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專利名稱：：雞傳染性法氏囊抗體免疫膠體金快速檢測試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。具體地講,本發明用于檢測雞血清中傳染性法氏囊抗體以確定被檢雞是否感染過雞傳染性法氏囊病毒或免疫過的雞體內是否產生了相應的抗體。
背景技術：
：傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病。IBDV主要影響法氏囊(bursaoffabricius，BF)B淋巴細胞的分化，導致不同程度的免疫抑制，從而增加對并發性或繼發性病毒和細菌感染的易感性。進而，給養禽業造成很大的損失。而對雞傳染性法氏囊血清抗體的監測和檢測仍停留在原有的經典方法上，如瓊脂擴散試驗(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)和病毒血清微量中和試驗等，這些方法有的耗費時間長(如瓊脂擴散試驗需2448小時；ELISA試驗需35小時等)，有的需要昂貴的儀器設備和繁瑣的操作步驟，只能在實驗室完成，不便于適時和快速診斷。免疫層析(immunochromatography)是出現于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法，該方法的核心技術是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細管作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發生高特異性、高親和性的免疫反應。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonado加pininurine.ClinChem.1990,36,1586)。層析過程中，金標記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體發生特異性的免疫反應而被截留，進一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的。這種方法對所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據這種原理，已經研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測試紙條。在人醫應用方面，國內外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細菌、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病標志物、藥物以及其他一些蛋白質等方面應用了金標免疫層析試紙條。在獸醫應用方面，例如在豬瘟、犬細小病毒病等方面也應用了金標免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測方面，中國發明專利(專利申請號99101537.1)，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應用，但該發明的要點是針對畜禽疫病病原的檢測，并未涉及對雞傳染性法氏囊抗體的診斷檢測。雞傳染性法氏囊病抗體檢測試劑盒實用新型專利申請(專利申請號02203069.7)為ELISA方法，且未公開其采用的生物材料樣品，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，本領域的技術人員無法實施該發明并達到該發明所示的效果。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術缺陷。其第一個目的是組裝一種用于檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒；第二個目的是本發明的試劑盒在雞傳染性法氏囊抗體檢測中的應用。本發明的總體技術路線圖見圖1所示。本發明是這樣實現的本發明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結構圖如圖2、3所示)是本發明的試劑盒的核心，由試紙條與測試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(NC膜)(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成。的金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細胞系BDRPDP已經公布在本申請人在先授權的專利文獻中，專利號ZL200510011521.8，該雜交瘤細胞系的己于2005年3月17日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(3)上包被有重組VP2蛋白構成的檢測線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構成的質控線(C線)(6)將試紙條裝入測試卡(8)中構成試紙卡。對于雞傳染性法氏囊病毒抗體檢測試劑盒，重組蛋白為雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原(VP2蛋白)，樣品稀釋液分別為0.8%氯化鈉溶液。所述硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊、金標墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購自Millipore公司。所述親和層析柱購自AmershamBiosciences公司。本發明所述的重組VP2蛋白是由本申請人:制備的大腸桿菌(^c力eric/^'aco力')BL21(DE3)plysS/pKG-VP2所表達的，包含該重組質粒的大腸桿菌已于2007年12月20日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCN0:M2072(M。本發明的原理是選用親和層析純化的雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原VP2蛋白作為檢測線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002,40(3):255-258)來檢測被檢血清中是否含有雞傳染性法氏囊抗體。檢測時，樣品中所有的雞血清IgG分子的Fc片段先和金標記抗雞IgGFc段單克隆抗體結合，形成金標記單克隆抗體與雞血清IgG的復合物，由于毛細管作用，反應復合物沿NC膜向前泳動。