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專利名稱：：甲亢疾病的易感基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，本發明涉及人UGRP1基因啟動子區域的單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)及其與甲亢疾病的相關性。本發明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術：
：彌漫性甲狀腺腫伴甲亢(Gmves病)為甲亢最常見的一種類型。甲狀腺功能亢進癥(Hyperthyroidism，簡稱甲亢)系指由多種病因導致甲狀腺激素(TH)分泌過多引起的臨床綜合征。甲亢的病人較復雜，其中以Graves病(GD)最多見。Gmves病是一種伴甲狀腺激素分泌增多的、器官特異性自身免疫性疾病，它是機體的免疫系統功能亢進，從而產生抗自身甲狀腺的抗體(免疫球蛋白)而引起的，這種特異性的抗體刺激甲狀腺增生、并使其分泌大量的甲狀腺激素。一般Graves病多見于女性，男女患病率之比為l:47，特別是青春發育期、妊娠期和更年前期。經研究，Graves病是一種常見的多基因疾病，是一種器官特異性自身免疫疾病，其發病具有較強的遺傳基礎。Graves病的發病原因被認為是由多種易感基因和環境因素共同造成的。已經發現人白細胞抗原(HLA)-II基因、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)基因，促甲狀腺受體(TSH-R)基因和甲狀腺球蛋白(Tg)基因等多個基因與Graves病存在一定的聯系。此外，還有其它的免疫相關基因，如白介素-l受體拮抗基因、腫瘤壞死因子e基因和甲狀腺過氧化物酶基因等，但很多結果存在爭議。在以往的工作中，通過在56個漢族Graves病人中進行全基因組篩査，發現在5q31的markerD5S436附近有很強的Lod值，隨后在這一區域使用排列更緊密的marker進行分析，D5S2090處的Lod值達到了4.31(參見JinY等，Genome-widescanofGraves'disease:evidenceforlinkageonchromosome5q31inChineseHanpedigrees.ClinEndocrinolMetab.2003Apr;88(4):1798-803)。此外，有文獻報道，一個日本的研究小組在對AITD(自身免疫性甲狀腺疾病，包括Graves病和喬本氏甲狀腺炎)進行遺傳定位時也將易感區段定位在D5S436(參見SakaiK等，Identificationofsusceptibilitylociforautoimmunethyroiddiseaseto5q31-q33andHashimoto'sthyroiditisto8q23-q24bymultipointaffectedsib-pairJinkageanalysisinJapanese.HumMolGenet.2001Jun15;10(13):1379-86)。因此，這一區段很可能包含一個亞洲人群中比較顯著的Gmves病易感基因，這也成為本發明人進行定位克隆時首先考慮的部位。由于自身免疫性疾病本身的復雜性、多個基因之間的相互作用，以及環境因素對疾病發展的影響，使易感基因的確定十分困難。因此，本領域迫切需要進行進一步的研究，以找到導致Gmves病發生和發展的易感基因，并研究和開發出可用于診斷和檢測Graves病的試劑盒，以及相關的治療藥物。本發明人在研究中發現，UGRPl基因與甲亢(尤其是彌漫性甲狀腺腫伴甲亢(Graves病))的發生和發展密切相關。因此，本發明的一個目的是提供UGRP1蛋I:i的用途，川丁-制備檢測曱亢的-U劑或試劑盒、用于制備檢測UGRP1的變異形式的試劑或試劑盒、用于篩選治療甲亢的藥物。本發明的另一目的是提供一種分型和/或鑒別診斷(尤其是早期監測或診斷)甲亢的方法。本發明的另一目的是提供一種篩選甲亢藥物以及評判甲亢藥物的療效的方法。在本發明的第一方面，提供一種UGRP1基因或其蛋白的用途，用于(i)制備用于甲亢分型或檢測甲亢的試劑或試劑盒；(ii)制備檢測UGRPl的變異形式的試劑或試劑盒；(iii)選擇治療甲亢藥物的標志；或(iv)篩選治療甲亢的藥物。在本發明的一個優選例中，所述的甲亢是UGRPl蛋白表達改變相關的甲
發明內容在本發明的另一優選例中，在本發明的另一優選例中，在本發明的另一優選例中，所述的甲亢為Graves病。所述的試劑是引物和/或探針。所述的變異形式選自下組UGRP1基因第-li2位，G—A;(PI)UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基茵第-1351位，G一A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(11-1)UGRP1基因第+271位，Tdel(T缺失)；(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A;(E3-l)UGRP1基因第-1664位，A—T;(P6)或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAAdel(T缺失);(P4)其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。在本發明的另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒用于檢測UGRP1基因的表達是否改變。