專利名稱：細胞測定套件和方法
技術領域：
本發明是針對一種細胞測定套件和方法，用于確定在一種細胞樣品中給定類型的 細胞的存在和/或濃度，并且特別是在該樣品中存在至少一個所選定的閾值水平的細胞。
背景技術：
多種疾病病況，包括對一種疾病狀態的治療的反應，可以通過血液學標志物、使用 在一種血液樣品中某些白血細胞的近似濃度作為針對該疾病的身體反應的一種指示物進 行監測。例如，在一種血液樣品中⑶4+T-淋巴細胞的濃度可以為HIV感染之后AIDS的爆 發提供一種標志物。低于約200個細胞/μ 1的細胞計數表示了一種受到嚴重削弱的免疫 系統，以及因此對立即開始(例如)抗逆轉錄病毒治療(ART)的需要。一些疾病病癥(例 如，病毒或細菌感染)的特征是增加濃度的血液白細胞，例如超過約10，000個細胞/μ 1血 液，因此這可以充當一種傳染性疾病狀態的指示物。相反地，在一個患有白血病或正在進行 化療或放療的個體中，在一種血液樣品中白細胞的濃度可以被降低，例如低于約4，000個 細胞/μ 1血液。在這些和其他特征為降低或升高的水平的一種白細胞類型的疾病病癥中， 可以將這些標志物細胞的水平用于檢測或證實一種病癥、或監測身體對該病癥的治療的反 應。目前，存在著兩種通用的血液學方法，這些方法通常被用于確定在一種細胞樣品 中給定細胞的濃度。在第一種方法中，所感興趣的細胞類型用一種標志物進行標記，該標志 物特異性地結合到該細胞類型上，典型地是一種抗原特異性抗體。然后，用一種細胞計數器 (例如，一臺流式細胞儀或一臺熒光活化細胞分選儀(FACS))對該細胞樣品進行分析，以便 確定具有該表面結合標志物的細胞的百分數。第二種通用的方法是標記所感興趣的細胞并且通過顯微鏡檢測來檢查一種代表 性細胞的體積，對標記的以及未標記的細胞的數目進行計數以便確定所感興趣的細胞類型 的百分數。在這兩種方法中，特別是其中希望確定一種給定的白細胞類型的濃度時，可以首 先對該細胞樣品進行處理以去除紅細胞或其他不需要的細胞。以上概述的方法非常適合于實驗室或診所，在那些地方良好訓練的實驗室人員以 及細胞分選或組織學設備是可供使用的。然而，它們不能使其自身容易地用于現場條件，例 如第三世界國家中的店面診所、或野外診所，在那里沒有經過訓練的實驗室人員或尖端的 細胞分選或顯微鏡設備。例如，在更為貧困的非洲地區，這些方法可能不太適合于對大量的 人群測試CD4+T細胞計數，作為HIV感染之后AIDS爆發的一種指示物，或者不太適合于一 個人對(例如)抗逆轉錄病毒藥物的反應。因此，令人希望的是提供簡單、快速、廉價的套件和方法用于對疾病相關的細胞(例如，在一種血液樣品中所選出的白細胞)確定細胞計數。具體地，這種方法和套件應當 可以僅用最少的訓練來容易地進行操作，并且需要極少的實驗設備或不要求特別的實驗設 備，例如，超過一臺簡單的(例如)手動驅動的臺式離心機。
發明內容
一方面，本發明包括一種用于對細胞樣品測定存在至少一個閾值濃度的給定類型 細胞的方法。該方法包括以下步驟(a)將含有該給定細胞類型的多個細胞的一種細胞樣品與多個顆粒進行反應，這 些顆粒能夠特異性連接到這些細胞上并且當與這些細胞相連接時對于增加這些細胞的密 度或磁化率是有效的，從而允許在一種重力或所施用的離心力或磁場力的影響下基于它們 的穿過一種選定介質的更大的遷移速率將該樣品中的結合顆粒的細胞以及游離的顆粒與 無顆粒結合的細胞分開，(b)使該細胞樣品中的這些結合顆粒的細胞與顆粒遷移穿過一個長形的收集室， 該收集室含有該選定的介質并且沿著它的長度具有多個細胞收集區，通過使該樣品受到一 種重力或所選定的離心力或磁場力持續一段時間，該時間足以使這些結合顆粒的細胞以及 顆粒完全填滿該收集室中的依次的細胞收集區，并且(c)檢查該室以便確定該至少一個選定的收集區是否部分地或完全被填滿，作為 該細胞樣品含有至少一個閾值濃度的給定細胞類型的細胞的證據。在一個通用的實施方案中，該收集室包括一個收集柱，該柱中的收集區包括沿著 該柱的一部分的多個限定長度的片段，并且這些收集區在步驟(b)中沿著該收集室的柱長 度以下游至上游的方向被依次地填滿。在另一個通用的實施方案中，該收集室包括一個長形的收集管；以及在該收集 管中形成這些收集區的、在該管中所安排的多個空腔，這樣將在步驟(b)中以上游至下游 的方向遷移穿過該管的細胞在最上游的空腔中被捕獲直到填滿，在這之后以上游至下游的 方法依次地填滿這些空腔。這些顆粒當在步驟(a)中與這些細胞相連接時對于用一種可檢出的報告基因對 這些細胞進行標記是有效的，并且所述檢查包括對該收集室肉眼檢查存在用該可檢出的報 告基因標記的細胞。該方法中步驟(b)包括通過將該室置于一個基本上直立的垂直布置的位置上使 這些結合顆粒的細胞受到重力，或使這些結合顆粒的細胞受到一種離心力。在這些實施方 案中，該選定密度的介質具有一種密度，該密度大于該樣品的密度并且低于這些顆粒的密 度，并且這些顆粒可以是基本上球形的金屬顆粒，這些顆粒具有優選的直徑，這些直徑在所 選定的約0. 05至5微米的大小范圍內，優選地在0. 2至5微米范圍內。可替代地，在該方法中步驟(b)可以包括使這些結合顆粒的細胞受到磁場力。在 該實施方案中，該選定密度的介質具有一種密度，該密度大于該樣品的密度，并且這些顆粒 可以是基本上球形的磁性(鐵磁或順磁)顆粒，這些顆粒優選地具有的直徑為在約5至 10，OOOnm之間，優選地在5至50nm范圍內。在該方法中步驟(b)可以進一步包括將該含有結合顆粒的細胞的樣品加入到該 收集室的一種界面區上游，并且將該樣品中的細胞與在該界面區中的一種選定密度的介質進行物理混合。當該細胞樣品是一種血液樣品時，這些顆粒可以使表面結合的結合蛋白能夠與一 種血細胞特異性抗原(例如，與特征為一種或多種特異性細胞類型的抗原)進行免疫反應。 這些顆粒可以受到表面處理以降低血液樣品中的顆粒聚集。為了檢測來自一個可能感染HIV的個體的血液樣品中⑶4+T淋巴細胞的濃度，作 為該個體的T細胞種類的一種指示物，反應步驟(a)是通過將來自該個體的一種血液流體 樣本暴露于具有表面結合的抗-CD4+結合劑的顆粒來進行的，并且步驟(c)可以基于觀察 到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表CD4+T-淋巴細胞的濃度，該濃度在一種選定 的200-750個細胞/μ 1血液的閾值范圍內，例如，250、350、450、或750個細胞/μ 1血液的 閾值。在一個實施方案中，步驟(a)可以進一步包括將該樣品中的細胞與能夠特異性地 結合到單核細胞上的CD14抗原上的第一批顆粒進行反應，并且與能夠特異性地結合到T淋 巴細胞和單核細胞上的CD4抗原的第二批顆粒進行反應，由此在這些T淋巴細胞上給予增 強的密度，并且在這些單核細胞上給予增強的密度以及磁化率，并且步驟(b)可以進一步 包括首先將結合顆粒的單核細胞從該細胞樣品中去除，這是通過施用一種磁力來進行的， 該磁力對于將這些結合顆粒的單核細胞從結合顆粒的T淋巴細胞中選擇性地去除是有效 的。兩種顆粒還可以按照已限定的比率同時進行施用，確保了在統計學上這些單核細胞與 具有磁化率的至少一種顆粒進行結合。