若樣品中有抗雞IBD的特異性抗體，到達檢測線時，遇到包被在檢測線上的重組VP2蛋白，就會形成重組VP2蛋白-抗雞IBD的特異性抗體-金標記單克隆抗體-雞血清IgG的復合物，從而富集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；不是抗雞傳染性法氏囊的非特異性抗體形成的抗體-金標記單克隆抗體復合物則會通過檢測線，到達質控線時與包被在質控線上的兔抗鼠IgG二抗結合，從而富集在質控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽性結果。若樣品中不含雞傳染性法氏囊病毒抗體，反應復合物到達檢測線時，反應復合物就不會與包被在檢測線上的重組蛋白結合，從而越過檢測線，到達質控線時與包被在質控線上的兔抗鼠IgG二抗結合，從而富集在質控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結果。本發明優點1、本發明的優點之一是生物安全性髙。本發明所涉及到的表達載體pGEX-KG是分子生物學中常用的表達載體，沒有生物危險性，在此基礎上構建的表達載體pKG-VP2也沒有任何生物危險性。重組大腸桿菌BL21(DE3)plysS/pKG-VP2是將表達載體pKG-VP2轉化至分子生物學中常用的大腸桿菌BL21感受態細胞后經氨芐青霉素與氯霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險性。本發明中的試紙條檢測線包被的是本發明制備的雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原VP2蛋白，制備過程中不涉及雞傳染性法氏囊活病毒，因此沒有雞傳染性法氏囊活病毒逃逸、擴散的潛在危險。2、本發明的優點之二是生產成本低。本發明所提供的試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc單克隆抗體與雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原(VP2蛋白)。抗雞IgGFc單克隆抗體可以通過將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細胞系(專利號ZL200510011521.8，保藏編號為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過經濟的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。VP2蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21(DE3)plysS/pKG-VP2在體外得到大量的表達，適合大規模的生產。3、與己公開的用于雞傳染性法氏囊病毒抗體檢測的ELISA方法相比，本發明的試劑盒具有許多ELISA方法所不能比擬的優點，如檢測快速(1015min);不需要任何特殊儀器設備，可用于現場操作；操作簡便，只需一步反應，不需由專業人員操作；檢測成本低；檢測過程中只需一種試劑(0.8%氯化鈉溶液)，對人體無危害，對環境無污染；儲存方便，對溫度要求不高，在4'C下有效保存期可達一年；在室溫下可保存六個月(表l)。表1本發明的試劑盒與已公開的ELISA方法的比較ELISA方法(現有技術)本發明方法(膠體金免疫層析方法)特異性強，靈敏度高特異性強，靈敏度高檢測時間長(24h)檢測快速(10min)需要酶標儀等設備，不適合現場操作不需要任何特殊儀器、設備，可用于現場操作操作煩瑣，需要多步反應，需由專業人員操作；操作簡便，只需一步反應，不需由專業人員操作；檢測成本較高檢測成本低檢測過程中需多種試劑，尤其是聯苯—胺(TMB)，有檢測過程中只需一種試劑(8%NaCl)，對人體無危害，害人體，污染環境。對環境無污染。儲存于4'C，室溫保存期很短。儲存方便，對溫度要求不高，在4'C下有效保存期可達一年；在室溫下可保存六個月。:圖l:本發明的總體技術路線圖圖2:本發明試紙卡的側視圖，圖中1、樣品墊(樣品端)；2、為金標墊；3、為硝酸纖維素膜(NC膜)；4、為吸收墊(手柄端)；5、為檢測線，即T線；6、為質控線，即C線；7、為不吸水的支撐薄片條；8、為測試卡；9、為加樣孔。圖3:本發明試紙卡的俯視圖，圖中1、樣品墊(樣品端)；2、為金標墊；3、為硝酸纖維素膜(NC膜)；4、為吸收墊(手柄端)；5、為檢測線，即T線；6、為質控線，即C線；8、為測試卡；9為加樣孔。圖4:發明試紙卡結果判定示意圖，圖中&為陽性結果++++;15性結果+++;。為陽性結果++;d為陽性結果+;e為陰性結果；f、g為試紙卡失效圖5:本發明涉及的VP2重組蛋白表達質粒的物理構建圖具體實施例方式實施例1雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的制備所使用的分子生物學方法參見文獻薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實驗指南，第二版，北京科學出版社，1992年版提供的方法進行。1、VP2基因的克隆與測序本發明所涉及的VP2基因是申請人根據參照GenBank收錄(AJ632141)的IBDV-STC毒株A片段cDNA序列設計一對引物，擴增長度為1.37kb的VP2基因，引物的合成由上海華諾生物科技有限公司完成，引物序列如下上游引物P1:5'-CGGATCCATGACAAACCTGCAAGAT-3'下游引物P2:5'-CCAAGCTTCACAGCTATCCTCCTTAGG-3'取適量傳染性法氏囊病毒(鄭玲燕，傳染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、表達及ELISA抗體檢測方法的建立[D],華中農業大學，2006，中國知網，中國優秀碩士學位論文全文數據庫http:〃dlib.edu.cnki.net/kns50/detail.aspxQueryID=23&CurRec=l)懸液提取RNA，按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.H式劑盒說明書中提供的方法，擴增出DNA，采用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(購買自E.Z.N.AGelExtractionKit公司)回收純化RT-PCR擴增產物，將回收的RT-PCR產物直接與購自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進行連接反應，然后將連接產物轉化到試劑盒(購自TaKaRa公司的商業試劑盒)中感受態細胞大腸桿菌DH5a中，用a互補檢查轉化效果。挑取陽性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實驗指南.第二版，北京科學出版社，1992版)提取重組質粒DNA，并對重組質粒DNA進行鑒定。將鑒定正確的重組質粒命名為pMD-VP2，并送中國上海博亞生物技術公司進行測序，然后將序列測定結果與GeneBank中的有關數據進行同源性比較和分折。