在本發明的第二方面，提供一種體外檢測UGRP1基因或轉錄本是否存在核苷酸變異的方法，所述的方法包括以下步驟檢測該個體的UGRP1基因、禾Q/或轉錄本，并與正常的UGRP1基因、和/或轉錄本相比較，存在以下變異形式就表明該個體的UGRP1基因、和/或轉錄本存在核苷酸變異UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(11-1)UGRP1基因第+271位，Tdei(T缺失)；(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A;(E3-l)UGRP1基因第-1664位，A—T;(P6)或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL(T缺失)；(P4)其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM一054023。在本發明的另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的另一優選例中，檢測的是UGRP1的基因的核苷酸序列，并與正常UGRP1基因的核苷酸序列比較差異。在本發明的第三方面，提供一種檢測樣品中是否存在UGRP1基因變異的方法，包括以下步驟(1)用UGRP1基因特異性引物擴增樣品中的UGRP1基因，得到擴增產物；以及(2)檢測擴增產物中是否存在選自下組的變異形式UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGkP丄基因^十222位，C—A;(11丄)UGRP1基因第+271位，Tdel(缺失)；(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A;(E3-1)UGRP1基因第-1664位，A—T;(P6)或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL(T缺失);(P4)其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。在本發明的另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的第四方面，提供一種對個體的甲亢患者進行分型的方法，所述方法包括檢測該個體的UGRP1基因、和/或轉錄本，并與正常的UGRP1基因、和/或轉錄本相比較，存在以下變異形式就表明該個體是UGRP1基因相關的甲亢患者UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(11-1)UGRP1基因第+271位，Tdel(T缺失)；(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A;(E3-1)UGRP1基因第-1664位，A—T;(P6)或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL(T缺失);(P4)其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。在本發明的另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的第五方面，提供一種檢測甲亢的試劑盒，它包括特異性擴增UGRP1基因、或轉錄本的引物。在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒中還包括選自下組的試劑(葉U變異部位結合的探針;和(b)識別變異位點的限制性內切酶。在本發明的另一優選例中，所述的變異選自UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623--622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(Il-l)UGRP1基因第+271位，Tdel;(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A(E3-1)。其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM_054023。在另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的第六方面，提供一種篩選調節UGRP1蛋白表達的藥物的方法，包括以下步驟(a)在測試組中，向表達UGRP1蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測UGRP1蛋白的表達情況；(b)將步驟(a)測試組中UGRPl蛋白的表達情況與未添加候選物的對照組中UGRP1蛋白的表達情況進行比較；如果測試組中UGRP1蛋白的表達在統計學上高于對照組，就表明該候選物是促進UGRP1蛋白表達的藥物；如果測試組中UGRP1蛋白的表達在統計學上低于對照組，就表明該候選物是抑制UGRP1蛋白表達的藥物。在本發明的另一優選例中，所述的表達UGRP1蛋白的體系為由野生型UGRP1基因表達UGRP1蛋白的體系；或為由帶有變異形式的UGRP1基因表達UGRP1蛋白的體系，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623--622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(11-1)UGRP1基因第+271位，Tdel;(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A(E3-1)。