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專利名稱：豬副嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)免疫診斷學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是關(guān)于一種豬副嗜血桿菌的檢測(cè)試
劑盒，用于豬副嗜血桿菌的鑒定及豬副嗜血桿菌病的診斷。
2.
背景技術(shù)：
豬副嗜血桿菌病是由豬副嗜血桿菌引起的一種傳染病。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展， 該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。 目前檢測(cè)豬副嗜血桿菌的主要方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定和PCR。生化鑒定 是利用化學(xué)或生物化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物鑒定細(xì)菌屬、種，但該法操作繁瑣、檢驗(yàn) 時(shí)間長；PCR方法高度靈敏、快速、簡單，但儀器昂貴，不適合基層使用。豬副嗜血桿菌按 Kieletein-Ra卯-Gabrielson(KRG)血清分型方法，至少可分為15個(gè)血清型，部分菌株不能 分型。由于豬副嗜血桿菌的血清型眾多，不同血清型間缺乏交叉反應(yīng)，目前還沒有針對(duì)豬副 嗜血桿菌所有血清型通用的血清學(xué)檢測(cè)方法。發(fā)明人研制出一種多價(jià)血清，通過平板凝集 試驗(yàn)即可檢測(cè)15個(gè)血清型和絕大部分未定型豬副嗜血桿菌。具有特異、方便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)， 無需特殊設(shè)備，特別適于現(xiàn)場診斷，具有較大的應(yīng)用前景。
3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用15個(gè)血清型的豬副嗜血桿菌制備免疫原免疫健康家兔，分別制備高免血 清，通過不同血清型組合，并吸附去除非特異凝集素，篩選出5種血清型組合制備多價(jià)診斷 血清，裝配成試劑盒，能特異性地檢測(cè)全部15個(gè)血清型的豬副嗜血桿菌和絕大多數(shù)未定型 菌株，可用于豬副嗜血桿菌的檢測(cè)。
4.
具體實(shí)施例方式
1)制備豬副嗜血桿菌高免血清分別將15個(gè)血清型的參考菌株復(fù)蘇，增菌培養(yǎng)，滅 活，加入福氏完全佐劑和不完全佐劑疫苗，常規(guī)方法免疫健康家兔，待高免血清平板凝集價(jià)
達(dá)到i : 200以上時(shí)采血，分離血清，即為豬副嗜血桿菌高免血清。 2)多價(jià)血清組合的篩選分別將不同血清型高免血清混合，評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)血清4型、5型、12型、13型、14型5價(jià)混合血清的特異性和檢出率最好，為本發(fā)明的最 佳配伍。 3)非特異性反應(yīng)的消除多價(jià)血清分別用大腸桿菌、沙門氏菌吸附處理，除去其非 特異性反應(yīng)成分，結(jié)果顯示多價(jià)血清只與豬副嗜血桿菌發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，不與大腸桿 菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜炎放線桿菌、空腸彎曲桿菌、鏈球菌等發(fā)生非特異性反應(yīng)。 4)試劑盒的組裝將5種高免血清按一定配比混合制成多價(jià)診斷血清，并配備其他
相關(guān)試劑，組裝成豬副嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)試劑盒，于2°c -st:保存。 實(shí)施例 實(shí)施例1 :質(zhì)量控制
