專利名稱：磷酸化的cop1分子及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于C0P1^JDNA損傷的診斷和治療的領域。
背景技術：
在哺乳動物中，基因組的完整性是維持細胞和組織的動態平衡的先決條 件。因此， 一組專門的蛋白質已經被劃入旨在抵抗潛在基因組擾動的聯盟。 共濟失調性毛細血管擴張癥(A-T)是一種罕見的常染色體隱性疾病，患有該 病的個體帶有細胞水平上的嚴重基因組不穩定性1。共濟失調性毛細血管擴 張癥突變型蛋白質激酶(ATM)中的突變與A-T有關，這暗示ATM是為維持基 因組完整性而構建的DNA損傷應答網絡的重要成分2。 ATM部分地通過磷酸 化關鍵底物而發揮功能，這些底物包括p53、 BRCAl和Chk2。 ATM底物的磷 酸化在DNA損傷后和在腫瘤發生的早期被檢測到9 。
腫瘤抑制物p53參與DNA損傷激活途徑。缺乏p53的小鼠通常發生展現出 非整倍性的淋巴瘤和肉瘤，而僅能夠細胞周期阻滯的帶有突變型p53的小鼠 形成具有雙倍體染色體數目的腫瘤11。 p53通過起到應激激活的轉錄因子的功 能，即誘導一組基因的表達，從而發揮其腫瘤抑制物的特性，這些基因的產 物參與細胞周期阻滯、衰老或凋亡。延緩具有堿基對突變的體細胞的增殖容 許細胞在其自身基因組復制或細胞分裂之前修復此類錯配。ATM直接在N-末端在S15上磷酸化p5312,通過促進轉錄共激活物p300的募集來提高p53靶基 因的反式激活活性13。此外，ATM磷酸化MDM2和MDMX,降低它們負調節 p53的能力14—16。 p53受到E3遍在蛋白連接酶的負調節5，包括在乳腺癌和卵巢 癌中過表達的COP13，4。
發明概述
一方面，本發明提供通過斥企測細胞中的COPl多肽來沖全測包含ATM多肽 的細胞中的DNA損傷的方法，其中C0P1多肽被ATM多肽磷酸化或者相對于 對照來說COPl多肽水平降低指示存在DNA損傷。
ATM多肽可以是人ATM多肽和/或COPl多肽可以是人C0P1多肽。磷酸 化可以是絲氨酸磷酸化。COPl多肽可以用特異性結合COPl多肽(例如包括 與人COPl多肽的氨基酸殘基377-400基本上相同的氨基酸序列的肽或包括與 人COPl多肽的絲氨酸387同源的氨基酸殘基的肽)的抗體來檢測。該肽中與 人C0P1多肽的絲氨酸387同源的可磷酸化的氨基酸殘基可以被磷酸化。
該方法可以進一步包括檢測ATM多肽，其中COP 1分子結合ATM分子指 示存在DNA損傷，和/或可以進一步包括檢測COPl E3連接酶活性的激活、 COP1自我遍在蛋白化的激活、p53-COPl復合物的破壞、COPl依賴性p53遍 在蛋白化的下降、COPl的細胞質-細胞核比例的提高、COPl多肽的周轉 (turnover),或COPl多肽的降解，和/或可以進一步包括"險測細胞中的p53分子， 其中相對于對照來說p53分子表達水平的上升或p53活性的升高指示存在 DNA損傷。p53分子可以是人p53分子和/或野生型p53分子。p53分子可以是 p53多肽。p53多肽可以用特異性結合p53多肽的抗體來檢測。p53活性可以是 激活p53依賴性反式激活、激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、-秀導p21啟動 子、提高p21 mRNA的水平、或誘導尸t/M4啟動子。
DNA損傷可能由輻射引起(例如致電離輻射或紫外線輻射、或放療)， 或者由化學化合物引起(例如烷化劑諸如化療劑)。細胞(例如癌細胞，諸 如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌或移行細胞癌的細胞)可能存在DNA損傷 或者存在發生DNA損傷的風險。癌細胞可以從受試者(例如人)中獲得，該 受試者正在接受癌癥治療或者已經暴露于輻射或化學化合物，該暴露可導致 DNA損傷。癌癥治療可以是已知或懷疑會導致DNA損傷的。
另 一方面，本發明提供通過將細胞暴露于增強COPl多肽降解的化合物 來增強細胞中對DNA損傷的應答的方法。化合物可以包括ATM分子，諸如已 活化的ATM多肽。化合物可以增強COPl多肽與ATM多肽結合或者增強ATM 多肽磷酸化COPl多肽。
另 一方面，本發明提供通過將COPl多肽和ATM多肽與增強COPl多肽結 合ATM多肽的化合物接觸來增強COPl多肽與ATM多肽相互作用的方法。
在其它實施方案中，該方法可以進一步包括確定該結合是否會導致降解
COPl多肽、激活COPl E3連接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、破壞 COPl-p53復合物、降低COPl依賴性p53遍在蛋白化、提高COPl多肽的細胞 質/細胞核比例、或提高p53分子的表達水平的步驟。接觸可以增強細胞中對 DNA損傷的應答，諸如存在DNA損傷或者存在發生DNA損傷的風險的細胞 (例如A-T細胞或癌細胞)。對DNA損傷的應答包括細胞凋亡或p53激活。p53 激活可以是激活p53依賴性反式激活、激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、 誘導p21啟動子、或誘導尸t/M4啟動子。COPl多肽可以是人COPl多肽和/或 ATM多肽可以是人ATM多肽。
本發明設想了如下化合物，其可以增強與人C0P1多肽的絲氨酸387同 源的氨基酸殘基的磷酸化；和/或增強人COPl多肽的絲氨酸387的磷酸化。
本發明還提供COPl多肽或其片段，包括具有與人COPl多肽的絲氨酸 387同源的殘基的多肽；包括與人COPl多肽的氨基酸殘基377-400基本上相同 的序列的多肽；在能夠被磷酸化的氨基酸殘基(例如與人COPl多肽的絲氨 酸387同源的殘基)上具有磷酸化的多肽；包括用蘇氨酸、谷氨酸或天冬氨 酸替代與人COPl多肽的絲氨酸387同源的殘基上的絲氨酸的COPl多肽；及 COPl模擬化合物。在一個實施方案中，該多肽包括在S387上包含變為其它 殘基的殘基變化的COPl多肽序列。
另 一方面，本發明提供一種用于鑒定增強包含ATM分子的細胞中對DNA 損傷的應答的化合物的方法，該方法在適合促進細胞中DNA損傷的條件下在 存在或缺乏測試化合物時溫育COPl多肽，并確定存在測試化合物時COPl多 肽的降解是否被增強，其中增強COP 1多肽降解的化合物是增強對DNA損傷 的應答的化合物。該確定可以相對于對照來進行。ATM分子可以是能夠磷酸 化COPl多肽的。
在其它實施方案中，該方法進一步包括確定該化合物是否增強激活 COP1 E3連接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、破壞COPl-p53復合物、 降低COPl依賴性p53遍在蛋白化、提高COPl多肽的細胞質/細胞核比例、提 高p53活性、或提高p53分子表達水平的選項，其中此類增強指示該化合物是 增強對DNA損傷的應答的化合物。p53活性可以是激活p53依賴性反式激活、 激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、誘導p21啟動子、或誘導PUMA啟動子。 適合促進DNA損傷的條件可以是輻射。對DNA損傷的應答可以包括細胞凋
亡或p53激活。
另 一方面，本發明提供用于鑒定能增強COPl多肽與ATM多肽的相互作 用的化合物的方法，該方法在存在或缺乏測試化合物時將C0P1多肽與ATM 多肽一起溫育，并確定測試化合物是否增加或穩定COPl多肽結合至ATM多 肽，其中增加或穩定COPl多肽結合至ATM多肽的測試化合物是能增強COPl 多肽與ATM多肽的相互作用的化合物。
在其它方面，本發明提供基本上由與人COP 1的氨基酸殘基377-400基本 上相同或同源的氨基酸序列組成的分離的肽，或基本上由圖6中所示的氨基 酸序列組成的分離的肽。在其它實施方案中，該肽可以包含SQ基序中的絲氨 酸上的替代(例如天冬氨酸或谷氨酸替代)。
在其它方面，本發明提供包含與人C0P1多肽的S387同源的磷酸化的分 離的或重組的被磷酸化的COP 1肽，或在與人COP 1多肽的S387同源的氨基酸 殘基上包含天冬氨酸或谷氨酸替代的分離的或重組的COPl肽，或COPl模擬 化合物。
在其它實施方案中，本發明提供編碼按照本發明的肽或模擬物的核酸分 子。該核酸分子可以包含在載體中，被可操作地連接至啟動子。該載體可以 進一步包含可操作地連接至啟動子的ATM核酸分子。該載體可以在宿主細胞 中。
在其它方面，本發明提供一種抗體或其它試劑，其特異性結合與人COPl 的絲氨酸387同源的氨基酸殘基被磷酸化的氨基酸序列。在其它實施方案中， 本發明提供編碼該抗體的核酸分子；包含該核酸分子的載體，該核酸分子可 操作地連接至啟動子；包含該載體的宿主細胞；和/或包含該抗體以及用于說 明如何檢測細胞中的被磷S臾化的COPl分子的說明書的試劑盒。
在其它方面，本發明提供用于調控受試者中對DNA損傷的應答或p53活 性的藥用組合物，包括包含本文所述多肽、肽或模擬物或者編碼該多肽或肽 序列的核酸的組合物。
在其它方面，本發明提供哺乳動物細胞，其包含編碼COPl分子的重組 核酸分子和編碼ATM分子的重組核酸分子。該哺乳動物細胞可以進一步包含 編碼p53分子的重組核酸分子。ATM分子可以是被激活的和/或COPl分子可 以是組成性被磷酸化或未磷酸化的(例如由于在S387上的突變)。
本發明還提供用于治療需要該治療的受試者中的DNA損傷或癌癥的方
法，該方法包括給該受試者施用治療有效量的本發明的肽或模擬物。另外，
本發明提供用于治療需要該治療的受試者中的DNA損傷或癌癥的方法，該方 法包括給該受試者施用治療有效量的化合物或編碼多肽的核酸，其中該化合 物或多肽增強COPl多肽結合至ATM多肽或者增強ATM多肽磷酸化所述的 C0P1多肽。按照一個實施方案，該化合物或多肽特異性結合COPl。按照另 一個實施方案，該化合物或多肽特異性結合ATM。按照又一個實施方案，該 化合物或多肽特異性結合未被磷酸化的COPl。按照又一個實施方案，該化 合物以有效增加具有DNA損傷的細胞或癌中的COPl多肽磷酸化的量施用。
本發明提供通過本發明的方法鑒定的化合物。另外，本發明提供本發明 的肽、模擬物、核酸及化合物在制備用于治療受試者中的DNA損傷或癌癥的 藥物中的用途。
附圖簡述
圖1A-E證明C0P1在IR后被周轉并且依賴于S387。 A，在暴露于IR時， C0P1的穩態水平下降。B，在暴露于IR時，C(9尸/mRNA水平未降低，但升 高了 。 C,根據環己酰胺(cyclohexamide)脈沖追蹤術(pulse-chase)的評價，COP1 在IR^被周轉。D, COPl上的潛在SQ基序。E， COPl-S387A對暴露于IR時
的降解有抗性。
圖2A-K證明ATM負調節COPl 。 A,內源ATM可以在體外磷酸化含有S387 的COPl GST肽。B， ATM在體內磷酸化S387。 C， COPl在體內與ATM相互 作用，并且在DNA損傷后被增強。D， COPl的穩態水平下降依賴于ATM。 E, IR^S387上的COPl磷酸化依賴于ATM的激酶活性。F,夕卜源ATM促進Saos-2 細胞中的COPl的穩態水平下降。G, ATM誘導COPl下降受26S蛋白酶體的介 導。H， ATM促進激酶依賴性方式的COPl遍在蛋白化。I, COP1-C136/139S RING突變體對ATM誘導的降解有抗性。J， S387上的磷酸-模擬物在體外促 進COPl的自我遍在蛋白化。K， COPl-S387D展現出增強的周轉能力。
圖3證明ATM促進COPl定位至細胞質。A,在DNA損傷后，COPl以ATM 依賴性方式定位至細胞質。B, COP1-S387D主要定位至胞質區室。
圖4A-I證明S387上的ATM修飾消弱p53的COPl負調節。A, B COPl與p53 相互作用在暴露于DNA損傷時被削弱。C, COPl-S387D結合p53的效率不太 高。D, p53展現出在體外結合COPl-S387D的能力下降。E， S387D突變抑制
COPl在體外遍在蛋白化p53。 F， COPl-S387D降解p53的效率不太高。G， COPl-S387D抑制p53依賴性反式激活的效力不太高。H， C0P1-S387D不能 負調節p53腫瘤抑制物功能。I,關于p53軸的ATMDNA損傷應答途徑的模型。
圖5證明全長COP 1上的S3 87是體外ATM磷酸化的主要位點。
圖6證明在哺乳動物直向同源物中，S387上的COPl SQ3是高度保守的。
圖7顯示pS387 COPl抗體的ELISA表征。將lng各種肽包被到ELISA平板 上，加入不同濃度的pS387抗體。用HRP二抗和ECL檢測結合肽的抗體。
圖8用體外激酶測定法來表征pS387抗體。在存在和缺乏指定抑制劑時， 將FL AG-ATM與GST-COP 1或GST-COP 1 -S3 87A—起溫育。
圖9證明在Saos-2中共轉染ATM時，內源COPl的穩態水平下降。用10ug ATM或ATM-KD轉染24小時，并通過western印跡評價水平。
圖10顯示從HEK293T純化的FLAG-COP1-WT、 FLAG-COPl-S387D、及 FLAG-COP 1 -RINGmt的SDS-PAGE的Imperial染色。