其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。在另一優選例中，所述的變異形式選自UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG—T;(P2)或UGRP1基因第-112位G—A(P1)和UGRP1基因第-718位G—A(P3)。在本發明的另一優選例中，所述的促進UGRP1蛋白表達的藥物為治療甲亢的藥物。較佳地，所述的表達UGRP1蛋白的體系包括但不限于原核細胞，真核細胞，或動物模型。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了UGRP1的受體在各種組織中的表達狀況。其中，圖1A顯示了小鼠的表達譜；圖1B顯示了人的表達譜。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次發現UGRP1基因表達水平的改變與甲亢(特別是Graves病)密切相關。具體地，UGRP1基因的下調與與甲亢(特別是Graves病)密切相關。因此可以通過檢測UGRP1的表達情況來輔助性診斷甲亢或對甲亢進行分型。進一步地，本發明人還提供了一些UGRP1基因的變異形式，這些變異形式與甲亢存在顯著的相關性。因此，基于本發明人的新發現，可以利用UGRP1基因或其蛋白(i)進行甲亢的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)評估相關人群的甲亢治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(Hi)早期評估相關人群甲亢患病風險，早期監測早期預防；(iv)篩選改變UGRPl表達水平的藥物，結合UGRP1基因的多態性來特異性治療相關類型的甲亢。UGRP1基因(子宮球蛋白相關蛋白1，UteroGlobin-RelatedProteinl)是一種新近發現的基因，人的UGRPl基因定位于5q31-5q34，主要表達在肺臟。UGRP1基因的功能目前還很不明確，由于多種自身免疫性疾病的候選區域定位于5q31-34附近，其與哮喘關聯已有許多報道。但是目前尚沒有人發現UGRP1基因與甲亢的相關性。UGRPl基因的總長度為3480bp，其基本序列在GenBank上的登錄號為NM一054023，UGRP1基因的CDS全長282bp，編碼一條含有93個氨基酸的蛋白。可通過GenBank登錄號NM—054023引申地找到UGRP1基因的內含子、啟動子等序列，具j本可參見網i止http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/。本發明人通過對于來自不同地區的數百個甲亢病例(Graves病)進行了深入的研究，并與正常對照進行比較，證實甲亢樣本與正常樣本的差異位點最多且差異最顯著的位點都位于UGRP1基因上，從而有力地證實了UGRP1基因與甲亢的(特別是Graves病)相關性。所述的差異包括以下變異形式的一種或多種UGRP1基因第-112位，G—A;(Pl)UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;(P2)UGRP1基因第-718位，G—A;(P3)UGRP1基因第-1351位，G—A;(P5)UGRPl基因第+222位，C—A;(11-1)UGRP1基因第+271位，Tdel(T缺失)；(11-2)UGRPl基因第+3337位，G—A;(E3-1)UGRP1基因第-1664位，A—T;(P6)或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL(T缺失);(P4)其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM一054023。進一步的，本發明人的研究結果顯示，統計學差異最明顯的單倍型都包含UGRP1基因上的P1+P2兩個SNP或P1+P3兩個SNP，證實這兩種單倍型與Graves病的發生密切相關。本發明人通過熒光素酶(Luceferase)試驗觀査啟動子區域的改變對ugrpi叢兇農達的說響，證實含iv這i從j種單倍型變化的涵粒jt發光'(」丄i:叨ffi——i;降，有統計學差異。這說明，相對于正常的啟動子序列，含有P1+P2、Pl+P3單倍型的啟動子對下游的基因轉錄有抑制作用。本發明人通過實時PCR(Real-timePCR)分析發現，當樣本的啟動子區域含有P1+P2或P1+P3單倍型時，其UGRP1基因的表達量相對于啟動子區P1-P3位點均正常的樣本有明顯的下降。另外，本發明人通過Northern印跡和RT-PCR試驗發現，UGRP1的受體在很多免疫相關的組織都有表達，這進一步提示UGRPl基因與Graves病這種自身免疫疾病有很強的相關性。通過上述研究，本發明人證實了UGRP1基因與甲亢的相關性，并且甲亢的發生和/或發展與UGRPl基因的單核苷酸多態性相關。因此，基于這種相關性可進行甲亢患者的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析。比如，可分離出由UGRP1基因表達異常而導致甲亢的人群，從而可進行更有針對性地治療；更進一步地，可從UGRP1基因表達異常的甲亢人群中分離出具有不同UGRP1基因SNP位點的患者，從而可實現更精確的治療。