專利名稱：：csPCNA同種型修飾及其用途的制作方法
技術領域：
：本文公開內容涉及惡性細胞的檢測，包括癌癥特異性蛋白修飾的用途。
背景技術：
：在細胞變成惡性細胞時發生的轉化是了解得最少且最復雜的疾病過程之一。該過程涉及遺傳突變和蛋白質組轉化，其結果是使細胞逃脫正常控制；阻止不適宜的細胞分裂。癌細胞共有某些相同特性。大部分癌細胞在正常的細胞周期控制之外增殖，表現出形態變化，并表現出對細胞過程的各種生物化學破壞。通常在開始出現細胞變化后腫瘤變得清晰可見時診斷出癌癥。許多癌癥在依據組織學檢驗活檢樣品的形態異常后被診斷出來，形態異常證明細胞增殖和遺傳不正常。惡性肺瘤的有效治療經常依賴于在疾病早期可靠地檢測惡性細胞的存在情況的能力，使得有效治療可在疾病對此治療更敏感的階段開始。因此，需要在惡性細胞還沒有發展至被看作惡性腫瘤的組織學階段，但可發展至惡性肺瘤狀態時，能夠可靠地檢測潛在的惡性細胞。還需要快速的、侵入性最低的技術來可靠地檢測或治療惡性細胞或潛在的惡性細胞。增殖細胞核抗原(PCNA)是一種29kDa的核蛋白，其在細胞周期的S期和G2期時于細胞中的表達使該蛋白成為良好的細胞增殖標記。還已經表明，在許多分子途徑中的配偶體負責細胞的生命和死亡。其在S期細胞核中的周期性出現提示與DNA復制有關聯。PCNA后來被鑒別為哺乳動物細胞中的DNA聚合酶輔助因子和體外SV40DNA復制的必需因子。除了在哺乳動物細胞中用作DNA滑動鉗蛋白和DNA聚合酶輔助因子以外，PCNA還與涉及轉錄、細胞周期關卡、染色質重塑、重組、凋亡和其它形式的DNA修復的眾多其它蛋白相互作用。除了作用不同之外，PCNA的許多結合配偶體還通過其對每種新一代細胞的細胞功能的精確遺傳的影響而連在一起。PCNA可用作協調染色體加工的主要分子。還已知PCNA與諸如FEN-1、DNA連接酶和DNA甲基轉移酶的其它因子相互作用。另外，還已經表明PCNA在多個DNA修復途徑中是必需的參與者。與錯配識別蛋白、Msh2和核苷酸切除修復內切核酸酶XPG之類的蛋白的相互作用使PCNA參與和DNA合成截然不同的過程。與多個配偶體的相互作用一般取決于能使PCNA以按順序的和遺傳有利的方式選擇性相互作用的機制。PCNA功能機制的線索起初通過研究哺乳動物細胞中存在的DNA合成體(synthesome)、多蛋白DNA復制復合物得以揭示。檢驗DNA合成體的合成活性的研究在惡性細胞中鑒別出的出錯率高于非惡性細胞中鑒別出的出錯率。這些結果提示，惡性細胞中DNA合成體的一個或多個組分的結構發生改變。DNA合成體的必需組分PCNA的2D-PAGE免疫印跡分析揭示出兩種具有極大不同的等電點(pI)的截然不同的同種型。一種PCNA同種型顯示出顯著的堿性pl,在惡性和非惡性細胞中均存在。具有酸性pl的另一同種型專有地存在于惡性細胞中。因為該同種型僅存在于惡性細胞中，所以將其稱為癌癥特異性同種型或csPCNA,導致PCNA的改變的2D-PAGE遷移模式的翻譯后改變仍未確定。一些采用PCNA的標記研究提示，PCNA的遷移很可能不是緣于磷酸化、乙酰化、糖基化或唾液酸化等改變。業已披露了嘗試鑒別針對PCNA的翻譯后修飾的相左研究。例如，據報道，PCNA的磷酸化影響其結合DNA合成位點。另一個研究主張PCNA終歸不是磷酸化的，而是乙酰化的。除了這些研究以外，酵母PCNA的分析表明，其是響應于DNA損傷的泛素化靶標以及沒有損傷情況下的蘇素化耙標。由于PCNA的多變性和相左的結構證據，所以難以鑒別哪種修飾(假使有的話)負責csPCNA同種型的出現和功能。因此，期望鑒別出正確的csPCNA翻譯后修飾，以開發診斷方法，另外基于csPCNA與其配偶體的相互作用開發治療劑。惡性癌細胞表達一種稱為癌癥特異性PCNA(csPCNA)的PCNA同種型，而非惡性細胞表達一種稱為非惡性細胞PCNA(nmPCNA)的同種型。癌癥的診斷和治療需要辨別兩種同種型的有效組合物和方法。發明概述鑒別了csPCNA的新的翻譯后修飾。鑒別了csPCNA的甲酯化。使用2D-PAGE/液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)法分析csPCNA同種型，并鑒別存在于csPCNA上的曱酯化。甲酯化修飾位于特定的谷氨酸和天冬氨酸殘基。本文公開了利用雙向電泳(2D-PAGE)和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)對分離自乳癌細胞的單一酸性PCNA同種型的結構分析。甲酯位于csPCNA的16個特定谷氨酸和天冬氨酸殘基。csPCNA的曱酯化代表了哺乳動物細胞中一種新型翻譯后修飾，與解決PCNA的多種功能的其中一些相關。一種檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細胞核抗原(csPCNA)同種型的方法包括以下步驟在疑似含csPCNA同種型的樣品中檢測在csPCNA同種型的一個或多個氨基酸殘基上含甲酯的翻譯后修飾；并通過比較csPCNA同種型和非惡性PCNA同種型上的曱酯水平確定csPCNA同種型的存在情況。其中一些生物樣品包括體液，例如血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。生物樣品還包括組織樣品，例如得自乳腺、前列腺、肺、結腸、上皮、結締組織、子宮頸、食道、腦、胸腺、甲狀腺、胰腺、睪丸、卵巢、腸、膀胱、胃、軟組織瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盤、纖維性組織、胚細胞組織及其提取物的組織。