專利名稱：肺炎衣原體檢測用抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及到作為一般的肺炎病原微生物屬于肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)的微生物檢測中有用的抗體、該微生物的檢測方法、該微生物的檢測用試劑盒、以及該微生物檢測用抗體的制造方法。
本發明在醫療上，特別是在由肺炎衣原體引起的非典型肺炎的診斷中很重要。
本發明在諸如從咽喉棉簽、組織樣品等檢測樣品以及體液采集的檢測樣品中含有的微生物肺炎衣原體的檢測中很有用。
背景技術：
微生物感染癥的診斷是通過通常感染部位等處的病原菌的檢測或針對血清、體液中病原菌的抗體的檢測確定的。該診斷在使病原菌的檢測轉向對患者的迅速治療成為可能意義上講很重要。
感染癥病原菌的檢測一般分為經過病原菌的分離培養、根據其生理學上、生物化學上或結構上的特性對其進行鑒定的培養鑒定法；通過聚合酶鏈式反應(PCR)或特異的核酸雜交使病原菌的基因擴增，對該基因進行檢測的基因診斷法以及利用抗體和病原菌的抗原標記物的特異反應檢測病原菌的免疫學方法。
然而使用培養鑒定法或基因診斷法時，要獲得結果花費的時間長。因此利用能夠在短時間內、高靈敏度地對病原菌進行檢測，迅速地與相應患者的治療聯系起來的免疫學方法的診斷被廣泛采用。
以往在利用免疫學方法檢測感染癥病原菌時，使用因菌種各異的標記抗原和抗體的組合。
肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)在世界上是肺炎的一般病原菌。是小的、非運動性的革蘭氏陰性菌，有選擇地侵入人體內，引起疾病。成為病原巢的動物還不清楚。血清陽性率在30～40歲成年人中為40～50％(Hyman，Roblin等1995)。該微生物可引起咽喉炎、支氣管炎和輕度肺炎。
該細菌是非常微小的專性寄生生物，在宿主細胞的細胞質中生長。在組織培養液中肺炎衣原體的生長非常緩慢(Godzik，O′Brien等1995)，在培養液中鑒定到細菌至少需要3～5日(Essig，Zucs等1997)。因此迅速檢測病原菌的診斷方法不能使用革蘭氏染色法和培養法等。因此作為衣原體的迅速診斷法往往使用利用抗體的免疫學方法。
當為衣原體(Chlamydia)屬時，已知存在作為屬特異抗原的脂多糖(LPS)的抗原決定族(Verkooye，Van Lent等1998)，特別是在各種各樣的診斷用試劑盒中砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的檢測用試劑抗體正被利用。
另外Peterson等人(Peterson，Cheng等1993；Peterson，de la Maza等1998)和Batteiger等人(Batteiger，Newhall等1986)報道了抗Chlamydia屬的主要外膜蛋白質(MOMP)單克隆抗體。
雖然還不清楚這些抗體在區別肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)中的作用，但后來知道這些抗體在闡明肺炎衣原體種內的多個抗原性的差別時起著重要的作用。這樣的抗原只在肺炎衣原體種內的血清類型分類中起作用，但在需要檢測肺炎衣原體種的所有菌株的通常診斷中并不起作用。盡管具有普遍功能的共同抗原及其大部分結構在微生物種間被保存下來，但為了區別它們可用于檢測的抗原到目前為止還不清楚。
本發明涉及到以同一功能的分子普遍存在于所有微生物的，且在制備抗體中用作蛋白質抗原的蛋白質。通常這樣的小分子只伴有小規模的結構變化。對這樣的具有同一功能普遍存在的分子的大規模結構變化可能會對生物的生存產生重大的壞影響。
商業上可利用的檢測衣原體病原體的單克隆抗體只有很少幾個，遠未達到充分程度。直到最近，只有TWAR株被認為是肺炎病原菌(Thom和Grayston 1991；美國專利No.5,008,186)。最近報道了幾種衣原體病原體的血清型。LPS或MOMP因菌株而異，現狀是用抗一種血清型的抗體不能覆蓋全部血清型。
發明概述本發明正是為了解決上述那樣的課題而形成的發明。即，本發明將提供能夠特異、高靈敏度、且迅速地檢測屬于肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)的微生物的方法，該檢測中使用的檢測用抗體、檢測用試劑盒作為課題。另外本發明還將提供檢測中使用的抗體的制造方法作為課題。
本發明人發現了在所有微生物中保持同一功能的蛋白質可作為有用的抗原。通常人們預想這樣的蛋白質結構變化非常小。然而令人吃驚的是抗該蛋白質抗體是微生物種或屬特異性抗體，抗該蛋白質抗體在用于微生物種或屬特異性識別中可能具有多樣性，同時發現作為檢測對象的微生物其所有血清型都可以檢測。
本發明人著眼于以具有同一功能的分子存在于所有微生物細胞的，而且其氨基酸結構具有微生物間一定程度差異的細胞內分子、特別是核糖體蛋白-核糖體蛋白L7/L12。已知核糖體蛋白L7/L12是分子量約為13kDa的蛋白質，是蛋白質合成所必需的核糖體蛋白質。特別是在包括肺炎衣原體在內的幾種微生物中的核糖體蛋白L7/L12的全部氨基酸序列已被解析。
本發明人注意到除了該分子在微生物間類似之外，還注意到其中一部分具有各個微生物固有的結構部分，發現通過利用抗該肺炎衣原體的核糖體蛋白L7/L12蛋白質的抗體有可能對各種各樣的微生物、細菌種特異的、且所有同一菌種內血清型進行檢測。
本發明人通過得到抗肺炎衣原體的該蛋白的特異抗體，發現利用該抗體可以對肺炎衣原體進行特異檢測，完成了本發明。
本發明發現并開發了抗肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質的特異單克隆抗體。該抗體是新的抗體，與以往眾所周知的任一抗體都不同，具有與上述蛋白質進行特異反應的性質。
序列表中序列1和2分別是肺炎衣原體的核糖體蛋白L7/L12基因的DNA序列(NCBI數據庫查詢碼#NC#000922)和對應的氨基酸序列(NCBI數據庫查詢碼#AE001593.1，NCBI數據庫)。序列表記載的氨基酸序列的左端和右端分別是氨基末端(以下稱為N端)和羧基端(以下稱為C端)，而堿基序列的的左端和右端分別是5′端和3′端。序列比對測試的氨基酸序列用氨基酸單字母縮寫表示。而序列比對測試中「+」標記表示有差別的氨基酸，但疏水性等性質類似的氨基酸，「」中的空白表示包括性質在內都不相同的氨基酸。而本發明敘述的基因操作的一系列分子生物學實驗根據通常實驗書記載的方法進行。上述通常實驗書如《分子克隆實驗手冊》Molecular Cloning，A laboratory manual，Cold SpringHarber Laboratory Press，Sambrook，J.等人(1989)。