基于上述的相關性以及甲亢的分型，可針對性地評估相關人群的甲亢治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法，從而避免盲目給藥或盲目治療。基于上述的相關性以及UGRP1基因的單核苷酸多態性位點，可早期評估相關人群甲亢患病風險，從而可實現早期監測、早期預防。基于上述的相關性，還可篩選改變UGRP1表達水平的藥物，結合UGRP1基因的多態性來特異性治療相關類型的甲亢。基于本發明的新發現，UGRP1基因或蛋白有著多方面的潛在新用途。這些潛在用途包括(但不限于)直接作為藥物治療UGRP1蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如Gmves病)，和用于篩選調節(特別是促進)UGRP1蛋白功能的物質，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人UGRP1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人UGRP1蛋白功能的多肽分子。正常的UGRP1蛋白可直接用于疾病治療因UGRP1不表達或表達下降所導致的疾病，例如，可用于甲亢治療。在使用本發明UGRP1蛋白時，還可同時使用其他治療甲亢的藥劑。利用本發明UGRP1蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與UGRP1蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。本發明UGRP1蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、靜脈內、或皮下給藥。人UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于UGRP1蛋白的無表達或異常/無活性的UGRP1蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。構建攜帶UGRP1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻。另外重組人UGRP1基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明UGRP1蛋白或調節UGRP1蛋白表達的調節劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的蛋白還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的UGRP1蛋白或調節UGRP1蛋白表達的調節劑(如激動劑)施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。本發明還涉及定量和定位檢測人UGRP1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，如包括FISH測定和/或放射免疫測定。一種檢測檢測樣品中是否存在UGRP1蛋白的方法是利用UGRP1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與UGRP1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在UGRP1蛋白。通過所述的方法還可定量檢測UGRP1蛋白。抗人UGRP1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人UGRP1蛋白。一種優選的抗UGRP1抗體是不識別正常UGRP1但識別變異UGRP1(如在UGRP1基因的-112位上所發生的G—A的突變)的抗體，或者識別正常UGRP1但不識別突變UGRP1的抗體。利用該抗體對正常和異常UGRP1蛋白的特異性差異，可以方便地進行蛋白質水平的甲亢易感性檢測或甲亢分型。UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于UGRP1蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測UGRP1蛋白的表達與否或在疾病狀態下UGRP1蛋白的異常表達。如UGRP1DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷UGRP1蛋白的表達異常。雜交技術包括Southem印跡法、Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用UGRP1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測UGRP1蛋白的轉錄產物。檢測UGRP1基因的變異也可用于診斷甲亢。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。UGRP1蛋白突變的形式包括與正常野生型UGRP1DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。一類優選的突變是表l所示的SNP。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發明還包括可用于檢測甲亢疾病的試劑盒，所述的試劑盒中可包括特異性擴增UGRP基因或轉錄本的引物。