能夠含csPCNA的任何生物樣品都適于分析。在一個方面，甲酯存在于csPCNA同種型的天冬氨酸上或谷氨酸上或其組合上。甲酯存在于csPCNA同種型上的16個天冬氨酸或谷氨酸殘基的一個或多個上。曱酯存在于16個天冬氨酸或谷氨酸殘基的一個或多個上，這16個殘基對應于csPCNA同種型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。含16個天冬氨酸或谷氨酸修飾殘基的csPCNA-衍生肽如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>，，Dm代表甲酯化天冬氨酸歹驢。在一個方面，使用質譜分析，例如通過液相色譜(LC)質譜(MS)分析，進行csPCNA同種型的檢測。檢測曱酯或甲酯化氨基酸殘基的任何合適方法都可用。與對應的未修飾肽相比，csPCNA-衍生肽的質譜分析產生14Da的質量位移(shift)。一種診斷或預后惡性肺瘤的方法，該方法包括以下步驟通過鑒別區分csPCNA同種型和非惡性PCNA(nmPCNA)同種型的csPCNA同種型的翻譯后修飾狀態檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細胞核抗原(csPCNA)同種型；并基于生物樣品中的csPCNA的檢測情況診斷惡性肺瘤。檢測csPCNA上的翻譯后修飾，例如曱酯化，并使用csPCNA相對于nmPCNA上的甲酯化水平確定惡性腫瘤。一種修飾的增殖細胞核抗原(PCNA)肽包含選自以下的氨基酸序列MFEmAR;正mDEEGS;正DEEmGS;VSDYEraMK;MPSGEmFAR;LSQTSNVDmK;CAGNEmDIITLR;FSASGEmLGNGNIK;AEDNADTLALWEAPNQEmK;AEJDNADTLALVFEAPNQEK;AEDmNADTLALWEAPNQEK;AEDNADTLALVFEmAPNQEK;LMDJLDVEQLGIPEQEYSCVVK;ATPLSSTVTLSMSADWLVVEmYK;和其中Em代表曱酯化谷氨酸殘基，Dm代表甲酯化天冬氨酸殘基。在一個方面，csPCNA或PCNA的修飾肽是翻譯后修飾的。在另一方面，對csPCNA或PCNA的修飾肽進行蛋白酶消化步驟。在另一方面，csPCNA或PCNA的修飾肽是合成的。在一個方面，檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細胞核抗原(csPCNA)同種型的方法包括測定csPCNA和nmPCNA的總體甲酯化水平，并基于該甲酯化水平確定生物樣品具有csPCNA。在考慮以下詳述的實施方案時，本文公開內容的其它特征對本領域技術人員將變得顯而易見，實施方案的詳述例舉了實施目前所認識到的公開內容主題的最佳方式。附圖簡述圖1表明通過LC-MS/MS肽表征由2D-PAGE鑒別csPCNA。(A)顯示了MDAMB468細胞核提取物(2mg)的代表性考馬斯藍染色的20-PAGE凝膠。選擇多個斑點，用于以胰蛋白酶蛋白水解，并通過LC-MS/MS鑒別。在凝膠的酸性一側鑒別出csPCNA(黑色箭頭)，pl約為4.6。依據2D分析軟件的檢測，2D-PAGE的三維表示檢測出對應于csPCNA的兩個斑點——個適中豐度的斑點(黑色箭頭)和一個低豐度的更酸性的斑點(白色箭頭)。在分析中鑒別出來的非PCNA的蛋白斑點(i-v)列于表I。(B)顯示了衍生于csPCNA的胰蛋白酶消化的肽的基峰色譜圖。(C)圖示了于43.3分鐘洗脫的csPCNA肽的質譜。1038.7質荷比離子的串聯質譜分析(D)鑒別出其為雙電荷肽，對應于人PCNA的殘基92-110。(E)是顯示于43.74分鐘洗脫的1045.4質荷比離子的質譜。單電荷離子的質量差異是雙電荷離子差異的2倍，因此1045.4質荷比離子顯現出+14Da質量位移。(F)表明，1045.4質荷比離子的串聯質譜與D部分中的質譜幾乎相同，只是所有y-離子都位移14Da。僅b化-離子的質量位移將額外的14Da定位在csPCNA的109位谷氨酸上。圖2顯示了csPCNA的交錯肽序列圖譜的建立。(A)代表性基峰色譜圖，顯示了用胰蛋白酶(藍色)、胰蛋白酶/CNBr(綠色)、GluC(紅色)和AspN(黑色)切割csPCNA衍生的肽的洗脫。(B)通過LC-MS/MS鑒別的序列的csPCNA圖譜。指示了甲酯的位置(Xm)。圖3表明，PCNA的C末端尾在多個位點被曱酯化。(A)衍生于csPCNA的C末端尾的3種不同肽的洗脫。用胰蛋白酶消化的csPCNA的基峰色譜圖與肽正DEEGS(778.5m/z)和甲酯化IEDEEGS肽(792.5)的選定離子色譜圖相比。甲酯化肽具有增加的疏水性，之后在反相梯度中洗脫。(B)未修飾肽的串聯質語解析顯示了具有序列IEDEEGS的單電荷肽的碎片。通常觀察到水的中性丟失水(-18Da)和許多碎片離子。另外，在373.9質荷比觀察到表現為由y4-離子中性丟失水和CO基團的碎片離子。(C)在以上色譜圖中先洗脫的肽的792.3質荷比離子的串聯質譜。可在質譜中鑒別出b3-6-離子，除y3和yr離子沒有位移之外，全部都位移14Da，提示修飾位于N-端的亮氨酸或谷氨酸中的任一個上。(D)在分離中第二洗脫的肽的792.3質荷比離子的串聯質譜。