国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

專利名稱：快速檢測(cè)微囊藻毒素的方法和試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水樣檢測(cè)方法和試劑，具體為一種快速檢測(cè)微囊藻毒素的方法和試紙。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)化、城市化的發(fā)展以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大量使用化肥，大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)注入水體，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重，導(dǎo)致藻類迅猛生長(zhǎng)，藍(lán)藻的過度繁殖，會(huì)造成水味腥臭、透明度下降、消耗水體溶解氧，其中的微囊藻屬、顫藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬等藻類自身及其代謝產(chǎn)物有毒性和致癌作用，危害人體健康。調(diào)查顯示，我國(guó)淡水湖泊中發(fā)生的水華80%是有毒的，在有毒藍(lán)藻水華產(chǎn)生的毒素中，微囊藻毒素(Microcystin，MC)是分布最廣、毒性最大的種類之一。微囊藻毒素(Microcystins)是一種環(huán)肽肝毒素，目前已發(fā)現(xiàn)MCs達(dá)70多種同分異構(gòu)體，其中最為常見并且已經(jīng)商業(yè)化提取的是MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF, MC-LW，L、R、 Y、F、W分別代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。微囊藻毒素能夠抑制絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶I(PPl)和2A(PP2A)的活性，在低濃度時(shí)對(duì)肝臟就有專有肝毒性和癌誘發(fā)活性，MCs的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝壞死，肝功能喪失和肝出血，對(duì)小鼠的腹腔注射的 LD50為40 8001a g/kg，MC-LR是目前研究的最詳細(xì)且毒性最大。為了降低MCs對(duì)人和水生動(dòng)物的毒性及潛在危害性，世界衛(wèi)生組織推薦水中微囊藻毒素的安全指導(dǎo)值MC-LR是 1000ng/L。有關(guān)MCs的安全標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)所建議的安全濃度略有不同，1998年，世界衛(wèi)生組織 (WHO)出版的《用水衛(wèi)生基準(zhǔn)》中建議飲用水中MCs標(biāo)準(zhǔn)為1. 0 μ g/L，暫定的MC臨時(shí)可耐受的每日攝取量為0. 04 μ g/kg. dBff ；英、美等國(guó)限定天然水體及飲用水中的MCs為1. 0 μ g/L， 加拿大健康組織認(rèn)為飲用水中可接受的MCs標(biāo)準(zhǔn)為0. 5 μ g/L。我國(guó)長(zhǎng)期以來都未規(guī)定MCs 限量標(biāo)準(zhǔn)，直到2006年，在新頒布的《用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)才在毒理增加了微囊藻毒素-LR，同時(shí)頒布了《微囊藻毒素檢測(cè)方法》(GB/T20466-2006)，規(guī)定其限值0. OOlmg/ Lmg/L。但魚類等水產(chǎn)品中MC的限量還沒有制定標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步的研究。由于淡水是人類及動(dòng)物的飲水源，淡水水華導(dǎo)致的微囊藻毒素嚴(yán)重危害人類的生命健康，MC也是我國(guó)三大肝癌的病因之一，因此MC已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者、民眾的重視。目前， 檢測(cè)MC的方法主要是生物法(小鼠法)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫檢測(cè)技術(shù)。小鼠法簡(jiǎn)便易行，但缺點(diǎn)是不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu)，受干擾較大，數(shù)據(jù)不精確；HPLC法可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類，檢測(cè)限可低至ng/g，但樣品前處理過程復(fù)雜，且儀器昂貴，需要專門的分析技術(shù)人員；免疫層析法是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，由于它的快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，具有高度特異性和高敏感性，結(jié)果直觀可靠，而且試劑和樣品用量極少，無需貴重儀器設(shè)備，簡(jiǎn)化了煩瑣的常規(guī)操作過程，同時(shí)也減小了因操作引起的誤差，因此已成為一種目前發(fā)展最快的復(fù)合型免疫技術(shù)，受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。為促進(jìn)微囊藻及其毒素研究，需要建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的、系統(tǒng)的檢測(cè)方法。