更優選的，它還含有選自下組的試劑(a)與UGRPl基因的突變部位結合的探針；(b)識別UGRPl基因的突變位點的限制性內切酶。在本發明的另一種優選方式中，所述的試劑盒中可包括特異性與UGRP1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。更優選的，所述試劑盒中還包括常規的可用于檢測抗原抗體結合狀況的試劑。本發明的主要優點在于(1)首次發現并證實UGRPl基因與甲亢疾病(特別是Gmves病)的密切相關性，從而為甲亢疾病的診斷與治療提供了新的途徑。(2)首次發現了UGRP1基因的新功能，即UGRP1基因表達的下降將導致甲亢的發生，從而為甲亢藥物的進一步開發提供了一種良好的靶點。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.通用材料和方法
技術領域：
：本發明具體實施方式中使用到以下的材料和方法，以下方法和實施例中使用的各種材料試劑等都是作為進一步例證和解釋本發明的工具和手段，而并非用于對本發明的限制。并且，常規的DNA抽提、序列測定、PCR、細胞培養、轉染等操作是本領域現有技術人員所熟知的，在本發明中不作詳細描述。1.樣本采集為了提高單核苷酸多態性(SNP)檢測的代表性和效力，DNA樣本取自數百名對象，他們分別來自我國兩個不同的地區山東、上海。所有的山東和上海的樣本均由當地醫院采集，甲亢患者均按一般臨床診斷標準確定，對照為體檢的正常人。每個樣本收集5ml的血樣，采用常規的酚-氯仿法抽提DNA。2.SNP鑒別3.0MB區段內的29個SNP和1.0MB區段內的39個SNP位點均選擇NCBI的dbSNP數據庫，1.0腿區段內的位于基因外顯子和啟動子區的51個SNP采用ABI公司的3700測序儀測序得到。對所有山東和上海樣本的測序是通過MassArray公司的Sequenora儀器完成。3.關聯分析病例-對照研究通過SpssV11.0軟件(購自SPSS公司)進行卡方檢驗，以F〈0.05認為是具有統計學差異。單倍型分析采用PHASE軟件，版本2.1;具體出處可參見http:〃ww.stat.Washington,edu/stephens/instruct2.1.pdf。4.細胞培養、轉染、熒光素酶試驗采用常規的方法，通過采用含有相應的多態位點的基因組DNA為模板進行PCR擴增，并結合重疊延伸產生特定位點誘變的方法來構建含有P1+P2、Pl+P3單倍型的啟動子。將上述含有P1+P2、Pl+P3單倍型的啟動子構建入pGL3-Basic質粒(購自Promega公司)的多克隆位點中，并以pRL-SV40質粒(購自Promega公司)為陰性對照。采用Invitrogen公司的Lipofectamine2000試劑瞬時轉染，36小時后使用Promega公司的DualLuciferaseReporterAssaySysten]進行檢測。5.實時PCR分析收集93例人甲狀腺組織，測序，按啟動子區是否含有P1+P2、Pl+P3單倍型或P1P3位點均為正常進行分型(共有11例樣本含有P1+P2單倍型，5例含有Pl+P3單倍型，16例P1P3位點均為正常)。采用常規的方法，設計Taqman探針，進行實時PCR檢測，結果顯示含有這兩種單倍型的樣本UGRP1的表達量比正常對照有明顯的下降。n.具體實施例實施例lUGRP1基因多態性的初步確定本發明人選擇-了包括最高Lod值D5S2090處Lod值下降1.5所包含的3.0MB區域D5s436-D5s413(Lod值下降1.5，其所涵蓋的區段含有易感位點的可能性大于99%)。這一區段包括25個基因，本發明人按照每100Kb選擇一個SNP的方法，使用192個Graves病人對192個正常對照的病例-對照研究，尋找易感區段。結果，在總共的29個SNP中，有兩個有統計學差異，其中Rsl368408處的P值達到8.74X10o接下來，本發明人將研究對象集中在Rsl368408附近的1.0MB(SHGC-111280-RH72492)。這一區段一共包括ll個基因，本發明人使用了48個Graves病人的樣本對所有這些基因的外顯子和啟動子區進行測序，共發現了52個SNP位點，同時對于內含子和基因間的區域，按照每5KB—個SNP位點的原則從NCBI的dbSNP數據庫(NCBIHumanGenomeBuild34Ver.3)共選擇了39個位點。將這l.0MB區域內選擇的全部91個SNP位點，采用MassArraySequenom的測序方法，對從山東地區采集的所有541例病人和478例正常對照進行測序分析。通過病例對照分析，發現一共有22個SNP位點有統計學差異，在這其中，差異位點最多且差異最顯著的位點都位于UGRP1基因上4個在啟動子區(P5(-1351，G/A)，P3(-718，G/A)，P2(-623-622，AG/T)，Pl(-112，G/A))，2個在內含子(11-1(+222，C/A)，11-2(+271，Tdel))，l個在外顯子區域(E3-1(+3337，G/A))，共7個位點，具體見表l。