圖11證明在IR處理后，COPl定位于細胞質。在用10GylR處理后H1299 細胞中的所轉染FLAG-COP1的免疫熒光揭示了大比例的COP 1定位于細胞 質，而損失細胞核的COPl部分。通過曱醇固定和生物素-鏈霉親合素放大法 進行免疫熒光，在Zeiss Axiovert 200M顯微鏡下使用Cy5濾光器(filter cube)進 行檢測。用帶有DAPI的Vectashield (Vector Laboratories)染色DNA。
發明詳述
本發明部分地證明，在DNA損傷或者染色質結構發生改變后，ATM與 COPl相互作用并磷酸化COPl 。由ATM引起的此類共價修飾破壞COPl-p53 復合物，并且抑制由COPl引起p53腫瘤抑制物的遍在蛋白化、降解和負調節。 而且，COPl發生磷酸化占用了E3自我降解機制，從而將COPl從反式遍在蛋 白連接酶活性轉變為順式遍在蛋白連接酶活性，這是通過磷酸化活化 RING-E3連接酶的首個例子。COPl發生磷酸化還提高了COPl的細胞質/細胞 核定位比例。如此，ATM磷酸化COPl或者COPl降解都導致COPl負調節p53 依賴性腫瘤抑制物功能的能力下降。不受特定假設的限制，ATM磷酸化COPl 或者COPl降解可以進一步解釋在A-T患者中p53途徑對基因組異常的應答顯 著延遲的原因(圖41)。
因而，ATM磷酸化COPl或者COPl降解可用于檢測DNA損傷。
本說明書描述了本發明的各種可選實施方案和實施例。這些實施方案和 實施例用于闡述目的，而不應解釋為限制本發明的范圍。
DNA損傷
"DNA損傷，，是指通過對DNA進行共價修飾或者使其偏離正常的雙螺 旋構象，對DNA造成的、影響DNA的正常功能的傷害。DNA損傷包括干擾 復制和轉錄的結構畸變，以及可破壞堿基對和可改變DNA序列的點突變。通 常，當細胞發生DNA損傷時，細胞周期阻滯在兩個檢查點(G1/S或G2/M) 之一上。細胞周期阻滯會導致DNA修復程序激活(在發生相對較小DNA損 傷的情形下)，或者導致誘導凋亡(在發生災難性DNA損傷的情形下)。
DNA損傷可由內源過程自發引起，諸如由正常代謝產生的反應性氧和自 由基引起的堿基氧化和DNA鏈斷裂、堿基曱基化、脫嘌呤(例如由于DNA 在水中的反應)、脫嘧啶、在DNA復制過程中由DNA聚合酶引起的錯配等。 DNA損傷還可由環境損害引起，諸如輻射(例如紫外線輻射、X射線、伽馬 射線、致電離輻射)、天然毒素(例如植物毒素)、合成毒素、藥物(例如癌 癥化療、放療)、烷化劑等。
DNA損傷可導致多種病癥或者可由多種病癥引起，包括遺傳性遺傳病癥 和暴露于環境損害而引起的病癥。其中DNA損傷作為并發因素的病癥包括共 濟失調性毛細血管擴張癥(A-T),也稱作為路易斯-巴爾綜合征(Louis-Bar syndrome或小月畝-目艮皮月夫毛纟田血管才廣 長癥(cerebello-oculocutaneous telangiectasia)、著色性干皮病(Xeroderma pigmentosa)、柯克凱內氏綜合征 (Cockayne's syndrome)、毛發低疏營養不良(trichothiodystrophy)、范康尼氏貧 血(Fanconi's anaemia)、布盧姆氏綜合征(Bloom's syndrome)、和阿耳茨海默氏 病(Alzheimer's disease)。 DNA損傷還可能由吸煙引起，導致例如心臟病，或 者由于其它疾病諸如癌癥的治療引起。
癌癥
"癌癥"、"贅生物"、"瘤形成"、"癌"或"腫瘤"是指不提供生理功能 的任何不期望的細胞生長。通常，贅生物或癌的細胞，如贅生性細胞，已經 不受正常的細胞分裂控制，即，細胞的生長或增殖不受細胞環境中的普通生 物化學和物理影響的調節，并展現出不受調節的生長、局部組織侵入、轉移等等的特性。 一般地，贅生性細胞增殖而形成良性或惡性細胞的克隆。因此，
生長。"惡性"是指任何細胞類型或組織的異常生長或增殖。當與同類型的 正常細胞或組織相比時，惡性細胞或組織可能抑制退行發育或者喪失分化/ 定向，并可能展現出侵入和轉移的能力。
大多數癌癥屬于三種廣泛的組織學分類癌，其是主要的癌癥，是上皮 細胞或者覆蓋在器官、腺體或其他身體結構(例如皮膚、子宮、肺、乳腺、
前列腺、胃、腸)的外部或內部表面的細胞的癌癥，并且其趨向于轉移；肉 瘤，其衍生自連接性或支持性組織(例如骨、軟骨、腱、韌帶、脂肪、肌肉)； 和血液學肺瘤，其來自骨髓和淋巴組織。癌可以是腺癌(其一般在能夠分泌 的器官或腺體中發生，諸如乳腺、肺、結腸、前列腺或膀胱)或者可以是鱗 狀細胞癌(其源于扁平上皮并一般在身體的大部分區域中發生)。肉瘤可以 是骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)、軟骨肉瘤(軟骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、 橫紋肌肉瘤(骨骼肌)、間皮肉瘤或間皮瘤(體腔的膜性內層)、纖維肉瘤(纖 維組織)、血管肉瘤或血管內皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪組織)、膠質瘤 或星形細胞瘤(腦中發現的神經原性結締組織)、粘液肉瘤(原始的胚性結 締組織)、間充質或混合型中胚層腫瘤(混合型結締組織類型)。血液學腫瘤 可以是骨髓瘤，其源于骨髓中的漿細胞；白血病，其可以是"液體癌"并且 是骨髓的癌癥，可以是髓細胞性或粒細胞性白血病(髓樣的和粒細胞的白血 球)，淋巴性、淋巴細胞性或成淋巴細胞性白血病(淋巴樣的和淋巴細胞的 血細胞)例如急性成淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性單核細胞 白血病、急性前髓細胞白血病、慢性髓細胞白血病等，或者真性紅細胞增多 或原紅細胞增多(erythremia)(各種血細胞產物，但是主要是紅血球)；或者 淋巴瘤，其可以是實體瘤并且其在淋巴系統的腺體或結中發生，其可以包括 何杰金(Hodgkin)或非何杰金淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma) 等。此外，還存在混合型癌癥，諸如腺鱗癌、混合型中胚層腫瘤、癌肉瘤或 畸胎瘤。
癌還可以根據它們的發源器官，即"原發性位點，，來命名，例如，乳腺、 腦、肺、肝、皮膚、前列腺、睪丸、膀胱、結腸和直腸、子宮頸、子宮等的 癌。即使癌癥轉移到不同于原發性位點的身體的另外部位時，也保留此類命 名，根據本發明癌癥包括原發性癌癥，以及已經轉移的癌癥。
根據原發性位點命名的癌癥可以與組織學分類相關。例如，肺癌一般是
小細胞肺癌或非小細胞肺癌，其可以是鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞癌；皮膚
癌一般是基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑素瘤，例如惡性黑素瘤。淋巴瘤可以 在與頭、頸和胸相關的淋巴結中，以及在腹部淋巴結或在腋窩或腹股溝淋巴 結中出現。癌癥的類型和階段的鑒定和分類可以通過使用例如國家癌癥學會
(http:〃seer.cancer.gov/publicdata/access.html )的Surveillance, Epidemiology and End Results ( SEER，即監偏^、流行病學和最終結果)程序(其是美國關 于癌癥發生和存活的權威信息來源，并且是全世界公認的)提供的信息來進 行。SEER程序的發生率和存活率數據可用于獲取特定癌癥位點和階段的標 準存活率。例如，為了確保最佳的比較組，可以從數據庫中選擇特定的標準， 包括診斷的日期和確切的分期。癌癥的鑒定還可以通過^f吏用例如診斷手冊諸 如The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 第17版，M.H. Beers和R. Barkow編，John Wiley and Sons, 1999中提供的信息來進行。
癌或贅生物的例子還可以包括但不限于本領域已知的轉化的和永生化 的細胞、實體瘤、髓性增殖性疾病(myeloproliferative diseases)、母細胞瘤、 鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺 癌、肺的腺癌和肺的鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、 胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、 乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、漿液性腺癌、 子宮內膜樣腺癌、透明細胞腺癌、粘液腺癌、伯倫納瘤(Brenner tumor)、畸 胎瘤、無性細胞瘤、絨毛膜瘤、纖維瘤、粒層細胞瘤、塞-萊二氏細胞瘤 (Sertoli-Leydig cell tumor)、未分化的卵巢癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、 外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、膽門癌、陰莖癌、頭和/頸癌、尤因氏肉瘤(Ewing，s sarcoma)、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi，s sarcoma)、月旨肪肉瘤、周圍神 經上皮瘤、滑膜肉瘤、何杰金氏病(Hodgkin，sdisease)等，正如本領域知道的。
多肽、核酸分子、和化合物
按照本發明的化合物包括但不卩艮于COP 1或ATM的核酸分子、多肽和/或 其同種型(isoform)、變體、模擬物、同系物、類似物或片段。在有些實施方 案中，本發明還使用p53、 p21、和其它核酸分子、多肽和/或其同種型、變體、 模擬物、同系物、類似物或片段。
COPl化合物
"C0P1分子"在本文中指與以下各項基本上相同的分子COPl多肽； 編碼C0P1多肽的核酸分子；CO尸7核酸分子；及其同種型、變體、模擬物、 同系物、類似物或片段。C0P1分子可以包括但不限于包含與以下各項登記 號所示序列基本上相同的序列的多肽或核酸分子AF508940 (人)、 AAH82804 (小鼠)、NP—036061 (小鼠)、NP_001001740 (人，同種型d24)、 NP—071902 (人，同種型a )、 XP—468011 (稻((9o^a ra^Va) )、 XP—468010 (稻)、 XP—463866 (稻)、AAM34692 (人)、AAH39723 (人)、BAB45239 (人)、 P_ABG08243 (人)、AAD51094 (小鼠)、^磨553 (油菜北京亞種CSm^/ca sw&; .尸A/"e"^) )、 CAA98718 (啤酒糖酵母)、CAA04168 (擬南芥 (」ra6^ / ^ Aa//awa))、 XM—477896 (稻)、XM—479164 (稻)、BK000438 (人)、AF508940 (人)、AF151110 (小鼠)、L24437 (擬南芥)、P_AAY60008 (人)、P—ABJ19398 (人)、P—ABB11576 (人)、P—ABG95247 (人)、 P—AAW74797 (人)、P—ABP69180 (人)、P—AAB92798 (人)、XP—064815 (人)、和/或P—AAG02591 (人)，及其同種型、變體、才莫擬物、同系物、類 似物或片段。COPl分子可以是在Bianchi等人6、 Wang等人7、或Yi等人"中記 載的分子。
"基本上相同的"序列指這樣的氨基酸或核苷酸序列，其與參比序列的 不同僅有一個或多個保守替代，如本文中所討論的，或者在不破壞所述氨基 酸或核苷酸序列的生物學功能的序列位置上存在一個或多個非保守替代、刪 除或插入。當使用例如Align Program"或FASTA在氨基酸或核香酸水平上與 用于比較的序列進行最佳比對時，這樣的序列可以是從10%到99%的任意數 值，或更一般地至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 55%或60%,或者至少 65%、 75%、 80%、 85%、 90%,或者95%，或者高達96%、 97%、 98%或99% 相同的。對于多肽來說，比較序列的長度可以是至少2個、5個、10個或15個 氨基酸，或者至少20個、25個或30個氨基酸。在其它實施方案中，比較序列 的長度可以是至少35個、40個或50個氨基酸，或者超過60個、80個或100個 氨基酸。對于核酸分子而言，比較序列的長度可以是至少5個、10個、15個、 20個或25個核普酸，或者至少30個、40個或50個核苦酸。在其它實施方案中， 比較序列的長度可以是至少60個、70個、80個或90個核苷酸，或超過100個、
200個或500個核香酸。序列同一性可以使用公眾可獲得的序列分析軟件(例 如Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705的序列分析軟件包或可乂人 National Library of Medicine獲得的BLAST軟件，或者如本文中所描述的)容 易地測量。有用的軟件的例子包括程序Pile-up和PrettyBox。此類軟件通過給 各種替代、缺失、插入及其它修飾賦予同源性程度來匹配相似序列。基本上 相同的序列包括同源序列，諸如本文中所描述的或本領域所知道的來自非人 物種的COPl相關序列。
