一種酶聯免疫顯色底物及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種酶聯免疫顯色底物，所述的顯色底物的pH為4.0-4.5，由質量濃度為0.9-1.5g/l的一水合檸檬酸、質量濃度為25-30g/l的十二水磷酸氫二鈉、質量濃度為3-3.5g/l的四甲基聯苯胺鹽酸鹽、質量濃度為0.15-0.3g/l的乙二胺四乙酸二鈉、與所述的顯色底物的體積比為0.01-0.02的丙三醇、質量濃度為0.095-0.1g/l的焦磷酸鈉、質量濃度為0.008-0.01g/l的錫酸鈉、pH調節劑和水組成。本發明采用四甲基聯苯胺鹽酸鹽作為顯色的主要成分，可以直接在水溶液條件下完全溶解，穩定性好、無需提前混合，簡化了操作步驟，減少了批間差異。
【專利說明】一種酶聯免疫顯色底物及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物體外診斷試劑【技術領域】，具體涉及一種酶聯免疫顯色底物及其制備方法。
【背景技術】
[0002]1971 年瑞典學者 Engvail 和 Perlmann,荷蘭學者 Van Weerman 和 Schuurs 分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。ELISA 現在已成為目前分析化學領域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(immunoenzymatictechniques)的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術。
[0003]基本原理:
[0004]它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。
[0005]在這種測定方法中有3種必要的試劑:
[0006]①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)
[0007]②酶標記的抗原或抗體(標記物)
[0008]③酶作用的底物(顯色劑)
[0009]測量時，抗原(抗體)先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體(抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物)，此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。
[0010]其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(酶標儀)加以測定。其方法簡單，方便訊速，特異性強。
[0011]目前顯色底物配制方法很多，市售的顯色底物不僅價格昂貴，而且儲存有效期短，在使用過程中對操作的準確性要求高；有很多實驗室自行配制，但配制方法多種多樣沒有統一的標準和規范；在研究論文中使用的顯色底物也是五花八門，對于檢測數據的對比及驗證造成了困難。并且，目前所用的顯色底物多采用四甲基聯苯胺(如CN102866249A和CN103063661A),需要使用DMSO溶解四甲基聯苯胺，并且目前的顯色底物多是由兩種溶液組成，使用時需要將兩種溶液按照一定比例預先混合。因此需要研制用于生物體外診斷的靈敏高效、穩定、易用及配置簡單的顯色底物是當務之急。
【發明內容】
[0012]本發明所要解決的技術問題是提供一種使用時不用預先混合的酶聯免疫顯色底物。
[0013]本發明所要解決的另一技術問題是提供上述顯色底物的制備方法。[0014]為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案:
[0015]一種酶聯免疫顯色底物，所述的顯色底物的pH為4.0-4.5，由質量濃度為
0.9-1.5g/l的一水合檸檬酸、質量濃度為25-30g/l的十二水磷酸氫二鈉、質量濃度為3-3.5g/l的四甲基聯苯胺鹽酸鹽、質量濃度為0.15-0.3g/l的乙二胺四乙酸二鈉、與所述的顯色底物的體積比為0.01-0.02的丙三醇、質量濃度為0.095-0.lg/Ι的焦磷酸鈉、質量濃度為0.008-0.0lg/Ι的錫酸鈉、pH調節劑和水組成。
[0016]優選地，所述的pH調節劑為濃度為5-7M的鹽酸。
[0017]一種上述酶聯免疫顯色底物的制備方法，包括如下步驟:
[0018]步驟(I)、將所述的一水合檸檬酸和所述的十二水磷酸氫二鈉先溶解在部分所述的水中，用所述的PH調節劑調節pH為4.0-4.5，然后再加入剩余的水定容至1000ml，即得緩沖母液；
[0019]步驟(2)、將所述的四甲基聯苯胺鹽酸鹽和所述的乙二胺四乙酸二鈉加入到所述的緩沖母液中，攪拌溶解，得到混合溶液；
[0020]步驟(3)、將所述的丙三醇、所述的焦磷酸鈉和所述的錫酸鈉加入到所述混合溶液中，攪拌溶解8-24小時，即得所述的顯色底物。