其中位于啟動子區的P2位點有最明顯的統計學差異(P侑-1.37X10—8)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>11-:iUGRPl基因第+222位，C—ACTTGCCTCACTGACAGTGGAATATG(SEQIDNO:15)CTTGCCTCACTGACAGTGGAATATG(SEQIDNO:16)0.04426ii-2UGRPl基因第+271位，Tdel(T缺失)ATTTTACTTTTAACTGACACATAAT(SEQIDNO:17)TTTTACTTTTAACTGACACATAAT(SEQIDNO:18)0.00163E3-11^1^1基因第+3337位，G—ArTCAGGAGGCGCTATCACACTTGGTgTGACATCAAGATAAAGAGCGGAGGT(SEQIDNO:19)TTCAGGAGGCGCTATCACACTTGGT厶TGACATCAAGATAAAGAGCGGAGGT(SEQIDNO:20)0.00027其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號醒—054023。除此之外，在周圍的其它幾個基因也有一些統計學有差異的位點，但數量較少且P值較小。以上的試驗結果都通過GenomicControl進行了校正(共選擇了20個中性位點作校正，卡方值的中位數等于0.5351)。實施例2上海樣本中UGRP1基因多態性的研究迸一步地，本發明人還收集了一批來自上海的樣本，有120例Graves病人和380人的正常對照。通過對同樣這91個位點的病例-對照分析，發現了6個SNP位點(它們是UGRP1(P2，-623-622)，STK32A(+108222)，SPINK5(+37390)，基因間區域(rs4705047，rsl363525，rs6895278))有統計學差異，且統計學差異最明顯的位點仍然是UGRP1的P2位點。實施例3山東樣本中UGRP1基因多態性的研究為了進行進一步地確證，本發明人對山東人群中UGRP1基因的9個SNP位點(它們是:P6(-1664)，P5(-1351)，P4(-1301-1303)，P3(-718)，P2(-623-622)，Pl(-112)，II-1(+222)，II-2(+271)，E3-1(+3337))組成的單倍型進行了分析。其中，P4和P2的變異情況見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號,J)54023。結果顯示，統計學差異最明顯的單倍型都包含P1和P2兩個SNP或P1和P3兩個SNP。.當把山東和上海兩個人群的樣本放在一起作分析時也有類似的結果。這進一步提示這兩種單倍型與Graves病的發生密切相關。實施例4Pl+P2、Pl+P3單倍型的致病相關性研究由于UGRP1基因的啟動子區P1-P3位點是所有位點中統計學差異最明顯的，且單倍型的分析提示P1+P2、Pl+P3這兩種組合與致病密切相關。1.熒光素酶(Luceferase)試驗首先本發明人用Luceferase試驗觀察啟動子區域的改變是否對基因的表達有影響。本發明人構建了包含P1+P2、P1+P3單倍型以及不含SNP位點變化的正常啟動子序列的報告基因系統質粒。通過熒光素酶試驗證實含有這兩種單倍型變化的質粒其發光值明顯下降，有統計學差異。這說明，相對于正常的啟動子序列，含有P1+P2、Pl+P3單倍型的啟動子對下游的基因轉錄有抑制作用。2.實時PCR(Real-timePCR)分析進一步地，本發明人還收集了93例人甲狀腺組織，并采用實時PCR進行分析。通過實時PCR分析發現，當樣本的啟動子區域含有P1+P2或P1+P3單倍型時，其UGRP1基因的表達量相對于啟動子區P1P3位點均正常的樣本有明顯的下降。實施例5UGRP1受體的表達狀況作為一種分泌蛋白，UGRPl的受體的定位及其作用對研究UGRPl與Graves病的關系有很強的提示作用。本實施例中，驗證UGRP1的受體在各種組織中的表達狀況。本發明人通過Northern印跡和RT-PCR試驗發現，UGRP1的受體在很多免疫相關的組織都有表達，所述組織包括肝臟，脾臟，胸腺等。具體見圖l，其中，圖1A顯示了小鼠的表達譜，圖1B顯示了人的表達譜。Graves病是一種自身免疫疾病，它是機體的免疫系統功能亢進造成的。由圖1(圖中，MACR0表示UGRP1的受體)的結果顯示UGRP1的受體在很多免疫相關的組織都有特異性高表達，而在非免疫相關的組織中表達量較低。因此可見，UGRPl與Graves病這種自身免疫疾病的發生和發展有很強的相關性。實施例6Graves病的檢測試劑盒制備一種檢測Graves病的試劑盒，其中包括如表3中所列的PCR引物:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>抽取待檢測對象的血液5ml，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將所獲得DNA進行PCR擴增。PCR反應液為含Taq酶、dNTP等的常規PCR反應緩沖液。檢測擴增產物中UGRP1的多核苷酸多態性，從而確定檢測對象是否患有Graves病或者其是否有患Graves病的風險。實施例7篩選促進UGRP1蛋白表達的藥物的方法建立測試組表達UGRP1蛋白的細胞，其中加入候選物；建立對照組表達UGRP1蛋白的細胞(與測試組同)，其中不加入候選物。測試組中UGRP1蛋白的表達情況與未添加候選物的對照組中UGRP1蛋白的表達情況進行比較；如果測試組中UGRP1蛋白的表達在統計學上高于對照組(如高50%)，就表明該候選物是促進UGRP1蛋白表達的藥物，從而可作為潛在的治療甲亢的藥物。