或者/另外，如果兩條核酸序列在高嚴格性條件下雜交，則它們是"基本 上相同的"。在有些實施方案中，高嚴格性條件是例如容許發生與如下條件 下的雜交具有可比性的雜交的條件，即使用長度為至少500個核苷酸的DNA 探針，在65。C的溫度，在含有0.5MNaHPO4, pH7.2， 7%SDS， ImMEDTA 和1。/。BSA (級分V)的緩沖液中進行雜交，或者在42。C的溫度，在含有48% 曱酰胺，4.8xSSC, 0.2MTris-Cl， pH7.6, lx Denhardt氏溶液，10%碌iJ交右 旋糖苷和0.1% SDS的緩沖液中進行雜交。(這些是用于高嚴格性northem或 Southem雜交的典型條件。)雜交可以執行約20 - 30分鐘、或者約2-6小時、 或者約10-15小時、或者超過24小時或者更久的一段時間。高嚴格性雜交還 依賴于分子生物學家常規實施的許多技術的成就，諸如高嚴格性PCR、 DNA 測序、單鏈構象多態性分析和原位雜交。與northern和Southem雜交相比，這 些技術通常用相對短的探針進行(例如，通常約16個核苷酸或更長的用于 PCR或測序，而約40個核苷酸或更長的用于原位雜交)。用于這些技術中的 高嚴格性條件是分子生物學領域的技術人員所熟知的，其中的例子可見于例 如Ausubel等人8，該文獻在此引入作為參考。
在有些實施方案中，人COP 1分子包括登記號為AF508940中所示的序列， 或其片段。
在有些實施方案中，人COPl核酸分子包括如下的序列或其片段
1 atgtctggta gccgccaggc cgggtcgggc tccgctggga caagccccgg gtcctcggcg
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181 ctcgggggcc cggtgcggcc tgtgttggtg gcgcccgccg tatcgggtag cggcggcggg
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301 ggcagcagct ccagcctagg cagcggcagc aggaagcgac ctctcctcgc ccccctctgc
3 61 aacgggctca tcaactccta cgaggacaaa agcaacgact tcgtatgccc catctgcttt
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481catcagagttta_6Lta_ga_tgtcccaagtgtaactatgttgtggacaatatt
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2161sgtcagggtscaattaaggtgctagaattggtatga
在有些實施方案中，人C0P1多肽包括如下的序列或其片段:
MSGSRQAGSGSAGTSPGSSAASSVTSASSSLSSSPSPPSVAVSA
VKSVLDKDRKEDDTNEFVSAVCWRALPDGESNVL工AANSGGTIKVLELV (絲氨酸387用下劃線示出)
在有些實施方案中，COPl多肽可以包含人C0P1多肽的氨基酸377-400 或其片段。在有些實施方案中，COPl肽可以包括但不限于如下的序列 DSRTASQLDEFC、 SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、或SRTASQLDEF,或者與它們基本上相同 的序列。在有些實施方案中，C0P1肽可以包括但不限于長度為3-20之間任 意數值的氨基酸的氨基酸序列，諸如5個氨基酸、7個氨基酸、IO個氨基酸、 12個氨基酸或15個氨基酸，其中該氨基酸序列包含與人COPl多肽的S387同 源的序列。
在有些實施方案中，COPl多肽能夠直接結合ATM多肽，或能夠直接尋皮 ATM多肽磷酸化。在有些實施方案中，COPl多肽可以包括與本文所示的氨 基酸序列基本上相同的、能夠被ATM磷酸化的分子。在有些實施方案中， COP1多肽可以是在與人COPl多肽的S387同源的殘基上被磷酸化或者能夠 被磷酸化的多肽。與人COPl多肽的S387同源的序列描述在例如圖6中。在有 些實施方案中，COPl分子包括在與人COPl多肽的絲氨酸387同源的氨基酸 殘基上被組成性磷酸化的COPl多肽。在有些實施方案中，COPl分子包括這 樣的COPl多肽，該多肽用人COPl多肽的絲氨酸387替代可磷酸化的氨基酸 殘基。
"被磷酸化的"COPl蛋白或多肽上的任何能夠在體內被磷酸化的氨基 酸殘基(例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸)在翻譯后被修飾。在本發 明內容中，被磷酸化的C0P1多肽一般在與人C0P1多肽的絲氨酸387 (S387 ) 同源的氨基酸殘基上被磷酸化。"不被磷酸化的"COPl多肽上的在體內可被 磷酸化的氨基酸殘基上未被磷酸化，例如，將該殘基突變為不能被磷酸化的 氨基酸。例如，在多肽序列中將絲氨酸突變為丙氨酸，生成在該多肽序列的 特定位置上不能被磷酸化的蛋白質。在與人C0P1多肽的位置387同源的位置 上用丙氨酸替換絲氨酸的COPl多肽就是這樣的"不被磷酸化的，，COPl多肽。 不被磷酸化的COPl多肽還可以是能夠在體內被磷酸化的多肽，例如在S387
上磷酸化，但是由于如下原因未被磷酸化的，例如存在抑制劑，例如激酶抑
制劑，諸如ATM激酶抑制劑；存在干擾磷酸化位點的抗體；或者由于磷酸酶 的活性。"被組成性磷酸化的，，COPl多肽是在與例如人COPl多肽的S387同 源的氨基酸殘基上具有突變的多肽，該氨基酸殘基在體內能夠被^^酸化，其 中該突變模擬磷酸化該殘基，并且所得多肽具有被磷酸化的多肽的生物學活 性。 一般地，將可被磷酸化的殘基突變為谷氨酸或天冬氨酸殘基，導致組成 性磷酸化。在有些實施方案中，被磷酸化的或被組成性磷酸化的C0P1肽可 以具有但不卩艮于如下序歹'J :DSRTA(pS/T/Y/D/E)QLDEFC 、 SRTA(pS/T/Y/D/E)Q 、 RTA(pS/T/Y/D/E)Q 、 TA(pS/T/Y/D/E)Q 、 A(pS/T/Y/D/E)Q、 (pS/TA7D/E)QLDE、 (pS/T/Y/D/E)QLD、 (pS/TA7D/E)QL 、 A(pS/T/Y/D/E)QL 、TA(pS/T/Y/D/E)QLD 、RTA(pS/T/Y/D/E)QLDE 、 SRTA(pS/TA7D/E)QLDEF，其中"pS/TA7D/E，，代表絲氨酸、蘇氨酸或酪氨 酸的磷酸化，或者用可被磷酸化的絲氨酸替代天冬氨酸或谷氨酸。
在有些實施方案中，按照本發明的化合物包括COPl多肽的模擬物。通 常，模擬化合物以COPl多肽為基礎，例如未被磷酸化的或者被磷酸化的 COPl多肽，例如與本文所述肽基本上相同的C0P1多肽或者在與S387同源的 氨基酸殘基上被磷酸化的COPl多肽，并且可以包括具有例如肽樣二級結構 的化合物。模擬化合物可以導致增強C0P1的活性或者選擇性，或者可以展 現出降解特性被降低而延長模擬作用。模擬化合物可以是激動劑或拮抗劑 (抑制劑)。模擬化合物可以包括例如環肽、肽類似物、受約束的肽 (constrained peptide),支架模擬物、非肽模擬物、肽核酸等。模擬化合物可 結合ATM多肽，其結合親和力為0.001pm - luM的任何數值，諸如至少 500nM、 100nM、 10 nM、 lnM、 500pM、 100pM、 10pM等。才莫擬化合物的 分子量可以小于2000Da，例如1500Da、 1000Da或500Da。例示性的COPl模 擬物化合物可以包括但不限于包括如下序列的化合物SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、 SRTASQLDEF,包括其中"SQ"基序中的絲氨酸被磷酸化的或組成性磷酸 化的化合物，和/或其中肽結構或序列被本文所述或本領域所知的方式修飾的 化合物。在有些實施方案中，按照本發明的化合物包括C0P1模擬化合物， 其模擬被磷酸化的COPl分子或其被磷酸化的片段。
在有些實施方案中，按照本發明的化合物包括這樣的抗體或其它試劑 (例如肽抗體(peptibody)),其特異性結合COPl,例如結合被磷酸化的COPl, 例如結合在與人COP 1多肽的絲氨酸387同源的氨基酸殘基上^^皮磷酸化的 COPl肽，或者結合包括如下序列的肽SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、 SRTASQLDEF。 例如，此類抗體可以是多克隆的或單克隆的，或者是人源化的抗體。此類肽 抗體可以是特異性結合融合至免疫球蛋白抗體(例如IgGl-4 )Fc部分的COPl 的肽。"特異性結合"抗原的抗體或其它試劑在識別并結合該抗原時，基本 上不識別和結合樣品中的其它分子。例如，COPl抗體特異性結合COPl分子， 但是基本上不結合任何其它分子，例如存在于癌細胞或組織中或者具有DNA 損傷的細胞中的那些分子。在有些實施方案中，COPl抗體或其它試劑可以 特異性結合人COPl分子，但是不會特異性結合來自其它物種的COPl分子。 在有些實施方案中，COPl抗體或其它試劑可以特異性結合4皮石粦酸化的COPl 分子，但是不會特異性結合未被磷酸化的COPl分子。在有些實施方案中， COPl抗體或其它試劑可以特異性結合在特定氨基酸殘基(例如人COPl多肽 的S387 )上被磷酸化的COPl分子，但是不會特異性結合在其它氨基酸殘基 上被磷酸化的COPl分子。例如，特異性結合抗原的抗體或其它試劑對抗原 的親和力可以比該抗體或試劑對樣品中的其它參照分子的親和力大至少IO 倍、100倍、1000倍或者10000倍。
在有些實施方案中，COPl分子包括COPl核酸分子，其編碼COPl多肽， 或者編碼特異性結合COPl多肽的抗體或其它試劑。
其它化合物
"共濟失調性毛細血管擴張癥突變的"或"ATM分子"在用于本文時指 與以下各項基本上相同的分子ATM多肽；編碼ATM多肽的核酸分子；^r似 核酸分子；及其同種型、變體、模擬物、同系物、類似物或片段。ATM分子 可以包括但不限于包含與以下各項登記號所示序列基本上相同的序列的多 肽或核酸分子Q13315 (人)、NM_007499 (小鼠)、NMJ38292 (人)、 畫—000051 (人)、畫—114689(擬南芥)、BC022307(人)、BC061584 (人)、 XM_777432 (海月旦)、BC007023 (人)、XM—680015 (斑馬魚)、XM_236275 (大鼠)、AAB65827 (人)等。在有些實施方案中，ATM多肽被活化并具有 激酶活性。 一般地，ATM多肽能夠磷酸化野生型COPl分子，或者在與人COPl
多肽的絲氨酸387同源的氨基酸殘基上能夠被磷酸化的COP1分子。例如， ATM激酶活性可以由DNA損傷產生，例如致電離輻射，或者能夠引起DNA 損傷的化學化合物。ATM激酶活性可以如本文所述或者如本領域所知來評 價。在有些實施方案中，ATM分子包括ATM多肽或其片段，其能夠結合和/ 或磷酸化COPl分子。
"p53"是一種有力的腫瘤抑制物蛋白，編碼393個氨基酸的磷蛋白質。 p53在許多癌癥中被負調節或被突變。p53的缺乏或失活可能促發癌癥。存在 極其多種p53突變。"野生型，，p53是在正常的(即非癌性的)細胞中找到的 p53，或者沒有與癌癥相關的突變的p53。樣品的p53狀態(例如樣品是否包 括野生型或突變型p53 )可以通過如例如Vogelstein等人的美國專利No. 6,090,566中所述或者使用標準技術諸如本文所述或本領域所知的來評估。 p53分子可以包括但不限于包含與例如登記號P04637所示序列基本上相同的 序列的多肽或核酸分子。
p21或"WAF1/Cipl"最初被描述為細胞周期蛋白(cyclin)依賴性激酶的 通用抑制劑。它由p53依賴性和p53非依賴性機制誘導，并已經被暗示作為細 胞增殖的抑制劑。
制備多肽、核酸分子、及測試化合物
本領域公知，可以在多肽結構中進行一些修飾和改變而基本上不改變該 肽的生物學功能，從而獲得在生物學上等效的多肽，其具有例如期望的特性， 諸如增強的穩定性等。在本發明的一個方面，本發明的化合物還延伸至生物 學上等效的肽或模擬物，其與本發明的COP 1多肽的 一部分序列因為氨基酸 替代或其它不影響生物學功能的替代而存在差別。
例如，可以如下制備C0P1化合物，在C0P1肽或肽類似物或模擬物的任 何位置上替換、刪除或插入一個氨基酸殘基，例如在與人COPl多肽的絲氨 酸387同源的位置上，用其它保守氨基酸殘基，即具有相似物理、生物學或 化學特性的殘基，例如蘇氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或者用非保守氨基酸殘 基，替換人COPl多肽的絲氨酸387,并對化合物篩選例如結合ATM多肽的能 力、或被已活化的ATM多肽磷酸化的能力、或破壞p53/COPl復合物的能力。 此類化合物可用于本發明的診斷、治療、篩選等任何方法。