其他去除不令人希望的細胞(具有與這些靶細胞相 同的表面標志物)的可能的方法是i)用空間大的珠粒掩蔽這些目標表面標志物，這些珠 粒對這些干擾細胞類型上的其他非目標表面標志物具有親和性(例如，在將該樣品暴露于 這些抗-⑶4珠粒之前使用非致密的、并且不受磁性影響的抗⑶14珠粒首先涂覆這些單核 細胞)，由此由于這些抗CD14珠粒覆蓋這些單核細胞的遮蔽作用來防止這些抗CD4珠粒與 這些單核細胞上的CD4標志物相結合。ii)通過其他手段(例如，使用抗體介導的四聚體抗 體復合物，這些復合物對例如CD14抗原以及紅細胞表面標志物均具有特異性)來遮蔽不令 人希望的細胞上的目標表面標志物，由此遮蔽這些單核細胞，這是通過用一個致密層的紅 細胞將它們覆蓋來進行的。iii)這些干擾性非目標細胞能夠通過特異性地捕獲這些細胞、 通過一種固體基質(含有，例如對抗僅在這些干擾細胞上存在的表面標志物的抗體)而被 去除。例如，抗CD14抗體可以被固定在一種過濾基質上。在將該血液樣品暴露于該過濾基 質之后，這些單核細胞通過結合到該基質上而從該血液樣品中棄去，在這之后將該血液樣 品暴露于抗CD4顆粒。為了對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行檢測，該個體可能患有一種 導致血液中白細胞升高的傳染病或其他病癥，反應步驟(a)是通過將來自該個體的一種血 液流體樣本暴露于具有表面結合的抗白細胞結合劑的顆粒來進行的，并且步驟(c)可以是 基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表白細胞大于約10，000個細胞/μ 1 血液的濃度。為了對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行監測，該個體由于化療、放 療或白血病可能在血液中具有降低的白細胞數目，反應步驟(a)可以是通過將來自該個體 的一種血液流體樣品暴露于具有表面結合的抗_白細胞結合劑的顆粒來進行的，并且步驟 (c)可以是基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表白細胞小于約4，000個
8細胞/μ 1血液的濃度。為了對來自一個個體的血液樣品中嗜中性細胞的濃度進行監測，該個體由于化療 或干擾素治療可能在血液中具有降低的嗜中性細胞數目，反應步驟(a)可以是通過將來自 該個體的一種血液流體樣品暴露于具有表面結合的抗_嗜中性細胞結合劑的顆粒來進行 的，并且步驟(c)可以基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表嗜中性細胞 在一個選定的在500至2，500細胞/y 1血液之間的范圍內的濃度。為了對來自一個感染的個體的體液樣本中細菌細胞的濃度進行檢測，作為感染的 程度和類型的一種指示物，反應步驟(a)可以是通過將該個體的一種體液樣品暴露于具有 一種表面接合的結合劑的顆粒來進行的，該結合劑能夠特異性地與一種或多種選定的細菌 壁抗原相結合，并且步驟(c)可以是基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在對 應于在該血液樣品中一種可檢出濃度的細菌細胞。另一方面，本發明包括了一種用于對細胞樣品測定在該樣品中存在至少一個閾值 濃度的選定細胞類型的細胞的套件。該套件包括(a) 一種測定裝置，該測定裝置具有一個用于接受該細胞樣品的樣品室、以及與其 進行流體相通的一個長形的收集室，該收集室含有一種選定的介質并且沿著它的長度具有 多個細胞收集區。(b) 一些顆粒，這些顆粒當被加入到該細胞樣品中時能夠特異性連接到該選定細 胞類型的細胞上，并且這些顆粒當連接到這些細胞上時對于增加這些細胞的密度或磁化率 是有效的，從而允許在一種重力或選定的離心力或磁場力的影響下使該細胞樣品中的結合 顆粒的細胞以及顆粒優先地遷移穿過該長形的收集室，直到基本上所有這些結合顆粒的細 胞以及顆粒完全填滿該收集室中依次的細胞收集區，并且(c)與該裝置收集室上的至少一個收集區相關聯的一種或多種標記，這種或這些 標記表示該選定類型的細胞對于至少部分地填滿該收集區有效的濃度，這是當結合顆粒的 細胞以及游離的顆粒被牽引穿過該收集室時進行的。在不同的實施方案中(1)該收集室包括一個收集柱，該柱中的收集區包括沿著 該柱的一部分的多個限定長度的片段，并且這些收集區被適配為沿著該收集室的柱長度以 下游至上游的方向被按步驟依次地填滿；(2)該收集室包括一個長形的收集管；以及在該 收集管中形成這些收集區的、在該管中所安排的多個空腔，并且這些收集區被適配為沿著 該柱長度以上游至下游的方向被依次地填滿；(3)該收集室包括一個收集管，該收集管具 有多個相對成角度的流動片段；以及在該收集管中形成這些收集區的、在鄰近的流動片段 之間所安置的多個有邊緣(rimmed)的空腔，這樣使得以上游至下游的方向從一個流動片 段遷移到另一個流動片段的細胞在這兩個流動片段之間的空腔中被捕獲，直到該空腔被填 滿；(4)該收集室包括一個收集管，該收集管在一種重力之下相對于該管中的結合顆粒的 細胞的流動方向成角度；以及在該收集管中形成這些收集區的、沿著該管的一個外表面部 分所安置的多個空腔，這樣使得以上游至下游的方向遷移穿過該收集管的細胞在最上游的 空腔中被捕獲直到被填滿，并且(5)該收集室包括一個流動管，該流動管在一種重力下相 對于結合顆粒的細胞的流動方向基本上橫向地延伸；以及在該收集室中形成這些收集區 的、沿著該流動管的長度所安置的多個空腔，這樣使得以上游至下游的方向流動穿過該流 量管的細胞沉淀進入到該最上游的空腔中直到填滿，在此之后以上游至下游的方向依次地將這些空腔填滿。該裝置進一步包括一個與該樣品室相通的捕獲室，并且顆粒(b)包括一種第一類 型的、能夠與在該選擇類型的細胞以及一種非選定類型的細胞上呈遞的一種抗原進行特異 性結合的顆粒，以及一種第二類型的、能夠僅與該非選定類型的細胞上呈遞的一種抗原進 行特異性結合的顆粒，允許在該選定類型的細胞遷移之前將結合到第二種類型的顆粒上的 顆粒通過遷移到該捕獲室中而被選擇性地去除，這些細胞僅結合到該第一類型的顆粒上以 便選擇性地遷移到該收集室中。當這些結合顆粒的細胞被適配為在一種重力或所施用的離心力的影響下遷移穿 過該收集區時，這些顆粒可以是基本上球形的金屬顆粒，這些顆粒所具有的直徑在優選選 擇的在約0. 2至2um之間的大小范圍內。為了對一種血液樣品中的一種給定類型的細胞進 行檢測，這些顆粒可能具有能夠與一種血細胞特異性的抗原進行免疫反應的表面結合的結 合蛋白。這些顆粒受到表面處理以降低血液樣品中的顆粒聚集，例如用一種親水性聚合物 涂層(例如，聚乙二醇聚合物鏈)進行涂覆。當這些結合顆粒的細胞被適配為在一種磁場力的影響下遷移穿過該收集區，這些 顆粒是基本上球形的磁性顆粒或順磁顆粒，這些顆粒所具有的直徑在一個優選選擇的在約 5至-50nm之間的大小尺寸范圍內。