2、表達載體pKG-VP2的構建pMD-VP2用HindIII和BamHI酶切后，回收1368bp左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的AmershamBiosciences公司的表達載體pGEX-KG連接，構建表達載體。用重組表達載體轉化新鮮制備的DH5a感受態細胞，并將轉化菌涂布氯霉素和氨芐青霉素(氯霉素25yg/mL，氨芐青霉素60ug/mL)的LB瓊脂平板37'C培養過夜。挑數個單菌落培養過夜后用堿裂解法小量制備質粒，進行酶切分析和PCR擴增鑒定。將得到的陽性克隆質粒命名為pKG-VP2。包含該重組質粒的大腸桿菌co//)BL21(DE3)plysS/pKG-VP2)保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日2007年12月20日；保藏編號CCTCCN0:M207204。對陽性克隆用堿裂解法大量制備質粒DNA，并分裝凍存于-20°C。重組表達質粒pKG-VP2構建流程如圖5所示。3、雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達將構建好的表達質粒pKG-VP2轉入表達用大腸桿菌的感受態細胞^c^r!WH'aco/!'BL21(DE3)plysS(五"hen'cWflco/iBL21(DE3)plysS購自Stratagene公司)中，涂布到含有相應抗生素(氯霉素25yg/mL，氨芐青霉素60yg/mL)的LB平皿上，37。C培養1618h，長出單菌落。挑取數個單菌落于加有相應抗生素(氯霉素25ug/mL，氨節青霉素60Pg/mL)的3mLLB中培養過夜，進行細菌活化。將過夜培養物按l:50的比例稀釋入新鮮的LB培養基中，37'C中振蕩培養(250300rpm)到OD600=0.50.8時，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)，調節搖床溫度為3(TC繼續培養誘導表達6h。4'C條件下8,000卬m離心15min，收集細菌。細菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(即PBS,配方如下140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心棄上清，沉淀用占培養物1/20體積添加有1/100二硫蘇糖醇(DTT)的O.OIMpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，用大超聲頭，設定功率400瓦、90個循環和破碎4秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎至清亮。fC條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清濃縮至體積為5mL,按蛋白純化柱(GlutathioneSepharoseTM4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產品)說明書提供的程序進行親和層析純化，得到純化的VP2蛋白。該蛋白可用于作為檢測雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑。實施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關心等(沈關心等，現代免疫學實驗技術(第二版)[M]，湖北科學技術出版社，2002)等所述方法進行取10.0mL健康Balb/C小鼠血清與等量0.8。/。氯化鈉溶液混合后，逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液20.0mL，使成50%飽和度的(>^4)2804溶液。4°C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL0.8。/。氯化鈉溶液；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33%飽和度的(>14)2804溶液。4'C放置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復進行上述操作后，將沉淀溶于1.0mL0.8。/o氯化鈉溶液(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內用0.8%氯化鈉溶液透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(NH4)2S04是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當體積，4'C下12,000r/min離心10min，取上清，測定蛋白質含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計算Vt=7ir2h(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據樣品的種類，本發明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過程如下-稱取3.0gSephadexG-200倒入數倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存備用。將潔凈的層析柱垂直固定于實驗架上，加少量洗脫液(0.01moI/L,pH7.2PBS)，檢查出液管的通暢性，合格后，關閉出液口。從4。C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內徑相當的濾紙片，O.Olmol/LpH7.2的PBS平衡過夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準備加樣。加樣時，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時，立即關閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙處沿管壁流下，取少許0.8%氯化鈉溶液沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進入柱床且剛出現濾紙時，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時以20%磺基水楊酸液檢測洗出液，當洗出液出現輕微乳濁反應時，立即用已經編號的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測不出渾濁時結束收集。