在用于本文時，術語"保守氨基酸替代"指在肽的特定位置上用一種氨，其中該替代基本上不會使相關功能喪失。在進行此 類改變時，可以根據側鏈取代基的相似性，例如它們的大小、電荷、疏水性、 親水性等進行相似氨基酸的替代，而且可以通過常規測試來分析此類替代對 肽功能的影響。在有些實施方案中，保守氨基酸替代指用可被磷酸化的氨基 酸，諸如蘇氨酸或酪氨酸，或者用磷酸化模擬物，諸如谷氨酸或天冬氨酸，
替換與人COPl多肽的絲氨酸387同源的氨基酸殘基。
在用于本文時，術語"氨基酸"是指通常在天然存在蛋白質中找到的那些
L-氨基酸、D-氨基酸以及經過修飾的此類氨基酸。因而，本發明的氨基酸可 以包括例如2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；(3-丙氨酸；P-氨基丙酸；2-氨基 丁酸；4-氨基丁酸；哌啶酸(piperidinic acid); 6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2,4-二氨基丁酸；鎖鏈素；2,2，-二氨基庚二酸；2,3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥基賴 氨酸；另'J-羥基賴氨酸；3-羥基脯氨酸；4-羥基脯氨酸；異鎖鏈素；另'J-異亮 氨酸；N-曱基甘氨酸；肌氨酸；N-曱基異亮氨酸；6-N-曱基賴氨酸；N-曱基 纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；和鳥氨酸。
在有些實施方案中，可以進行保守氨基酸替代，其中一種氨基酸殘基用 具有相似親水性值的另一種氨基酸替代(例如，在±2.0、或±1.5、或±1.0、 或土0.5的數值之內)，其中為氨基酸殘基指派具有約-1.6的水療指數 (hydropathic index)的氨基酸，諸如Tyr (-1.3)或Pro (-1.6)(詳情見美國專 利No. 4,554,101，在此引入作為參考)Arg(+3.0); Lys(+3.0); Asp (+3.0); Glu(+3.0); Ser(+0.3); Asn (+0.2 ); Gln (+0.2 ); Gly ( 0 ); Pro (畫0.5 ); Thr(-0.4); Ala (-0.5 ); His (-0.5 ); Cys(-1.0); Met (-1.3); Val(-1.5); Leu (-1.8); lie (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5);和Trp(畫3.4)。
在其它實施方案中，可以進行保守氨基酸替代，其中一種氨基酸殘基用 具有相似水療指數的另一種氨基酸替代(例如，在±2.0、或±1.5、或±1.0、 或土0.5的數值范圍之內)。在此類實施方案中，每種氨基酸殘基可以根據它們 的疏水性和電荷特征被賦予如下水療指數Ile( +4.5 ); Val( +4.2 ); Leu( +3.8 ); Phe(+2.8); Cys(+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4 ); Thr (-0.7 ); Ser(-0.8); Tip (-0.9); Tyr (-1.3); Pro(-1.6); His (-3.2); Glu(-3.5); Gin (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys(-3.9);和Arg (-4.5 )。
在其它實施方案中，可以使用公眾可獲得的相似性矩陣家族來進行保守 氨基酸替代23-29。 PAM矩陣基于衍生自進化模型的計數，而Blosum矩陣利用 衍生自比對中高度保守部分的計數。在PAM或Blosum矩陣中，大于零的相似 性得分可以用來進行保守氨基酸替代。
在其它實施方案中，可以進行保守氨基酸替代，其中氨基酸殘基用相同 類型的其它氨基酸替代，其中氨基酸如下分為非極性的、酸性的、堿性的和 中性的類型非才及性的Ala， Val, Leu, lie, Phe， Trp， Pro, Met;酸性的 Asp， Glu;石咸性的Lys， Arg, His;中性的Gly, Ser， Thr, Cys, Asn， Gln， Tyr。
保守性氨基酸改變包括用相應的D-氨基酸、保守的D-氨基酸或天然存在 的非遺傳編碼形式的氨基酸替代L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守替代。天然 存在的、非遺傳編碼的氨基酸包括(3-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2, 3-二氨基丙 酸、cc-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、N-曱基甘氨酸(肌氨酸)、羥脯氨酸、鳥 氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-曱基異亮氨酸、苯基甘氨 酸、環己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、2-萘基丙氨酸、吡咬基丙氨酸、 3-笨并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯 丙氨酸、青霉胺、1,2，3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸、P-2-噻吩基丙氨酸、曱硫氨 基亞砜、高精氨酸、N-乙酰基賴氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2，4-二氨 基丁酸、p-氨基笨丙氨酸、N-曱基纈氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、半胱磺 酸(cysteicacid)、 s-氨基己酸、5-氨基戊酸、或2，3-二氨基丁酸。
在其它實施方案中，保守氨基酸改變包括基于親水性或疏水性、大小或 容積、或者電荷考慮的改變。主要根據氨基酸側鏈的性質，氨基酸一般可表 征為疏水性的或親水性的。基于Eisenberg等人"的標準化共有疏水性尺度， 疏水性M酉殳展現出大于零的疏水性，而親水性氨基酉g現出小于零的親水 性。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Gly、 Ala、 Phe、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Met 和Trp，而遺傳編碼的親水性氨基酸包括Thr、 His、 Glu、 Gln、 Asp、 Arg、 Ser和Lys。非遺傳編碼的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的 親水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
疏水性或親水性氨基酸可以基于它們的側鏈的特征作進一步細分。例 如，芳香族氨基酸是具有含至少 一個芳香環或者雜芳香環的側鏈的疏水性氨 基酸，其可以含有一個或多個取代基，諸如-OH、 -SH、 -CN、 -F、 -Cl、 -Br、 -1、 -N02、 -NO、 -NH2、 -NHR、 -NRR、 -C(O)R、畫C(O)OH、 -C(O)OR、 -C(0)NH2、
-C(O)NHR、 -C(O)NRR等，其中R獨立地是(C廣Q )烷基、取代的(C廣C6) 烷基、(C廣Q)烯基、取代的(d-C6)烯基、(C'-C6)炔基、取代的(C廣Q) 炔基、(C5-C20 )芳基，取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26 )烷芳基、取代的(C6-C26 ) 烷芳基、5-20元的雜芳基、取代的5-20元的雜芳基、6-26元的烷雜芳基、或 取代的6-26元的烷雜芳基。遺傳編碼的芳香族氨基酸包括Phe、 Tyr和Trp,而 非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、P-2-噻吩基丙 氨酸、1，2，3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙 氨酸和4-氟苯丙氨酸。
非極性氨基酸是具有在生理pH不帶電荷的側鏈的疏水性氨基酸，其具有 這樣的鍵，在所述鍵中被兩個原子所共有的一對電子一般由該兩個原子的每 一個原子平等地持有(即側鏈不是極性的)。遺傳編碼的非極性氨基酸包括 Gly、 Leu、 Val、 Ile、 Ala和Met，而非遺傳編碼的非極性氨基酸包括環己基 丙氨酸。非極性氨基酸可以進一步細分，其中包括脂肪族氨基酸，其是具有 脂肪族烴側鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Ala、 Leu、 Val 和Ile,而非遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。
極性氨基酸是具有在生理pH不帶電荷的側鏈的親水性氨基酸，但其具有 一個這樣的鍵，在該鍵中一對電子被兩個原子所共有，其中一個原子比另一 個原子更緊密地持有該對電子。遺傳編碼的極性氨基酸包括Ser、 Thr、 Asn 和Gln,而非遺傳編碼的極性氨基酸包括瓜氨酸、N-乙酰基賴氨酸和曱硫氨 酸亞砜。
酸性氨基酸是側鏈pKa值小于7的親水性氨基酸。由于缺失了氫原子，酸 性氨基酸通常具有在生理pH帶負電荷的側鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括 Asp和Glu。堿性氨基酸是側鏈pKa值大于7的親水性氨基酸。由于結合有氫離 子，堿性氨基酸通常具有在生理pH帶正電荷的側鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸 包括Arg、 Lys和His,而非遺傳編碼的堿性氨基酸包括非環狀氨基酸鳥氨酸、 2,3-二氨基丙酸、2, 4-二氨基丁酸、和高精氨酸。
本領域技術人員將領會，前述分類不是絕對的， 一種氨基酸可以被劃分 入超過一個的種類。此外，可以基于已知表現和/或基于特定測定法的或與之 前鑒定的氨基酸進行比較的特征性的化學、物理，或生物學性質，對氨基酸 進行分類。氨基酸還可以包括具有氨基酸樣側鏈的雙功能模塊。
保守改變還可以包括用化學衍生化模塊對非衍生化殘基的替代，例如通
過氨基酸的功能性側基的反應。因此，這些替代可以包括這樣的化合物，其
游離氨基被衍生為鹽酸胺(amine hydrochloride), p-曱苯石黃酰基(p-toluene sulfonyl group)、 千氧羰基(carbobenzoxy group)、 叔丁氧叛基 (t-butyloxycarbonyl group)、 氯乙酰基(chloroacetyl group)或曱酸基(formyl group)。類似的，游離羧基可以被衍生化，以形成鹽、曱酯和乙酯或其它類 型的酯或酰肼，而側鏈可以被衍生化，以形成游離羥基的O-酰基或O-烷基衍 生物，或組氨酸的咪唑氮的N-im-卡基組氨酸。肽類似物或模擬物還包括已 被化學改變的氨基酸，例如通過曱基化，通過由烷基胺諸如乙胺、乙醇胺或 乙二胺的C-末端氨基酸的酰胺化，或氨基酸側鏈的酰化或曱基化(例如賴氨 酸的s氨基的酰化)。肽類似物或模擬物還可以包括用取代的酰胺(例如， 式-C(O)-NR的基團，其中R是(C廣C6)烷基、(CrC6)烯基、(C廣C6)炔基、 取代的(C廣Q)烷基、取代的(CrC6)烯基、或取代的(C廣Q)炔基)或 酰胺鍵的電子等排物(isostere)(例如-CH2麗-、-CH2S、 -CH2CH2-、 -CH=CH-(順式和反式)、-C(0)CH2-、 -01(0印012-或-01280-)替換肽中的酰胺鍵。 化合物可以被共價連接，例如通過聚合或偶聯(conjugation)，而形成同 聚物或異聚物。可以使用間隔物(spacers)和接頭，其一般由小的中性分子， 諸如在生理條件下不帶電荷的氨基酸組成。接頭可以通過多種方式獲得。例 如，可以在肽末端添加半胱氨酸殘基，并通過受控的氧化可以共價地鍵合多 個肽。或者，可以使用異雙功能試劑，諸如形成二^L化物/酰胺的試劑，或形 成硫醚/酰胺的試劑。化合物還可以被連接至其它化合物，所述其它化合物能 夠例如耙向癌細胞或具有DNA損傷的細胞，或者抑制癌細胞或具有DNA損 傷的細胞的生長或增殖，或者誘導癌細胞或具有DNA損傷的細胞的死亡。還 可以通過具有環狀的部分來約束化合物。
肽或肽類似物或模擬物可以通過標準化學技術來合成，例如通過使用液 相或固相合成方法的自動化合成。自動化肽合成儀可通過商業途徑獲得，并 且利用了本領域公知的技術。肽和肽類似物或模擬物也可以使用DNA重組技 術的標準方法來制備，諸如例如Sambrook等人"或Ausubel等人8中記載的那 些。
在有些實施方案中，本發明的化合物包括與COPl或ATM核酸分子或其 片段基本上相同的核酸分子，或者與COPl或ATM核酸分子或其片段互補的 核酸分子。例如，此類核酸分子可用作本發明的測定法和方法中的探針或引