為了對來自一個可能感染HIV的個體的血液樣品中⑶4+T-淋巴細胞的濃度進行 檢測，作為該個體的T細胞種類的一種指示物，這些顆粒具有表面結合的抗CD4+結合劑，并 且所述標記被設計為表示⑶4+T淋巴細胞約200個細胞/ μ 1血液的濃度以及約500個細 胞/μ 1血液的細胞濃度。為了對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行檢測，該個體可能患有一種 導致該血液中白細胞升高的傳染病或其他病癥，這些顆粒具有表面結合的抗白細胞結合 劑，并且這些標記被設計為表示白細胞大于約10，000個細胞/ μ 1血液的濃度。為了對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行監測，該個體由于化療、放 療或白血病可能在血液中具有降低的白細胞數目，這些顆粒可能具有表面結合的抗白細胞 結合劑，并且這些標記被設計為表示白細胞小于約4，000個細胞/ μ 1血液的濃度。為了對來自一個個體的血液樣品中嗜中性細胞的濃度進行監測，該個體由于化療 或干擾素治療可能在血液中具有降低的嗜中性細胞數目，這些顆粒具有表面結合的抗嗜中 性細胞結合劑(例如，⑶16)，并且這些標記被設計為表示嗜中性細胞在一個選定的500至 2，500個細胞/ μ 1血液的范圍內的濃度。為了對來自一個感染個體的血液或尿液樣品中一種細菌感染的存在進行檢測，這 些顆粒可能具有能夠與一種細菌壁抗原進行特異性結合的表面結合的結合劑，并且這些標 記被設計為表示在血液或尿液樣品中細胞的存在。該套件可以進一步包括一種裝置支持器，該支持器用于支持該裝置并且對所支持 的裝置施用一種離心力或磁場力。本發明的這些和其他連同特征當結合附圖閱讀以下本發明的詳細說明時應當變 得更加完全清楚。
圖1是在一個通用的實施方案中形成本發明的套件的一部分的測定裝置的平面圖；圖2展示了在一個通用的實施方案中以本發明的測定套件的操作為基礎的結合 以及細胞遷移事件；圖3A至3C示出了在一個第二通用的實施方案中本發明的裝置的收集室的側視截 面圖，其中該收集室包括多個成角度的流動片段以及安置在鄰近的流動片段之間的有邊緣 的空腔(圖3A和3B)，并且其中該收集室在一種所施用的力之下相對于在該管中結合顆粒 的細胞的流動方向成角度，并且具有沿著該管的一個表面部分所安置的多個空腔；圖4展示了結合顆粒的細胞在圖3B中所展示的裝置的空腔中以上游至下游的方 向依次進行的累積；圖5是在本發明的一個第三通用的實施方案中該收集室的側視截面圖；圖6展示了根據本發明的一種檢測裝置用于檢測一個個體內CD4+細胞的閾值水 平的用途；圖7A至7C在示意圖(7A)、攝像圖(7B)、以及熒光讀取圖(7C)中示出了根據本發 明的方法所進行的一種測定操作的末端；圖8示出了在本發明的測定方法中僅針對珠粒(左道)、以及IxlO5個細胞(中 道)、以及5x10s個細胞(右道)的末端結果；圖9A至9B展示了使用一種兩室裝置的測定，該裝置允許初步去除一種不需要的 細胞類型，該細胞類型與所感興趣的細胞類型共有一種關鍵的表面抗原；并且圖IOA至IOC展示了在一種適合于通過沉淀(IOA)、或在所施用的離心力(IOB)或 磁場力(IOC)之下進行細胞遷移的支持器中的樣品裝置。
具體實施例方式I.定義除非另外說明，以下術語在此具有以下含義一種“細胞樣品”指在含有或懷疑含有一種或多種處于懸浮狀態的細胞類型的任 何液體樣品。一種細胞樣品包括一種“體液樣品”，該體液樣品是指例如從人類或其他動物 體獲得的血液、尿液、或唾液樣品。一種血液樣品可以是全血或經處理的血液、或其中所有 或大量的紅細胞已被去除的全血。其他可能的細胞樣品包括例如從組織樣品、廢水獲得的 細胞培養物、細胞提取物。懷疑含有細胞的細胞樣品包括例如用一種不需要的(例如)細 胞或細菌類型污染的牛奶和其他食物。在一種細胞樣品中細胞的“濃度”是指在一個給定的細胞樣品體積中細胞的數目。 該術語被典型地表達為每個樣品體積的細胞數目。一種“給定類型的細胞的閾值水平或濃度”是指在一個給定體積的樣品中所含有 的細胞的閾值數目，也表示為細胞濃度，例如CD4+細胞的數目大于500個細胞/ μ 1血液樣 品，或CD4+細胞的數目小于200個細胞/ μ 1血液樣品。細胞的“沉淀”指在一種液體懸浮液中顆粒在重力的影響下從該懸浮液中沉降出、 或者沉降到該懸浮液的底部或進入不同密度或粘度的另一種液體介質中。—種“給定類型”的細胞或“分析物”細胞是指在一種樣品中其濃度有待測定的細胞。這些細胞可以是細菌性或病毒性顆粒(例如，來自一種體液樣品)、哺乳動物細胞(例 如，下表中列出的白細胞類型)或細胞碎片(例如，血小板)、來自一種血液樣品、組織或器 官衍生的哺乳動物細胞(例如，由一種實體瘤或其他組織腫塊所衍生的癌細胞)、所培養的 或其他的分離的植物或動物細胞、來自單細胞真核生物的細胞(例如，酵母細胞)、以及在 一種工業的、環境的或城市的樣品中所含有的細胞(例如，土壤或廢水樣品中所含有的細 菌)。一種給定類型的白細胞其特征可以典型地是細胞表面特異性抗原標志物(例如CD)， 這些⑶抗原標志物是在下表中所表示的白細胞類型的特征。
細胞類型⑶標記物干細胞CD34+, CD31-所有白細胞的基團CD45+粒細胞CD45+，CD15+單核細胞CD45+，CD14+T淋巴細胞CD45+, CD3+T輔助細胞CD45+，CD3+, CD4+細胞毒性T細胞CD45+，CD3+,CD8+B淋巴細胞CD45+，CD 19+or CD45+，CD20+凝血細胞CD45+，CD61+自然殺傷細胞CD16+, CD56+, CD3-細胞的“遷移”是指細胞在一種重力或所使用的離心力或磁場力的影響下穿過一 種介質(典型地具有一種選定的密度)的移動。顆粒(例如，金屬顆粒)對于增加這些顆粒所連接的細胞的密度是有效的。這些 細胞以及所連接的顆粒與單獨這些細胞相比具有一種結合的更大的密度，例如通過這些細 胞以及所結合顆粒在一種重力或所施用的離心力的影響下穿過一種給定密度的介質的更 高的遷移速率作為證據。磁性顆粒(包括鐵磁性和順磁性顆粒)對于增加這些顆粒所連接的細胞的磁化率 是有效的，條件是這些細胞以及所連接的顆粒與單獨這些細胞相比具有一種更高的結合的