結束收集后，用紫外分光光度計測定每管流出液中蛋白質含量，以EP管編號為橫坐標，管內流出液蛋白質含量為縱坐標繪制曲線圖，根據蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當體積。4'Cl2,000r/min離心10min，收集上清，用紫外分光光度計測定經過濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-20'C凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點注射。免疫3次后，采血檢測血清效價，當血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agargelimmunodiffusion,AGID)簡稱瓊擴試驗)效價達到1:32時，再加強免疫1次，IO天后頸動脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照本實施例步驟1和步驟2的方法進行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發明所需高特異性、高效價的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發明膠體金試紙卡的質控線(C線)。實施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3。/。甲醇(體積比)的0.01MpH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，膜濾過，置4。C備用，有效期一周。1000ml3%甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaCl8g、KC10.2g、Na2HPO4*12H2O2.9g、KH2PO40.2g、甲醇30ml，用雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用本實施例步驟1中的包被緩沖液將VP2蛋白稀釋到600Pg/ml，調整機器，劃線為T線，即為檢測線，T線靠近金標墊端，距金標墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到5010(^g/ml，調整機器，劃線為C線，即為質控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應細致、均勻。37。C烘干，封裝備用。實施例4膠體金、金標記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液(質量體積比)，置4'C備用，有效期四個月。1000mlP/。氯金酸溶液配方10g氯金酸，雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解擰檬酸三鈉，配成1%溶液，0.22Wn膜濾過，現配現用。100ml1%檸檬酸三鈉溶液的配方lg檸檬酸三鈉，雙蒸去離子水定容至訓ml。(3)0.1MoI/L碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22Pm膜濾過，置4'C備用，有效期四個月。1000ml0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀，雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2%PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22Wn膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml2。/。PEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、O.OlMpH7.2PBS溶液，0.22Wri膜濾過，置4'C備用，有效期四個月。1000ml標記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100mlO.OP/。氯金酸加入2mlP/。檸檬酸三鈉，繼續煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3膠體金標記單克隆抗體的制備用0.1Mol/L碳酸鉀調膠體金的pH值至8.2，按810Mg抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為l%(m/V)，靜置1小時。13000rpm、4'C離心30min，棄上清，沉淀用標記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實施例5金標墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、O.OlMpH7.2PBS溶液，0.224m微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標墊的制備將金標墊浸泡于本實施例步驟1中的封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標記抗體均勻的鋪在金標墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4'C備用實施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22tai微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于本實施例步驟l中的封閉液中30min后，于37。C烘干，封裝，置4'C備用。實施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測試卡。每十個一包，加入干燥劑，真空封裝。48t:保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。實施例8快速檢測雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒組成1快速檢測雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關溶液的配制快速檢測雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒的樣品稀釋液樣品稀釋液為0.8%氯化鈉溶液。配制方法8gNaCl，加蒸餾水定容至1000ml。實施例9本發明試劑盒的使用方法-1樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用0.8%的氯化鈉溶液稀釋20倍。