專利名稱：一種多波長核酸蛋白層析分離檢測系統的制作方法
技術領域：
本發明是生物化學和生物制藥領域的專用分離檢測方法與設備，尤其是涉及多波 長核酸蛋白層析分離檢測方法和系統。
二背景技術：
在科學研究和生產過程中，存在著大量的蛋白質、核酸和多肽等生物大分子的分 析、分離和純化工作，迫切需要高效快速的分析、分離和制備方法。目前廣泛采用的 生化分離技術主要有沉淀分離、層析分離、電泳分離、離心分離、膜分離技術。而層 析分離技術以其獨特的優勢始終占據著生物大分子純化技術的主導地位。層析系統包 括兩個相固定相和移動相。當移動相流過加有樣品的固定相時，由于各組分在兩相 之間的分配比例不同，各組分就會以不同速度移動而互相分離開來。根據固定相基質 的形式，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。生化技術中常用的凝膠層析、離 子交換層析等通常采用柱層析方法。柱層析系統主要有兩部分組成，層析柱系統和檢 測器系統。根據研究對象設計層析柱系統，包括柱體、固定相、流動相(洗脫劑)、 流速等，已形成專門研究領域。檢測器是柱層析系統分析、分離和純化工作的"眼睛"， 主要有紫外(UV)吸收、示差折光、介電常數等。其中紫外吸收檢測器是柱層析系統
應用最廣的檢測器，它有①靈敏度高，最低檢測濃度可達10—"g/mL②受操作條件和外 界環境影響小，適于梯度洗脫③對無紫外吸收的物質組分無響應④非破壞性檢測，可 與其他檢測器串聯使用等特點及優點。既可以用于少量物質的分離鑒定，又可用于大 量物質的分離純化和制備。占據著生物大分子分離純化技術的主導地位，使用率占 70%左右。傳統核酸蛋白層析分離裝置雖然配有280nm、 254nm等波長選擇，但實際使 用時只能選定單一波長進行檢測，因此，傳統層析分離裝置只能利用物質特征波長分 離己知單一組分(蛋白或核酸等)，不能對未知混合組分進行分離，更不能分析蛋白 或核酸的純度。目前使用的大分子層析分離裝置由核酸蛋白檢測儀、層析柱、恒流泵、 部分收集器和記錄儀等部件構成。作為一種簡便的分析分離手段與方法，長期應用于 教學實驗、科學研究和工業生產。在零點調整、靈敏度選擇、讀數換算、使用記錄儀 描譜等環節的操作基本一樣，且僅在單一波長(280nm或254nm)下檢測。只能利用 物質特征波長分離己知單一組分(蛋白或核酸)，不能對未知混合組分進行分離，更 不能分析蛋白或核酸的純度。傳統核酸蛋白檢測儀在操作和技術上普遍存在以下幾方 面不足1、誤差。儀器檢測的第一數據為光透過率值。由于儀器的對數轉換裝置誤 差沒能得到很好的校正補償，實際轉換結果存在較大的誤差。雖然要求使用者在進樣 前一定要進行零點調整，方法為先調整透過率為100%，然后再調吸光度為O，使該 點(T=100%， A=0)兩者符合了朗伯--比爾定律(A=lg(l/T))。但是，無法保證在測 量范圍內(一般取0—2A)都符合朗伯一比爾定律。事實上不同點兩者存在著誤差， 有的誤差超過50%。因此，儀器檢測的科學性得不到保證。2、 讀數。傳統檢測儀為保證測量時讀數在儀器有效測量范圍內，在儀器面板上 都設有靈敏度選擇裝置(2.0A、 l.OA、 0.5A、 0.2A、 0.1A、 0.05A等)，由此會帶來 ①當對未知樣品濃度不甚了解，不知如何選擇靈敏度，需要反復摸索；②儀器顯示值 不是樣品吸光度值，真正吸光度值是儀器顯示數與靈敏度的乘積；③如在測量時改變 儀器的靈敏度將會帶來嚴重后果(基線變化大)。
3、 繁瑣。大多傳統檢測儀在不同靈敏下的測量結果均為0-10mv直流電壓信號， 將此信號輸出到記錄儀上，選擇適當的記錄儀走紙速度，在記錄紙上繪出吸光度譜。 可想而知，記錄紙上的吸光度并非樣品吸光度，也受到儀器靈敏度的調制。要想從記 錄紙上得到吸收峰的面積、歸一化等參數將是一件費工耗時、十分繁瑣的事。再者， 紙質譜圖提供的信息單一且難以保存，更不能直接在文章中插入使用。
4、 單一。傳統檢測儀雖然可能配有280nm、 254nm等波長選擇，但使用時只能選 定單一波長進行檢測，不能同時進行雙波長(280nm和254nm)同步檢測。因此，傳 統層析分離裝置只能利用物質特征波長分離已知組分。需進一步分離未知物質，傳統 層析分離裝置無能為力。
發明內容