bs和b6-離子含如上的14Da位移，但1^3和1)4離子不位移，與位于該肽5位谷氨酸上的甲酯相一致。圖4顯示了PCNA的免疫印跡。圖5顯示了PCNA的氨基酸序列(1-262個氨基酸)。發明詳述增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白在癌細胞中被改變。PCNA是一種28kD的蛋白，其電泳遷移率等于36kDa蛋白的電泳遷移率。PCNA是DNA聚合酶5介導高效DNA復制活性所需的輔助因子。由惡性細胞純化的DNA合成體包含至少兩種形式的PCNA。兩種PCNA的總電荷明顯不同。因此，惡性腫瘤或癌癥特異性的酸性PCNA形式csPCNA和非惡性或正常的堿性PCNA形式nmPCNA可在雙向聚丙烯酰胺凝膠上得以辨別。酸性csPCNA在惡性細胞系中表達，例如HeLa(人宮頸癌)、Hs578T(乳癌)、HL-60(人原粒細胞白血病)、FM3A(小鼠乳癌)、PC10(前列腺癌)、LNCaP(前列腺癌)、LN99(前列腺癌)、MD-MB468(人乳癌)、MCF-7(乳癌)、KGE卯(食道-結腸癌)、KYE350(食道-結腸癌)、SW48(食道-結腸癌)和T98(惡性神經膠質瘤)。酸性csPCNA還在得自人乳腺胂瘤、前列腺肺瘤、腦胂瘤、人胃腸腫瘤或食道-結腸胂瘤、鼠乳腺腫瘤的惡性細胞中和人慢性原粒細胞白血病中表達。在非惡性細胞系(例如乳腺細胞系Hs578Bst和MCF-10A)中或在非惡性血清或組織(例如乳腺)的樣品中未檢測到酸性csPCNA。LC-MS/MS肽表征方法用于測序存在于惡性細胞中的csPCNA同種型。鑒別出一種存在于csPCNA的眾多殘基上的新型翻譯后修飾。此修飾一甲酯化存在于csPCNA中的16個不同的天冬氨酸和谷氨酸上。PCNA的未修飾氨基酸序列示于圖5。依據串聯質譜，這些甲酯最初在肽質鐠中被鑒別為14Da位移，定位于谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基。甲酯化肽的相對定量表明，惡性細胞中的csPCNA蛋白包括含一個或多個甲酯的幾種分子，這些甲酯存在于整個蛋白中的多個殘基處。特定殘基的甲酯化有可能導致離散的蛋白構象變化，這些變化可促進和/或破壞蛋白/蛋白相互作用。甲酯化對哺乳動物蛋白功能的影響了解得很貧乏。過去對哺乳動物蛋白甲酯化研究大部分集中于蛋白老化和酶蛋白異天冬氨酸甲基轉移酶(PIMT)對異天冬氨酰殘基的修復。但是，存在于csPCNA上的大部分甲酯被發現在谷氨酸殘基上，而不是在天冬氨酸殘基上，提示修飾經另路途徑發生。PCNA的甲酯化有可能改變其構象，有效隱藏和/或暴露特異性蛋白結合位點，并決定其功能。還進行了重組PCNA的LC-MS/MS序列分析，發現了曱酯化證據。因此，存在于PCNA上的甲酯化可穩定蛋白的特定構象狀態，避免蛋白結構無序。另外，PCNA的靜電勢計算表明，PCNA三聚體的外表面具有高度的負電勢以及谷氨酸和天冬氨酸殘基豐度。這些殘基的曱基化因此可改變此電勢，并有效改變蛋白的表面拓樸學。公開了由2D-PAGE解析的特定同種型csPCNA的LC-MS/MS肽表征。使用組合的蛋白水解法產生csPCNA的交錯肽序列圖譜，通過LC-MS/MS鑒別出100%的csPCNA蛋白序列。鑒別出一種存在于csPCNA上的新翻譯后修飾。甲酯出現在csPCNA同種型的16個特定天冬氨酸和/或谷氨酸殘基的至少一個上。這些修飾可改變PCNA三聚體的結構，并通過這樣做促進可能與有序的蛋白/蛋白相互作用相關的構象改變。生物樣品可為體液樣品，其可包括血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、精液、淚液、滑液或可測試csPCNA同種型存在情況的任何體液。或者，所述生物樣品可為組織樣品，其中組織樣品的細胞可被懷疑是惡性的。例如，組織切片或細胞培養物可封裝在玻璃或塑料載玻片上，并按照標準免疫細胞化學方法與抗體接觸。組織提取物或細胞濃縮物或細胞提取物也是適宜的。在另一個實施方案中，提供一種診斷惡性腫瘤的方法。所述方法包括以下步驟檢測生物樣品中的csPCNA，所述生物樣品得自人，或者具體地說是疑似具有惡性腫瘤病癥的患者，其中檢測csPCNA的步驟包括檢測本文公開的含甲酯的翻譯后修飾的水平。在另一個實施方案中，提供一種有助于診斷惡性腫瘤的方法。所述方法包括與正常細胞中的PCNA相比檢測組織樣品的惡性細胞中的csPCNA上的翻譯后修飾的步驟，其中組織樣品的細胞疑似為惡性的，其中檢測csPCNA的步驟包括檢測csPCNA上的甲酯。要理解的是，惡性細胞不限于諸如乳腺、前列腺、血液、腦、胰腺、平滑肌或橫紋肌、肝臟、脾臟、胸腺、肺、卵巢、皮膚、心臟、結締組織、腎臟、膀胱、腸、胃、腎上腺、淋巴結或子宮頸的組織中的惡性細胞，或例如Hs578T、MCF-7、MDA-MB468、HeLa、HL60、FM3A、BT-474、MDA畫MB-453、T98、LNCaP、LN99、PC10、SK畫0V畫3、MKN-7、KGE90、KYE350或SW48的細胞系中的惡性細胞。在另一個實施方案中，提供一種有助于預后惡性腫瘤發展的方法。該方法包括通過檢測本文公開的翻譯后修飾檢測組織樣品中的csPCNA,其中組織樣品的細胞可被懷疑是惡性的，并將csPCNA水平與具體惡性腫瘤疾病的進展相關聯。而且，csPCNA上的翻譯后修飾的檢測和分析可用于預后已發展出惡性肺瘤的患者的潛在存活結果。