表1序列比對測試Ct1 MTTESLETLVEQLSGLTVLELSQLKKLLEEKWDVTAAAPVVAVAGAAAAGDAPASAEPTE 60+TTESLETLVE+LS LTVLELSQLKKLLEEKWDVTA+APVVAVA A G+AP +AEPTECp1 VTTESLETLVEKLSNLTVLELSQLKKLLEEKWDVTASAPVVAVA-AGGGGEAPVAAEPTE 59Ct61 FAVILEDVPSDKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQE 120FAV LEDVP+DKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQ+Cp60 FAVTLEDVPADKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQD 119Ct121 AGAKAVAKGL 130AGAKA KGLCp120 AGAKASFKGL 129Ct沙眼衣原體Chlamydia trachobatisCp肺炎衣原體Chlamydia pneumoniae本發明中所謂“微生物”指的是肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)，特別是指在呼吸器官中有病原性、作為衣原體感染癥的病原菌有很大診斷意義的微生物。
本發明中所謂“與微生物進行特異反應的抗體”指的是與微生物種或屬進行特異反應的抗體，在微生物感染癥的診斷中對微生物種進行特異反應的抗體特別有用。
本發明中的抗體指的是多克隆抗體或單克隆抗體，可以通過使用核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的全長或其部分肽制備。制備抗體用的肽的長度沒有特別限定，在制備抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質抗體時，只要是賦予該蛋白質特征的長度都可以，優選5個氨基酸以上，特別優選使用8個氨基酸以上的肽特別理想。
將該肽或全長蛋白質直接、或與稱之為KLH(匙孔鱟血藍蛋白，keyhole-limpet hemocyanin)或BSA(牛血清白蛋白，bovine serumalbumin)的載體蛋白質搭橋后根據需要同時與佐劑一起接種到動物中，通過回收該血清，可以獲得含有識別核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的抗體(多克隆抗體)的抗血清。另外可以從抗血清中純化出抗體后再使用。作為接種的動物有羊、馬、山羊、兔、小鼠、大鼠等，特別是在制備多克隆抗體時，優選羊、兔等。另外利用制備骨髓瘤細胞的眾所周知的方法也可以獲得單克隆抗體，此時優選小鼠。
對將該蛋白質的全長或5個殘基以上、優選8個殘基以上的氨基酸序列與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等作成融合蛋白的產物進行純化之后用作抗原、或不純化也可以直接用作抗原。可以通過或書(《抗體實驗手冊》，Antibodies a laboratory manual，E.Harlow等，Cold Spring HarborLaboratory)給出的各種方法以及基因克隆法等使用分離到的免疫球蛋白基因，使其在培養的細胞中表達的基因重組抗體來制備。
抗可以用作本發明的標記抗原的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的抗體可以通過以下方法或其類似的其它方法獲得，但不限定于這些方法。
a)對于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的基因序列和氨基酸序列已知的微生物來說，通過合成與其它微生物中該蛋白質的氨基酸序列類似性少區域的肽段，以此作為免疫原制備多克隆抗體、或單克隆抗體來獲得目的抗體。
另外通過以已知的該基因的兩端部位的DNA序列作為探針的PCR法進行的基因擴增、以相同部分序列作為模板探針的雜交法等通常的基因操作手法可以獲得該基因的全長序列。
然后構建與其它蛋白質基因的融合基因，以大腸桿菌為宿主通過眾所周知的基因導入法將該融合基因插入到宿主內，使其大量表達后，利用抗融合蛋白質的抗體親和柱法等純化表達蛋白質，可以獲得目的蛋白質抗原。此時由于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質作為抗原，所以即便獲得了針對微生物間保守氨基酸部分的抗體也不符合本發明的目的。因此，對于按照本方法獲得的抗原，通過眾所周知的手法可以獲得產生單克隆抗體的雜交瘤，通過選擇只與該微生物反應的抗體的克隆可以獲得目的抗體。
b)對于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列未知的微生物來說，其一，由于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列在微生物種間有50～60％同源性，首先以該氨基酸序列相同部分的序列為基礎利用PCR法對特定序列部分進行擴增和通過以同源部分序列作為探針的雜交法等通常的基因操作手法可以很容易地獲得該蛋白質的基因。
然后構建與其它蛋白質基因的融合基因，以大腸桿菌為宿主通過眾所周知的基因導入法將該融合基因插入到宿主內，使其大量表達，利用抗融合蛋白質的抗體親和柱法等純化表達蛋白質，可以獲得目的蛋白質抗原。此時由于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質作為抗原，所以即便獲得了針對微生物間保守氨基酸部分的抗體也不符合本發明的目的。因此，對于按照本方法獲得的抗原，通過眾所周知的手法可以獲得產生單克隆抗體的雜交瘤，通過選擇只與該微生物反應的抗體的克隆可以獲得目的抗體。
c)或者作為核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列未知的情況下的其它方法，可以制備相當于在已知的對于核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列中微生物間保守的共同序列部分5～30氨基酸的合成肽，利用眾所周知的方法制備針對該肽序列的多克隆抗體或單克隆抗體。通過使用該抗體的親和柱層析通過對目的微生物的細胞破碎液進行純化，可以獲得高度純化的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質。