目前對(duì)MC的檢測(cè)有很多方法，如高效液相色譜(HPLC)、薄層層析法(TLC)、質(zhì)譜(MQ、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以及蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)等。此外還有免疫膠體金快速診斷技術(shù)是建立在酶聯(lián)免疫吸附的基礎(chǔ)上、以膠體金為作為示蹤標(biāo)志物標(biāo)記物，通過直接觀察就可以判定結(jié)果的新技術(shù)。該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、激素檢測(cè)食品安全檢測(cè)、藥物殘留和毒品快速檢測(cè)，以及抗原抗體等諸多診斷領(lǐng)域迅速發(fā)展，是四大免疫標(biāo)記技術(shù)之一。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)關(guān)于微囊藻毒素檢測(cè)主要的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，我國(guó)已有出售美國(guó)生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)MC-LR的試劑盒，國(guó)內(nèi)也有幾家研制ELISA檢測(cè)試劑盒，但質(zhì)量不太高。而關(guān)于MC-LR的膠體金檢測(cè)試紙條技術(shù)尚少報(bào)道，我國(guó)市場(chǎng)也未見有銷售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種用于快速檢測(cè)微囊藻毒素的方法。本發(fā)明還提供了快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙。本發(fā)明建立了微囊藻毒素MC-LR的快速膠體金免疫層析檢測(cè)方法。首先制備了平均粒徑30nm左右的膠體金，用以標(biāo)記抗微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體；將微囊藻毒素 MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶，羊抗鼠二抗作為控制帶，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理，建立快速檢測(cè)微囊藻毒素MC-LR的免疫層析試紙條方法。該方法靈敏度可達(dá)到3ng/mL，只需3 5min即可目測(cè)判斷結(jié)果，具有快速、直觀、操作簡(jiǎn)單、便于使用等特點(diǎn)，可以作為現(xiàn)場(chǎng)大量篩查淡水及淡水產(chǎn)品是否感染微囊藻毒素MC-LR的有效手段。技術(shù)方案為，一種用于快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，依次包括點(diǎn)樣孔、檢測(cè)帶(T 線)和控制帶(C線)；點(diǎn)樣孔上噴涂膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物，檢測(cè)帶為微囊藻毒素MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物，控制帶上噴涂羊抗鼠二抗。試紙的基材為硝酸纖維素膜或定性濾紙。膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物的制備方法為(1)將膠體金與鼠抗MC-LR單克隆抗體溶液混合攪拌0. 5 池！·，加入小牛血清BSA繼續(xù)攪拌20 45min， 其中膠體金與鼠抗MC-LR單克隆抗體和BSA的用量比Iml 5 40 μ g 8 12mg，優(yōu)選為Iml 20 μ g IOmg ；所述的膠體金粒徑在28 3&im ；(2)取沉淀溶解于pH = 7. 3 7. 45緩沖液，鼠抗MC-LR單克隆抗體與緩沖液用量比100 600 μ g/ml，優(yōu)選為400 μ g/ml，再加入BSA至BSA濃度為8 12mg/ml。膠體金制備方法為將濃度為0. 005% 0. 015%的氯酸金溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸混勻繼續(xù)煮沸4 Smin ；氯酸金與檸檬酸的用量比為1 0. 012 0. 0016。鼠抗MC-LR單克隆抗體的制備方法為，取MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物與完全福氏佐劑混合孵化后免疫小鼠；10 15天后取MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物與不完全福氏佐劑混合孵化后，每10 15天免疫小鼠，共三次。MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物制備方法為微囊藻毒素活化后與鑰孔藍(lán)蛋白(KLH)混合反應(yīng)制備，兩者重量比為1 6 1 7 ；并用磷酸鹽緩沖液PBS透析，取上清液。膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物中的單抗、MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物及羊抗鼠二抗的重量比為1 1.8 2 2 3;優(yōu)選為1 18.75 2. 5。檢測(cè)方法為，將待測(cè)水樣滴加在點(diǎn)樣孔內(nèi)，3 5min內(nèi)觀察顯色結(jié)果。待測(cè)水樣與膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物用量比100 μ 1 0. 25 1. 5 μ g，優(yōu)選為為 100 μ 1 1 μ g。MC-LR是多肽，無特殊的基團(tuán)，對(duì)于制備單克隆抗體有一定的困難。本研究在成功合成MC-LR完全抗原的基礎(chǔ)上獲得了高質(zhì)量的MC-LR單克隆抗體，為成功制備MC-LR膠體金檢測(cè)試紙條打下了基礎(chǔ)。