要理解的是，可使用所述抗體診斷或預后的疾病包括但不限于惡性腫瘤，例如各種形式的成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、黑素瘤、結腸癌、肺癌、腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、成淋巴細胞瘤、白血病、骨肉瘤、乳癌、肝癌、腎瘤、腎上腺癌或前列腺癌、食道癌。如果惡性細胞表達csPCNA同種型，則本文公開的技術能夠檢測csPCNA同種型。包含本文公開的翻譯后修飾檢測的檢測技術還可檢測乳腺組織某些侵入性和非侵入性腫瘤類型中的惡性腫瘤，這些腫瘤類型包括管嚢胂、頂泌腺化生、硬化性腺病、管上皮細胞增生、非-非典型管內乳頭瘤病、柱狀細胞改變、放射狀硬化病(放射狀瘢痕)、乳頭腺瘤、管內乳頭瘤、纖維腺瘤、乳腺乳頭瘤、非典型管上皮細胞增生、非典型小葉增生、原位管癌一再分類為核級1、2和3、原位小葉癌、原位多形性小葉癌、乳腺內脂瘤、乳腺錯構瘤、粒細胞瘤、乳腺內脂肪壞死、假血管瘤樣間質增生(PASH)、涉及乳腺的惡性黑素瘤、涉及乳腺的惡性淋巴瘤、葉狀瘤一良性、臨界和惡性亞型以及乳腺肉瘤。在另一個實施方案中，本文公開的方法用于通過比較隨時間變化的胂瘤中的csPCNA水平確定腫瘤的惡性程度、跟蹤惡性腫瘤疾病的進展或患者對治療的響應。通過測定血樣的csPCNA同種型存在情況的方法，所述方法還可用于檢測已脫離肺瘤并存在于患者血流中的惡性細胞。生物樣品可得自人類患者或脊推動物患者。術語"抗體"包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出期望的生物活性或特異性。可制備特異性識別翻譯后修飾的nmPCNA或csPCNA的抗體。術語"修飾的蛋白或肽"指在衍生于這些蛋白的csPCNA或nmPCNA蛋白或肽上存在一個或多個翻譯后修飾。該術語還指合成的以及分離純化的csPCNA和nmPCNA肽，它們包含一個或多個翻譯后修飾。該術語還指蛋白酶消化的csPCNA和PCNA肽，以及通過任何已知方法片段化的csPCNA和PCNA的肽，它們含一個或多個翻譯后修飾。除非另有說明，否則本文使用的所有化學品都得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)或FisherScientific(Hampton,NH)。質譜級水和乙腈得自HoneywellBurdickandJackson(Morristown,NJ)。使用任何標準技術分析由個體所獲樣品中存在的csPCNA和nmPCNA的翻譯后修飾。例如，質鐠分析是一種適宜的技術。質譜分析可與其它技術聯用。MDAMBA468和MCF7乳癌細胞得自ATCC,并保持在含10%FCS(BioWhittaker,Walkersville,MD)和抗生素-殺真菌劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM(MediaTech,Herndon,VA)中。細胞在100mm細胞培養皿上生長，直至60-70%匯合，淋洗，并用橡膠淀帚刮到水冷的PBS中，之后使之沉淀。如在Malkas等，說0c/^肌^71990,29,6362-6374中所述將細胞分級分離為核提取物。簡而言之，使用DounceTM勻漿器勻化細胞，并沉淀核。隨后用150mMKC1于4。C提取核蛋白2小時，通過超離心沉淀膜。將核提取物冷凍在-80。C，直至使用。使用IEFCell和17cmpH4-7ReadyStripIPG膠條(Bio-Rad,Hercules,CA)進行等電聚焦。蛋白樣品使用蛋白脫鹽離心柱(Pierce,Rockford,IL)脫鹽，并在speed-vac(ATRBiotech，Laurel,MD)中凍干。將凍干的樣品重懸浮在再水合緩沖液(9M尿素、4%CHAPS、0.2%Bio-Lytes(Bio-Rad,Hercules,CA)、2mM三丁基膦、0.001%溴酚藍)中，并于20。C被動再水合入IPG膠條中達12小時。按照生產商的說明(Bio-Rad,Hercules,CA)進行等電聚焦。在SDS-PAGE之前，通過在含20mg/mlDTT的緩沖液(6M尿素、0.375Mtris、2%SDS、20%甘油，pH8.8)中溫育還原IPG膠條，并在含替代DTT的碘乙酰胺的相同緩沖液中烷基化。使用ProteanXL裝置(Bio-Rad,Hercules,CA)以恒定電流在12%聚丙烯酰胺凝膠(20cmx20cm)上進行約5小時的SDS-PAGE。凝膠在10%乙酸/50%曱醇的水溶液中固定，并用GelCodeBlue(Pierce,Rockford,IL)過夜染色。使用GS710掃描圖象光密度計(Bio-Rad，Hercules,CA)實現成像，并用PhoretixEvolution2D軟件(NonLinearDynamics,Inc.,Durham,NC)進行凝膠分析。使用1mm打孔取樣器(TheGelCompany,SanFrancisco,CA)手工進行斑點揀選。如先前所迷并采用某些改進(Rosenfeld等，AnalBiochem1992,203，173-179;vanMontfort等，BiochimBiophysActa2002,1555,111-115)，用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)、溴化氰(CNBr)(Sigma-Aldrich,StLouis,MO)、GluC或AspN(Roche,Indianapolis,IN)進行蛋白切割。