蛋白質的純度不夠時可以通過眾所周知的純化手法-離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等手法純化后通過利用制作的抗體的Western印跡等方法對核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的洗脫級分進行鑒定，可以獲得純化的蛋白質。以得到的純化的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質抗原作為基礎通過眾所周知的方法獲得雜交瘤，通過選擇與目的微生物進行特異反應的雜交瘤可以獲得目的抗體。
通過上述方法a)、b)和c)得到的對各種微生物特異的本發明的抗體可以用于使用對靶微生物特異的各種診斷試劑和試劑盒的各種免疫學分析方法中。例如，該抗體可以用于作為眾所周知測定方法的使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應、在微滴板中進行的眾所周知技術ELISA法、已有的免疫層析法、使用著色粒子或具有發色能力的粒子、或被捕捉(capture)抗體和用酶或熒光物標記的該抗體一起包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有的免疫測定手法。
所謂使用抗體的微生物診斷方法指的是利用使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應、在微滴板中進行的眾所周知技術ELISA法、已有的免疫層析法、使用著色粒子或具有發色能力的粒子、或使用被捕捉(capture)抗體和用酶或熒光物標記的該抗體一起包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有免疫測定手法的診斷方法。
另外，作為使用抗體的特別有用的微生物診斷方法通過在由特表平7-509565號公報記載的硅、氮化硅等形成的光學薄膜上進行的抗體反應通過光干涉原理等進行檢測的所謂光免疫分析法(OIA，OpticalImmunoassay)等作為高靈敏度的診斷方法很有用。
而在該檢測方法中所必需的來自微生物細胞內標記抗原的提取方法可以利用通過使用TritonX-100，Tween-20為代表的各種表面活性劑的萃取試劑的處理法、使用適當的蛋白酶等酶的酶處理法、通過物理方法使微生物細胞破碎等已知的細胞結構的破碎方法。希望通過表面活性劑等的組合對于每種微生物設定使用試劑進行的最適萃取條件。
而所謂本發明中利用抗體的微生物檢測用試劑盒相當于利用該檢測方法的檢測用試劑盒。
肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列及其DNA序列如序列表中序列1和2所示。因此，可以將該微生物的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的氨基酸序列與序列表記為序列比對(cross match)的類似微生物的同種蛋白質進行比較。合成同源性低部分的肽，制備抗該肽的多克隆抗體或單克隆抗體有可能省略對微生物具有特異性的抗體的選擇。
特別是多克隆抗體的情況，將免疫的動物的抗血清利用Protein A柱等進行純化，獲得IgG級分之后，希望進一步實施通過在動物免疫用的合成肽的親和層析純化。
另外根據來自該微生物的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的DNA序列的N末端和C末端的序列制備PCR引物。利用該PCR引物的同源性，使用基因組DNA通過PCR法使DNA片段擴增，對DNA片段進行提取，按照常規方法可以獲得肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12基因的片段。肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12基因的全長通過分析這些片段的DNA序列信息可以知道。
得到的肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12基因構建成例如與GST等的融合蛋白質基因，使用適當的表達用質粒構建表達載體后，轉化大腸桿菌，可以使該蛋白質大量表達。對轉化的大腸桿菌進行適當培養，通過使用GST的親和柱對菌體破碎液進行純化，可以得到肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質與GST的融合蛋白質。
可以將該蛋白質直接、或切斷GST部分后作為抗原蛋白質，利用眾所周知的手法建立多個雜交瘤克隆，通過選擇對肺炎衣原體菌體或菌體破碎液或肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質表現出特異反應的抗體，也可以得到目的特異單克隆抗體。
根據本發明制作的抗體可以用于下列方法即作為眾所周知的測定方法的使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應、作為微滴板中進行的眾所周知技術ELISA法、已有的免疫層析法、使用著色粒子或具有發色能力的粒子、或使用被捕捉抗體和用酶或熒光物標記的該抗體一起包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有的免疫測定手法。
根據本發明制作的抗體在所有的免疫測定手法中可以作為于固相或液相中捕獲該抗原蛋白質的所謂捕捉抗體發揮作用，同時通過利用眾所周知的方法對過氧化物酶和堿性磷酸酶等酶進行修飾的酶標記抗體也可作為檢測用抗體發揮作用。
具體實施例方式
以下例子是具體說明本發明的例子，但本發明并不限定于這些范圍。