[0021]由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點:
[0022]本發明采用四甲基聯苯胺鹽酸鹽作為顯色的主要成分，取代了過去的四甲基聯苯胺，其優勢是，不用單獨使用DMSO溶解四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺鹽酸鹽可以直接在水溶液條件下完全溶解而且其穩定性優于原來的DMSO溶解下的四甲基聯苯胺；并且本發明的顯色底物在檢測中無需提前混合，簡化了檢測操作步驟，減少了顯色底物的批間差異。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施條件為本行業中的常規條件。
[0024]實施例1
[0025]將1.0g —水合檸檬酸和26g十二水磷酸氫二鈉加入到800mL蒸餾水中，用濃度為6M的鹽酸調節pH至4.0，加入蒸餾水定容至IOOOmL制得緩沖母液；向緩沖母液中加入3.2g四甲基聯苯胺鹽酸鹽和0.2g乙二胺四乙酸二鈉，攪拌溶解，得到混合溶液；向混合溶液中加入15mL丙三醇、98mg焦磷酸鈉和9mg錫酸鈉，進行避光過夜攪拌，即得顯色底物。
[0026]實施例2
[0027]將1.5g—水合檸檬酸和30g十二水磷酸氫二鈉加入到800mL蒸餾水中，用濃度為6M的鹽酸調節pH至4.5，加入蒸餾水定容至IOOOmL制得緩沖母液；向緩沖母液中加入3.5g四甲基聯苯胺鹽酸鹽和0.3g乙二胺四乙酸二鈉，攪拌溶解，得到混合溶液；向混合溶液中加入20mL丙三醇、IOOmg焦磷酸鈉和IOmg錫酸鈉，進行避光過夜攪拌，即得顯色底物。
[0028]實施例3
[0029]將1.2g—水合檸檬酸和28g十二水磷酸氫二鈉加入到800mL蒸餾水中，用濃度為6M的鹽酸調節pH至4.2，加入蒸餾水定容至IOOOmL制得緩沖母液；向緩沖母液中加入3.4g四甲基聯苯胺鹽酸鹽和0.25g乙二胺四乙酸二鈉，攪拌溶解，得到混合溶液；向混合溶液中加入17mL丙三醇、99mg焦磷酸鈉和IOmg錫酸鈉，進行避光過夜攪拌，即得顯色底物。
[0030]實施例4:顯色底物的顯色性能測試
[0031]將包被好的花生過敏原微孔板加入100 μ I質控血清及其稀釋樣本,在25°C下反應I小時；用洗滌液洗滌3-5次；加入酶結合物每孔100 μ 1，放入25°C下反應30分鐘；用洗滌液洗滌3-5次；分別加入北京某公司市售顯色底物以及實施例1至3中的顯色底物，每孔100 μ 1，每個檢測樣品重復3次，在25°C下反應30分鐘；用2M的硫酸溶液進行終止反應，每孔50 μ I。表1為不同配方顯色劑的試驗結果(表中數據為平均值)
[0032]其中:
[0033]質控血清:含花生過敏抗體陽性質控血清；
[0034]花生過敏原:按照0.5ug/孔過夜包被；
[0035]包被液:Na2C0315mM，NaHC0x35mM,NaCl 0.2M ；
[0036]封閉液:1%BSA用于稀釋二抗，避免非特異性結合；
[0037]洗滌液:TBST，Trisl2.lg+NaC19.0g+H20600ml (定容至 1000ml)、使用 6M鹽酸調pH值到 7.5+0.5ml Tween-20 ；
[0038]酶結合物:Ant1-1gE-AP (抗人IgE抗體與堿性磷酸酶偶聯物)，0.05mg/mL
[0039]表1
[0040]
【權利要求】
1.一種酶聯免疫顯色底物，其特征在于:所述的顯色底物的pH為4.0-4.5，由質量濃度為0.9-1.5g/l的一水合檸檬酸、質量濃度為25-30g/l的十二水磷酸氫二鈉、質量濃度為3-3.5g/l的四甲基聯苯胺鹽酸鹽、質量濃度為0.15-0.3g/l的乙二胺四乙酸二鈉、與所述的顯色底物的體積比為0.01-0.02的丙三醇、質量濃度為0.095-0.lg/Ι的焦磷酸鈉、質量濃度為0.008-0.0lg/Ι的錫酸鈉、pH調節劑和水組成。
2.根據權利要求1所述的酶聯免疫顯色底物，其特征在于:所述的PH調節劑為濃度為5-7M的鹽酸。
3.—種如權利要求1或2所述的酶聯免疫顯色底物的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 步驟(I)、將所述的一水合檸檬酸和所述的十二水磷酸氫二鈉先溶解在部分所述的水中，用所述的PH調節劑調節pH為4.0-4.5，然后再加入剩余的水定容至1000ml，即得緩沖母液； 步驟(2)、將所述的四甲基聯苯胺鹽酸鹽和所述的乙二胺四乙酸二鈉加入到所述的緩沖母液中，攪拌溶解，得到混合溶液； 步驟(3)、將所述的丙三醇、所述的焦磷酸鈉和所述的錫酸鈉加入到所述混合溶液中，攪拌溶解8-24小時，即得所述的顯色底物。
【文檔編號】G01N33/531GK103913566SQ201410143488
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】李慶春, 秦楓, 王秀偉 申請人:蘇州浩歐博生物醫藥有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