隨著人們對(duì)MCs危害認(rèn)識(shí)的不斷深入，我國(guó)衛(wèi)生部新頒布的《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》將MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)值的列入，快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的微囊藻毒素的檢測(cè)方法的建立已成為一項(xiàng)刻不容緩的工作。最近，不同國(guó)家和地區(qū)的31個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用不同方法如高效液相色譜法、 酶聯(lián)免疫學(xué)方法以及蛋白磷酸酶方法測(cè)定同一種樣品中微囊藻毒素，結(jié)果顯示在以商業(yè)化 MCLR作為標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行定量測(cè)定微囊藻毒素時(shí)其測(cè)定值有明顯差異。目前，帶有二極管陣列檢測(cè)器或者連接有質(zhì)譜的高效液相色譜儀仍是最廣泛采用的微囊藻毒素檢測(cè)手段。高效液相色譜法是一種很有效的檢測(cè)方法，它不僅能將毒素定性，而且還能夠提供準(zhǔn)確定量。但是，其所需設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)要求高，方法的建立依賴于一系列的標(biāo)準(zhǔn)品， 檢測(cè)過程往往還需要復(fù)雜的前處理，比較消耗時(shí)間。以生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法代表了快速、簡(jiǎn)單的MCs的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫法對(duì)樣品前處理要求低、設(shè)備操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度和選擇性高，但是商業(yè)化MC S的試劑盒交叉反應(yīng)變化比較大，一般只能以MCLR當(dāng)量的形式來定量毒素。免疫金技術(shù)將待檢物與金標(biāo)記抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。具有體積小、攜帶方便、不需要儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、 3 5min出結(jié)果及結(jié)果可由肉眼根據(jù)T線顏色深淺判斷等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)初篩，在獸藥殘留快速檢測(cè)中頗受關(guān)注。本研究在建立了微囊藻毒素的免疫膠體金試紙條檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)其技術(shù)參數(shù)和檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)定，并初步應(yīng)用于實(shí)際樣本檢測(cè)中，其靈敏度、重復(fù)性、批次間的穩(wěn)定性均很好；目前國(guó)內(nèi)外尚無同類產(chǎn)品銷售，只有ELISA檢測(cè)試紙盒出世，與ELISA試劑盒相比較，我們研制的試紙條價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單， 檢測(cè)時(shí)間3-5分鐘，對(duì)使用人員無任何技術(shù)要求，在我國(guó)專業(yè)知識(shí)普遍不足的國(guó)情下，本產(chǎn)品具有很大的推廣價(jià)值，有助于提供我國(guó)水產(chǎn)品的安全檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)限為2 3ng/ml，與我國(guó)飲用水標(biāo)準(zhǔn)1. Ong/ml尚有一定距離，不能檢測(cè)水樣是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但可以用于大量水樣的初步篩查；也可以用于魚類等水產(chǎn)品的大量篩查。由于膠體金試紙條檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、價(jià)格便宜、便于攜帶，因此，在水樣及水產(chǎn)品的大量篩查中有一定的使用價(jià)值，與其他復(fù)雜的檢測(cè)方法結(jié)合使用，必能降低很多的工作量和節(jié)省大量的費(fèi)用。預(yù)計(jì)將在檢驗(yàn)檢疫、食品安全部門及衛(wèi)生監(jiān)控部門具有較廣的應(yīng)用前景，有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。同時(shí)，可為水產(chǎn)品食用安全檢測(cè)國(guó)際方法的修訂或增補(bǔ)提供科學(xué)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明試劑與儀器儀器二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀，37°C恒溫培養(yǎng)箱，恒溫電磁攪拌器(國(guó)華電器)，Biodot噴膜機(jī)(基因公司)，切條機(jī)(上海韓感電子科技)。電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津中環(huán))。