實施例1來自肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)的核糖體蛋白質L7/L12基因的克隆將肺炎衣原體(ATCC VR-1310、從ATCC購入)于HL細胞的單層上進行培養。肺炎衣原體的詳細培養方法根據Kuo等人(Cles和Stamm1990；Kuo和Grayston 1990；Yoshizawa，Dairiki等1992)的記載進行。在CO2培養箱內于37℃、5％CO2條件下對微生物培養5日。通過離心收集感染的細胞，懸浮于TE緩沖液(和光純藥工業生產)，使最終濃度達到5×107個/ml左右。將該懸浮液1.5ml移至微量離心管中于10,000rpm下離心2分鐘。棄掉上清，沉淀部分再懸浮于567μl的TE緩沖液。然后加入30μl的10％SDS和3μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，充分混合，于37℃下溫育1小時。懸浮液再于56℃下溫育1小時。然后加入80μl的10％的十六烷基三甲基銨溴化物/0.7M NaCl溶液，充分混合之后，于65℃下溫育10分鐘。加入700μl的同一體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合液，充分攪拌。
將該溶液用微量離心機于12000rpm、4℃下離心5分鐘之后，將水相級分移至新的微量離心管中。然后向該離心管中加入0.6倍量的異丙醇，充分振蕩離心管，形成DNA沉淀。用玻璃棒將白色的DNA沉淀撈出，移至加了1ml 70％乙醇(-20℃冷卻的)的另一個微量離心管中。然后將該離心管于10,000rpm下再離心5分鐘，將上清緩慢地除去。追加1ml的70％乙醇，將混合物再離心5分鐘。
再將上清除去之后，沉淀溶解于100μl的TE緩沖液中，得到DNA溶液。根據《分子克隆實驗手冊》Molecular Cloning，A laboratory manual，1989，Eds.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，Cold Spring HarberLaboratory Press的E5，DNA或RNA量的分光光度法測定(Spectrophotometric Determination of the Amount of DNA or RNA)對該基因組DNA溶液的濃度進行定量。
從該基因組DNA中取出10ng進行PCR(聚合酶鏈反應，polymerasechain reaction)。PCR使用Taq聚合酶(寶酒造公司生產、編號R001A)。將酶附帶的緩沖液5μl、酶附帶的dNTP混合物4μl和各200pmol的寡核苷酸(序列表中序列3和4所示)加到酶中。加水使總容積達到50μl。
使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480，對該混合物進行5次95℃1分鐘、50℃2分鐘、72℃3分鐘的循環之后，再進行25次95℃1分鐘、60℃2分鐘、72℃3分鐘的循環。使用一部分PCR產物，于1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳。用溴乙錠(日本基因公司生產)染色后，于紫外線下觀察，確認約400bp的DNA被擴增了。使用限制酶BamHI和XhoI進行酶切后，再于1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳和用溴乙錠染色。從凝膠中切出約400bp的帶。該帶用Suprec01(寶酒造株式會社生產)純化，插入一般載體的pGEX-6P-1(Pharmacia公司生產)中。該載體通過將目的基因片段整合到適當的限制酶的位點，可以起到能夠表達與GST蛋白質融合的融合蛋白質的目的分子的表達載體的作用。
具體來說是將載體pGEX-69-1和先前的DNA以摩爾比為1∶3那樣比例混合，通過T4DNA連接酶(Invitrogen公司生產)將DNA整合到載體中。整合了DNA的載體pGEX-6P-1通過基因手法導入到大腸桿菌的短暫感受態細胞，然后接種到含有50μg/ml的氨芐青霉素(Sigma公司)的半固體狀培養板的LBL-肉湯瓊脂(寶酒造株式會社)。將培養板于37℃下溫育12小時，對生長的菌落進行隨機選擇，接種到含有同濃度的氨芐青霉素的L-肉湯培養液中。于37℃下振蕩培養8小時，收集菌后，使用Wizard Miniprep，根據附帶的說明書分離質粒。該質粒用限制酶BamHI/XhoI進行酶切處理。通過對約370bp的DNA進行酶切確認PCR產物插入。使用上述的克隆確定插入的DNA堿基序列。
利用Applied Biosystems公司生產的熒光測序儀確定插入DNA片段的堿基序列。
使用PRISM，Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司生產)制備測序樣品。首先將9.5μl的反應液、4.0μl的0.8pmol/μl的T7啟動子引物(Gibco BRL)和6.5μl的0.16μg/μl模板DNA加到0.5ml的微量管中，進行混合。該混合物用2層的100μl礦物油覆蓋后，進行25循環PCR擴增處理。每一循環為96℃處理30秒、55℃處理15秒和60℃處理4分鐘。產物于4℃下保存5分鐘。反應結束后，加80μl的無菌純化水，攪拌。將產物離心，水相用苯酚-氯仿混合液萃取3次。將10μl的3M醋酸鈉pH5.2和300μl的乙醇加到100μl的水相中，攪拌。然后于14,000rpm、室溫下離心15分鐘，回收沉淀。用75％乙醇洗沉淀，真空下靜置2分鐘，使其干燥，作為測序樣品。測序樣品溶解在含有4μl的10mM的含有EDTA的甲酰胺之后，于90℃下變性2分鐘。該變性溶液于冰中冷卻之后供測序用。
隨機選擇的5個克隆中的2個與PCR使用的探針有序列上的同源性。而與核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的基因序列一致的DNA序列已經清楚。該結構基因部分的全堿基序列以及對應的氨基酸序列是序列表中序列1和2所示的那樣序列。顯然該基因片段是編碼肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的基因。
實施例2肺炎衣原體的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質在大腸桿菌中的大量表達和純化整合了表達載體的大腸桿菌50ml于LB培養基中于37℃下培養過夜。將500ml的2倍濃度的YT培養基于37℃下加熱1小時。將培養過夜的大腸桿菌液50ml加到上述500ml的培養基中。一小時后，加入550μl的100mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，培養4小時。回收產物，移至250ml的離心管中，于7000rpm下離心10分鐘。棄掉上清，沉淀溶解于含有50mM Tris緩沖液pH7.4、4.25％蔗糖的Lysis緩沖液各25ml的溶液中。然后再加入1.25ml 10％NP-40、125μl的1M MgCl2之后，移至塑料管中。冰冷卻下進行5次1分鐘的超聲波處理。然后于12,000rpm下離心15分鐘，回收上清。