12磁化率，例如通過這些細胞以及所連接的顆粒在一種所施用的磁場力的影響下穿過一種給 定密度和/或粘度的介質的更高的遷移速率作為證據。“磁化率”是被置于一個均勻磁場中的身體的磁化強度的一種量度。“微通道”或“微量通道或柱”是指一種通道或柱，它所具有的尺度在微尺度范圍 內，典型地在10至500之間，例如寬度和深度為50至100微米。II.測定裝置和套件圖1示出了根據本發明的一個實施方案所構建的細胞測定套件20。該裝置包括一 個襯底或背板22，該裝置的其他元件安裝或結合其上。例如，以下說明的某些儲蓄槽和通 道元件可以作為微流體元件結合到該襯底上，該微流體元件根據熟知的方法在兩個襯底板 之間形成，例如其中該儲蓄槽和通道元件在下層板24中形成作為凹槽，該下層板用一個上 層蓋板26覆蓋。在一個優選的實施方案中，該裝置的室和連接性微通道是由一種光滑表面 的材料(像玻璃或硬聚合物材料)構建的，并且該室和通道表面用一種涂層涂覆從而將細 胞與這些通道壁的非特異性連接最小化。例如，這些通道壁可以用如在美國專利5567440、 6884628和5462990中所說明的聚乙二醇化的多離子性共聚物進行涂覆。可以采用本領域 內已知的其他涂層來降低或防止細胞與這些通道壁的非特異性或不希望的粘附，這些涂層 例如基于以下各項的涂層特異性硅烷、烷硫醇自組裝的單層、PEG共聚物、表面活性劑以 及無機層或被動吸附蛋白(例如，BSA或血清)。如在這些圖中所見，該裝置包括一個取樣頭28，它被設計為吸取一種細胞樣品，例 如通過毛細管作用、通過將該頭浸入該樣品中。該取樣頭可以是一種指尖刺血針或其他毛 細管結構用于抽取一個固定體積的樣品。該取樣頭是通過一個微通道管32而與一個樣品 室30相連接的。該樣品室可以用給定體積的顆粒懸浮液進行預先裝滿，這些顆粒(i)能夠 特異性與有待檢測的給定類型的細胞相連接(ii)當連接到這些細胞上時，實質上增加了 這些細胞的密度或磁化率，例如將一種實質上更高的密度或磁化率給予這些顆粒所結合的 細胞。適合于在本發明中使用的顆粒將參照圖2在以下進行說明。圖1中所示的裝置以及 在具有該樣品的樣品室種所含有的或加入到其中的顆粒在此也一起被稱為一種測定套件。在該裝置中一個溢流的儲液槽34通過一個微通道管36與樣品室30連接，并且發 揮作用以便當一個給定體積的樣品加入到該裝置時接受溢流的液體。該樣品室沿著它的下 端與一個界面室38相通。正如所見，圖1中室38是僅從一側以向下的方向成錐形；圖2中 一個等效功能的界面室38’是從該樣品室的兩側對稱地成錐形；并且在圖6中，一個界面區 對應地形成為分離室38”、39”。圖1中室38 (或圖2中室38，或圖6中室39”)的下端與一個長形的收集室40流 體相通。在圖1、2、以及6中所示的通用的實施方案中，該收集室是一個長形的微通道，該微 通道沿著該柱的長度具有多個限定長度的片段，例如通過一對標記物、或標記(例如，沿著 該柱的長度所展示的標記物44)所定義的片段42。如圖2中所見，通過這些展示的標記所 表示的這些柱片段或區域用來確定該樣品的細胞數目、或細胞計數，正如通過已經遷移入 該柱的細胞的塞子的頂部的高度所測定。因此，沿著該柱的長度所展示的標記提供了這些 測定結果的讀數。盡管在此沒有示出，該裝置可以裝配有一個透鏡元件，該元件被放置在該 收集室的前面用于增強在該細胞區中細胞的檢測。還考慮了根據已知的方法通過分光鏡監 測或電子監測來檢測該收集室中細胞的水平，盡管所展示的實施方案的一個優點是該測定讀數可以通過對該收集室中細胞的分布進行簡單地目測來測定。正如從以下說明的測定操作中應當理解，在該收集室中所收集的細胞的總體積將 反映具有結合的顆粒以及游離顆粒的細胞的組合體積。在更大的顆粒的情況下，例如在0. 5 至5微米尺寸范圍內，這些顆粒可以在該收集室中為細胞的總體積作出一種可測量的貢 獻。在這種情況下，這些顆粒的體積貢獻可以通過在這些儲水槽片段中提供一個“零”片段 而被補償，該“零”片段對應于單獨加入的顆粒的體積。在這種配置下，具有結合顆粒的細 胞加上任何的游離顆粒的總體積將被假定為等于游離顆粒的總體積加上未結合顆粒的天 然細胞的總體積。其中這些顆粒是相當小的，例如對于小的磁顆粒，這些顆粒的體積貢獻可 以是忽略不計的，在這種情況下可能不存在針對顆粒體積的作用來調節這些儲水槽體積的 需要。然而，甚至在相對小顆粒的情況下，如果將大量過量的顆粒加入到這些細胞中，例如 以便確保在含有高濃度的分析物細胞的樣品中的完全反應，這些顆粒可以為這種已測量的 堆疊或消除體積作出相當可觀的貢獻，需要調節儲水槽體積以補償顆粒體積。可以容易地 確定該顆粒體積的作用，例如通過對有待穿過該收集室加入到該樣品中該量值的顆粒進行 離心，并且測量單獨這些顆粒的體積貢獻。完成在圖1中所示的說明，將一個填充口 46通過一個微通道48與柱40的下端連 接，允許該柱和界面區在制造時或恰好在測定之前被一種適當密度的介質填滿。在一個通 用的實施方案中，其中細胞在重力或所施用的離心力之下遷移穿過該介質，該介質具有一 種特異性的密度，該密度低于在該樣品室中形成的連接顆粒的細胞的密度，并且優選地等 于或大于未連接這些顆粒的樣品細胞的密度。圖2和3展示了以該裝置的操作為基礎的細胞反應和遷移的事件。在圖2中，樣品 室30用一種給定的預先存在的反應顆粒或珠粒的懸浮液進行填充，并且接受一個限定體 積的樣品來填充該室，或者接受一個定義組合體積的預先混合的樣品并且與一個給定體積 的顆粒懸浮液進行預反應。當這些細胞在一種重力或所施用的離心力之下被允許遷移進入 并且穿過該收集室時，加入這些樣品細胞的顆粒是相對高密度的，典型地大于約5gm/CC，并 且是通過金屬、陶瓷材料、高密度玻璃、以及類似物來形成的。這些顆粒例如通過共價連接、 用一種結合劑進行涂覆，該結合劑在該檢測中能夠特異性高親和性與一種細胞表面抗原相 結合，該抗原對于所感興趣的細胞是獨特的。因此，例如在針對CD4+細胞的測定中，這些顆 粒可以用對CD+抗原特異性的抗體(例如，單克隆抗體)進行涂覆。多種細胞抗原特異性抗體是可商購的、或者是通過已知的單克隆抗體方法容易獲 得的。一種示例性的顆粒是一種1微米的金微顆粒，該金微顆粒具有經由這些顆粒表面上 的胺或羧基化學基團所連接的單克隆抗體，并且具有一種密度，該密度接近金的密度，約 19.3克/(^。其他顆粒包括其它金屬、氧化物或聚合物(的微米尺寸或膠體的顆粒例如， 鐵、銀、玻璃、硅或PTFE的微米顆粒或納米顆粒)，連同銀或金的SERS (表面增強的拉曼光譜 學)顆粒、聚合物涂覆的金屬顆粒、以及量子點。這些顆粒還可以對于用一種可檢出的報告 基因標記這些細胞是優選地有效的。該報告基因可以是該顆粒其本身，例如以濃縮形式可 以容易地看到的金顆粒，或可以是一種加入的標簽，例如，一種熒光標記，它直接與這些顆 粒連接或連接到涂覆這些顆粒的結合劑上。適用于在生物學應用中使用的、并且具有適合 于加入細胞特異性結合劑的表面化學基團的磁性或順磁的顆粒是熟知的，并且容易例如從 invitrogen(Carlsbad, CA)獲得0
14