物。"探針，，或"引物，，是具有確定序列的單鏈DNA或RNA分子，其可以與含有 互補序列(靶物)的第二DNA或RNA分子堿基配對。所得雜合分子的穩定性 取決于發生堿基配對的程度，并受到一些參數諸如探針與靶分子之間的互補 性程度和雜交條件的嚴格性程度的影響。雜交嚴格性程度受到一些參數諸如 溫度、鹽濃度和有機分子諸如曱酰胺濃度的影響，而且可通過本領域技術人 員公知的方法來確定。對本文所述核酸序列或其部分特異的探針或引物可以 在長度上不同，從至少8個核苷酸到超過500個核苷酸的任何整數，包括中間 的任何數值，取決于使用探針或引物的目的和條件。例如，探針或引物可以 是長度為8、 10、 15、 20或25個核苷酸，或者可以是長度至少為30、 40、 50 或60個核苷酸，或者可以是長度超過IOO、 200、 500或1000個核苷酸。對本 文所述核酸分子特異的探針或引物可以與本文所述核酸序列具有大于 20-30%的序列同一性，或至少55-75%的序列同一性，或至少75-85%的序列 同一性，或至少85-99°/。的序列同一性，或100%序列同一性。
探針或引物可以衍生自基因組DNA或cDNA序列，例如通過擴增，或衍 生自克隆的DNA區段，而且可以含有代表來自單個個體的單個基因的全部或 一部分的DNA或cDNA序列。探針可以含有獨特的序列(例如與COPl或ATM 的核酸分子100%相同)和/或含有已知的序列。探針或引物可以化學合成。
探針或引物可以通過本領域技術人員已知的方法可4企測地標記，或是放 射性地或是非放射性地。探針或引物可用于牽涉核酸雜交的方法，諸如核酸 測序、通過聚合酶鏈式反應的核酸擴增、單鏈構象多態性(SSCP)分析、限制 性片段多態性(RFLP)分析、Southern雜交、northern雜交、原位雜交、電泳遷 移率變動測定法(EMSA)、和本領域技術人員已知的其它方法。
核酸分子還可以是反義分子、siRNA分子、或三股螺旋分子，其可以用 于例如降低細胞中的靶分子的表達。
在有些實施方案中，測試化合物包括有機小分子。"有機小分子"指天然 存在的或者合成的有機分子，其分子量超過約50道爾頓并低于約2500道爾 頓、優選低于約2000道爾頓、優選在100至約1000道爾頓、更優選在約200至 約500道爾頓。
在本發明的一些實施方案中，測試化合物包括肽、核酸分子、模擬物或
小分子、抗體或其它試劑，其能夠介導COPl/ATM相互作用，例如磷酸化或 壯入
-口 口 o
文庫或化學文庫中鑒定候選或測試化合物。藥物發現和開發領域的技術人員 會理解，測試提取物或化合物的確切來源對于本發明的方法而言不是至關重 要的。因而，事實上，可以使用本文所述例示性方法篩選任意數目的化學提 取物或化合物。此類提取物或化合物的例子包括但不限于基于植物、真菌、 原核生物或動物的提取物、發酵肉湯和合成化合物，以及現有化合物的修飾 形式。還能獲得許多方法用于進行任意數目化合物(包括但不限于基于糖類、 脂質、肽和核酸的化合物)的隨機或導向合成(例如半合成或全合成)。合 成化合物文庫可以通過商業途徑獲得。或者，以細菌、真菌、植物和動物提 取物的形式存在的天然化合物文庫可以通過商業途徑從許多來源獲得，包括
Biotics ( Sussex, UK)、 Xenova ( Slough， UK)、 Harbor Branch Oceanographic Institute (Ft. Pierce, FL， USA)、和PharmaMar (MA, USA )。此外，如果
希望，可以根據本領域已知的方法，例如通過標準的提取和分級方法，生產 天然的和合成生成的文庫。更進一步地，如果希望，可以使用標準的化學、 物理或生物化學方法，很容易地修飾任何文庫或化合物。
當發現一種新的粗提取物例如增強COPl/ATM相互作用時，為了分離產 生所觀察到的效果的化學成分，進一步將陽性主導提取物(positive lead extract)分級是必需的。如此，提取、分級和純化過程的目標是仔細表征和鑒 定粗提取物中具有COPl/ATM相互作用增強活性的化學實體。本文所述用于 檢測化合物混合物中活性的相同測定法可用于純化活性成分和測試其衍生 物。分級和純化此類異質提取物的方法是本領域已知的。如果希望，可以根 據本領域已知的方法對已證明是治療有用試劑的化合物進行化學修飾。被鑒 定為具有治療、預防、診斷或其它價值的化合物隨后可以使用例如癌癥或輻 射損傷的任何動物模型進行分析。
診斷、治療、預防和/或篩選的用途、測定法和試劑
根據本發明的化合物、組合物(例如，藥用組合物)和方法可以用于診 斷或檢測DNA損傷，用于調控受試者中對DNA損傷的應答和/或p53活性，或 者用于篩選或鑒定可用于調控受試者中對DNA損傷的應答和/或p53的測試 化合物。
在用于本文時，受試者可以是人類、非人靈長類、大鼠、小鼠、牛、馬、
豬、綿羊、山羊、犬、貓、蠅、蠕蟲等。受試者可以是臨床患者、臨床試驗 志愿者、實驗動物等。受試者可以是被懷疑患有或者存在患上癌癥或DNA
損傷的風險的受試者、被診斷患有癌癥或DNA損傷的受試者、或者被確認沒 有患上癌癥或DNA損傷的對照受試者、或者是被誘導患上DNA損傷或癌癥 的受試者。在一個優選的實施方案中，受試者是人類。
正如在此討論的，DNA損傷可以通過測量COPl表達水平的減少(其中 C0P1表達下降表明存在DNA損傷)或者通過測量COPl磷酸化(其中在與人 COP 1多肽的絲氨酸387同源的氨基酸上存在COP 1磷酸化表明存在DNA損 傷)來診斷或檢測。
"檢測"意圖包括確定物質的存在與否，或量化物質的量。如此，該術語 指使用本發明的化合物、組合物和方法進行定性和定量的測定。通常情況下， 對于實施本發明而言，用于檢測的特定技術不是至關重要的。例如，根據本 發明，"檢測"可以包括使用本領域已知的或下文描述的方法檢測COPl多 肽在例如與人COPl多肽的S387同源的氨基酸殘基上的磷酸化的變化； CO尸八^rM、 p"或p53基因、基因組、或核酸分子，或者C0P1、 ATM、 p21 或p53多肽的存在或缺乏；CO尸7、 ^rM、 ； "或p"基因中的突變；COPl、 ATM、 p21或p53核酸分子的表達水平的變化，例如mRNA或多肽；COPl多 肽(例如，COPl連接酶活性、p53周轉、p53依賴性反式激活活性的抑制) 或p53多肽(例如，p53結合、p53依賴性反式激活、COPl結合、p21的反式 激活等)的生物學功能/活性的變化。在有些實施方案中，"檢測"可以包括檢 測野生型p53。在有些實施方案中，"^r測"可以包括^:測突變型p53。；險測可 以包括量化與對照比較時在10%和90%之間的任何值、或者在30%和60%之 間的任何值、或者超過100%的變化(提高或降低)。檢測可以包括量化與對 照比較時在2倍和10倍之間的任何值(包括兩端點)，例如3倍、5倍、7倍或 更高，例如50倍或100倍的改變。
"增強"應答，或增強相互作用，例如結合或磷酸化，可以包括與對照相 比時促進應答或相互作用，或者提高早就存在的應答或相互作用，增量在 10%和90%之間、30%和60%之間，或者超過100%的任何值。增強可以包括 與對照相比時在2倍和10倍之間的任何值(包括兩端點)，例如3倍、5倍、7 倍或更高，例如50倍或100倍的升高。例如，根據本發明"增強"可以包括使 用本領域已知的或下文描述的方法提高或促進COPl多肽在例如與人COPl
多肽的S387同源的氨基酸殘基上的磷酸化的變化；COPl、 ATM、 p21或p53 核酸分子的表達水平的變化，例如mRNA或多肽；COPl多肽(例如，COP1 連接酶活性、p53周轉、p53依賴性反式激活活性的抑制)或p53多肽(例如， p53結合、p53依賴性反式激活、C0P1結合、p21的反式激活等)的生物學功 能/活性的變化。
表述"降低"指相對于對照，例如相對于由沒有實質性DNA損傷的細胞 正常產生的表達水平，特定分子例如COPl的多肽表達的降低。展現出COPl 分子表達降低的細胞還可以展現出p53分子(例如p53多肽)的表達升高、或 者p21分子(例如p21mRNA)的表達升高、或者p53或p21活性升高。此類升 高或降低可以是與對照相比時在10%和90%之間的任何值，或在30%和60% 之間的任何值，或者超過100%，或者可以是在2倍和10倍之間的任何值(包 括兩端點)，例如3倍、5倍、7倍或更高，例如50倍或100倍的變化。過量表 達或升高，或者減少或降低的確切量不是至關重要的，只要該過量表達或降 低在統計學上是顯著的。
"對照"包括用于確定基線表達或活性而獲得的樣品。因而，可以通過 許多方法從以下各項中獲得對照樣品沒有DNA損傷(通過標準技術確定) 的細胞；非癌性細胞或組織，例如圍繞受試者的腫瘤或癌細胞的細胞；未患 癌癥或DNA損傷病癥的受試者；未被懷lt存在患上癌癥或DNA損傷的風險 的受試者；或衍生自此類受試者的細胞或細胞系。對照還包括早先已經建立 的標準物。因而，按照本發明進行的任何測試或測定法可以與所述已經建立 的標準物進行比較，可以不必每次都需要獲得用于比較的對照樣品。在體外 遍在蛋白化測定法中，對照可以是遍在蛋白化p53分子的能力下降的COPl分 子(例如，在連接酶結構域中存在缺陷的分子，例如COPlARing)。在體外 或體內激酶測定法中，對照可以是無激酶活性的(kinase-dead)ATM、已知被 磷酸化的或者未被磷酸化的C0P1分子、等等。
按照本發明的試劑包括本文中所描述的化合物。在有些實施方案中，本 發明涵蓋包含本文所述化合物的細胞，例如哺乳動物細胞。例如，哺乳動物 細胞可以通過例如重組技術來改造以包括重組ATM、重組COPl和/或重組 p53分子。此類哺乳動物細胞可以用于例如篩選增強C0P1/ATM相互作用(例 如結合和/或磷酸化)、破壞p53/COPl結合、或者提高p53或COPl活性的測試 化合物。可以將此類細胞與測試化合物一起溫育，測定細胞周期、ATM激酶
活性、p21表達、p53誘導的凋亡、p53依賴性反式激活、COPl連接酶活性等 方面的改變。可以使用基于報道物的構建體例如p21-營光素酶，以內部Renilla 螢光素酶報道物作為背景，采用實時RT-PCR技術。此類哺乳動物細胞可以 在現有的細胞系諸如例如p53野生型細胞系(U2-OS細胞)、p53缺乏的細胞 系(H1299)、 ATM缺乏的細胞系(GM02052或GM09607)中工程化，這些 細胞系可以被工程化來表達C0P1分子、ATM分子或p53分子。如此，COP1 或ATM分子可以在A-T細胞、癌細胞、組織或細胞溶解物中提供，或者可以 使用重組技術來構建。細胞和/或細胞系可以從商業來源獲得，例如ATCC, Manassas ， VA， USA。
按照本發明的測定法可以在體內、體外或離體進行，使用來自標準來源 的樣品并通過標準規程實施。可以使用微陣列，例如組織微陣列。可以在癌 癥或DNA損傷的合適動物模型中進行體內測定法，該模型可以從例如The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA獲得。
在有些實施方案中，可以使用在ATM、 COPl或p53的表達或活性方面存 在缺陷的動物模型。"樣品"可以是分離自受試者的任何器官、組織、細胞 或細胞提取物，諸如分離自患有癌癥或存在DNA損傷的哺乳動物的樣品。例 如，樣品可以包括但不限于從患者(人或動物)、測試受試者或實驗動物獲 得的細胞或組織(例如，來自活才企或尸4企)，其來自骨、腦、乳房、結腸、 肌肉、神經、卵巢、前列腺、視網膜、皮膚、骨骼肌、腸、睪丸、心、肝、 腎、胃、胰腺、子宮、腎上腺、扁桃體、脾、軟組織、外周血、全血、紅細 胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、紅細胞蛋白質、血漿、富含血小 板的血漿、血漿濃縮物、血漿的任何級分的沉淀物、血漿的任何級分的上清 液、血漿蛋白質級分、純化的或部分純化的血液蛋白質或其它成分、血清、 精液、哺乳動物初乳、乳汁、尿液、糞便、唾液、腦脊液、心包液、腹膜液、 胎盤提取物、羊水、冷凍沉淀物、冷凍上清液、細胞溶解物、哺乳動物細胞 培養物或培養液、發酵產物、腹水、血細胞中存在的蛋白質、實體瘤或任何 其它標本、或其任何提取物。在有些實施方案中，可能期望將樣品中的癌性 細胞與非癌性細胞分開，或者將存在DNA損傷的細胞與未受損傷的細胞分 開。
樣品還可以包括但不限于用正常的或被轉化的細胞(例如通過重組DNA 或單克隆抗體技術)通過細胞培養制備的產物。樣品還可以包括但不限于從
非哺乳動物的受試者中分離的任何器官、組織、細胞或細胞提取物，諸如昆 蟲或蠕蟲。"樣品"還可以是在試驗條件下產生的、不是從受試者直接分離 的細胞或細胞系。樣品還可以是無細胞的、人工衍生的或者合成的。樣品可
以來自已知是癌性的或存在DNA損傷的、被懷疑是癌性的或存在DNA損傷 的、或者據信不是癌性的或不存在DNA損傷的(例如正常的或對照的)細胞 或組織。
COPl、 p53或ATM核酸分子或多肽的表達或活性，或者COPl/ATM或 COPl/p53的結合可以使用各種技術來測定，包括免疫組織化學(IHC)、原位 雜交(ISH)、 Northem印跡、聚合酶鏈式反應(例如實時定量PCR或RT-PCR)、 基于抗體的測定法諸如免疫沉淀、免疫熒光、Western印跡等。例如，對衍生 自樣品的PCR產物進行的諸如測序、單鏈構象多態性(SSCP)分析或限制性片