簡而言之，凝膠斑點在25mM碳酸氫銨(ABC)/50。/。乙腈中脫鹽，接著用100%乙腈脫水，并在speed-vac(ATRBiotech,Laurel,MD)中干燥。然后將斑點在蛋白酶溶液的(20pg/ml的胰蛋白酶、GluC或AspN)25mMABC中再水合。于4'C達10分鐘后，去除過量的蛋白酶溶液，用新鮮的25mMABC置換，并于37。C過夜溫育。在25mMABC/50%乙腈(一次)和5%甲酸/50%乙腈(兩次)存在下通過超聲由凝膠提取肽。合并肽提取物，并在speed-vac中干燥。隨后通過將干燥的肽提取物重懸浮在70%甲酸中，并加入CNBr至相對于所述肽約200M過量，進行胰蛋白酶消化物的CNBr切割(對選定樣品)。于室溫進行4小時的CNBr切割，并在speed-vac中干燥。所有樣品都在臨分析前重懸浮在1%甲酸中。使用在內部用MagicC18Aq5)u、200A(Michrom，Inc.,Auburn,CA)裝填的MegraFrit(NewObjective,Inc.,Woburn,MA)捕獲柱和用MagicC18Aq5|ii、100A材料自裝填并固定在由定制納噴霧臺原位保持的小型十字架上(Gatlin等，爿加/所oc/ew1998,263,93-101)的0.05mmxl00mm^立尖的熔融石圭4i(PolymicroTechnologies,Phoenix,AZ)進行納流HPLC。使用含0.1%曱酸的2-50%線性乙腈梯度分離肽。裝置由SurveyorHPLC和LCQAdvantage離子阱質譜儀(ThermoElectron,Waltham,MA)或UltimateHPLC(LCPackings)和LCQDECAXP(ThermoElectron，Waltham,MA)組成。使用BioWorks3.1(ThermoElectron,Waltham，MA)由原始數據產生峰表。使用Mascot(MatrixScience,Inc.,Boston,MA)進行Swissprot數據庫檢索(另參見Creasy&Cottrell,尸ra&om,h2002,2,1426-1434)。母離子和碎片質量容差分別設為3和0.8Da,最大未切割位點設為2。選擇脲甲基半胱氨酸和氧化的曱硫氨酸作為笫一遍哺乳動物數據庫檢索中的可變修飾。在選擇胰蛋白酶作為酶的情況下進行隨后的容錯檢索，并另外將谷氨酸和天冬氨酸曱酯看作可變修飾。盡管以下的詳迷和實施例及其作為參考的具體實施方案中詳細描述了與csPCNA同種型相關的檢測翻譯后修飾的方法及其用途，但對本領域一般技術人員顯而易見的是，可對本發明實施各種變更和修改，而不偏離本發明的精神和范圍。本文提及的所有參考文獻都通過引用整體結到本文中。實施例提供以下實施例僅是為了解釋目的，無意限制上文廣義上已描述的公開內容。實施例1:csPCNA同種型的雙向2D-PAGE和JI^征通過2D-PAGE解析分離自MDAMB468乳癌細胞的核提取物級分(圖1A)。由凝膠切下多個具有接近36kDa的表觀分子量以及處于或接近4.5的pI(PCNA的表觀SDS-PAGEMW和計算pI)的斑點，并用胰蛋白酶進行凝膠內消化。利用納流液相色譜法(LC)和使用四極桿Mascot檢索引擎檢索串聯MS數據鑒別每個斑點包含的蛋白。使用該方法定位2D-PAGE凝膠上的csPCNA。該方法允許以有限的樣品處理常規csPCNA鑒別和分析，因此使翻譯后修飾的潛在損失最小。圖1B顯示了由2D-PAGE凝膠切下的csPCNA的凝膠內胰蛋白酶消化產生的肽的代表性基峰LC/MS色譜圖。在該實驗中，鑒別出25個覆蓋全長PCNA序列的97%的肽。在該實驗中鑒別出的代表性csPCNA肽示于圖1C。該肽于43.3分鐘-陂洗脫，并顯示出1038.7的質荷比(2+)(圖1C)。肽的碰撞誘導解離(CID)(Roepstorff,P.和Fohlman,丄，歷ow^A/a^S/7e"ram1984,11,601)揭示了人PCNA的氨基酸92-110的序列AEDNADTLALVFEAPNQEK(圖1D)。實施例2:csPCNA的曱酯化該實施例表明，csPCNA同種型在一個或多個氨基酸位置表現出甲酯化。LC-MS/MS數據鑒別出多個表現出14Da的母肽質量位移的肽。令人感興趣的是，鑒別出的質量位移提示存在翻譯后修飾一曱酯化。哺乳動物細胞中的甲基化一般被認為是不可逆的翻譯后修飾。主要在賴氨酸殘基的胺基和蛋白N末端上存在的甲基化已在諸如p53和組蛋白H3和H4的蛋白上被鑒別出來。但是，檢查CID譜的+14Da位移肽將甲基定位在天冬氨酸和谷氨酸殘基，與曱酯化一致。圖1E表明在該實驗中甲酯化肽(1045.4質荷比[2+])于43.8分鐘被洗脫。該肽緊鄰(25秒后)未修飾的1038.7質荷比(2+)肽被洗脫(圖1C),在MS譜中仍可見。1045.4質荷比離子的碎片(圖1F)揭示了非常類似于1038.7質荷比肽的模式(圖1D)。這些碎片譜的主要差異在于，與1038.7質荷比肽的y系列離子相比，在1045.4質荷比肽的幾乎所有y系列離子中都有+14質量位移。檢查1045.4CID譜的高MW區(圖1F)鑒別出兩個具有1943.3和1800.2的質荷比值的b-離子。1943.3離子對應于b,r離子，表明C-末端失去未修飾的賴氨酸。該離子與在1038.7質荷比肽的碎片質語(圖1D)中觀察到的b^-離子(1928.4)也相差14Da,這進一步提示賴氨酸未被修飾，14-Da質量位移在該肽的另一個殘基上。