本發明目的是為徹底解決傳統層析分離裝置存在的誤差大、讀數不直觀、記錄 儀描譜、只能單波長檢測等問題。提出一種涉及多波長核酸蛋白層析分離和檢測系統。 本發明技術解決方案是多波長核酸蛋白層析分離和檢測方法，紫外光源分光 后成不同波長的兩束單色光，兩束單色光通過光路經狹縫射到核酸蛋白層析分離后的
樣品池，經樣品池分別透射到兩只光電管(R2868)上，光電管經光電轉換得到與透 射光強度成正比例的電信號；先將信號放大，然后進行信號對數轉換，此時得到的信 號與樣品池光吸收成正比例，再經雙通道A/D轉換形成數字信號。紫外光源(包含 UA、 UB、 UC波段)分光后成不同波長的兩束光射入波長(分別為280nm和254nm)， 單色光通過光路(兩組45度反射鏡)經狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上。 光源產生的兩束單色光光路進行檢測的步驟是
1)、在紫外光源內部出口處設有光路選擇裝置，該裝置由步進電機和遮光片組 成，遮光片上開有(二的倍數，如4對)窗口，在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光 射入射相應濾光片；2)、對數放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉換器；3)、通 過控制步進電機的旋轉和A/D轉換器信號獲得實現同步，保證不同波長信號和A/D輸 出相一致；4)、然后對兩路數字信號進行整形變換，送給接口電路。 多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品 池、光電管，信號放大器，對數轉換器，雙通道A/D轉換器構成，紫外光源經至少兩 種干涉濾光片分光后成不同波長的單色光，單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別 透射到光電管上，光電管經光電轉換器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，電 信號接信號放大器進行信號放大，并輸入到對數放大器(轉換器)進行信號對數轉換， 對數轉換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再接雙通道A/D轉換器，A/D轉換器輸出的數字信號；由控制器連接A/D轉換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作 站的接口通信端；電腦工作站進行數據傳輸接收、屏幕繪譜、參數分析、譜圖編輯、 數據保存等工作。
光源產生的兩束單色光結構是在紫外光源內部出口處設有光路選擇裝置，該 裝置由步進電機和遮光片組成，遮光片上開有兩波長光交替輸出對應的(如4對)窗 口，分別對應著兩種波長的單色光輸出。在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光射入濾 光片；對數放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉換器；步進電機帶動遮光片旋轉時 分別在光路中輸出兩種波長的單色光；根據需要本發明亦可以采用三束相異波長的 光。對應的采用三只光電管(R2868)，遮光片上開有(三的倍數，如6對)窗口，在 窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光射入相應的濾光片。
本發明有益效果是本發明以朗伯-比爾定律為依據，在檢測方法、光源設計、 光路轉換進行了設計。在檢測電路包括模擬放大、對數放大、A/D轉換、數字控制、 嵌入式技術以及電腦工作站等方面亦然。經過試驗和用戶試用，完成了"雙波長核酸 蛋白檢測儀"和電腦軟件工作站的研制，配上層析柱、恒流泵、部分收集器等部件， 構成了完整的"雙波長核酸蛋白層析分離檢測系統"。該系統實現了良好檢測效果 本發明在層析過程中用兩種波長(如280nm和254nm)對樣品池液體的吸光度進行實 時同步檢測并設計層析電腦軟件工作站。繪制出信息更加豐富的雙波長層析譜，在雙 波長圖譜中進行比值運算(如用280nm吸光度除以254nm吸光度)，得到蛋白和核酸 的純度圖譜。
