率，可使串擾減 少。采用不利用酶的化學激發的化學發光時，由于有機溶劑的選擇寬度 大，折射率的調整更筒便。另外，上述聚苯乙烯的折射率為1.58，而將 珠的材質制成具有的折射率低的物質時，例如，折射率為1.47的玻璃 時，可在低范圍內調整溶液的折射率，更容易防止串擾。
圖14是關于第4實施方式中珠發光的串擾，對于溶液折射率釆用
丙三醇調整時的效果，從反射率的觀點進行驗證的圖。使水溶液折射率 發生較大變化，并且對酶反應影響小的物質有丙三醇。丙三醇水溶液的 折射率，隨著其相對重量濃度(重量％)的增加，從1. 33增大到1. 47。串 擾以垂直方向的光反射率為代表進行評價，把丙三醇的濃度為0%時的 反射率和100%時的反射率以反射率比表示分別計算、制成曲線。當珠 為聚苯乙烯(PS)時，水溶液中的反射率為0.74%。當丙三醇濃度提高時 由于折射率差變小，反射率也減少。例如，當丙三醇達到50%時，反射率 比下降至50%,得到充分的效果。此時的折射率差為0.18。當丙三醇濃 度大于80%時，由于粘度大幅上升，有可能對實際送液產生不良情況。 即，當珠為聚苯乙烯時，丙三醇濃度為50%以上80%以下的范圍是所希 望的。當珠為玻璃時，對水溶液的反射率為0. 25%，是聚苯乙烯的1/3， 另外，當丙三醇濃度僅僅達到30%時，反射率比為49%，達到一半以下。
即，當珠為玻璃時，丙三醇濃度為30%以上80%以下的范圍是所希望的。 如珠陣列中考慮采用一般的珠方案時，一般根據上述條件，丙三醇濃度 為30%以上80%以下的范圍是所希望的。在此示出丙三醇的情況，但只 要采用能使折射率變化的溶劑即可，但又不限于此。
珠的折射率為nb、溶液的折射率為ns時的反射率，當用界面的垂 直方向反射率k表示時，則存在k-(nb-ns)7(nb+ns)2的關系。丙三醇 溶液時的丙三醇的范圍，如上所述，30%以上80%以下的范圍是所希望 的。當為其他溶液時，珠的折射率與溶液的折射率小者是優選的，從以 后的考察認為，如實際達到0. 2左右時有充分的效果。上述反應率公式 以溶液的折射率ns作為解，則為ns-nb*[(l+k)/(l-k) + {(l+k)7 (l-k)2-l}]。珠的材質為聚苯乙烯時，nb-l. 58，玻璃時為1.47。作為 發光試劑，不進行任何折射率調整時的反射率為kQ時，如反射率達到 一半，則有充分的效果，作為k，考慮用0.5X kO代替也可。此時的溶 液折射率ns，珠分別為聚苯乙烯及玻璃時計算達到1. 40及1. 37。珠折 射率之差達到0. 18及0. 10。 一般的樹脂折射率比玻璃的折射率高，當 考慮采用聚苯乙烯以外的樹脂珠時，如折射率差為0. 2左右或以下，則 具有充分的效果。
圖15是第4實施方式中的珠發光的串擾，含有用于發光反應的試 劑的溶液的含丙三醇濃度調整達到70%時的例子圖。此時的溶液233 的折射率為1.43。其他的構成如圖11相同，珠采用折射率1.58的聚 苯乙烯。圖15(A)為圖像放大的模擬圖，圖15(B)為對每個珠觀察到的 發光強度加以標準化表示的圖。測定時間為5分鐘。把用于發光反應 的試劑的溶液調整至丙三醇濃度70%，借此，未發光的珠212的發光強 度，從對發光有貢獻的珠211的發光量的0. 7%抑制到1. 0%。其與未調 整折射率時相比，達到約1/4的值，大幅降低。通過使溶液的折射率達 到接近珠的折射率，具有使預測不發光的珠212的串擾降低的效果。
在本實施方式中，采用珠陣列，但對采用珠陣列的場合未作限定。 在具有捕捉了作為檢測對象的生物化學物質的探針固定在固相的流路 的設備中，發光檢測在處于該探針的附近進行測量的體系中，由于 一般
引起串擾問題，故本實施方式有效。
圖16表示第4實施方式中利用偏振片降低串擾的裝置概略。除圖 10所示的裝置結構外，是在珠陣列群201與CCD照相機205之間設置 偏振片241的裝置。從珠陣列201的發光，由于發光底物向著無規方向 發光，故考慮不用偏光，關于通過相鄰的珠反射的串擾，由于s波及p 波的反射率不同，考慮用偏光。因此，通過安裝偏振片241，降低影響串 擾的成分。該法與釆用圖12至圖15中描述的遮光性粒子的體系或進 行溶液折射率的調整體系相比，結構非常簡單而且價廉，對于進行串擾 的降低是有利的。
實施例 實施例1
實驗中使用的裝置概略圖示于圖17。另外，反應按圖1的流程圖 進行。