沉淀、RIA、 ELISA或westem印跡可用于測量COPl或ATM或p53多肽的水平 或結合；northern印跡可用于測量COPl或p53 mRNA水平；或者PCR可用于 測量COPl或ATM或p53核酸分子的水平。此類測定法包括檢測任何或所有形 式的COPl或ATM或p53，包括前體、片段(例如，由內切蛋白水解降解產生 的)、翻譯后修飾形式等。本發明的方法涵蓋對COPl相關生物學活性的測定， 諸如自我遍在蛋白化、p53降解、p53的遍在蛋白化、對p53反式激活的抑制、 對p53誘導的凋亡的抑制、p21 mRNA的減少等。本發明的方法涵蓋對ATM 相關生物學活性的測定，諸如激酶活性。
在有些實施方案中，受試者中的細胞可以體內暴露于抗體(例如COPl 抗體，和任選的ATM抗體或p53抗體)，所述抗體4壬選纟皮可4企測地標記，例如 放射性同位素，而且該抗體對細胞的結合可以通過例如放射性的外部掃描或 活組織檢查分析來評價。測定法可以使用可檢測標記的分子來進行，即用于 標記和鑒定分子是否存在的任何手段，例如寡核苷酸探針或引物、基因或其 片段、肽、或cDNA分子。用于可檢測地標記一種分子的方法在本領域是眾 所周知的，包括但不限于放射性標記(例如用同位素，諸如"P或"S)和非 放射性標記(諸如酶標記，例如使用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)、化學 發光標記、熒光標記(例如使用熒光素)、生物發光標記、或對附著于探針 的配體的抗體檢測。該定義中還包括通過間接手段可檢測地標記的分子，例 如，結合有第一模塊(諸如生物素)、繼而與可被觀察和測定的第二模塊(諸如熒光素標記的鏈霉親合素)結合的分子。標記物還包括洋地黃毒苷
(digoxigenin)、螢光素酶和水母發光蛋白。
在有些實施方案中，受試者中的細胞可以在體內暴露于本文所述COPl 化合物，以調控對DNA損傷的應答或p53活性。COPl化合物可以是編碼COPl 多肽或其片段、類似物、模擬物或變體的核酸分子。
藥用組合物、劑量、；sjfe用
小分子、模擬物、肽、或肽類似物)，其中存在脂質體、佐劑或任何藥學上 可接受的載體，為適合于向哺乳動物(例如人、小鼠等)施用的方式。例如，
本發明的化合物可以用于調控受試者中對DNA損傷的應答、p53活性、COP1 活性或ATM活性。
在有些實施方案中，根據本發明的治療性化合物包括C0P1分子或核酸 分子或其小分子、模擬物、肽或肽類似物，例如含有與人COPl多肽的S387 同源的可磷酸化的氨基酸殘基的COPl多肽。根據本發明的化合物可以被長 期地或間歇地提供。"長期的"施用是指持續一段時間地施用該化合物，以代 替一個急性的短期劑量，以便維持最初的治療效果(活性)。"間歇地"施用 是指治療中的某段時期沒有使用那種特定化合物。
可以采用常規的藥物實踐來提供合適的配制劑或組合物，以施用于患有 癌癥或癌癥前期癥狀的受試者。可以釆用任何合適的施用途徑，例如，胃腸 外的、靜脈內的、皮下的、肌肉內的、顱內的、眶內的、眼的、心室內的、 嚢內的、脊柱內的、鞘內的、腦池內的、腹膜內的、鼻內的、氣霧、表面的 或口服施用。治療用配制劑可以是液體溶液或懸浮液的形式；對于口服施用， 配制劑可以是片劑或膠嚢的形式；對于鼻內的配制劑，可以是粉劑、滴鼻劑 或氣霧劑的形式。
本領域公知的制備配制劑的方法可以見例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"(第19版)，A. Gen匿o編，1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa。胃腸外施用的配制劑可以例如含有賦形劑、無菌水 或鹽水、聚(亞烴基)二醇諸如聚乙烯乙二醇、植物油或氬化的萘。生物相 容的、生物可降解的丙交脂聚合物、丙交脂/乙交脂共聚物、或聚氧乙烯-聚 氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。其它潛在有用的胃腸外投遞系統包括乙烯-醋酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統、和脂質體。 吸入施用的配制劑可以含有賦形劑，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙 烯-9-月桂基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或者可以是以滴鼻劑形式 或作為膠體施用的油性溶液。對于用于治療或預防或防止瘤生長的組合物來
說，可以根據癌癥及希望的結果，以足夠防止、抑制或減緩DNA損傷或癌生
長或進展的量施用化合物。用于治療腫瘤的化合物的效力的測量包括如下可
觀察的和/或可測量的一項或多項的減少或消失含有DNA損傷的細胞數的 減少；癌細胞數的減少或癌細胞的消失，腫瘤大小的降低；癌細胞向周圍器 官的浸潤得到抑制(即防止、抑制、減緩或停止)；肺瘤轉移得到抑制(即 防止、抑制、減緩或停止)；肺瘤生長在一定程度上得到抑制；和/或與特定 癌癥相關的一種或多種癥狀在一定程度上得到減輕，以及發病率和死亡率降 低，或者癌細胞或含有DNA損傷的細胞的凋亡或細胞死亡增加。
根據本發明的化合物的"有效量"包括治療有效量或者預防有效量。"治 療有效量"是指對于獲得期望的治療結果是有效的量，其在劑量和時間上是 必需的，所述期望的治療結果諸如如下 一項或多項可觀察的和/或可測量的減 少或消失含有DNA損傷的細胞數的減少；癌細胞數的減少或癌細胞的消失， 胂瘤大小的降低；癌細胞向周圍器官的浸潤得到抑制(即防止、抑制、減緩 或停止)；腫瘤轉移得到抑制(即防止、抑制、減緩或停止)；肺瘤生長在一 定程度上得到抑制；和/或與特定癌癥相關的一種或多種癥狀在一定程度上得 到減輕，以及發病率和死亡率降低，或者癌細胞或含有DNA損傷的細胞的凋 亡或細胞死亡增加。化合物的治療有效量可以隨著某些因素而發生變化，諸 如個體的病情、年齡、性別和體重，以及化合物在個體中引發期望響應的能
力。可以調節劑量方案來提供最佳的治療響應。治療有效量也是這樣一種量， 其中治療上的有益效果勝過化合物的任何毒性或不利效應。"預防有效量"是 指對于獲得期望的預防結果是有效的量，其在劑量和時間上是必需的，所述 期望的預防結果諸如如下一項或多項可觀察的和/或可測量的減少或消失含 有DNA損傷的細胞數的減少；癌細胞數的減少或癌細胞的消失，腫瘤大小的 降低；癌細胞向周圍器官的浸潤得到抑制(即防止、抑制、減緩或停止)； 腫瘤轉移得到抑制(即防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤生長在一定程度上 得到抑制；和/或與特定癌癥相關的 一種或多種癥狀在一定程度上得到減輕， 以及發病率和死亡率降低，或者癌細胞或含有DNA損傷的細胞的凋亡或細胞
死亡增加。典型地，在發生疾病之前或者在疾病發生的早期階^L，對受試者 施用一劑預防劑量，因而預防有效量可以少于治療有效量。化合物的治療或
預防有效量的優選范圍可以是0.1nM-0.1M、 0.1nM-0.05M、 0.05nM-15(iM或 0.01nM-10^M之間的任何數值。
需要注意的是，劑量值可以隨著需要減輕的疾患的嚴重程度而變化。對 于任何特定受試者，可以根據個體的需要和施用組合物或監督組合物施用的 人員的專業判斷，隨時調節具體的劑量方案。本文所述劑量范圍僅是例示性 的，醫學從業人員所選擇的劑量可以不受該限制。組合物中活性化合物的量 可以根據某些因素而發生變化，諸如個體的病情、年齡、性別和體重。可以 調節劑量方案來提供最佳的治療響應。例如，可以施用單次推注(bolus)，可 以隨著時間分開施用幾個分劑(divided doses)，或者可以-f見所表現出來的治療 情況的緊急事件而按比例減少或提高劑量。以劑量單位形式來配制胃腸外組 合物，對于使施用變得輕松和劑量均勻而言是有利的。
一般的，本發明的化合物的使用應當基本上不引起毒性。本發明化合物 的毒性可以使用標準技術來測定，例如通過在細胞培養物或實驗動物中測 試，并確定治療指數，即LD50 (對群體的50。/。致死的劑量)和LDIOO (對群 體的100%的致死的劑量)之間的比值。然而，在有些情況中，例如在嚴重 疾病的場合中，施用實質性過量的組合物可能是必需的。
在有些實施方案中，藥用組合物可以包含編碼本發明化合物(例如COPl 多肽或核酸分子或其小分子、模擬物、肽或肽類似物)的核酸分子，與藥學 可接受載體相結合。此類藥用組合物可以使用任何適當的技術來施用，例如 病毒載體系統。合適的病毒載體可以包括腺病毒、牛痘病毒或其它痘病毒、 皰滲病毒等，而且可以使用用于施用此類載體的任何技術。
實施例
實施例l:材料和方法
表達載體、重組蛋白和抗體
FLAG畫COPl 、 pcDNA3.1+p53 、 ； "-Luc 、 k-Luc 、 pGEX4Tl畫p53和 pGEX6Pl-COPl先前已有記載3' 21 。 GST-S387肽含有人COPl多肽的氨基酸 377-400，而GST-S387-A肽在S387上存在丙氨酸突變。FLAG-ATM和 FLAG-ATM-KD是Michael Kastan教4受(St. Jude Children's Research Hospital,
TN)惠贈的。所有突變體構建物是通過Quickchange定點誘變(Stratagene)生成 的。所有08丁重組蛋白是在大腸桿菌81^21(053)密碼子+ (Stratagene)中表達， 接著用谷胱甘肽Sepharose 4B分批法(GE Healthcare)純化的。抗p53 (DO-l) (Calbiochem)、抗p53 pS15 (Cell Signalling)、抗p21 (Ab-1) (Calbiochem)、抗 FLAG (M2) (Sigma),抗Myc (9E10) (Roche)、抗肌動蛋白質(ICN)、抗微管蛋 白(Ab6161) (Abcam)、抗組蛋白H1 (SC8030) (Santa Cruz Biotechnology),抗
COPl先前已有記載3， 22。抗pS387是QCB生成的兔多克隆抗體，使用肽 Ac-DSRTA(pS)QLDEFC-NH2作為抗原，并通過針對被磷酸化的和未被磷酸 化的肽進行序貫數輪親和純化來純化。 細胞、轉染和l艮道物測定法
U2-OS、 Saos-2、 HEK293T和H1299細胞購自ATCC，并在含有10。/。FBS 的McCoy，s 5A (Invitrogen)中維持。GM02052、 GM03490、 GM0637和GM09607 成纖維細胞從Coriell Cell Repositories獲得，并在含有15% FBS的MEM (ATCC)中維持。所有轉染使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)按照制造商的 推薦進行。對于用10 Gy IR處理的GM03490和M02052成纖維細胞或用100ng 各種COPl構建體轉染的HEK293和U2-OS細胞，使用NE-PER試劑盒(Pierce) 進行細胞質和細胞核提取。為了評價COPl對p53穩態水平的影響，用漸增量 (0.5嗎、l|ug和2g )的FLAG畫COPl或FLAG-C0P1-S387D和150ng pcDNA3.1+p53轉染Saos-2細胞。對于報道物測定法，用150ng pcDNA3.1+p53、 100ng/ "-Luc和10ng pRL-TK，用或不用漸增量(0.5)ug、 1 |ig和2fig )的pCMV-FLAG-COP 1或pCMV-FLAG-COP 1 -S3 87D瞬時轉染 Saos-2細胞。雙重螢光素酶測定法按照制造商(Promega)的推薦進行。 免疫沉淀、GST-下拉(pull down)測定法和脈沖追蹤測定法 將細胞在放射免疫沉淀測定法(RIPA)緩沖液(0.1% SDS、 1% NP-40、 150mMNaCl、 0.5%脫氧膽酸鹽、50mM Tris pH7.4、 lmMDTT和蛋白酶抑 制劑混合物)中溶解，預先澄清，并用靶抗體和蛋白A/GPLUS珠(SantaCruz Biotechnology)進行免疫沉淀。如下進行體外下拉測定法，在PBST(含有0.10/。 Tween 20和lmM DTT的PBS )中混合GST或GST-p53與從哺乳動物細胞中純 化得到的FLAG-COPl或FLAG-COPl-S387D，并在室溫下輕輕搖動溫育l小 時。COPl所結合的蛋白質用FLAG肽(Sigma)洗脫，并進行SDS-PAGE，用抗
FLAG和抗GST進行免疫印跡。為了環己酰胺追蹤實驗，用lOOpg/ml CHX溫 育細胞，并在指定時間點收獲細胞。 體外遍在蛋白化和激酶測定法
從HEK293T細胞中純化FLAG-COPl-WT或FLAG-COPl-S387D,并在含 有50mMTrispH7.5、 2mMATP、 5mMMgCl2、 20|iMZnCl2、 2mMDTT和2]LiM 遍在蛋白醛的緩沖液中與10iug遍在蛋白(BostonBiochem)、 2fig生物素化遍在 蛋白(Boston Biochem)、 20ng UbcH5b (A.G. Scientific) 、 20ng兔El (Sigma)— 起溫育。若有指出，則在反應中包括100ng從大腸桿菌中純化得到的GST-p53。 于30。C輕輕搖動溫育2小時后，在含有1% SDS的PBST中使反應煮沸5分鐘， 然后用PBST降低到0.1。/。 SDS,用于用抗FLAG或抗p53 (FL393) (Santa Cmz Biotechnology)進行的再次免疫沉淀。最后，對樣品進行SDS-PAGE，接著用 鏈霉親合素-HRP (Invitrogen)進行免疫印跡來檢測COP 1或p53的遍在蛋白化 種類。如先前所述，用內源ATM和外源ATM實施激酶測定法。如指出的4吏 用渥曼青霉素(Calbiochem)和咖啡因(Sigma)。