然后使上述上清液吸附于用PBS平衡的谷胱甘肽瓊脂糖柱。用含有20mM pH7.4 Tris緩沖液、4.2mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)洗滌液(2倍柱體積)洗柱子，用含有5mM谷胱甘肽的50mM pH9.6 Tris緩沖液進行洗脫，洗脫級分的蛋白質含量用色素結合法(Bradford法；BioRad Co.)確定，得到主要級分。
得到的純化的GST融合核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的純度通過電泳方法確認，純度約為75％，作為免疫原可確保有充分純度。
實施例3抗肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12單克隆抗體的制備首先在免疫小鼠時，將肺炎衣原體的GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質抗原100μg溶解于200μl的PBS后，加入200μl弗氏完全佐劑，進行混合。乳化后向腹腔內注入200μl。2周后、4周后和6周后向腹腔內注入同樣的乳化抗原。10周后和14周后向腹腔內注入2倍濃度的乳化抗原。最后免疫結束后3天摘取脾臟，進行細胞融合。
相對于無菌摘取的108個小鼠脾細胞加入骨髓瘤細胞2×107個，用玻璃管充分混合之后，于1500rpm離心5分鐘，棄掉上清，然后將細胞充分混合。
細胞融合使用的骨髓瘤細胞使用NS-1系的細胞株于含有10％胎牛血清的RPMI1640培養基進行培養，從細胞融合2周前開始用含有0.13mM的氮雜鳥嘌呤、0.5μg/ml的MC-210、10％胎牛血清的RPMI1640培養基培養1周后，再用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養基培養1周。
將保持在37℃的RPMI1640培養液50ml加到混合細胞樣品中，經15,000rpm離心分離，除去上清液，加入保持在37℃的50％聚乙二醇1ml，攪拌1分鐘。加入保持在37℃的RPMI1640培養液10ml，通過用滅菌的吸液管對混合液進行大約5分鐘的吸、吹操作，進行更激烈攪拌。
于1,000rpm下離心分離5分鐘，除去上清后，加入30ml HAT培養液使細胞濃度達到5×106/ml。對該混合液進行攪拌直至均一為止，然后加入到96孔板中，每孔0.1ml，于37℃、7％二氧化碳氛圍下進行培養。在第1天、第1周和第2周每孔各加入0.1ml的HAT培養基，通過ELISA法篩選產生目的抗體的細胞。
溶解在含有0.05％疊氮鈉的PBS中的GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質和GST蛋白質分別稀釋到10μg/ml后的稀釋液分別加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附過夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應1小時，進行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween，PBS)洗滌。然后加入融合細胞的培養液100ml，于室溫反應2小時。除去上清，用洗滌液洗沉淀。然后加入濃度為50ng/ml的過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體溶液100μl，使混合物于室溫下反應1小時。除去上清，生成物再用洗滌液洗。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生產)，使混合物于室溫下反應20分鐘。顯色時加入100μl 1N硫酸終止反應，測定450nm的吸光度。
結果表明出現了只對GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質反應，而對GST蛋白質不反應的陽性孔，這樣的孔含有抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質抗體。
然后分別回收陽性孔中的細胞，加到24孔的塑料板中用HAT培養基進行培養。
用HT培養基對培養的融合培養基進行稀釋，使細胞數達到約20個/ml，取其中的50μl與懸浮于HT培養基的6周齡小鼠胸腺細胞106個于96孔板中進行混合。混合后，于7％CO2、37℃條件下培養2周。
使用上述的ELISA法對培養上清中的抗體活性進行同樣的測定，回收與核糖體蛋白L7/L12蛋白質反應呈陽性的細胞。再反復進行同樣的稀釋測定、克隆操作，得到5個克隆的雜交瘤CPRB-1～5。
實施例4檢測肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質的單克隆抗體的選擇用上述那樣得到的陽性雜交瘤細胞按照常規方法生產回收單克隆抗體。
具體來說，將用RPMI1640培養基(含有10％FCS)進行傳代培養的細胞5×106個(PBS中)注射到2周前預先已向腹腔內注射了0.5ml降植烷的Balb/C小鼠腹腔內。3周后回收腹水，獲得該腹水的離心上清。
使得到的含有抗體的溶液吸附于Protein A柱(5ml，Pharmacia生產)上，用3倍量的PBS洗。然后用pH3檸檬酸緩沖液進行洗脫。回收抗體級分，得到由各個雜交瘤產生的單克隆抗體。通過ELISA法對來自這5株雜交瘤的單克隆抗體進行評價。
在單克隆抗體的評價中使用夾層分析法。通過使制備的單克隆抗體與過氧化物酶結合，用作檢測用抗體。
酶標記使用辣根過氧化物酶(Sigma grade VI)，在結合中使用試劑S-乙酰硫代醋酸N-羥基琥珀酰亞胺，根據Analytical Bio-chemistry132(1983)，68-73報道的方法進行。在ELISA反應中將市售的抗肺炎衣原體多克隆抗體(兔)以10μg/ml濃度稀釋后的稀釋液100μl分別注入96孔板中，于4℃下吸附過夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應1小時，進行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween 20，PBS)洗凈。然后向上述洗凈的生成物加入100μl抗原溶液(該抗原溶液是通過向各個微生物培養液加入濃度達到0.3％的量的Triton X-100，于常溫下萃取5分鐘得到的)，于室溫反應2小時。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。然后加入濃度為5μg/ml的過氧化物酶標記的抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質抗體溶液100μl，于室溫下反應1小時。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生產)，使混合物于室溫下反應20分鐘。顯色時加入100μl 1N硫酸終止反應，測定450nm的吸光度。