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表〈110>上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院〈120〉甲亢疾病的易感基因及其應用<130〉062425<160〉24<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>1a.tcttaccat.agtagatgtgtgagtggg28<210〉2<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400〉2acagttatctgggatatttttcaggag27<210>3<211〉27<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature〈223〉引物<400〉3agccttggaaetcaaattactactcctg27<210〉4<211〉25〈212〉DNA〈213>人工序列_<220〉〈221>misc—feature〈223〉引物<400〉4tggagaatcacattagctgatgaac25<210〉5〈211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400>5ggaatatgtgggagaaatggaag23<210>6<211>23〈212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物<400〉6ccaaccataaggtgtgtagcttg23<210〉7〈211〉51<212>DNA<213〉Homosapiens<400>7aagtggaaaaccctccaaattgtttggtgagaaaacataacatttatccct51<210>8〈211〉51<212>DNA<213>Homosapiens<400〉8aagtggaaaaccctccaaattgtttagtgagaaaacataacatttatccct51〈210〉9<211>52<212>DNA〈213〉Homosapiens<400>9aaaattgaatcccaggtttttcaaaagacactctgattttagatcttaagcc52〈210〉10〈211〉51<212>DNA<213〉Homosapiens<400>10aaaattgaatcccaggtttttcaaatacactctgattttagatcttaagcc51<210>11〈211〉51〈212〉DNA<213>Homosapiens<400>11ccttatggttggttgtgttatttatgttcccattttagatgagaggaccaa51<210>12<211〉51<212〉DNA<213>Homosa.pi')ns<400〉12ccttatggttggttgtgttatttatattcccattttagatgagaggaccaa51<210〉13<211〉51<212>DNA<213〉Homosapiens<400〉13ttgaggtgcatggcaggcattcatggtgtctttcatgtagtttataaagta51<210>14<211〉51<212〉DNA〈213〉Homosapiens<400>14ttgaggtgcatggcaggcattcatgatgtctttcatgtagtttataaagta51<210〉15<211>51<212>DNA<213〉Homosapiens<400>15tgttaataagagcacaactagtaagccttgcctcactgacagtggaatatg51〈210〉16<211>51<212>DNA〈213>Homosapiens<400>16tgttaataagagcacaactagtaagacttgcctcactgacagtggaatatg51<210>17<211>51〈212〉DNA<213>Horaosapiens<400>17tggtggtaggaattgtatttttttttattttacttttaactgacacataat￡51<210〉<211〉<212>〈213〉1850DNAHomosapiens〈400>18t.Rgtgg'aggafittgtatttttttl:att.ttartt-ttnactgacacat朋t<210><211〉<212>〈213>1951DNAHomosapiens<400>19ttcaggaggcgctatcacacttggtgtgacatcaagataaagagcggaggt51<210>20<211>51<212>DNA〈213>Homosapiens<400>20ttcaggaggcgctatcacacttggtatgacatcaagataaagagcggaggt51<210>21<211>51〈212〉醒<213>Homosapiens<400>21ggcatagagcttgaaattcatttatatatactaa鄉aaaaactcataact51":21()〉22〈211〉51<212>DNA<213>Homos鄰iens<400〉22ggcatagagcttgaaattcatttatttatactaaaggaaaaactcataact51<210>23<211>51<212〉DNA<213>Homos即iens〈400〉23tagtttataaagtagcagaaagataaagaaatgacagttacaacatggtaa51<210〉24<211>48<212>DNA<213〉Homosapiens<400〉24tagtttataaagtagcagaaagatgaaatgacagttacaacatggtaa48權利要求1.一種UGRP1基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制備用于甲亢分型或檢測甲亢的試劑或試劑盒；(ii)制備檢測UGRP1的變異形式的試劑或試劑盒；(iii)選擇治療甲亢藥物的標志；或(iv)篩選治療甲亢的藥物。