另一方面，圖1F中的bn-離子(1800.2)緊密匹配圖1D中的bn-離子(1799.4),表明失去谷氨酸(129Da)加甲基(14Da)，或失去1045.4質荷比肽的bn和b『離子之間的143Da。剛好在圖1D和1F中的b『離子左側的小峰分別具有1911.1和1925.4的質荷比值，與b]8-離子中性丟失H20或NH3相一致。這些觀察結果與位移的y-離子質量一起將曱酯定位于全長csPCNA蛋白109位的谷氨酸殘基。除了csPCNA以外，分析凝膠中其它蛋白的甲酯化存在情況。5個代表性蛋白斑點示于圖1A，這些印跡的身份及其曱酯化狀態示于表l。令人感興趣的是，發現所分析的5種蛋白中的一種(Stathmin)被甲酯化以及N-末端乙酰化。csPCNA的曱酯化不是樣品處理(例如用乙酸和甲醇進行凝膠固定)的結果，因為僅對一小部分蛋白觀測到甲酯化，并一致地對特定csPCNA殘基觀測到曱酯化，而不是在凝膠中存在的所有蛋白中存在。實施例3.csPCNA甲酯化的鑒別除了圖1中鑒別的AEDNADTLALVFEAPNQEK肽以外，多個其它csPCNA肽一致地表現出14Da質量位移。為成功地鑒別所有曱酯化位點以及鑒別csPCNA同種型上存在的任何其它潛在翻譯后修飾，使用不同試劑產生如在csPCNA同種型的序列圖譜中所示的交錯肽。圖2A顯示了LC-MS/MS實驗中來源于用單獨的胰蛋白酶、胰蛋白酶繼之以溴化氰(CNBr)切割、單獨的AspN、單獨的GluC分別消化的csPCNA的代表性基峰色譜圖。這些基峰描圖顯示出使用這些技術產生的肽洗脫譜的差異。用單獨的胰蛋白酶以及胰蛋白酶和CNBr消化提供序列覆蓋，AspN和GluC實驗提供額外的證實數據。從C末端向甲硫氨酸殘基方向切割的CNBr切割降低了較大胰蛋白酶消化肽的大小，使這些序列適于使用離子阱的LC-MS/MS分析。此組合消化可用于表征33個殘基的胰蛋白酶消化肽用AspN和GluC消化產生證實數據，但其不產生完整序列覆蓋。這有可能歸因于多種因素。例如，與胰蛋白酶相比，GluC和AspN在PCNA中具有較少的切割位點，因此產生更難以分析的較大肽。另夕卜，這些蛋白酶識別蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸殘基，本研究發現這些殘基被甲酯化。因此，甲酯化可潛在地影響蛋白酶切割產生的較大肽，最終導致不佳的序列覆蓋。這種蛋白酶切割的損失可用作檢測甲酯化的診斷工具。產生的具有質子化C-末端殘基的肽如胰蛋白酶消化肽一樣通常產生高質量的CID譜。使用這些不同方法由多個測序實驗產生的組合數據一致地在MDAMB468和MCF7乳癌細胞的csPCNA上鑒別出16個甲酯化的谷氨酸殘基和天冬氨酸殘基(參見表III)。產生的csPCNA序列圖譜連同通過LC-MS/MS鑒別的任何修飾示于圖2B。除了甲酯化以外，觀察到幾種其它修飾。在所有實驗中于csPCNA和其它蛋白上都一致地觀測到氧化的甲硫氨酸和脲甲基半胱氨酸。另外，在胰蛋白酶/CNBr消化物中觀測到多個"曱酰化"絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。但是，這些修飾可能是由樣品處理產生的化學修飾，不是"天然的"翻譯后修飾。實施例3A:PCNA和csPCNA上的其它翻譯后修飾的鑒別除了鑒別csPCNA上的曱酯以外，還分析完整的csPCNA分子的其它已知翻譯后修飾的存在情況。與先前對其它形式的PCNA的報道相反，在csPCNA上未鑒別出csPCNA肽表現出與泛素化或蘇素化綴合一致的質量位移，這強有力地表明，在此分析的凝膠斑點中的csPCNA既沒有泛素化，也沒有蘇素化。而且，盡管先前已報道了磷酸化的PCNA,但在這些分析中沒有發現支持csPCNA的任何殘基磷酸化的數據。在這些分析中觀測到的csPCNA肽沒有一個顯示出+80Da質量位移和/或H3P04的中性丟失(98Da)，這與表明PCNA是乙酰化的而不是磷酸化的報道相一致。另外，為確定磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、乙酰化賴氨酸以及聚(ADP)核糖的存在情況，對凝膠進行免疫印跡分析，但未能在PCNA上檢測到這些翻譯后修飾。乳癌細胞中的csPCNA同種型不是磷酸化的、乙酰化的、泛素化的或蘇素化的，而是曱酯化的。與乙酰化和磷酸化類似，曱酯化可改變其在2D-PAGE上的遷移。但是，與能將分子遷移至更酸性pl的乙酰化和磷酸化不同，曱酯化會使蛋白在更堿性的pl解析。因此，可以假定，在圖1A中可見的低豐度酸性同種型(白色箭頭)可為與csPCNA同種型相比含較少或不含曱酯的同種型。與正常或非惡性形式的PCNA(nmPCNA或簡單PCNA)相比，csPCNA同種型含少量的曱酯化。非惡性或堿性PCNA同種型可能包含較高水平的甲酯化。此結論部分地基于以下事實甲酯化小務飾酸性殘基，會將蛋白遷移至更堿性的pl(由于失去酸性電荷)，csPCNA同種型非常接近其理論p14.5。但是，乙酰化、磷酸化和ADP-核糖基化會將蛋白遷移至4.5以下的更酸性pl(由于加入酸性電荷)。因此，這些修飾不可能引起所述pl遷移。檢測PCNA和csPCNA上的甲酯化程度區分惡性肺瘤與非惡性腫瘤(區分csPCNA與nmPCNA)。使用本文公開的方法，確定和比較csPCNA和nmPCNA的曱酯化水平，用于診斷惡性肺瘤。例如，表II提供了多種csPCNA衍生肽的曱酯化狀態以及異質群體中的修飾百分率。