作為標記抗體使用來自雜交瘤CPRB-1的單克隆抗體時，通過使用以106個/ml的靈敏度檢測實驗的肺炎衣原體所有菌株同時，對其它的流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae，肺炎克氏桿菌Klebsiellapneumoniae，肺炎支原體Mycoplasma pneumoniae以及腦膜炎奈瑟球菌Neisseria meningitides等微生物即使在108個/ml的高濃度也沒有反應性的抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質單克隆抗體，可以明確地確認獲得具有肺炎衣原體特異反應性的抗體。該抗體被命名為AMCP-1。表2只給出了使用AMCP-1的結果。使用與別的微生物表現交叉反應的其它抗體的結果這里沒有涉及。
表2
(+陽性，-陰性)實施例5使用核糖體蛋白L7/L12蛋白質固定化親和柱獲得與肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質特異反應的多克隆抗體用實施例1記載的方法獲得的肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質或經Triton X-100處理的菌體的上清作為抗原。將含有100μg抗原的生理鹽水約1.2ml與弗氏佐劑1.5ml乳化。將乳化液向SPF日本白兔進行皮下注射，對兔子進行免疫。每隔2周免疫5～6次，對抗體效價進行確認。
抗體效價的確認通過ELISA法實施。溶解在含有0.05％疊氮鈉的PBS中的肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質以10μg/ml稀釋后的稀釋液分別加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附過夜。除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應1小時，進行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween 20，PBS)洗凈。然后加入正常的兔血清和免疫后兔抗血清經稀釋后得到的溶液100μl，于室溫反應2小時。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。然后加入濃度為50ng/ml的過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體溶液100μl，于室溫下反應1小時。除去上清，生成物再用洗滌液洗。各加入100μl的OPD溶液(Sigma公司生產)，使混合物于室溫下反應20分鐘。顯色時加入100μl 1N硫酸終止反應，測定492nm的吸光度。
確認抗體效價上升后，實施大量采血。從耳動脈將血液采集到玻璃離心管中，于37℃放置1小時后，于4℃下靜置過夜。然后于3000rpm離心5分鐘，回收上清。得到的抗血清保存在4℃下。
制備固定了肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質親和柱。使用HiTrap NHS活化柱(1ml，Pharmacia公司生產)。柱子后用1mM HCl置換后立即加入核糖體蛋白L7/L12蛋白質的PBS溶液(1mg/ml)。將柱子靜置30分鐘后，加入封閉試劑，用PBS進行平衡。
使用該肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質固定化親和柱，對用肺炎衣原體經Triton X-100處理的菌體的上清作為抗原得到的抗血清中的多克隆抗體進行純化。將該抗血清用PBS稀釋5倍，用0.45μm的膜過濾后，以流速0.5ml/min吸附于肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質固定化柱。然后用0.1M pH2.1甘氨酸緩沖液從柱子上洗脫出來立即用1MpH9.0 Tris緩沖液中和后，通過與抗體效價測定方法同樣的ELISA法回收目的抗體的洗脫級分。
這樣得到的多克隆抗體通過特表平7-509565號公報記載的OIA法進行評價。
純化的抗體作為OIA法的捕捉抗體使用。作為檢測抗體使用實施例4記載的AMCP-1單克隆抗體經過氧化物酶標記的抗體。酶標記使用辣根過氧化物酶(Sigma grade VI)，結合中使用試劑S-乙酰硫代醋酸N-羥基琥珀酰亞胺，根據Analytical Bio-chemistry 132(1983)，68-73報道的方法進行。
在OIA反應中含有0.05％疊氮鈉的PBS中的純化多克隆抗體用0.1MpH8.0 HEPES緩沖液稀釋到10μg/ml后的稀釋液(50μl)加到硅晶片上，于室溫下反應30分鐘后，用蒸餾水洗凈，用含有蔗糖以及堿處理干酪素的包被溶液包被后使用。
然后向上述硅晶片上加入通過向上述操作得到的各個微生物培養液加入濃度達到0.5％的量的Triton X-100，于常溫下萃取5分鐘得到的抗原溶液15μl，于室溫反應10分鐘。然后加入20μg/ml的過氧化物酶標記的單克隆抗體溶液15μl，于室溫下反應10分鐘。用蒸餾水洗凈后，各加入15μl的TMB溶液(KPL公司生產)，使混合物于室溫下反應5分鐘。生成物用蒸餾水洗凈，用肉眼可以觀察到通過酶反應生成的藍色。
結果就象表3所示的那樣，表明通過將純化多克隆抗體APCP-1作為捕捉抗體使用，可以以108個/ml的靈敏度檢測肺炎衣原體，但不能檢測其它微生物的反應性。因此可以通過固定了肺炎衣原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質的親和柱確認獲得了對肺炎衣原體特異反應的多克隆抗體。
表3
(+陽性，-陰性)