1)、吸光度A和透過率T嚴格符合朗伯-比爾定律(A=Lg(l/T))，任意兩者(A 和T)對應誤差小于1%; 2)、系統自動調整吸光度到0.000，透光率到100%; 3)、雙 波長(如280nm和254nm)同步檢測；4)、數據采集、電腦接口 (COM口和USB接口) 和軟件工作站，檢測、采集、軟件工作站一體化系統集成；5)、層析分析軟件具有數 據采集、實時描譜、分析參數、保存、打印、編輯等功能。6)、分析參數有峰高、峰 寬、峰面積、歸一化、保留時間、面積含量、純度、層析柱分辯率等。
四
圖1是本發明硬件構成示意圖 圖2是本發明檢測系統框圖 圖3、 4是兩種檢測圖譜
五具體實施例方式
如附圖所示，根據硬件框圖與，本發明多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由 控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管，信號放大器，對數轉換器， 雙通道A/D轉換器構成，紫外光源經至少兩種干涉濾光片分光分光后成不同波長的單 色光，單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經光電轉換 器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，電信號接信號放大器進行信號放大，并 接對數放大器(轉換器)進行信號對數轉換，對數轉換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再接雙通道A/D轉換器，A/D轉換器輸出的數字信號；由控制器連接A/D轉 換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站的接口通信端；電腦工作站進行數據 傳輸接收、屏幕繪譜、參數分析、譜圖編輯、數據保存等工作。
由紫外光源產生的兩束單色光結構是在紫外光源內部出口處設有光路選擇裝 置，該裝置由步進電機和遮光片組成，遮光片上開有(4對)窗口，在窗口上裝有聚 光透鏡，會聚后的光射入濾光片；對數放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉換器；
本發明以朗伯-比爾定律為依據，在光源設計、光路設計、模擬放大、對數放大、 A/D轉換、數字控制、嵌入式技術以及電腦工作站等方面使用全新設計理念。經過長 時間研究、試驗和用戶使用，完成了 "雙波長核酸蛋白檢測儀"和電腦軟件工作站的 研制，配上層析柱、恒流泵、部分收集器等部件，構成了完整的"雙波長核酸蛋白層 析分離系統"。該系統實現了
1、 吸光度A和透過率T嚴格符合朗伯-比爾定律(A=Lg(l/T))，任意兩者(A和 T)對應誤差小于1%;
2、 系統自動調整吸光度到0.000，透光率到100%;
3、 雙波長(如280nm和254nm)同步檢測；
4、 數據采集、電腦接口 (COM口和USB接口)和軟件工作站，檢測、采集、軟件 工作站一體化系統集成；
5、 層析分析軟件具有數據采集、實時描譜、分析參數、保存、打印、編輯功能；
6、 分析參數有峰高、峰寬、峰面積、歸一化、保留時間、面積含量、純度、層 析柱分辯率等；
(二)由朗伯--比爾定律可知，組分在不同波長下的吸光度值A(入)，只與該組 分下得消光系數K(X)有關，即:A(入l)-K(入l)Cb A(入2):K(入2)Cb
A(入l)/ A(入2):K(入1)/ K(入2) 此比值為一常數。用兩種(如280nm、 254nm)或兩種以上波長對樣品池液體的吸光 度進行同步檢測并進行繪制，得到信息更加豐富的雙波長或多波長層析譜。本發明用 雙波長(如280nm和254nm)進行同步實時檢測，在得到的雙波長圖譜中進行運算(用 280nm吸光度除以254nm吸光度)，就得到蛋白、核酸純度圖譜?？梢灾滥睦锸羌?蛋白(比值大于1.7)，哪里是純核酸(比值小于0.'5)。
圖3為血紅蛋白和核黃素混合樣品溶液2mg，層析柱長20cm，內徑1.0cm,固定 相為葡聚糖凝膠G25，用0.05mol磷酸緩沖液洗脫得到的層析圖譜。由于血紅蛋白和 核黃素分子量不同(血紅蛋白分子量大于核黃素分子量)，在層析柱的停留時間將不 同。第一個峰為血紅蛋白組分，第二峰為核黃素組分，可以看到兩組分已完全分離。
圖4是在圖3基礎上進行比值運算(用280nm (淺色)吸光度除以254nm (深色) 吸光度(黑色)曲線，即A280/A254)后得到的純度譜。文獻指出純度譜中比值 大于1.7部分純蛋白，比值小于0. 5部分為純核酸。因此，樣品里血紅蛋白組分純度 較高，核黃素組分蛋白純度較低。