2檢測取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100lU制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，1015分鐘內判定結果。3結果判定如圖4所示，當試紙卡出現肉眼可見的紫紅色質控線，沒有出現肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陰性，記為"一"；當試紙卡出現肉眼可見的紫紅色質控線，同時也出現肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陽性，記為"+";檢測線顏色深度與被檢血清中的抗體效價呈正相關，顏色越深說明被檢測樣品的抗體效價越高；檢測線顏色濃厚，與質控線顏色一致或接近時判為++++，顏色深度介于+與++++之間時酌情判++或+++。達到+及以上的顏色深度時，判為該份被檢血清的抗體為陽性。質控線無條帶出現則判為檢測試紙卡失效。實施例10快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩定性考核設計溫度20°C、4°C設計時間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4。C的冰箱內或2(TC室溫中)考核指標敏感性表2本發明試劑盒試紙卡穩定性測試結果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>實施例11快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的制備及應用1快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的制備按實施例1-9的方法制備快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒。2快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的應用2.1雞標準血清的檢測①特異性試驗分別將雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清、雞毒霉形體(MG)陽性血清、雞新城疫(ND)陽性血清、傳染性支氣管炎(IB)陽性血清(購自中國獸醫藥品監察所)、禽流感病毒H5、H9亞型陽性血清、SPF雞血清(購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所)按本發明實施例9所述方法(GICA)進行試驗。結果見表3。表3顯示，本發明的檢測試紙卡與雞傳染性法氏囊陽性血清(IBD)標準陽性血清試驗后，質控線及檢測線均出現明顯的紫紅色條帶；而與0.8%氯化鈉溶液(空白)、雞毒霉形體(MG)陽性血清、雞新城疫(ND)陽性血清、雞滑液支原體(MD)陽性血清雞、傳染性支氣管炎(IB)陽性血清、禽流感病毒H5、H9亞型陽性血清、SPF雞血清。這表明本發明試紙卡特異性高，與雞的其它重要疾病抗體無任何交叉反應。_表3本發明的試劑盒對雞標準血清檢測結果_檢測樣品0.8%SPF雞ND陽性IB陽性H5陽性H9陽性MG陽性IBD陽氯化血清血清血清血清血清血清性血清鈉溶_^_檢測樣品一一—一-一一+H+②敏感性試驗將雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清(購自中國獸醫藥品監察所)分別進行倍比稀釋，最終稀釋度為l:4096，各取100W稀釋好的樣品按本發明方法(GICA)進行試驗。同時，瓊脂擴散法(AGID)(沈關心，周汝麟，現代免疫學實驗技術(第二版)[M]，湖北科學技術出版社，2002)測定雞傳染性法氏囊陽性血清的效價(試驗結果見表4)。結果表明，本發明檢測試紙卡法的靈敏度比瓊脂擴散試驗高128倍。表4本發明試劑盒與常規檢測方法對雞傳染性法氏囊抗體檢測的敏感性試驗結果本發明試劑盒檢測AGID檢測雞IBD標準陽性血清1:40961:322.2送檢雞血清樣品的檢測11從湖北的新洲、江夏及潛江等地的4個雞場共采集216份雞血清，按本發明方法(GICA)進行試驗。同時瓊脂擴散方法(AGID)測定。結果見5。表5顯示，本發明的方法檢出率56.48%(122/216)，AGID法檢出率為28.70%(62/154)，比GICA法檢出率低，是因為GICA法的敏感度比AGID高128倍(4096/32)，使得GICA法陽性時而AGID法陰性，二者的符合率64.81%((54+86)/216，((AGID和GICA同為陽性+AGID和GICA同為陰性)/總樣品數)。表5本發明的試劑盒與常規方法檢測效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>^管本發明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發明范圍的限制，本發明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發明的保護范圍內。權利要求1、一種適用于檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒，它包含盒體、設在盒體內的試紙卡和樣品稀釋液，其特征在于，其中的試紙卡由試紙條與測試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成，所述的金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異VP2抗原蛋白構成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構成的質控線(6)；所述的樣品稀釋液為蒸餾水。2、權利要求1所述的試劑盒在檢測雞傳染性法氏囊抗體中的應用。全文摘要本發明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。公開了一種分別用于快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設在盒體內的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞傳染性法氏囊VP2重組蛋白作為檢測線和包被有抗鼠IgG作為質控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構成。所述的試劑盒檢測相應的抗體具有特異性強、靈敏度高、操作簡便和診斷快速的顯著優點。文檔編號G01N33/577GK101196523SQ20071016910公開日2008年6月11日申請日期2007年12月29日優先權日2007年12月29日發明者梅劉,張展英,張文通,張進良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時,肖運才,胡思順,許青榮申請人:華中農業大學