表II可用作在惡性腫瘤診斷中確定不同甲酯化水平的對比表。實施例4.甲酯化的csPCNA肽的半定量進一步研究了相對于同種型的pi鑒別csPCNA上的甲酯。PCNA具有約4.5的理論pi,使用周圍蛋白的pi在2D-PAGE凝膠校準后測定的csPCNA的pi稍高，約為4.6。相反，如果在圖2中鑒別出的全部16個酸性殘基100%都是甲酯化的，則蛋白的pi應有可能遷移至比0.1pH單位更顯著的堿性(例如5.66)。可能有額外的殘基被修飾，以產生堿性或nmPCNA同種型。nmPCNA同種型還可以在與csPCNA不同的和/或額外的殘基上被甲酯化。本文公開的方法能使本領域一般技術人員確定csPCNA和nmPCNA的甲酯化水平。檢測甲酯化肽的相對豐度，并與未修飾肽相比較。這通過檢測和比較每個未修飾肽及其曱酯化對應物的峰面積完成。峰面積的比較揭示了如表II所示的在此LC-MS/MS實驗中鑒別出的各個甲酯的相對豐度。在比較峰面積時，每種肽僅顯示出部分曱酯化(<25%)。因此，csPCNA同種型可能由具有相同pi的PCNA的異質群體組成。換句話說，單個csPCNA分子可能具有一個或幾個甲酯，但沒有16個。但是，一個或幾個甲酯可遍及蛋白的16個不同殘基上存在。csPCNA的這種異質性表現為csPCNA的C-末端肽上存在曱酯化。未修飾肽IEDEEGS(778質荷比)在28.9分鐘-波洗脫(圖3A),該肽的CID譜與含未修飾的酸性殘基的肽相一致(圖3B)。令人感興趣的是，在該肽的甲酯化物質(792質荷比)的選定離子色譜圖中，鑒別出保留時間增加2-3分鐘的兩個峰。這可能歸因于增加的疏水特征和甲酯化賦予的電荷的丟失。因此，這兩個峰的解析指示了這些肽的結構的差異。檢查CID譜鑒別出所述肽是曱酯化的，但在不同殘基上(圖3C和D)。因為沒有觀測到在兩個殘基上都具有曱酯的肽，所以這些肽的出現最有可能是由csPCNA的異質群體的分析產生。觀測到的修飾物質的異質性和低百分率有可能是曱酯修飾自身的易變性的結果。某些報道指出，蛋白甲酯化修飾在中性和堿性溶液中是短暫的。因此，蛋白曱酯和存在于csPCNA上的那些甲酯一樣，可自發水解，剩下未修飾的殘基和甲醇。另外，SDS-PAGE的堿性和氧化條件也可導致PCNA失去甲酯，將高度曱酯化形式的PCNA—堿性PCNA同種型解析至其堿性pl的嘗試似乎表現出向更酸性pl的自發回歸(圖4)。高水平的甲酯可能引起PCNA向堿性pI聚焦，如在圖4中的免疫印跡所示(約pH8.8-9.0)。但是，此同種型的聚焦可能是不均一的(有條紋)，可能以較低密度存在。此同種型解析處的堿性pH可能對保持蛋白上的所有曱酯化沒有幫助。在該凝膠上觀察到的不能于特定pl聚焦(圖4)可能歸因于一種或多種甲酯由于聚焦于堿性pH而伴發的缺失。甲酯出現自發水解，釋放甲醇和未修飾的氨基酸側鏈。通過此"堿性水解"再生酸性側鏈可能引起PCNA的pl由堿性pl遷移至更酸性的pl,這由PCNA向凝膠的更酸性一側(pH7)累積得以證實。甲酯化的鑒別和分析可在使甲酯丟失最小化的條件下進行。例如，業已描述了一種方法(0'Connor等，Jwa/萬,oc/2em1985,148,79-86)，該方法描述了使用能夠保護蛋白曱酯的條件的酸性2D-PAGE。但是，存在的許多識別PCNA的蛋白酶在中性至堿性pH有活性，并且相當大量的甲酯化有可能會在消化過程中丟失。在完整細胞或提取物中，負責甲酯化的一種或多種酶可能有活性，可修飾由于自發水解而失去曱酯的殘基。PCNA與負責甲酯化的酶的分離以及在支持水解的條件(例如7.0以上的pH)中溫育可導致失去一個或多個曱酯。例如，可通過在樣品處理和分析過程中保持稍微酸性的條件使甲酯的這種丟失最小化。表I.多種蛋白的甲酯化狀態的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>a:在圖1A中標識蛋白斑點位置。b:清楚顯示出在天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基上的+14質量位移的肽。c:通過將鑒別出的氨基酸殘基數除以蛋白中的總殘基數計算序列覆蓋。表II:多種csPCNA衍生肽的甲酯化狀態<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>a:所示的肽修飾為氧化的曱硫氨酸(M。)、脲甲基半胱氨酸(Cca)、甲酯化谷氨酸(Em)和曱酯化天冬氨酸(Dm)。b:通過將甲酯化肽的峰面積除以甲酯化肽和未修飾肽的組合峰面積計算曱酯百分率。c:Mascots得分報告為-101og(P)，其中P是匹配為隨機事件的概率。d:相比于LCQAdvantage使用LCQDECAXP產生的數據。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>權利要求1.一種檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細胞核抗原(csPCNA)同種型的方法，所述方法包括在疑似含csPCNA同種型的樣品中檢測在csPCNA同種型的一個或多個氨基酸殘基上含甲酯的翻譯后修飾；并通過比較csPCNA同種型和非惡性PCNA同種型上的甲酯水平確定csPCNA同種型的存在情況。2.權利要求1的方法，其中所述生物樣品是體液。3.權利要求l的方法，其中所述體液選自血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。