權利要求
1、多波長核酸蛋白層析分離和檢測方法，其特征是將紫外光源分光后成不同波長的兩束單色光，兩束單色光通過光路經狹縫射到核酸蛋白層析分離后的樣品池，經樣品池分別透射到兩只光電管上，光電管經光電轉換得到與透射光強度成正比例的電信號；先將信號放大，然后進行信號對數放大轉換，此時得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再經雙通道A/D轉換形成數字信號。
2、 根據權利要求l所述的多波長核酸蛋白層析分離和檢測方法，其特征是光源 產生的兩束單色光光路進行檢測的步驟是1) 、在紫外光源內部出口處設有光路選擇裝置，該裝置由步進電機和遮光片組 成，遮光片上開有兩波長光交替輸出對應的窗口，在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的 光射入濾光片；得到兩束單色光；2) 、信號對數放大轉換輸出的兩路電信號輸入到A/D轉換器；3) 、通過控制對步進電機和A/D轉換器實現同步，保證不同波長信號和A/D輸 出相一致；4) 、然后對兩路數字信號進行整形變換，送給信號處理的接口電路。
3、 多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫外光源、干涉濾光片分 光、樣品池、光電管，信號放大器，對數轉換器，A/D轉換器構成，其特征是采用雙 通道A/D轉換器，所述紫外光源是經兩干涉濾光片分光后成不同波長的兩束單色光的 紫外光源，兩束單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經 光電轉換器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，所述電信號接信號放大器進行 信號放大，并接對數轉換器進行信號對數轉換，對數轉換得到的信號與樣品池光吸收 成正比例，再連接雙通道A/D轉換器，雙通道A/D轉換器輸出數字信號；由控制器連 接A/D轉換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站的信號處理的接口電路。
4、 根據權利要求3所述的多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，其特征是光源產生的兩束單色光結構是在紫外光源內部出口處設有光路選擇裝置，該裝置由步進 電機和遮光片組成，遮光片上開有4對窗口，分別對應著兩種波長的單色光輸出，在 窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光射入濾光片；對數放大器輸出的兩路電信號輸入到 A/D轉換器；設有步進電機帶動遮光片旋轉，分別在光路中輸出兩種波長的單色光。
全文摘要
多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管，信號放大器，對數轉換器，A/D轉換器構成，采用雙通道A/D轉換器，所述紫外光源是經兩干涉濾光片分光后成不同波長的兩束單色光的紫外光源，兩束單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經光電轉換器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，所述電信號接信號放大器進行信號放大，并接對數轉換器進行信號對數轉換，對數轉換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再連接雙通道A/D轉換器，雙通道A/D轉換器輸出數字信號；由控制器連接A/D轉換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站的信號處理的接口電路。
文檔編號G01N21/59GK101620182SQ200910032840
公開日2010年1月6日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者徐順利 申請人:南京大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