這些顆粒可以受到額外地表面處理或涂覆以降低這些顆粒在懸浮狀態下自身聚 集的趨勢。在一個示例性的方法中，這些顆粒用一種親水性聚合物涂覆，優選在一種水性 介質中高度溶劑化的一種聚合物，例如聚乙二醇聚合物鏈。用于制備具有表面反應性基團 (例如，醇、酸、或胺基基團)的顆粒、將聚合物鏈連接到此類基團上的方法是已知的。在圖2中，非分析物細胞(例如細胞50)是用空心方塊表示的，分析物細胞(例如 細胞52)是用空心圓圈表示的，細胞結合的顆粒(例如顆粒54)是用實心圓圈表示的，并且 結合顆粒的細胞(例如細胞56)是用加深的空心圓圈表示的。最初，該樣品和顆粒可以在 一個單獨的試管中預混合并且反應，然后一起加入該樣品室中，允許這些反應的細胞從該 樣品室穿過該沉淀區沉淀到該收集室中。可替代地，可以將該樣品直接加入到該樣品室用 于與該樣品室中的顆粒進行反應，在這種情況下，該裝置可以被放置于一個水平位置以防 止在該細胞結合反應完成之前顆粒和細胞免于沉淀到該收集室中。在一個適當的反應時間(例如10分鐘)之后，該裝置被放置在一個適當的支持 器上用于促進這些具有結合顆粒的細胞的遷移以便遷移進入該收集室，如圖10A-10C中所 展示。當顆粒遷移穿過該收集區是在重力之下提供沉淀時，該支持器僅發揮作用來將該收 集室放于一個直立的、并且優選地垂直地直立位置，如圖IOA中所示，其中檢測裝置140 (具 有一個收集室140)被放置在一個桌面支持器144中，該支持器144被適配為在一種基本上 垂直、直立的位置中支持該裝置。當顆粒遷移是通過離心時，該支持器可以僅是一個管支持 器，該管支持器被適配為放置在一臺離心機的頭部，例如一臺典型的臺式離心管支持器，如 圖IOB中所示。在此，檢測裝置146 (具有一個收集室148)是(例如)通過在該裝置的相 對側接受套接口、通過一個U形叉152的可伸展臂151而接合的，該U形叉是用于圍繞著一 臺離心機的軸150進行旋轉，用于圍繞該軸心線旋轉。例如，該離心機可以是一臺廉價的手 動驅動的臺式離心機。因此，該離心機和所連接的叉子在本實施方案中充當該裝置的支持 器。當顆粒遷移是通過一種磁場的施用時，該支持器可以僅僅是一個臺架，該臺架在其底座 上具有一個永磁體或電磁體，如圖IOC中所示，它展示了一個測定裝置154，該測定裝置具 有直立地安裝在一個臺架158的一個收集室156。在該臺架的底端的一個永磁體160用于 將磁珠結合的細胞牽引進入并且穿過該收集室。在每種方式中，該測定促進了結合顆粒的 細胞(以及游離的顆粒)遷移進入并且穿過該界面區(室38’)并且進入柱40中，其中這 些細胞積累到一種最終深度，該深度與在加入的樣品中結合顆粒的細胞數目成正比。對沿 著該柱所顯示的標記進行校準以表示該細胞數目，優選地表示一種細胞濃度、對應于一個 給定的樣品體積。根據本發明，在每個實施方案中所示的支持器可以形成一種測定套件的 一部分，該套件還包括該測定裝置以及與該細胞樣品進行反應的細胞特異性顆粒。在本發明的另一個實施方案中，如圖9A和9B中所展示，該細胞樣品含有具有一個 給定細胞表面標志物的分析物細胞以及具有分析物細胞標志物連同一種第二細胞特異性 標志物這兩者的不需要的細胞。為了說明的目的，將說明對于一種血液樣品中CD4+T細胞 的細胞測定。該樣品中的細胞含有CD4+T細胞以及具有表面CD4抗原的不需要的單核細 胞，同時這些單核細胞額外地含有⑶14表面抗原。該細胞樣品與涂覆著對抗這兩種抗原之 一的抗體的重顆粒進行反應，與涂覆著對抗這兩種細胞表面抗原之外的抗原的抗體的磁珠 進行反應。該檢測裝置(顯示為130)包括一個或多個樣品接受和界面區136、一個收集室 136、以及一個捕獲室134，用于收集不需要的單核細胞。
在圖9A中所展示的測定中，該細胞樣品與重顆粒(例如，金顆粒)的混合物進行 反應，這些顆粒與⑶4抗原進行免疫反應，并且因此將與⑶4+T細胞和⑶4+單核細胞相結 合，并且與磁珠進行反應，這些磁珠與⑶14進行免疫反應，并且因此將與這些⑶4/⑶14單 核細胞進行反應。一個適當的反應時間后，這些結合顆粒的細胞被允許在重力之下在該裝 置中沉淀。當這些細胞沉淀時，在該捕獲室附近所施用的一個磁體138牽引不需要的單核 細胞進入該捕獲室，釋放這些CD4+T細胞沉淀進入不需要的單核細胞的收集室中。在圖9B中說明的測定中，這兩種顆粒的作用是相反的，其中這些重顆粒是對抗 CD14進行免疫反應的，而這些磁珠是對抗CD14抗原進行免疫反應的。在這些細胞與這兩種 顆粒類型反應之后，該檢測裝置如所示是成角度的，允許用這些重顆粒標記的單核細胞沉 淀進入捕獲室134，將這些細胞從這些CD4+T細胞中去除，它們被該室下端的磁體138牽引 進入該收集室。圖3A-3C展示了在像以上說明的、但根據本發明的一種第二通用的實施方案所構 建的一個細胞沉淀測定裝置中的收集室構型。在所有這些裝置中，該收集室包括一個長形 的收集管；以及在該收集管中形成這些收集區的、沿著該管所安置的多個空腔。這些空腔被 安排在該管中，這樣使得以上游至下游的方向遷移穿過該管的細胞在最上游的空腔中被捕 獲直到填滿，在此之后以從上游至下游的方向依次地填滿這些空腔。圖3A顯示了一種測定裝置60，它具有與一個收集管或室64相連的一個界面區 62。該收集管具有多個相對成角度的流動片段，例如片段66、68。該管中的多個收集區是 多個有邊緣的空腔，這些空腔被安置在鄰近的流動片段之間，例如在鄰近的流動片段66、68 之間的空腔70。圖3B中所示的收集室是與圖3A的相類似的。在此，在一種測定裝置74中一個收 集管72是由相對成角度的流動片段(例如片段76、78)、以及在鄰近的流動元件之間的一系 列空腔(例如，在流動片段76，78之間的空腔80)形成的。該構型的一部分示于圖4中，并 且展示了遷移穿過該收集管的細胞是如何以上游至下游的方向在這些空腔中被依次地捕 獲，允許通過識別這種含有連接顆粒的細胞的最下游空腔容易地測定細胞計數。如在圖4 中所見，結合顆粒的細胞(例如，細胞79)，以上游至下游的方向(在該圖中從上到下)、沿 著由箭頭75所表示的力的一條線、從一個流動片段遷移到另一個流動片段，在最上游空腔 80中被捕獲直到該室被填滿，在這個時候細胞將開始填充下一個最下游的空腔，以此類推， 直到所有的細胞已經被捕獲。在該收集管中捕獲的細胞的數目可以通過測定含有細胞的最 下游空腔進行半定量地確定。在一個實際的測定裝置中，將這些收集區校準，這樣使得每個 依次的收集區代表某一個總數的感興趣的樣品細胞，例如約200個細胞/每空腔，這樣使得 從頂部第η個空腔中細胞的存在表示一個細胞計數，該計數在約例如(η-1)χ200至ηΧ200 個細胞之間。如以上所說明，可以對空腔大小和細胞數目之間的關系進行調整以便對填充 這些儲水槽的顆粒體積(結合的顆粒以及游離顆粒)進行校正。在圖3C中，在一個裝置84中一個收集管82是與在一種重力或所施用的離心力或 磁場力下在該管中結合顆粒的細胞的流動方向成角度的，由箭頭86表示。該收集管中的收 集區包括多個空腔(例如，空腔88)，它們沿著該管的一個外表面部分90被安置，這樣使得 以上游至下游的方向、并且在由箭頭86所表示的力的方向上遷移穿過該收集管的細胞首 先在最上游的空腔被捕獲，并接著當每個空腔充滿時在更多的下游空腔中被依次地捕獲。