4.權利要求l的方法，其中所述生物樣品是組織樣品。5.權利要求1的方法，其中所述組織選自乳腺、前列腺、肺、結腸、上皮、結締組織、子宮頸、食道、腦、胸腺、曱狀腺、胰腺、睪丸、卵巢、腸、膀胱、胃、軟組織瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盤、纖維性組織、胚細胞組織及其提取物。6.權利要求l的方法，其中所述甲酯存在于天冬氨酸上。7.權利要求l的方法，其中所述曱酯存在于谷氨酸上。8.權利要求1的方法，其中所述甲酯存在于csPCNA同種型上的16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的一個或多個上。9.權利要求8的方法，其中所述曱酯存在于16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的一個或多個上，所述16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基對應于csPCNA同種型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。10.權利要求8的方法，其中所述甲酯存在于16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的一個或多個上，所迷16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基對應于具有修飾的氨基酸殘基的肽，所述肽選自MFE^AR;IEJ)EEGS;IEDEEmGS;VSDYEmMK;MPSGEmFAR;LSQTSNVDJC;CAGNEmDIITLR;FSASGEmLGNGNIK;AEDNADTLALVFEAPNQEmK;A^DNADTLALWEAPNQEK;AEDraNADTLALWEAPNQEK;AEDNADTLALVFE加APNQEK;LMDmLDVEQLGIPEQEYSCWK;ATPLSSTVTLSMSADWLWEmYK;和LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR,其中Em代表甲酯化谷氨酸殘基，Dm代表甲酯化天冬氨酸殘基。11.權利要求l的方法，其中所述csPCNA同種型的檢測使用質譜分析進行。12.權利要求11的方法，其中所述質譜分析是液相色譜(LC)質譜(MS)分析。13.權利要求ll的方法，其中與對應的未修飾肽相比，csPCNA衍生肽的質譜分析產生14Da的質量位移。14.一種診斷或預后惡性胂瘤的方法，所述方法包括通過鑒別區分csPCNA同種型和非惡性PCNA(nmPCNA)同種型的csPCNA同種型的翻譯后修飾狀態檢測癌癥特異性增殖細胞核抗原(csPCNA)同種型；并基于生物樣品中的csPCNA的檢測情況診斷惡性腫瘤。15.權利要求14的方法，其中所述翻譯后修飾是甲酯化。16.權利要求15的方法，其中所述甲酯化存在于csPCNA同種型上的16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的一個或多個上。17.權利要求14的方法，其中所述翻譯后修飾包括測定csPCNA同種型和nmPCNA同種型的甲酯化水平。18.權利要求16的方法，其中所述曱酯存在于16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的一個或多個上，所述16個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基對應于csPCNA同種型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。19.一種修飾的增殖細胞核抗原(PCNA)肽，所述肽包含選自以下的氨基酸序列MFEmAR;IEmDEEGS;IEDEEraGS;VSDYEJMK;MPSGEmFAR;LSQTSNVDmK;CAGNEraDIITLR;FSASGEJLGNG離；AEDNADTLALWEAPNQEmK;AEmDNADTLALWEAPNQEK;AEDmNADTLALWEAPNQEK;AEDNADTLALWEmAPNQEK;LMDJLDVEQLGIPEQEYSCWK;ATPLSSTVTLSMSADVPLWEmYK;和LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR,其中Em代表曱酯化谷氨酸殘基，Dm代表曱酯化天冬氨酸殘基。20.權利要求19的修飾的肽，其中所述肽被翻譯后修飾。21.權利要求19的修飾的肽，其中所述肽經受蛋白酶消化步驟。22.權利要求19的修飾的肽，其中所述肽是合成的。全文摘要公開了通過鑒別一種或多種翻譯后修飾檢測csPCNA同種型的存在情況的方法和組合物。公開了通過翻譯后修飾(包括甲酯化水平)鑒別csPCNA同種型的方法。文檔編號G01N33/50GK101258161SQ200680030926公開日2008年9月3日申請日期2006年6月26日優先權日2005年6月27日發明者D·J·赫爾茨,L·H·馬卡斯,R·J·希基申請人:印第安納大學研究及科技有限公司
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