把93|am的聚苯乙烯珠(JSR (林)制造，聚苯乙烯制造的標準粒子 DYNOSPHERES,型號SS-922P)懸浮液10滴(約lmL)，放入1. 5mL的工'7 《7卜'A7管中，用臺式小型離心機U 'J術7社千e夕》、製造卜；、一 精工)，分離珠與上清液，用移液管除去上清液后，添加用碳酸緩沖液 (Na跳3. 0g、 Na2C031.5g、水1L、 pH9. 6)調整過的10ug/mL抗IgE 抗體(Bethyl社制造，Goat Anti-H讓n IgE-affinity Purified型號 A80-108A) lmL，放置一夜，進行固定。然后，除去上清液，添加碳酸緩沖 液進行攪拌，再用臺式離心機分離上清液與珠，除去上清液。該洗滌操 作進行3、 4次。用y口少夕工一義TM(銷售商大日本制藥(林)，制造商 雪印乳業(抹))，進行l小時封閉。
另外地制作用7'口少夕工一義TM僅進行封閉處理的、未固定有抗 IgE抗體的珠(下面，稱作空白珠)。
外徑375 um、內徑150nm的熔融(7工一;C卜')硅石毛細管(GL 廿>f工》久社制造)切成1 Ocm，中心部分用燃燒法使表面的聚酰亞胺剝 離，設置觀察窗，在其部分上依次并列空白珠10個、抗IgE抗體固定的珠1個、空白珠10個。兩端用直徑50y m的SUS304不銹鋼線((林) 二 5 ]制造，型號751107)加以固定。采用該設備，采用圖17的裝置進 行反應、檢測。各毛細管的連接采用內連接器(GL廿4工》只社制造， 適用內徑250 ~ 530 um)進行。
開始，采用50u L的:/口少夕工一 只TM，以流速100y L/min進行往 返送液(10次往返)，使反應IO分鐘(流路封閉)。
其次，用磷酸緩沖液(和光純藥工業(林)制造，磷酸緩沖液生理食 鹽粉末(1L中NaH2P04 0. 35g、 Na2HP04 1. 28g、 NaCl 8g) 、 pH7. 4，下面 簡稱PBS)稀釋的lng/mL IgE (Bethyl社制造，Human IgE Calibrator, 型號RC80-108) 50 p L，以流速100 u L/min進4亍往返送液(20次往返)， 4吏反應20分鐘。
把PBS以流速100u L/min，在一方向擠壓流動，洗滌4分鐘。用PBS 稀釋的1000ng/mL HRP標記抗IgE抗體(Bethyl社制造，Goat Anti-H觀n IgE -證Conjugate) 50 p L，以流速10014 L/min進行往 返送液(20次往返)，使反應20分鐘。PBS以流速lOOu L/min向一方向 擠壓流動，洗滌4分鐘。
在圖18中，作為HRP的發光底物，采用SuperSignal WestFemto (PIERCE社制造)顯示發光的測量結果。作為用于發光反應 的試劑，當添加上述發光底物時(320秒附近)，可得到來自發光的峰。 積算100秒時，其值為5.5，同樣的實驗，當為Ong/mL IgE時(無IgE) 的值為2. 3。
實施例2
實驗中使用的裝置概略圖示于圖17。另外，反應按圖1的流程圖 進行。
把"urn的聚苯乙烯珠(JSR(林)制造，聚苯乙烯制造的標準粒子 DYNOSPHERES，型號SS-922P)懸浮液10滴(約lmL)，放入1. 5mL的工少 《7卜V^:7管中，用臺式小型離心機U卩求7社f匕'夕y、製造卜；、一 精工)，分離珠與上清液，用移液管除去上清液后，添加把雪松花粉提取
物用PBS調整至50 u g/mL的溶液lmL,放置一夜，進行雪松花粉提取物 抗原固定。然后，除去上清液，添加碳酸緩沖液進行攪拌，再用臺式離心 機分離上清液，除去上清液。該操作進行3， 4次。添加7'口^夕工一 ^TM(銷售商大日本制藥(林)，制造商雪印乳業(林))lmL，進行l小時 封閉。
用y口少夕工一》TM只進行封閉處理的、未固定雪松花粉提取物 抗原的珠(下面，稱作空白珠)，另外進行制造。
設備上采用在3. 0cmX4. OcmXO. 15cm尺寸的聚甲基丙烯酸甲酯 上加工成內徑110 ii QiX 110 u m溝的芯片。芯片的開放部分用同樣材質 的厚度50um的膜進行層壓堵塞。在芯片上依次并列空白珠IO個、雪 松抗原固定的珠l個、空白珠10個。芯片兩端為防止珠流出，設置壩 結構，對側形成錐狀結構，插入外徑375 u m、內徑50y m的熔融硅石毛 細管(GL廿4工7只社制造)，防止珠流出。各毛細管的連接釆用內連 接器(GL廿4工》只社制造，適用內徑250 ~ 530 um)進行。