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的甲亢是UGRP1表達改變相關的甲亢。3.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的變異形式選自下組UGRP1基因第-112位，G—A;UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;UGRP1基因第-718位，G—A;'UGRP1基因第-1351位，G—A;UGRPl基因第+222位，C—A;UGRP1基因第+271位，Tdel;UGRPl基因第+3337位，G—A;UGRP1基因第-1664位，A—T;或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL;其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NMJ)54023。4.一種體外檢測UGRP1基因或轉錄本是否存在核苷酸變異的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟檢測該個體的UGRP1基因、和/或轉錄本，并與正常的UGRP1基因、和/或轉錄本相比較，存在以下變異形式就表明該個體的UGRP1基因、和/或轉錄本存在核苷酸變異UGRP1基因第-112位，G—A;UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;UGRP1基因第-718位，G—A;UGRP1基因第-1351位，G—A;UGRPl基因第+222位，C—A;UGRP1基因第+271位，Tdel;UGRPl基因第+3337位，G—A;UGRP1基因第-1664位，A—T;或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL;其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，檢測的是UGRP1的基因的核苷酸序列，并與正常UGRP1基因的核苷酸序列比較差異。6.—種檢測樣品中是否存在UGRP1基因變異的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用UGRP1基因特異性引物擴增樣品中的UGRP1基因，得到擴增產物；以及(2)檢測擴增產物中是否存在選自下組的變異形式UGRP1基因第-112位，G—A;UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;UGRP1基因第-718位，G—A;UGRP1基因第-1351位，G—A;UGRPl基因第+222位，C—A;UGRP1基因第+271位，Tdel;UGRPl基因第+3337位，G—A;UGRP1基因第-1664位，A—T;或UGRP1基因第-1301至-1303位，AAADEL;其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM—054023。7.—種對個體的甲亢患者進行分型的方法，其特征在于，所述方法包括檢測該個體的UGRP1基因、和/或轉錄本，并與正常的UGRP1基因、和/或轉錄本相比較，存在以下變異形式就表明該個體是UGRP1基因相關的甲亢患者UGRP1基因第-112位，G—A和UGRP1基因第-623至-622位，AG—T;或UGRP1基因第-112位，G—A和UGRP1基因第-718位，G—A;其中，核苷酸位置編號基于GenBank登錄號NM一054023。8.—種檢測甲亢的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增UGRP1基因、或轉錄本的引物。9.如權利要求S所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括選自下組的試劑(a)與變異部位結合的探針；和(b)識別變異位點的限制性內切酶。10.—種篩選調節UGRP1蛋白表達的藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在測試組中，向表達UGRP1蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測UGRP1蛋白的表達情況；(b)將步驟(a)測試組中UGRPl蛋白的表達情況與未添加候選物的對照組中UGRP1蛋白的表達情況進行比較；如果測試組中UGRP1蛋白的表達在統計學上高于對照組，就表明該候選物是促進UGRP1蛋白表達的藥物；如果測試組中UGRP1蛋白的表達在統計學上低于對照組，就表明該候選物是抑制UGRP1蛋白表達的藥物。全文摘要本發明涉及分子生物學和醫學領域，公開了一種UGRP1(子宮球蛋白相關蛋白1)的用途，用于(i)制備用于甲亢分型的試劑或試劑盒；(ii)制備檢測UGRP1的變異形式的試劑或試劑盒；(iii)選擇治療甲亢藥物的標志；或(iv)篩選治療甲亢的藥物。本發明首次發現并證實UGRP1基因與甲亢疾病的密切相關性，從而為甲亢疾病的診斷與治療提供了新的途徑。文檔編號G01N33/68GK101113466SQ200610029480公開日2008年1月30日申請日期2006年7月28日優先權日2006年7月28日發明者宋懷東申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院