通過本發明不僅可以利用針對在微生物進化過程中保持功能的細胞內分子的抗體對特定種類微生物進行特異檢測，而且可以高精度地檢測同一種內的所有血清型微生物。
作為這樣的抗體可以使用針對微生物核糖體蛋白質、核糖體蛋白質L7/L12蛋白質的抗體，對肺炎衣原體進行高精度地檢測。
另外通過使用這樣抗體為組成成分的微生物檢測試劑盒，可以對微生物進行更廣泛、更高精度的檢測。
引用文獻專利文獻美國專利No.5,008,186、Grayston，等1991，引起急性呼吸器官疾病的特異的衣原體的檢測。
美國專利No.5,281,518、Campbell等1994，引起急性呼吸器官疾病的特異的衣原體的檢測。
美國專利No.5,350,673、Campbell等1994，引起急性呼吸器官疾病的特異的衣原體的檢測。
其它文獻Batteiger，B.E.，Newhall，W.J.th.等(1996)，「使用小鼠單克隆抗體的沙眼衣原體的主要外皮薄膜蛋白質的抗原分析法」Infect Immuno 53(3)，646-50Cles，L.D.和W.E.Stamm(1990)「用于肺炎衣原體的分離和傳代培養的HL細胞」J Clin Microbiol 28(5)，938-40Essig，A.，P.Zucs，等(1997)「通過慢性肺炎患者的聚合酶鏈式反應和細胞培養診斷鳥疫(鳥類病；ハト病)」、Clin Diagn Lab Immunol 4(2)，213-6Godzik，K.L.，E.R.O′Brien，等(1995)、「肺炎衣原體感染人血管壁細胞的生物體外易感性」J Clin Microbiol 33(9)，2411-4Hyman，C.L.，P.M.Roblin，等(1995)「通過聚合酶鏈式反應的免疫學分析和通過培養對主觀上看上去健康成年人中無癥狀的肺炎衣原體鼻喉保持率的評價」 Clin Infet Dis 20(5)，1174-8Kuo，C.C.和J.T.grayston(1990)「用于肺炎衣原體分離和增殖的感應細胞株和HL細胞的使用」J Infet Dis 162(3)，755-8Peterson，E.M.，X.Cheng，等(1993)「肺炎衣原體的功能性主要外皮薄膜蛋白質抗原表位」J Gen Microbiol 139(Pt11)，2621-6Peterson，E.M.，L.M.de la Maza，等(1998)「由肺炎衣原體脂多糖類引起的中和單克隆抗體的物性的確定」Sc和J Infet Dis 30(4)，381-6Thom，D.H.和J.T.Grayston(1991)「肺炎衣原體TWAR感染」Clin ChestMed 12(2)，245-56Verkooyen，R.P.，N.A.Van Lent，等(1998)「利用微量免疫熒光分析和ELISA法診斷慢性閉塞性肺炎患者中肺炎衣原體感染」Am Heart J 135(1)，15-20Yoshizawa，H.，K.Dairiki，等(1992)「Hep-2細胞和HL細胞對肺炎衣原體的感度的比較」Kansenshogaku Zasshi 66(8)，1037-41NCBI數據庫#NC#000922.Kalman，S.Mitchell，W，Marathe，R.，Lammel，C.，Fan，J.，Olinger，L.，Grimwood，J.，Davis，R.W.，和Stephens，R.S.NCBI數據庫#AE001593.1.Kalman，S.Mitchell，W.，Marathe，R.，Lammel，C.，Fan，J.，Olinger，L.，Grimwood，J.，Davis，R.W.，和Stephens，R.S.Harlow，E.，和D.Lane(1988)「抗體實驗手冊」NewYork.，Cold SpringHarbor Laboratory PressShambrook.J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis.，(1989)「分子克隆實驗手冊」NewYork.，Cold Spring Harbor Laboratory Press
序列表<110>旭化成株式會社<120>肺炎衣原體檢測用抗體<130>ASAHI-9<150>JP 2000-062684<151>2000-01-31<160>4<210>1<211>39<212>DNA<213>肺炎衣原體Chlamydia pneumoniae<400>1gtg aca aca gaa agt ttg gaa act tta gta gag aag tta agt aat tta 48Val Thr Thr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Val Glu Lys Leu Ser Asn Leu1 5 10 15act gta cta gaa ctc tct caa ttg aaa aaa tta tta gaa gag aag tgg 96Thr Val Leu Glu Leu Ser Gln Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Lys Trp20 2530gat gtt act gct tct gct ccc gta gtt gct gtt gct gct ggt ggt ggc 144Asp Val Thr Ala Ser Ala Pro Val Val Ala Val Ala Ala Gly Gly Gly35 40 45gga gaa gct cct gtt gct gcc gaa cct aca gaa ttt gca gta acc ctc 192Gly Glu Ala Pro Val Ala Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ala Val Thr Leu5055 60gaa gat gtt cct gca gat aaa aaa atc ggc gtc tta aaa gtc gtt agg 240Glu Asp Val Pro Ala Asp Lys Lys Ile Gly Val Leu Lys Val Val Arg6570 75 80gaa gta act gga tta gct tta aaa gaa gct aaa gaa atg aca gaa ggt 288Glu Val Thr Gly Leu Ala Leu Lys Glu Ala Lys Glu Met Thr Glu Gly8590 95tta cct aaa act gtt aaa gaa aaa act tct aaa agt gat gct gaa gat 336