開始，采用50u L的f口 '7夕工一 義 ，以流速lOOu L/min進行往 返送液(10次往返)，使反應10分鐘(流路封閉)。
用PBS調整的100ng/mL小鼠單克隆抗Cryjl抗體((林)林原生物 化學研究所制造 ，AB -Cedar Pollen Allergen Cryjl， (026) (mo) (M) ， Af fin) 50 u L,以流速lOOu L/min進行往返送液 (20次)，使反應20分鐘。PBS以流速lOOy L/min向一方向擠壓流動， 洗滌4分鐘。用PBS調整的lOOOng/mL HRP標記抗小鼠IgG抗體(Dako 制造，Anti-Mouse Immunoglobul ins/HRP型號P0447) 50 u L，以流速 100uL/min進行往返送液，使反應20分鐘。PBS以流速lOOuL/min 向一方向擠壓流動，洗滌4分鐘。
在圖19中，作為用于發光反應的試劑，采用SuperSignal WestFemto (PIERCE社制造)，當送液開始時，在(500秒附近)，可得到 峰。積算100秒時，其值為16.2。
實施例3
實驗中使用的裝置概略圖示于圖20。對于250 um的PS珠 (Polysciecnce制造，粒徑范圍250 ~ 300 u m)，用經過PBS調整的 lOug/mL的HRP標記抗Aldolase抗體(ROCKLAND社制造，Anti-Aldolase， Rabbit Muscle, Goat-Poly, HRP型號200-1341)，在終夜冷 藏庫內進行固定。
對于上述珠用黑色珠(DukeScience制造，粒徑50 u m，型號BK050T) 每幾個夾住兩側，再在兩側，把未作任何固定的250 um PS珠在外徑 450 pm、內徑320 um的熔融珪石毛細管(GL廿4工》只社制造)中并 排排列。
兩端用直徑50um的SUS304不銹鋼線((抹)二 5 ]制造，型號 751107)加以固定。
用于發光反應的試劑，釆用HRP發光底物SuperSignal WestFemto (PIERCE社制造)，把發光底物安裝在注射器泵中，向珠陣列 送液。開始送液，積算5分鐘的結果是，取得珠陣列設備上的線路圖， 對像點顯示強度的曲線示于圖21。
把空白珠用HRP標記抗Aldolase抗體固定化珠夾住的狀態，作為 比較。
結果是，在檢測對象的珠用遮光珠夾住時，可以防止向相鄰的珠泄 漏光。
權利要求
1.生物化學物質的分析方法，其特征在于，該方法具有向收納至少一部分上結合了探針的固相的流路，供給含有已被標記的檢測對象物質或未被標記的檢測對象物質的液體的工序；把上述已被標記的檢測對象物質捕捉在上述探針上的工序或把未被標記的檢測對象物質捕捉在探針上并加以標記的工序；通過液流向上述流路供給用于發光反應的試劑的工序；以及對上述用于發光反應的試劑與上述標記反應的部位附近進行光學檢測的工序。
2. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，在把上述已被標記的 檢測對象物質捕捉在上述探針上的工序或把未被標記的檢測對象物質 捕捉在上述探針上并加以標記的工序中，通過往返送液，供給含已被標 記的檢測對象物質或未^皮標記的檢測對象物質的液體。
3. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，上述標記為酶，上述 用于發光反應的試劑含有與所用的酶對應的底物。
4. 權利要求3中記載的分析方法，其特征在于，上述酶為過氧化物 酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、p-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶、蔗糖酶、腺苷三磷酸酶(以下稱為ATP)、熒光素酶或水母發光 蛋白，上述底物為魯米諾、二氧雜環丁烷、過草酸酯、葡萄糖、P-D-半 乳糖、葡萄糖-6-磷酸、光澤精、抗壞血酸磷酸酯、腺苷三磷酸、熒光 素或它們的衍生物、或鈣離子。
5. 權利要求4中記載的分析方法，其特征在于，用于上述發光反應的 試劑還含有氧化劑或氧添加劑。
6. 權利要求3中記載的分析方法，其特征在于，上述酶為過氧化物酶， 上述底物為魯米諾或魯米諾衍生物，用于上述發光反應的試劑還含有氧 ^匕劑或氧添加劑。
7. 權利要求6中記載的分析方法，其特征在于，上述氧化劑為含過 氧化氫或烷基過氧化氫的過酸。