氯金酸，檸檬酸三鈉等化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工；微囊藻毒素購(gòu)自北京伊普瑞斯公司；DMS0，水溶性碳二亞胺-NHS (EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 及各種交叉反應(yīng)藥物均購(gòu)自上海生工；牛血清蛋白(BSA)購(gòu)自四季青生物公司；福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、鄰苯二胺(OPD)等為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清和新生牛血清為四季青生物公司產(chǎn)品，HAT、HTIMDM和高湯培養(yǎng)基購(gòu)自hyclone公司，PEG2000為Roche公司產(chǎn)品，GAM-HPR，DMSO等購(gòu)自Merk公司。實(shí)施例1完全抗原制備3mg微囊藻毒素溶于1. aiilDMF中，加入100微升活化液(12mg EDC，HCL和7mg NHS 溶于Iml DMF中)，4°C活化反應(yīng)過夜。取20mg KLH鑰孔藍(lán)蛋白溶于5ml pH = 9. 6的碳酸緩沖液中l(wèi)h，4°C過夜。混合后用0. OlM PBS透析3天，離心取上清，用lorry法測(cè)定MCLR-KLH偶聯(lián)物的濃度1. %ig/ml，然后根據(jù)需要稀釋為不同的濃度。實(shí)施例2單抗(鼠抗MC-LR)的制備 動(dòng)物免疫適量MCLR-KLH與等體積完全福氏佐劑混合，完全孵化，取5只8周齡雌性BALB/C小鼠，頸背部皮下3點(diǎn)，四肢腋(胭)皮下，以及腹腔注射，每只小鼠注射孵化后抗原500 μ 1 (相當(dāng)于每只小鼠免疫抗原100 μ g)。14天后，適量MCLH-KLH與等體積不完全福氏佐劑混合，完全孵化后皮下多點(diǎn)及腹腔注射抗原，按此法每14天免疫一次。第三次基礎(chǔ)免疫7天后，尾靜脈采血檢測(cè)效價(jià)。MCLH-K包被酶標(biāo)本，間接法測(cè)定效價(jià)。小鼠血清清梯度稀釋(1 1000,1 2000， 1 4000，1 8000，1 16000)，空白BALB/C小鼠血清做陰性對(duì)照。細(xì)胞融合無菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以 5 1體積比混合，按常規(guī)方法進(jìn)行融合，融合劑為PEG。細(xì)胞篩選融合7天后，在HAT的選擇性培養(yǎng)下，SP2/0、未融合的脾細(xì)胞都已經(jīng)死亡，雜交瘤細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，融合率100%。取細(xì)胞上清間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)。強(qiáng)陽性孔 26個(gè)，弱陽性孔138個(gè)。特異性檢測(cè)選取陽性細(xì)胞孔上清做間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)上清中抗體的特異性。經(jīng)過3次亞克隆，8A9和6E12細(xì)胞完全純化，亞克隆的細(xì)胞100%陽性。抗體評(píng)估采用間接ELISA法測(cè)定。將抗體濃度調(diào)整到lmg/ml，再用PBS稀釋 (1 10000,1 20000,1 40000,1 80000,1 160000,1 320000,1 640000)。最高腹水效價(jià)為1 6.4X105。抗體靈敏度檢測(cè)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定。IC50為0. 81ng/ml。實(shí)施例3膠體金的制備參照FrenS1973年介紹的膠體金顆粒的制備方法，取Iml 氯金酸(HAuCl4)溶液，加入到IOOml水中，加熱至沸，再加入0. 5 細(xì)1 檸檬酸三鈉，混合煮沸5min，直到顏色不發(fā)生變化。該方法可制備15 60nm不同直徑大小的金顆粒，顆粒大小取決于加入的檸檬酸三鈉的量。0. 01%氯金酸(HAuCl4)水溶液IOOml加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉1. 5ml，混勻，煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紫紅后，冷卻備用，得到粒徑30nm (士 2nm)的膠體金。 實(shí)施例4膠體金對(duì)單抗的標(biāo)記取實(shí)施例3所得30nm的膠體金2ml，加200 μ g/ml實(shí)施例2制備的單抗0. 2ml，攪拌混勻1小時(shí)，再加20mg BSA,繼續(xù)攪拌30分鐘，IOOOOrpm離心30分鐘，去上清，沉淀用 PH7. 420mM Tris-HCL 100 μ 1溶解，加BSA至終濃度為10mg/ml，置4°C中備用，得到膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物(下稱為金標(biāo)鼠抗MC-LR)。實(shí)施例5靈敏度的檢測(cè)用噴金機(jī)對(duì)實(shí)施例4中各不同單抗?jié)舛葮?biāo)記的金標(biāo)鼠抗MC-LR進(jìn)行包被，試紙的材料為硝酸纖維素膜；金標(biāo)鼠抗MC-LR (實(shí)施例4制備)噴涂在點(diǎn)樣孔，檢測(cè)線(T線)上噴涂濃度為0. 75mg/ml的鼠抗MC-LR (實(shí)施例2制備)，控制線(C線)上噴涂市售的羊抗鼠 IgG抗體(濃度l.Omg/ml)；噴涂量均為2. 5 μ l/cm(噴涂的長(zhǎng)度為1cm)，干燥，組裝試紙。 即，點(diǎn)樣孔內(nèi)金標(biāo)鼠抗MC-LR中的單抗用量1 μ g，T線MCLR-KLH用量1. 875 μ g，C線2. 5 μ g 羊抗鼠IgG抗體。測(cè)試時(shí)，點(diǎn)樣孔上分別滴加100 μ 1不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以各最佳條件制備金標(biāo)測(cè)試條，對(duì)各濃度MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品作靈敏度檢測(cè)，結(jié)果如下表1不同MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品濃度的靈敏度效果比較