在每次使用檢測(cè)試劑盒前應(yīng)作下列質(zhì)量控制檢測(cè) 1)檢測(cè)試劑的控制取1滴多價(jià)血清和1滴生理鹽水在載玻片上混勻，靜置2min， 輕搖玻片，觀察是否會(huì)出現(xiàn)凝集，如果出現(xiàn)凝集反應(yīng)，表明多價(jià)血清或生理鹽水受到污染， 應(yīng)廢棄處理。 2)陽性對(duì)照的控制滴1滴豬副嗜血桿菌抗原和1滴多價(jià)血清于載玻片同一個(gè)測(cè) 試反應(yīng)環(huán)內(nèi)，用接種環(huán)在整個(gè)區(qū)域內(nèi)混勻液體，靜置20s觀察結(jié)果。如果未出現(xiàn)凝集反應(yīng)， 應(yīng)采用新鮮的檢測(cè)試劑盒。 實(shí)施例2 :平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)豬副嗜血桿菌 1)取10 ill生理鹽水于載玻片的一個(gè)反應(yīng)環(huán)內(nèi)。 2)用接種環(huán)從含5%小牛血清和0. 01% NAD的TSA平板上挑取可疑菌落適量，與 反應(yīng)環(huán)內(nèi)的生理鹽水混合。 3)輕搖檢測(cè)板2分鐘，觀察是否會(huì)出現(xiàn)自凝集現(xiàn)象。如果菌懸液保持均勻狀態(tài)，繼 續(xù)第4步。 4)取10iU多價(jià)血清于載玻片上，用接種環(huán)從TSA平板上挑取適量可疑菌落與多
價(jià)診血清混合均勻。 5)在20s內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。 6)若在20s內(nèi)出現(xiàn)凝集，則判為豬副嗜血桿菌陽性，如不出現(xiàn)凝集，則為豬副嗜血 桿菌陰性。
權(quán)利要求
一種豬副嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)試劑盒，可用于豬副嗜血桿菌的檢測(cè)。其特征是由多價(jià)血清、豬副嗜血桿菌陽性抗原對(duì)照、0.85％氯化鈉溶液和盒體所組成，多價(jià)血清、豬副嗜血桿菌陽性抗原和0.85％氯化鈉溶液均密封于有蓋的玻璃瓶內(nèi)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒的組成包括1瓶多價(jià)血清，1瓶豬副 嗜血桿菌陽性抗原和一瓶0. 85%氯化鈉溶液。
3. 權(quán)利要求1所述的特異性多價(jià)血清為豬副嗜血桿菌單價(jià)高免血清4型、5型、12型、 13型、14型混合而制成的。
4. 權(quán)利要求3所述的單價(jià)高免血清4型、5型、12型、13型、14型為由此5種血清型的 豬副嗜血桿菌采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序分別免疫健康家兔所產(chǎn)生的免疫血清。
5. 權(quán)利要求1所述的豬副嗜血桿菌包括15種血清型的豬副嗜血桿菌和未定型的豬副 嗜血桿菌。
6. 權(quán)利要求1所述的多價(jià)血清用于檢測(cè)豬副嗜血桿菌。
7. 權(quán)利要求1所述的豬副嗜血桿菌陽性抗原用于平板凝集試驗(yàn)的陽性對(duì)照。
8. 權(quán)利要求1所述的0. 85%氯化鈉溶液用于平板凝集的陰性對(duì)照。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒的的特征是加10i！ iU多價(jià)血清和適量的待檢細(xì)菌充 分混勻，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照，室溫靜置5 20s觀察結(jié)果，陽性對(duì)照出現(xiàn)凝集且陰性對(duì) 照不凝集，待檢菌若出現(xiàn)凝集則為豬副嗜血桿菌，若不出現(xiàn)凝集反應(yīng)則為豬副嗜血桿菌陰 性。
全文摘要
本發(fā)明是一種豬副嗜血桿菌的檢測(cè)試劑盒，能特異性地檢測(cè)全部15個(gè)血清型豬副嗜血桿菌及絕大部分未定型的豬副嗜血桿菌，用于豬副嗜血桿菌的鑒定。檢測(cè)所采用的抗體是15個(gè)血清型豬副嗜血桿菌分別免疫家兔所生的高免血清，通過對(duì)不同血清型組合配伍，篩選出5價(jià)混合血清，經(jīng)過大腸桿菌、沙門氏菌吸收去除非特異凝集素制成多價(jià)血清，并與其他試劑裝配成豬副嗜血桿菌檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明特異性強(qiáng)、操作簡單。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101750490SQ20091026348
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者岳華, 湯承, 郭定乾 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)