8. 權利要求3中記載的分析方法，其特征在于，用于上述發光反應的 試劑還含有發光增敏劑。
9. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，上述固相為粒子，上 述附近為上述粒子附近。
10. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，上述檢測工序與通 過液流供給用于上述發光反應的試劑的工序同時進行。
11. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，上述固相為多個粒 子，上述多個粒子包含遮光性粒子與固定上述探針的檢測對象粒子，在 上述檢測對象粒子與其他上述檢測對象粒子之間配置至少1個上述遮光 性粒子。
12. 權利要求9中記載的分析方法，其特征在于，供給上述流路的含 有用于上述發光反應的試劑的溶液的折光率與上述粒子的折光率之差 在0. 2左右以下。
13. 權利要求9中記載的分析方法，其特征在于，供給上述流路的含 有用于上述發光反應的試劑的溶液含有甘油。
14.權利要求9中記載的分析方法，其特征在于，供給上述流路的含 有用于上述發光反應的試劑的溶液所含甘油的濃度在30°/。以上80%以下 的范圍。
15. 權利要求1中記栽的分析方法，其特征在于，在上述檢測工序中 通過偏振片進行光學檢測。
16. 權利要求1中記載的分析方法，其特征在于，在上述檢測工序中， 使包含狹縫的光學系統與上述固相在上述流路的長度方向作相對移動， 進行光學檢測。
17. 分析試劑盒，其特征在于，具有細管；固定探針并且收納在上述 細管中的第l粒子；含有遮光性物質并且收納在上述細管中的第2粒子； 和用于發光反應的試劑。
18. 權利要求l7中記載的分析試劑盒，其特征在于，上述第2粒子 對通過上述發光反應產生的發光的波長具有遮光性。
19. 權利要求17中記載的分析試劑盒，其特征在于，用于上述發光反 應的試劑包含魯米諾、二氧雜環丁烷、過草酸酯、葡萄糖、p-D-半乳 糖、葡萄糖-6-磷酸、光澤精、抗壞血酸磷酸酯、腺苷三磷酸(ATP)、 熒光素或它們的衍生物、或釣離子。
20. 權利要求19中記載的分析試劑盒，其特征在于，用于上述發光 反應的試劑還含有氧化劑或氧添加劑。
21. 權利要求17中記載的分析試劑盒，其特征在于，用于上述發光反 應的試劑含有魯米諾或其衍生物，以及氧化劑或氧添加劑。
22. 權利要求21中記載的分析試劑盒，其特征在于，上述氧化劑為 含有過氧化氫或烷基過氧化氫的過酸。
23. 權利要求17中記載的分析試劑盒，其特征在于，用于上述發光反 應的試劑還含有發光增敏劑。
24. 分析裝置，其特征在于，該裝置具有用于向收納至少一部分上固定了探針的固相的細管導入和/或導出 液體的送液部；用于收納試樣的第l容器； 用于收納用于發光反應的試劑的第2容器；和 用于對上述固相的任意部位進行光學檢測的檢測部， 上述第1容器和上述第2容器與上述送液部連結。
25. 權利要求24中記載的分析裝置，其特征在于，上述固相為粒子， 上述檢測部是一個端部設置在測定對象的上述粒子附近的光纖維。
26.權利要求24中記載的分析裝置，其特征在于，上述送液部具有使 多根上述細管分別連結的連接部。
27.權利要求24中記載的分析裝置，其特征在于，上述檢測部相對上 述細管作相對移動。
28. 權利要求24中記載的分析裝置，其特征在于，上述固相為多個 粒子，上述多個粒子包含固定了上述探針的多個第1粒子和在上述多個 第l粒子的各個間配置的并且未固定上述探4i"的多個第2粒子。
29. 權利要求24中記載的分析裝置，其特征在于，在上述細管與上述 檢測部之間的位置上具有偏振片。
全文摘要
在使用微流路把對象物質捕捉在固相上的分子檢測設備中，實現以高靈敏度通過定量發光的分析方法。在具有結合在固相上的探針的流路狀設備中，捕捉作為檢測對象的生物化學物質，作成用于發光的標記后，使發光試劑流入，光學檢測探針附近的發光。
文檔編號G01N21/76GK101180530SQ20068001751
公開日2008年5月14日 申請日期2006年2月10日 優先權日2005年5月20日
發明者小原賢信, 小林照幸, 野田英之, 須藤邦宏 申請人:日立化成工業株式會社
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