菌落形成測定法
將H1299細胞鋪入10cm皮氏培養皿，隨后用指定的表達載體轉染24小 時。在Zeocin ( 600嗎/ml)中對被轉染的細胞進行10天選擇。然后去除培養 液，將菌落用PBS洗滌2次，于-20。C在冰冷的曱醇中固定10分鐘，然后在吸 走曱醇后在0.5%結晶紫溶液中溫育10分鐘。隨后將板用蒸餾水洗滌，并在空 氣中晾干。在倒置顯微鏡中對包含超過20個細胞的染色菌落評分并計數。進 行三個獨立實驗，重復每次計數。
實施例2:暴露于IR時，COPl在翻譯后被修飾
本發明人用GM0637成纖維細胞檢查了在用10 Gy IR誘導DNA損傷后的 C0P1穩態水平。用COPl的抗體探查的溶解物揭示了COPl的穩態水平早在 IR后的30分鐘時就開始下降，并在l小時時幾乎消失(圖1A)。值得注意的是， 隨著COPl水平下降，p53的穩態水平上升，這與下游靶基因p21的激活是一 致的(圖1A和1B)。為了揭示這種C0P1蛋白減少的機制，進行實時PCR來評 價CO尸/基因座上的基因活性。在IR刺激后，C(9尸7mRNA水平適度升高。p2/
量級遠遠大于CO尸7啟動子。因此，這些數據意味著，COPl蛋白質水平下降
不能歸因于C(9尸7 mRNA水平的降低。因此，進行環己酰胺(CHX)脈沖追蹤 實驗來確定這種調節是否是在翻"^后水平上的。在GM0637成纖維細胞中， COP1的半衰期超過30分鐘，但是在將細胞暴露于IO Gy IR時，COPl的半衰 期顯著縮短到剛剛超過7分鐘(圖1C)。這些數據表明，在暴露于IR時，COP1 是在翻譯后被修飾的。
實施例3: COPl修飾^ATM依賴性的
由于ATM是DNA損傷信號傳導途徑的主要響應物，測定了潛在的ATM 磷酸化位點。在COPl上存在五種SQ基序(圖1D);然而，由于將SQ3(S387) 上的絲氨酸殘基突變為丙氨酸能夠防止COPl的穩態水平在IR后下降，因此 SQ3 (S387)是最令人感興趣的(圖1E)。為了確定S387是否是ATM介導的石壽 酸化的真正靶物，從大腸桿菌中純化GST肽，并用作體外激酶測定法的底物， 其中從ATM野生型或缺乏ATM的成纖維細胞中免疫沉淀ATM (圖2A)。實際 上，ATM能磷酸化包含S387的肽(GST畫C0P1-WT)和p53 S15 (GST-p53)， 這是經典的ATM底物17。相反，ATM不能磷酸化包含S387A突變的肽 (GST-COPl-A)。為了證實全長C0P1是ATM的底物，而S387是COPl上的主 要SQ位點，從大腸桿菌中純化得到全長C0P1和C0P1-S387A，并在體外激酶 測定法中與重組ATM或ATM-KD—起溫育(圖5)。與COPl-S387A突變蛋白 相反，將COPl與ATM而不是ATM-KD—起溫育，從COPl產生強大的磷酸信 號(phospho-signal)。這些數據暗示S387是體外ATM的主要位點。因此，在兔 子中生成針對被磷酸化的S387的多克隆磷酸特異性抗體，純化，并通過4吏用 ATM進行的體外激酶測定法(圖8 )和肽ELISA (圖7 )表征。為了確定ATM 是否能在體內磷酸化COPl ，在用或不用ATM或ATM-KD時，用FLAG-COP1 轉染HEK293T細胞。用FLAG抗體免疫沉淀溶解物，并用抗pS387抗體進行 western印跡(圖2B )。當用ATM共轉染時，僅檢測到對應于pS387 COP 1的特 異性條帶，而用X-磷酯酶處理時，該條帶消失。
為了確定在體內是否存在ATM與COPl之間的相互作用，專一地用 FLAG-ATM或者與HA-COP 1 —起轉染HEK293T細胞，并進行依托泊戒 (etoposide)誘導的DNA損傷或用DMSO媒介對照處理(圖2C )。只有在用 FLAG-ATM轉染HA-COPl時，抗HA珠下拉ATM,雖然是微弱的。然而，在 用依托泊甙處理細胞時，用HA-COPl下拉ATM的量得到驚人的增加，這表
明COP 1與ATM之間的相互作用可被DNA損傷誘導。為了評價IR后COP 1的穩 態水平下降和升高的周轉(分別見1A和1C)是否可歸因于ATM的存在，將 衍生自A-T患者的成纖維細胞(GM09607)用IR處理，并在各個時間點上》]欠 獲，用于western印跡。有趣的是，在缺乏ATM的成纖維細胞中，COPl蛋白 的穩態水平下降是不完全的(defective)(圖2D)。這與缺乏p53穩定性和對p21 蛋白的誘導是相關的。然后，用抗pS387抗體在ATM-WT和A-T成纖維細月包中 探查被ATM磷酸化的COPl (圖2E)。值得注意的是，只有在存在能夠-秀導 DNA損傷的藥物博來霉素時，在ATM-WT成纖維細胞中檢測到C0P1 pS387。 在ATM-WT成纖維細胞中檢測到p53 pS15,但是在A-T成纖維細胞中幾乎枱r 測不到p53pS15。在A-T細胞中檢測不到pS387 COPl，這表明該位點的》務飾 是ATM依賴性的。
實施例4: S387上的ATM磷酸化通過促進自我遍在蛋白化，足以增加COPl 的周轉
將外源ATM導入Saos-2細胞中，并評價外源和內源COPl蛋白的穩態水 平。導入外源ATM導致外源和內源COP 1蛋白顯著下降(分別見圖2F和圖9 ), 與此相反，ATM-KD對外源和內源COPl的穩態水平不起任何作用。由于COPl 在暴露于IR后發生周轉，本發明人希望查明這種由ATM介導的周轉是否是通 過26S蛋白酶體實現的。因此，在用HA-COPl和FLAG-ATM轉染后，用蛋白 酶體抑制劑處理Saos-2細胞(圖2G)。 ATM的轉染導致COPl驚人的減少；然 而，這可以通過用蛋白酶體抑制劑處理細胞來完全消除，表明ATM磷酸化 COP 1促進蛋白酶體依賴性COP 1降解。本發明人調查了 COP 1在應答ATM激 活時是否被遍在蛋白化。將H1299細胞用帶HA標簽的遍在蛋白、ATM或 ATM-KD、和COPl轉染，并用蛋白酶體抑制劑預先處理以容許在收獲溶解 物之前積累被遍在蛋白化的產物。用抗FLAG免疫沉淀COPl,用抗ELM企測 被遍在蛋白化的種類(圖2H)。僅用COPl轉染揭示了低豐度的可檢測的遍在 蛋白產物；然而，與用ATM-KD共轉染相反，當ATM與COPl—起共轉染時， 出現代表被遍在蛋白化的COPl的實質性信號。鑒于ATM促進COPl的遍在蛋 白化并隨后降解的事實，本發明人期望確定ATM是否能夠發出COP1的RING 突變體(C136/139S)的降解信號，其基本原理在于如果COPl自身能夠進行 自我遍在蛋白化，則ATM將不能促進RING突變體的COPl降解。將Saos-2細
跡評價COPl蛋白的穩態水平(圖21)。如前面的實驗所鑒定的，ATM引起 COPl的穩態水平急劇下降，而ATM-KD不產生任何作用。相反，RING突變 體對由ATM誘導的降解不起反應。這些數據暗示ATM磷酸化促進COPl自我 遍在蛋白化和隨后的降解。為了進一步回答這個問題，生成C0P1-S387D突 變體，在該絲氨酸殘基上模擬磷酸化，并從哺乳動物細胞中純化得到(圖10 )， 用于體外的自我E3遍在蛋白化測定法，其中使用COPl-WT和COPl-RING突 變體分別作為陽性和陰性對照(圖2J)。 COPl-WT具有中等的自我E3活性， 而COPl的RING突變體不能夠自我進行遍在蛋白化。相反，S387D COPl突 變體具備驚人的自我E3連接酶活性，并且與ATM磷酸化通過自我E3機制增 加COPl遍在蛋白化的想法一致。考慮到S387D突變體在體外的自我E3連接 酶活性增大，表明該突變體在體內以較快的速率周轉。為了說明這種可能性，
驗，在與CHX—起溫育后，在指定的時間點上收集細胞(圖2K)。溶解物的 Western印跡揭示了被轉染的COPl的半衰期約為50分鐘，比較而言，S387D 突變體被迅速周轉，半衰期約為15分鐘。因此，這些數據表明，ATM在S387 上的磷酸化足以通過促進自我遍在蛋白化來增加COP 1的周轉。
本發明人使用免疫熒光檢查在IR之前和之后外源COPl在H1299細胞中 的定位(圖ll)。通過用DAPI共染色并重疊圖象進行的評價，定位分析揭示 了COPl主要定位于細胞核區室。令人驚奇的是，在暴露于10Gy IR達2小時 后，COPl主要定位于細胞質區室。接著，本發明人通過野生型(GM03490) 或截短型ATM (GM02052 )的原代成纖維細胞中的生物化學級分評價內源 COPl的定位。與在H1299細胞中進行的外源C0P1研究一致(圖IO)，在不使 用任何DNA損傷劑時，在野生型成纖維細胞和A-T成纖維細胞中，內源COPl 專一地定位于細胞核級分(圖3A)。相反，在用依托泊戒處理時，大約50% 的COP1存在于GM03490成纖維細胞的細胞質級分，而從A-T成纖維細胞中未 檢測到任何可檢測的細胞質COPl。這些數據表明，COPl在細胞質區室中的 定位是ATM依賴性的。由于ATM具有在S387上磷酸化COPl的能力，本發明
人希望確定S387上的這種修飾是否足以引起細胞質定位。因此，在10GylR 處理之前和之后分析COPl-S387D的定位，并與HEK293T細胞中的野生型 COPl比較(圖3B)。 WT-COPl以大約l:l的比例定位于細胞質和細胞核區室。 相反，在未添加任何DNA損傷劑時，C0P1-S387D蛋白展現出驚人的4:1的細 胞質/細胞核定位比例。此外，用IR處理細胞未能進一步提高COPl-S387D的 細胞質/細胞核比例，而WT-COP1的細胞質/細胞核比例從l:l升高到大約3:1 。
COPl的細胞質集合。
實施例6: COPl-S387D在降解p53和抑制p53依賴性基因反式激活方面被消 弱
將H1299細胞(p53一)用編碼FLAG-COPl、有或無HA-p53的構建體轉 染，并用博來霉素處理2小時，而COPl和p53之間的相互作用通過免疫沉淀
時揭示了結合至HA-珠；然而，在用博來霉素誘導DNA損傷時，這種相互作 用得到顯著抑制。用相反的IP獲得了類似結果，其中僅當共轉染FLAG-COPl 時，HA-p53才被抗FLAG珠免疫沉淀(圖4B)。考慮到COPl在DNA損傷后在 S387上被磷酸化，本發明人希望確定這種修飾是否在破壞p53/COPl復合物中 起作用。為此，本發明人通過免疫沉淀評價相對于WT-COPl， C0P1-S387D 突變體在細胞中是否保留了與p53形成復合物的能力(圖4D)。 IP的Westem 印跡揭示了與WT-COPl相比，明顯較少p53 (光密度分析法評定為約3倍)能 夠與COPl-S387D復合。此外，本發明人能夠使用純化的COPl-S387D (圖9) 及從大腸桿菌衍生的和純化的GST-p53在體外重建這些觀察結果，其中檢測 到p53的結合下降約5倍(圖4D)。盡管沒有完全消除COPl與p53之間的相互 作用，但是顯然S387的磷酸化使得COPl在體外和在體內結合p53方面下降了 至少約3倍。此外，這與COPl-S387D在體外遍在蛋白化p53的能力下降相關 (圖4E)。因此，這些觀察結果表明，ATM在S387上修飾COPl抑制COPl抑 制p53肺瘤抑制物功能的能力。因此，進行實驗，在瞬時轉染測定法中確定 COP1-S387D是否保留降解p53的能力。將Saos-2細胞用p53及漸增滴度的 C0P1-WT或C0P1-S387D轉染(圖4F)。收獲并用抗p53進行westem印跡的溶 解物揭示了在共轉染COPl-WT時，p53的穩態水平迅速下降，而共轉染
C0P1-S387D時，p53水平僅略微下降。這些數據還與p21蛋白質水平和p21 基因反式激活能力相關(分別見圖4F和圖4G)。因此，這些數據暗示， COPl-S387D在降解p53和抑制p53依賴性基因反式激活方面被消弱。為了證 實這與適當的生理學讀數(readout)相關，在H1299細胞中進行菌落形成測定 法來監測COP1-WT和COPl-S387D在抑制p53依賴性功能方面的長期效應 (圖4H )。 p53的轉染導致極少的存活菌落，而相對于僅轉染p53 ( 6 x 103 cfu ) 和僅轉染COPl-WT ( 72 x 103 cfu)，共轉染COPl和p53導致了大量菌落的插-救(25 x 103 cfu)。明顯相反，相對于僅轉染p53 ( 6 x 103 cfb)和僅轉染 C0P1-S387D ( 77 x 103 cfb),在與p53共轉染時，C0P1-S387D未能恢復大量 菌落(6x 103cfU)。
參考文獻
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其它實施方案