16如在圖3A和3B中所展示的實施方案，該裝置允許通過識別含有結合顆粒細胞的最下游空 腔容易地測定細胞計數。在所有三種裝置中還顯示了與該收集管的下端相通的一個預填充的通道92，提供 了 一個端口，通過該端口可以對該收集管和界面區進行填充。圖5展示了在像以上說明的、但根據本發明的一個第三通用的實施方案所構建的 一個細胞沉淀測定裝置94中的收集室構型。在這個裝置中，該收集室(表示為96)包括一 個流動管98，該流動管在其上游端與一個沉淀區97相連、并且在一種重力下相對于結合顆 粒的細胞的流動方向基本上橫向地延伸。換言之，流動穿過管的方向(由箭頭100表示) 是基本上垂直于施用到這些細胞的力的方向的，例如在重力之下，由箭頭102所表示。該室 包括多個空腔104，這些空腔沿著管98的底面間隔排列。在操作中，結合顆粒的細胞(例 如，表示為106)以一定的流速流動穿過該室，這樣使得這些顆粒首先基本上專一性地遷移 進入最上游的空腔(表示為108)，并且當該空腔被填滿時，繼續在空腔108中收集的顆粒將 被該流體流攜帶從而沉淀進入下一個下游空腔，并且同樣地進入每一個鄰近的空腔，直到 所有細胞已經在一個空腔中被捕獲。對于該通用的實施方案中使用其他裝置，結合顆粒的 細胞的細胞計數是可以從含有細胞的最上游空腔進行確定的。III.測定方法本發明的方法使用以上細胞檢測裝置用于對細胞樣品檢測存在至少一個閾值濃 度的給定類型細胞。為了說明的目的，該方法將針對一種方法進行說明，該方法用于確定在 一個感染HIV的、正在對感染狀況進行監測的個體中存在的CD4+T細胞的閾值濃度(細胞 計數)。大體上，⑶4+細胞計數在500-1500個⑶4+T細胞/ μ 1血液之間表明在該個體中T 細胞免疫正常發揮作用，其中細胞遷移是在重力下通過沉淀穿過一種定義了密度的介質而 產生的。當HIV殺死⑶4+Τ細胞時，這樣使得存在著小于200個⑶4+Τ細胞/ μ 1血液，細胞 免疫喪失，導致一種可能的AIDS診斷。在此所展示的測定方法被設計為檢測CD4+T細胞小 于250/μ 1血液的閾值水平，這意味著在這個閾值建議進行治療。可以將該閾值調節(例 如取決于該個體的年齡)到比如說350、450、550、或750個/ μ 1血液。在該測定中所采用的測定裝置在圖6中示出。該裝置(表示為110)包括與圖1 和2所說明的相類似的裝置、一個樣品室30(處于液體相通、以上游至下游的方向)、一個沉 淀室38”、以及集中室39” (合起來，一個界面室)、以及一個收集管40，其中該收集管中收 集區是由通過沿著該管的長度的標記44表示的。假設該裝置已經用一種選定密度的介質 預填滿，填滿該界面室和收集室。該樣品室可以含有一個選定體積的可檢出顆粒的懸浮液， 這些顆粒能夠與CD4+細胞的CD4+抗原進行特異性反應，或可替代地，這些顆粒可以被分開 提供用于在加入到該樣品室之前與該樣品混合。作為該測定的一個第一個步驟，從該患者采集血液流體樣本。在將該樣品施用到 該裝置之前，該樣品中的RBC可以部分地或全部地通過以下方式去除例如裂解、抗體沉 淀、離心以便特異性地去除RBC、或離心從而將所有血細胞團聚之后跟隨白細胞部分的再懸 浮，這是根據實驗室血液學熟知的方法進行的。在任何情況下，將最終的白細胞樣品的體積 進行調節以便對應于該初始血液樣品的已知體積。將含有白細胞的樣品以一個給定的體積施用到該裝置中的樣品室，并且允許這些 細胞與這些細胞結合的顆粒反應足以完成該反應的一段時間，例如10分鐘。可替代地，該反應是在一個單獨的試管中進行的，然后一起加入到該樣品室中。在如圖6中所示的裝置 中，⑶4+結合顆粒被表示為小實心圓圈112，⑶4+陽性細胞由陰影圓圈114表示，⑶4+陰 性細胞被表示為空心圓圈116，并且結合顆粒的CD4+細胞被表示為具有深色的顆粒外層的 陰影圓圈，代表結合的顆粒。如以上所表示，這些結合顆粒的細胞具有實質上增加的密度， 并且優選地易于通過肉眼檢出。目前，該樣品中的細胞被允許在重力之下沉淀穿過一種沉淀介質(該介質具有一 種密度，該密度小于這些結合顆粒細胞的密度)進入具有多個收集區的一個收集室，例如 通過將該裝置放在一個直立的位置上或以慢速離心，直到基本上所有這些結合顆粒的細胞 已經沉積到該收集管中。圖6示出了當一些結合顆粒的細胞已經沉積到該收集管中時完成 之前的沉淀過程。一旦沉淀結束，對該裝置檢查(優選地通過目檢)在至少一個選定的收集區中存 在結合顆粒的細胞。在所展示的裝置中，這些收集區代表該管增加的片段，對應于沿著該管 側面的標記44，粗略地對應于每個標記增加100個細胞/ μ 1。作為本方法的最后一步，基于已填滿的或部分填滿的收集區的數目來測定所加入 的樣品體積是否包含正在測定的細胞類型的細胞的選定閾值數目。在本展示中，可以看到 在該測定中在結束時細胞計數將是大于500個細胞/ul，這表示所測試的個體具有正常發 揮作用的免疫系統。圖7C-7C展示了一種示例性測定方法的結果，正如示意圖(7A)、通過照片(7B)、并 且通過熒光讀數(7C)所見。該熒光讀數是使用兩個不同樣品的PBMC(外周血單核細胞) 進行熒光標記而獲得的，一個含有所施用的7. 6x IO5個細胞(左道，在圖7C中)以及所施 用的7. BxlO4個細胞(右道，在圖7C中)。如在該圖中所見，在該測定的收集管中具有更大 細胞體積的樣品產生了大于超過2倍的塞子高度。圖8示出了一種細胞測定的結果，其中僅含有珠粒的樣品的柱高(左道)、珠粒加 上IxlO5個⑶4+細胞(中道)、以及珠粒加上5x10s個⑶4+細胞。這些沉淀珠粒單獨產生 一個柱高，在該圖中表示為120。加入IxlO5個細胞小量地增加了高度，表示為122 ；并且加 入5x10s個細胞一定量地增加了高度，表示為124，這是較小的細胞計數樣品的大概5倍，正 如所預期。其他用于監測白細胞作為一種健康或治療狀況的指示物的應用包括但不限于檢測或監測可能來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度，該個體可能患有一種 導致血液中白細胞升高的感染或其他病癥。在該應用中，這些細胞與具有表面結合的抗白 細胞結合劑(例如CD45)的顆粒進行反應，并且對應于所感興趣的一個或多個閾值收集區 的這種標記或這些標記表示白細胞大于約10，000個細胞/μ 1血液的濃度。檢測或監測來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度，該個體由于化療、放療或 白細胞在血液中具有降低的白細胞數目。在該應用中，這些細胞與具有表面結合的抗白細 胞結合劑(例如CD45)的顆粒進行反應，并且對應于所感興趣的一個或多個閾值收集區的 這種標記或這些標記表示白細胞小于約4，000個細胞/ μ 1血液的濃度。檢測或監測來自一個個體的血液樣品中嗜中性細胞的濃度，該個體由于化療或干 擾素治療在血液中具有降低的嗜中性細胞數目。在該應用中，這些細胞與具有表面結合的 抗嗜中性細胞結合劑(例如CD16)的顆粒進行反應，并且對應于所感興趣的一個或多個
18閾值收集區的這種標記或這些標記表示嗜中性細胞的濃度，該濃度在一個選定的500至 2，500個細胞/μ 1血液之間的范圍內。檢測或監測來自一個感染的個體的體液樣品中細菌細胞的濃度，作為感染的程度 和類型的標志物。在該應用中，這些細胞與具有一種表面結合的結合劑的顆粒進行反應，該 結合劑能夠與一種或多種選定的細菌壁抗原進行特異性地結合，并且對應于所感興趣的一 個或多個閾值收集區的這種標記或這些標記表示在該血液樣品中細菌細胞的可檢出的濃度。從以上所述，可以看到本發明的不同目標和特征是如何達到的。本測定和裝置的 原理是基于結合顆粒的細胞在一個特異的微細管中或梯類型的細胞收集安排中的優先遷 移。以這種方式對該裝置進行校準，這樣使得細胞堆疊的高度或填滿的收集區的數目對應 于細胞計數，特別是當對顆粒體積進行調節時。該方法不要求抗體涂覆的裝置表面，并且讀 出可以通過肉眼來實現，無需任何額外的染色步驟或讀取器儀器。因此，本方法結合了血球 計中細胞計數的精確性以及明白的并且簡單的、無需讀取器的讀出的便捷性。由于它的簡 單性，本方法可以理想地適合于一些發展中國家種的惡劣環境條件。盡管相對于具體的實施方案和實例已經對本發明進行了說明，應當理解可以進行 不同的改變和修改，而不偏離本發明的精神。