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，依次包括點(diǎn)樣孔、檢測(cè)帶和控制帶； 點(diǎn)樣孔上噴涂膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物，檢測(cè)帶為微囊藻毒素 MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物，控制帶上噴涂羊抗鼠二抗。
2.權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，試紙的基材為硝酸纖維素膜或定性濾紙。
3.權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗 MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物中的單抗、MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物及羊抗鼠二抗的重量比為1 1.8 2 2 3。
4.權(quán)利要求1或3所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物中的單抗、MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物及羊抗鼠二抗的重量比為1 18.75 2.5。
5.權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗 MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物的制備方法為(1)將膠體金與鼠抗MC-LR單克隆抗體溶液混合攪拌0. 5 》ir，加入小牛血清BSA繼續(xù)攪拌20 45min，其中膠體金與鼠抗MC-LR單克隆抗體和BSA的用量比Iml 5 40 μ g 8 12mg ；所述的膠體金粒徑在觀 32nm，其制備方法為將濃度為0. 005 % 0. 015 %的氯酸金溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸混勻繼續(xù)煮沸4 Smin ；氯酸金與檸檬酸的用量比為 1 0. 012 0. 0016 ；(2)取沉淀溶解于pH = 7. 3 7. 45緩沖液，鼠抗MC-LR單克隆抗體與緩沖液用量比 100 600 μ g/ml，再加入BSA至BSA濃度為8 12mg/ml。
6.權(quán)利要求5所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，步驟(1)中膠體金與鼠抗 MC-LR單克隆抗體和BSA的用量比為Iml 20 μ g IOmg ；步驟(2)中鼠抗MC-LR單克隆抗體與緩沖液用量比為400 μ g/ml。
7.權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，所述微囊藻毒素MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物的制備方法為微囊藻毒素活化后與鑰孔藍(lán)蛋白(KLH)混合反應(yīng)制備，兩者重量比為1 6 1 7;并用磷酸鹽緩沖液PBS透析，取上清液。
8.權(quán)利要求5所述快速檢測(cè)微囊藻毒素的試紙，其特征在于，所述鼠抗MC-LR單克隆抗體的制備方法為，取MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物與完全福氏佐劑混合孵化后免疫小鼠；10 15天后取MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物與不完全福氏佐劑混合孵化后， 每10 15天免疫小鼠，共三次。
9.一種快速檢測(cè)微囊藻毒素的方法，其特征在于，將待測(cè)水樣滴加在權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述試紙的點(diǎn)樣孔內(nèi)，放置3 5min ；待測(cè)水樣與膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物用量比100 μ 1 0. 25 1.5 μ g。
10.權(quán)利要求9所述一種快速檢測(cè)微囊藻毒素的方法，其特征在于，待測(cè)水樣與膠體金標(biāo)記的鼠抗MC-LR單克隆抗體-BSA復(fù)合物用量比100 μ 1 Iygo
全文摘要
本發(fā)明涉及水樣的檢測(cè)，建立了微囊藻毒素MC-LR的快速膠體金免疫層析檢測(cè)方法及試紙。首先制備平均粒徑30nm左右的膠體金，用以標(biāo)記抗微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體；將微囊藻毒素MC-LR半抗原與鑰孔藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶，羊抗鼠二抗作為控制帶，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理，建立快速檢測(cè)微囊藻毒素MC-LR的免疫層析試紙條方法。該方法靈敏度可達(dá)到3ng/mL，只需3～5min即可目測(cè)判斷結(jié)果，具有快速、直觀、操作簡(jiǎn)單、便于使用等特點(diǎn)，可以作為現(xiàn)場(chǎng)大量篩查淡水及淡水產(chǎn)品是否感染微囊藻毒素MC-LR的有效手段。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102495212SQ20111042540
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者何培民, 汪卿, 繆輝南, 胡樂琴, 蔡春爾 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)