盡管本文公開了本發明的各種具體實施方案，根據本領域技術人員的公 知常識，可以在本發明的范圍內進行許多修改和變更。此類+務改包括用已知 的等效手段替換本發明的任何方面，從而以基本上相同的方式達到相同結 果。本文中所使用的登記號指來自多個數據庫的登記號，對于核苷酸序列， 包括歐洲分子生物學實驗室的(EMBL ) GenBank、日本DNA數據庫(DDBJ ) 或基因組序列數據庫(GSDB)，對于多肽序列，包括蛋白質信息資源(PIR)、 SWISSPROT、蛋白質研究基金(PRF)和蛋白質數據庫(PDB)(來自已解 析結構的序列)，以及來自GenBank、 EMBL、 DDBJ或RefSeq的核苷S吏序列 的注明編碼區的翻譯物。數值范圍包括限定該范圍的端點數值。在本說明書 中，詞語"包含"是開放式術語，基本上等同于術語"包括，但不限于"。在 本文中對參考文獻的引用不應解釋為承認這些參考文獻是本發明的現有技 術。所有出版物引入本文作為參考，如同每篇出版物被具體地和分別地引入 本文作為參考，就像完整列在本文中一樣。2005年12月31日提交的流水號為 60/755,412的美國臨時專利申請同樣完整收入本文作為參考。本發明包括基 本上如上所述和參考實施例和附圖的所有具體實施方案及其變化形式。
權利要求
1. 一種檢測包含ATM多肽的細胞中的DNA損傷的方法，該方法包括:檢測細胞中的COP1多肽，其中相對于對照，所述ATM多肽磷酸化所述COP1多肽或者所述COP1多肽的表達水平下降，則指示存在DNA損傷。
2. 權利要求l的方法，其中所述ATM多肽是人的ATM多肽。
3. 權利要求l的方法，其中所述COPl多肽是人的COPl多肽。
4. 權利要求l - 3任一項的方法，其中所述磷酸化是絲氨S交磷酸化。
5. 權利要求l-4任一項的方法，其中所述C0P1多肽用特異性結合所述 COP 1多肽的抗體來檢測。
6. 權利要求5的方法，其中所述抗體識別一種肽，該肽包含與人C0P1多肽 的氨基酸殘基377-400基本上相同的氨基酸序列。
7. 權利要求5的方法，其中所述抗體識別一種肽，該肽包含與人COPl多肽 的絲氨酸387同源的氨基酸序列。
8. 權利要求6或7的方法，其中所述肽在與人C0P1肽的絲氨酸387同源的可 磷酸化的氨基酸殘基上被磷酸化。
9. 權利要求l-8任一項的方法，進一步包括檢測所述ATM多肽，其中所述 COPl分子結合所述ATM分子指示存在DNA損傷。
10. 權利要求l - 9任一項的方法，進一步包括檢測由COPl E3連接酶活性的 激活、C0P1自我遍在蛋白化的激活、p53-COPl復合物的石皮壞、COP1 依賴性p53遍在蛋白化的降低、C0P1的細胞質-細胞核比例的提高、C0P1 多肽的周轉、COP 1多肽的降解組成的組中的 一項或多項。
11. 權利要求l - 10任一項的方法，進一步包括檢測所述細胞中的p53分子， 其中相對于對照，所述p53分子表達水平的升高或p53活性的增大指示存 在DNA損傷。
12. 權利要求ll的方法，其中所述p53分子是人p53分子。
13. 權利要求11或12的方法，其中所述p53分子是野生型p53分子。
14. 權利要求ll _ 13任一項的方法，其中所述p53分子是p53多肽。
15. 權利要求14的方法，其中所述p53多肽用特異性結合所述p53多肽的抗體 來斗企測。
16. 權利要求ll - 15任一項的方法，其中所述p53活性選自由激活p53依賴性 反式激活、激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、誘導p21啟動子、提高 p21 mRNA水平、和i秀導尸t/M4啟動子組成的組中的一項或多項。
17. 權利要求l - 16任一項的方法，其中所述DNA損傷是由輻射或化學化合 物引起的。
18. 權利要求17的方法，其中所述輻射是致電離輻射或紫外線輻射。
19. 權利要求17的方法，其中所述輻射來自放療。
20. 權利要求17的方法，其中所述化學化合物是烷化劑或化療劑。
21. 權利要求l - 20任一項的方法，其中所述細胞存在DNA損傷或者存在發 生DNA損傷的風險。
22. 權利要求l-21任一項的方法，其中所述細胞是癌細胞。
23. 權利要求22的方法，其中所述癌細胞選自由乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、 肺癌和移行細胞癌的細胞組成的組中的一項或多項。
24. 權利要求22或23的方法，其中所述癌細胞從正接受癌癥治療的受試者中 獲得。
25. 權利要求24的方法，其中所述癌癥治療已知會導致DNA損傷或者被懷疑 會導致DNA損傷。
26. 權利要求24或25的方法，其中該受試者是人。
27. 增強細胞中對DNA損傷的應答的方法，該方法包括將細胞暴露于增強 COPl多肽降解的化合物。
28. 權利要求27的方法，其中所述化合物包括ATM分子。
29. 權利要求28的方法，其中所述ATM分子是已活化的ATM多肽。
30. 權利要求27的方法，其中所述化合物增強所述COPl多肽結合至ATM多 肽或增強ATM多肽磷酸化所述COPl多肽。
31. 增強COPl多肽與ATM多肽的相互作用的方法，該方法包括將所述COPl 多肽和所述ATM多肽與 一種化合物接觸，該化合物增強所述C0P1多肽 結合所述ATM多肽。
32. 權利要求30或31的方法，其中所述結合引起如下的一項或多項降解所 述C0P1多肽、激活COPl E3連接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、 破壞COPl-p53復合物、降低COPl依賴性p53遍在蛋白化、提高COPl多 肽的細胞質/細胞核比例、和提高p53分子的表達水平。
33. 權利要求31的方法，其中該接觸增強細胞中對DNA損傷的應答。
34. 權利要求27 - 30和33任一項的方法，其中該細胞存在DNA損傷或者存在 發生DNA損傷的風險。
35. 權利要求34的方法，其中所述細胞是A-T細胞。
36. 權利要求34的方法，其中所述細胞是癌細胞。
37. 權利要求27 - 30和33 - 36任一項的方法，其中所述對DNA損傷的應答包 括細胞凋亡或p53激活。
38. 權利要求37的方法，其中所述p53激活選自由激活p53依賴性反式激活、 激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、誘導p21啟動子、和誘導尸t/M4啟動 子組成的組中的 一項或多項。
39. 權利要求26- 38任一項的方法，其中所述C0P1多肽是人C0P1多肽。
40. 權利要求28 - 39任一項的方法，其中所述ATM多肽是人ATM多肽。
41. 權利要求27-40任一項的方法，其中所述化合物增強對與人C0P1多肽 的絲氨酸387同源的氨基酸殘基的磷酸化。
42. 權利要求41的方法，其中所述化合物增強對人COPl多肽的絲氨酸387的 磷酸化。
43. 權利要求27-42任一項的方法，其中所述化合物包含COPl多肽或其片 段，該COPl多肽或其片段包含與人COPl多肽的絲氨酸387同源的殘基。
44. 權利要求27-42任一項的方法，其中所述化合物包含一種多肽，該多肽 包含與人COPl多肽的氨基酸殘基377-400基本上相同的序列。
45. 權利要求43或44的方法，其中所述化合物在能夠被磷酸化的氨基酸殘基 上包含磷酸化。
46. 權利要求45的方法，其中所述氨基酸殘基與人COPl多肽的絲氨酸387同源。
47. 權利要求27-42任一項的方法，其中所述化合物包含一種COPl多肽， 該COP 1多肽在與人COP 1多肽的絲氨酸387同源的殘基上包含用蘇氨 酸、谷氨酸或天冬氨酸替代絲氨酸。
48. 權利要求27-42任一項的方法，其中所述化合物包含一種COPl模擬化 合物。
49. 鑒定在包含ATM分子的細胞中增強對DNA損傷的應答的化合物的方法， 該方法包括在適合促進細胞中的DNA損傷的條件下，在存在或缺乏測試 化合物時，溫育COPl多肽，并確定在存在所述測試化合物時，所述COPl 多肽的降解是否被增強，其中增強所述COPl多肽降解的化合物是增強對DNA損傷的應答的化合物。
50. 權利要求49的方法，其中所述確定是相對于對照而作出的。
51. 權利要求50的方法，其中所述ATM分子能夠磷酸化所述COPl多肽。
52. 權利要求49-51任一項的方法，進一步包括確定由COPl E3連接酶活性 的激活、COP1自我遍在蛋白化的激活、COPl-p53復合物的破壞、COP1 依賴性p53遍在蛋白化的降低、COP1多肽的細胞質/細胞核比例的提高、 p53活性的升高、和p53分子表達水平的升高組成的組中的一項或多項是 否被所述化合物增強，其中此類增強指示所述化合物是增強對DNA損傷 的應答的化合物。
53. 權利要求52的方法，其中所述p53活性選自由激活p53依賴性反式激活、 激活p53誘導的凋亡、激活p21分子、誘導p21啟動子、和i秀導PUMA啟 動子組成的組中的 一 項或多項。
54. 權利要求49-53任一項的方法，其中適合促進DNA損傷的條件是輻射。
55. 權利要求49 - 54任一項的方法，其中對DNA損傷的應答包括細胞凋亡或 p53激活。
56. 用于鑒定增強COPl多肽與ATM多肽的相互作用的化合物的方法，該方 法包括a) 在存在或缺乏測試化合物時，將COPl多肽和ATM多肽一起溫育；并b) 確定該測試化合物是否增加或穩定所述COPl多肽結合至所述ATM 多肽，其中增加或穩定所述COPl多肽結合至所述ATM多肽的測試化合物是增 強COPl多肽與ATM多肽的相互作用的化合物。
57. —種分離的肽，其基本上是由與人COP1的氨基酸殘基377-400基本上相 同或同源的氨基酸序列組成的。
58. —種分離的肽，其基本上是由圖6中所示的氨基酸序列組成的。
59. 權利要求57或58的肽，其中所述肽包含對SQ基序中的絲氨酸的替代。
60. 權利要求59的肽，其中所述替代是天冬氨酸或谷氨酸替代。
61. 分離的或重組的被磷酸化的COPl肽，其包含與人COPl多肽的S387同源 的磷酸化。
62. 分離的或重組的被磷酸化的COPl肽，其在與人COPl多肽的S387同源的 氨基酸殘基上包含天冬氨酸或谷氨酸替代。
63. 權利要求57 - 62任一項的肽的COPl模擬化合物。
64. 編碼權利要求57 - 62任一項的肽或權利要求63的模擬物的核酸分子。
65. —種載體，其包含可操作地連接到啟動子上的權利要求64的核酸分子。
66. 權利要求65的載體，進一步包含可操作地連接至啟動子的ATM核酸分 子。
67. —種宿主細胞，其包含權利要求65或66的載體。
68. 特異性結合一種氨基酸序列的試劑，該氨基酸序列在與人COPl的絲氨 酸387同源的氨基酸殘基上被磷酸化。
69. 按照權利要求68的試劑，其中該氨基酸序列是S387被磷酸化的人COPl。
70. 按照權利要求69的試劑，其中該試劑是抗體。
71. 編碼權利要求68的試劑或權利要求70的抗體的核酸分子。
72. —種載體，其包含可操作地連接至啟動子的權利要求71的核酸分子。
73. —種宿主細胞，其包含權利要求72的載體。
74. —種試劑盒，其包括權利要求68的試劑或權利要求70的抗體，以及使用 說明書，該使用說明書對檢測細胞中的被磷酸化的COPl分子進行說明。
75. —種藥用組合物，其包含權利要求57-62任一項的肽或權利要求63的模 擬物或編碼該肽或才莫擬物的核酸序列。
76. 治療需要治療的受試者中的DNA損傷或癌癥的方法，該方法包括給該受 試者施用治療有效量的權利要求57 - 62任一項的肽或者權利要求63的 模擬物。
77. 治療需要治療的受試者中的DNA損傷或癌癥的方法，該方法包括給該受 試者施用治療有效量的權利要求64的核酸。
78. 治療需要治療的受試者中的DNA損傷細胞或癌癥的方法，該方法包括給 該受試者施用選自由增強COP1多肽結合至ATM多肽的化合物和增強 ATM多肽磷酸化所述COPl多肽的化合物組成的組的化合物。
79. 按照權利要求78的方法，其中該化合物以有效的在DNA損傷細胞或癌癥 中增強COP 1多肽磷酸化的量施用。
80. 由權利要求49或56的方法所鑒定的化合物。
81. 權利要求57-62任一項的肽、權利要求63的模擬物或權利要求80的化合 物用于制備治療受試者中的DNA損傷或癌癥的藥物中的用途。
82. —種哺乳動物細胞，其包含編碼C0P1分子的重組核酸分子和編碼ATM 分子的重組核酸分子。
83. 權利要求82的哺乳動物細胞，進一步包含編碼p53分子的重組核酸分子。
84. 權利要求82或83的哺乳動物細胞，其中所述ATM分子是已激活的。
85. 權利要求82- 84任一項的哺乳動物細胞，其中所述C0P1分子是被組成 性磷酸化的或者組成性非磷酸化的。
86. 權利要求85的哺乳動物細胞，其中S387上的突變防止COPl在387上一皮磷 酸化，從而使得該COPl分子在S387上組成性非磷酸化。
全文摘要
本發明提供COP1分子和COP1活性調控物，以及使用它們的方法，包括其診斷和治療用途。此類分子可用于檢測DNA損傷及用于在受試者中調控對DNA損傷的應答和p53活性。本發明還提供用于篩選能夠調控COP1活性的測試化合物的試劑和試劑盒。
文檔編號G01N33/50GK101384727SQ200680053246
公開日2009年3月11日 申請日期2006年12月21日 優先權日2005年12月31日
發明者戴維·多南 申請人:健泰科生物技術公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