權利要求
一種用于對細胞樣品測定存在至少一個閾值濃度的給定類型細胞的方法，該方法包括(a)將含有該給定細胞類型的多個細胞的一種細胞樣品與多個顆粒進行反應，這些顆粒能夠特異性連接到這些細胞上并且當與這些細胞相連接時對于增加這些細胞的密度或磁化率是有效的，從而允許在一種重力或所施用的離心力或磁場力的影響下基于它們的穿過一種選定介質的更大的遷移速率將該樣品中的結合顆粒的細胞以及游離的顆粒與無顆粒結合的細胞分開。(b)使該細胞樣品中的這些結合顆粒的細胞與顆粒遷移穿過一個長形的收集室，該收集室含有該選定的介質并且沿著它的長度具有多個細胞收集區，通過使該樣品受到一種重力或所選定的離心力或磁場力持續一段時間，該時間足以使這些結合顆粒的細胞以及顆粒完全填滿該收集室中的依次的細胞收集區，并且(c)檢查該室以便確定該至少一個選定的收集區是否部分地或完全被填滿，作為該細胞樣品含有至少一個閾值濃度的給定細胞類型的細胞的證據。
2.如權利要求1所述的方法，其中該收集室包括一個收集柱，該柱中的收集區包括沿 著該柱的一部分的多個限定長度的片段，并且這些收集區在步驟(b)中沿該收集室的柱長 度以下游至上游的方向上被依次地填滿。
3.如權利要求1所述的方法，其中該收集室包括一個長形的收集管；以及在該收集管 中形成這些收集區的、在該管中所安排的多個空腔，這樣使得在步驟(b)中以上游至下游 的方向遷移穿過該管的細胞在最上游的空腔中被捕獲直到填滿，在這之后以上游到下游的 方向依次地填滿這些空腔。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述顆粒當步驟(a)中與這些細胞相連接時對于用 一種可檢出的報告基因對這些細胞進行標記是有效的，并且所述檢查包括對該收集室肉眼 檢查存在用該可檢出的報告基因標記的細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括通過將該室置于一個基本上直立的垂 直布置的位置上，使這些結合顆粒的細胞受到重力，該選定密度的介質具有一種密度，該密 度小于這些結合顆粒細胞的密度，并且這些顆粒是基本上球形的金屬顆粒。
6.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括使這些結合顆粒的細胞受到離心力，該 選定密度的介質具有一種密度，該密度小于這些結合顆粒的細胞的密度，并且這些顆粒是 基本上球形的金屬顆粒。
7.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括使這些結合顆粒的細胞受到磁場力，并 且這些顆粒是基本上球形的磁性顆粒或順磁顆粒。
8.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括以一個方向將一種流動組分施用到該 收集室內的介質中，該方向基本上垂直于重力或所施用的離心力或磁場力的方向。
9.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)進一步包括將該含有結合顆粒的細胞的樣 品加入到該收集室的一種界面區上游，并且將該樣品與在該界面區中的一種選定密度的介 質進行物理混合。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述樣品是一種血液樣品，并且所述顆粒具有能夠 與一種血細胞特異性抗原進行免疫反應的表面結合的結合蛋白，并且這些顆粒被表面處理 以便降低血液樣品中的顆粒聚集。
11.如權利要求10所述的方法，用于對來自一個可能感染HIV的個體的血液樣品中 CD4+T-淋巴細胞的濃度進行檢測，作為該個體的T細胞種類的一種指示物，其中反應步驟 (a)是通過將來自該個體的一種血液流體樣本暴露于具有表面結合的抗-CD4+結合劑的顆 粒來進行的，并且步驟(c)是基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表具有 一個在200至750/ μ 1血液的選定閾值的⑶4+Τ-淋巴細胞的濃度。
12.如權利要求10所述的方法，其中步驟(a)進一步包括將該樣本中的細胞與能夠特 異性地結合到單核細胞上的CD14抗原的顆粒進行反應、同時或之后隨后與能夠特異性地 結合到T淋巴細胞上的Cd4抗原的第二批顆粒進行反應，由此在這些T淋巴細胞上給予增 強的密度或磁化率，并且在這些單核細胞上給予增強的密度和磁化率，并且步驟(b)進一 步包括首先將結合顆粒的單核細胞從該細胞樣品中去除，這是通過施用一種力來進行的， 該力對于將這些結合顆粒的單核細胞從結合顆粒的T淋巴細胞中選擇性地去除是有效的。
13.如權利要求10所述的方法，用于對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行 檢測，該個體可能患有一種導致血液中白細胞升高的傳染病或其他病癥，其中反應步驟(a) 是通過將該個體的一種血液流體樣品暴露于具有表面結合的抗_白細胞結合劑的顆粒來 進行的，并且步驟(c)是基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表白細胞大 于約10，000個細胞/ μ 1血液的濃度。
14.如權利要求10所述的方法，用于對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行 監測，該個體由于化療、放療或白血病可能在該血液中具有降低的白細胞數目，其中反應步 驟(a)是通過將來自該個體的一種血液流體樣品暴露于具有表面結合的抗-白細胞結合劑 的顆粒來進行的，并且步驟(c)是基于觀察到的在一個收集區中存在的細胞，該存在代表 白細胞小于約4，000個細胞/ μ 1血液的濃度。
15.如權利要求10所述的方法，用于對來自一個個體的血液樣品中嗜中性細胞的濃度 進行監測，該個體由于化療或干擾素治療可能在該血液中具有降低的嗜中性細胞數目，其 中反應步驟(a)是通過將來自該個體的一種血液流體樣品暴露于具有表面結合的抗-嗜 中性細胞結合劑的顆粒來進行的，并且步驟(c)是基于觀察到的在一個收集區中存在的細 胞，該存在代表嗜中性細胞在一個選定的在500至2，500細胞/ μ 1血液之間的范圍內的濃 度。
16.如權利要求10所述的方法，用于對來自一個感染個體的體液樣本中細菌細胞的濃 度進行檢測，作為感染的程度和類型的一種指示物，其中反應步驟(a)是通過將來自該個 體的一種體液樣品暴露于具有一種表面接合的結合劑的顆粒來進行的，該結合劑能夠特異 性地與一種或多種選定的細菌壁抗原相結合，并且步驟(c)是基于觀察到的在一個收集區 中存在的細胞，該存在對應于在該血液樣品中一種可檢出濃度的細菌細胞。