Leu Pro Lys Thr Val Lys Glu Lys Thr Ser Lys Ser Asp Ala Glu Asp100105110act gtt aag aag tta caa gat gct ggc gca aaa gcc tca ttt aag gga 384Thr Val Lys Lys Leu Gln Asp Ala Gly Ala Lys Ala Ser Phe Lys Gly115120125ctg taa 390Leu<210>2<211>122<212>PRT<213>肺炎衣原體Chlamydia pneumoniae<400>2Val Thr Thr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Val Glu Lys Leu Ser Asn Leu1 5 10 15Thr Val Leu Glu Leu Ser Gln Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Lys Trp2025 30Asp Val Thr Ala Ser Ala Pro Val Val Ala Val Ala Ala Gly Gly Gly35 40 45Gly Glu Ala Pro Val Ala Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ala Val Thr Leu50 55 60Glu Asp Val Pro Ala Asp Lys Lys Ile Gly Val Leu Lys Val Val Arg6570 75 80Glu Val Thr Gly Leu Ala Leu Lys Glu Ala Lys Glu Met Thr Glu Gly8590 95Leu Pro Lys Thr Val Lys Glu Lys Thr Ser Lys Ser Asp Ala Glu Asp100105110Thr Val Lys Lys Leu Gln Asp Ala Gly Ala Lys Ala Ser Phe Lys Gly115 120125Leu<210>3<211>33<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于從肺炎衣原體獲得核糖體蛋白質L7/L12基因使用的PCR的引物DNA<400>3gtgggatccg tgacaacaga aagtttggaa act 33
<210>4<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于從肺炎衣原體獲得核糖體蛋白質L7/L12基因使用的PCR的引物DNA<400>4ttactcgagt tacagtccct taaatgaggc ttttg 3權利要求
1.抗屬于肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)微生物的核糖體蛋白質L7/L12的單克隆抗體，其僅與肺炎衣原體核糖體蛋白質L7/L12特異反應，與其他微生物的核糖體蛋白質L7/L12不反應。
2.權利要求1記載的抗體，其中抗體是與酶結合的抗體。
3.屬于肺炎衣原體微生物的檢測方法，其特征在于使用權利要求1或2記載的抗體。
4.屬于肺炎衣原體微生物的檢測方法，該方法由以下a)、b)和c)構成a)通過使檢測樣品與溶解液接觸，從微生物中提取核糖體蛋白質、b)提取的檢測樣品通過與捕捉抗體，即權利要求1或2記載的抗體被固定于固體表面上的抗體接觸，在核糖體蛋白質和捕捉抗體之間形成抗原抗體復合物以及c)使用檢測用抗體、即權利要求1或2記載的抗體對抗原抗體復合物進行檢測。
5.權利要求4記載的方法，其中檢測用抗體是與酶結合的抗體，抗原抗體復合物是通過該酶的特異底物可被檢測的復合物。
6.屬于肺炎衣原體微生物的檢測用試劑盒，其特征是使用權利要求1或2記載的抗體。
7.權利要求1或2記載的抗體的制造方法，其特征是將通過基因操作或從微生物分離純化得到的屬于肺炎衣原體微生物的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質、其部分肽、或相當于其部分肽的合成肽作為免疫原。
8.抗屬于肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)微生物的核糖體蛋白質L7/L12的多克隆抗體，其僅與肺炎衣原體核糖體蛋白質L7/L12特異反應，與其他微生物的核糖體蛋白質L7/L12不反應。
9.權利要求8記載的抗體，其中抗體是與酶結合的抗體。
10.屬于肺炎衣原體微生物的檢測方法，其特征在于使用權利要求8或9記載的抗體。
11.屬于肺炎衣原體微生物的檢測方法，該方法由以下a)、b)和c)構成a)通過使檢測樣品與溶解液接觸，從微生物中提取核糖體蛋白質、b)提取的檢測樣品通過與捕捉抗體，即權利要求8或9記載的抗體被固定于固體表面上的抗體接觸，在核糖體蛋白質和捕捉抗體之間形成抗原抗體復合物以及c)使用檢測用抗體、即權利要求8或9記載的抗體對抗原抗體復合物進行檢測。
12.權利要求11記載的方法，其中檢測用抗體是與酶結合的抗體，抗原抗體復合物是通過該酶的特異底物可被檢測的復合物。
13.屬于肺炎衣原體微生物的檢測用試劑盒，其特征是使用權利要求8或9記載的抗體。
14.權利要求8或9記載的抗體的制造方法，其特征是將通過基因操作或從微生物分離純化得到的屬于肺炎衣原體微生物的核糖體蛋白質L7/L12蛋白質、其部分肽、或相當于其部分肽的合成肽作為免疫原。
全文摘要
本發明提供能夠特異、而且高靈敏度迅速地檢測屬于肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)的微生物的方法，該檢測中使用的檢測用抗體、檢測用試劑盒、以及檢測中使用的抗體的制造方法。作為抗屬于肺炎衣原體的微生物的核糖體蛋白質的抗體是可特異與該微生物反應的抗體。使用該抗體檢測樣品中的該微生物的方法以及含有該抗體的檢測用試劑盒。該抗體的制造方法。作為核糖體蛋白質有核糖體蛋白L7/L12蛋白質，用于肺炎病原微生物的感染檢測。
文檔編號G01N33/569GK1962694SQ20061015408
公開日2007年5月16日 申請日期2001年1月31日 優先權日2000年1月31日
發明者M·拉曼, 江藤高志 申請人:旭化成株式會社
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