17.一種用于對細胞樣品測定在該樣品中存在至少一個閾值濃度的選定細胞類型的細 胞，該套件包括(a)一種測定裝置，該測定裝置具有一個用于接受該細胞樣品的樣品室、以及與其進行 流體相通的一個長形的收集室，該收集室含有一種選定的介質并且沿著它的長度具有多個 細胞收集區，(b)一些顆粒，這些顆粒當被加入到該細胞樣品中時能夠特異性連接到該選定細胞類 型的細胞上，并且這些顆粒當連接到這些細胞上時對于增加這些細胞的密度或磁化率是有效的，從而允許在一種重力或選定的離心力或磁場力的影響下使該細胞樣品中的結合顆粒 的細胞以及顆粒優先地遷移穿過該長形的收集室，直到基本上所有這些結合顆粒的細胞以 及顆粒完全填滿該收集室中依次的細胞收集區，并且(C)與該裝置收集室上的至少一個收集區相關聯的標記，該標記表示該選定類型的細 胞對于至少部分地填滿該收集區有效的濃度，這是當結合顆粒的細胞以及游離的顆粒被牽 引穿過該收集室時進行的。
18.如權利要求17所述的套件，其中該收集室包括一個收集柱，該柱中的這些收集區 包括沿著該柱的一部分的多個限定長度的片段，并且這些收集區被適配為沿著該收集室的 柱長度以從下游至上游的方向被按步驟依次地填滿。
19.如權利要求18所述的套件，其中該收集室包括一個長形的收集管；以及在該收集 管中形成這些收集區的、在該管中沿著它的長度所安排的多個空腔，并且這些收集區被適 配為沿著該柱長度以上游至下游的方向被依次地填滿。
20.如權利要求17所述的套件，其中該收集室包括一個收集管，該收集管具有多個相 對成角度的流動區段；以及在該收集管中形成這些收集區的、在鄰近的流動片段之間所安 置的多個有邊緣的空腔，這樣使得以上游至下游的方向從一個流動區段遷移到另一個流動 區段的細胞被捕獲在這兩個流動片段之間的空腔中，直到該空腔被填滿。
21.如權利要求17所述的套件，其中該收集室包括一個收集管，該收集管在一種重力 之下相對于在該管中的結合顆粒的細胞的流動方向成角度；以及在該收集管中形成這些收 集區的、沿著該管的一個外表面部分所安置的多個空腔，這樣使得以上游至下游的方向遷 移穿過該收集管的細胞在最上游的空腔中被捕獲直到被填滿。
22.如權利要求17所述的套件，其中該收集室包括一個流動管，該流動管在一種重力 下相對于結合顆粒的細胞的流動方向基本上橫向地延伸；以及在該收集室中形成這些收集 區的、沿著該流動管的長度所安置的多個空腔，這樣使得以上游至下游的方向流動穿過該 流量管的細胞沉淀進入到該最上游的空腔中直到填滿，在此之后以上游至下游的方向依次 地將這些空腔填滿。
23.如權利要求17所述的套件，其中裝置(a)進一步包括一個與該樣品室相通的捕獲 室，并且顆粒(b)包括一種第一類型的、能夠與在該選擇類型的細胞以及一種非選定類型 的細胞上呈遞的一種抗原進行特異性結合的顆粒，以及一種第二類型的、能夠僅與該非選 定類型的細胞上呈遞的一個抗原進行特異性結合的顆粒，允許在該選定類型的細胞遷移之 前將結合到第二種類型的顆粒上的顆粒通過遷移到該捕獲室中而被選擇性地去除，這些細 胞僅結合到該第一類型的顆粒上以便選擇性地遷移到該收集室中。
24.如權利要求17所述的套件，其中所述結合顆粒的細胞被適配為在一種重力或離心 力的影響下遷移穿過該收集區，其中所述顆粒是基本上球形的金屬顆粒。
25.如權利要求17所述的套件，其中用于對血液樣品中的給定類型的細胞進行檢測， 并且所述顆粒具有能夠與一種血細胞特異性的抗原進行免疫反應的表面結合的結合蛋白。
26.如權利要求25所述的套件，其中這些顆粒受到表面處理以便降低血液樣品中的顆 粒聚集。
27.如權利要求26所述的套件，其中用親水聚合物涂層對所述顆粒進行涂覆。
28.如權利要求17所述的套件，其中所述結合顆粒的細胞被適配為在一種磁場力的影響下遷移穿過該收集區，其中所述顆粒是基本上球形的磁性顆粒或順磁顆粒。
29.如權利要求17所述的套件，用于對來自一個可能感染HIV的個體的血液樣品中 CD4+T-淋巴細胞的濃度進行檢測，作為該個體的T細胞種類的一種指示物，其中所述顆粒 具有表面結合的抗CD4+結合劑，并且所述標記被設計為表示CD4+T淋巴細胞的濃度，這些 細胞具有一個選定的在200至750/μ 1血液之間的閾值。
30.如權利要求17所述的套件，用于對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行 檢測，該個體可能患有一種導致該血液中白細胞升高的傳染病或其他病癥，其中所述顆粒 具有表面結合的抗白細胞結合劑，并且所述標記被設計為表示白細胞大于約10，000個細 胞/μ 1血液的濃度。
31.如權利要求17所述的套件，用于對來自一個個體的血液樣品中白細胞的濃度進行 監測，該個體由于化療、放療或白血病可能在該血液中具有降低的白細胞數目，其中所述顆 粒具有表面結合的抗白細胞結合劑，并且所述標記被設計為表示白細胞小于約4，000個細 胞/μ 1血液的濃度。
32.如權利要求17所述的套件，用于對來自一個個體的血液樣品中嗜中性細胞的濃度 進行監測，該個體由于化療或干擾素治療可能在該血液中具有降低的嗜中性細胞數目，其 中所述顆粒具有表面結合的抗嗜中性細胞結合劑，并且所述標記被設計為表示嗜中性細胞 在一個選定的500至2，500個細胞/ μ 1血液的范圍內的濃度。
33.如權利要求17所述的套件，用于對來自一個感染個體的血液或尿液樣品中一種細 菌感染的存在進行檢測，其中所述顆粒具有能夠與一種細菌壁抗原進行特異性結合的表面 結合結合劑，并且所述收集區被設計為表示在血液或尿液樣品中細胞的存在。
34.如權利要求17所述的套件，該套件進一步包括一種裝置支持器，該支持器用于支 持該裝置并且對所支持的裝置施用一種離心力或磁場力。
全文摘要
在此披露了一種用于對細胞樣本測定存在至少一個閾值數目的給定類型細胞的方法和套件。該套件包括一種測定裝置，該測定裝置具有一個用于接受該細胞樣品的樣品室、以及一個長形的收集室，該收集室含有一種選定密度和/或粘度的介質并且沿著它的長度具有多個細胞收集區，以及多個顆粒，這些顆粒能夠與該選定細胞類型的細胞進行特異性連接，并且這些顆粒當與這些細胞連接時對增加這些細胞的密度或磁化率是有效的。在實施中，該細胞樣品中結合顆粒的細胞以及顆粒在一種重力或所選定的離心力或磁場力的影響下被牽引穿過該長形的收集室，直到這些結合顆粒的細胞以及顆粒完全填滿該收集室中的多個依次的細胞收集區。與至少一個收集區相關聯的標記表示了該選定類型的細胞對于至少部分地填滿該收集區是有效的。
文檔編號G01N33/543GK101939645SQ200880126275
公開日2011年1月5日 申請日期2008年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者勞倫斯·魯伊斯-泰勒, 勒妮·托比亞斯, 弗蘭克·佐格, 彼得·凱爾寧, 彼得·瓦格納, 西爾維亞·麥克馬努斯·穆尼奧斯 申請人:齊翁米克斯股份有限公司
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