專利名稱：流式細胞儀－細胞內分子探針技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用流式細胞儀--腫瘤細胞內分子探針技術在體外、實驗動物體內示蹤腫瘤細胞的增生過程，并同時對潛在抗腫瘤藥物進行快速篩選。
背景技術：
腫瘤目前已成為對人類生命構成嚴重威脅的三大疾病之一。因此，研究腫瘤細胞的增生過程以及尋找有效的抗腫瘤藥物，對腫瘤的臨床診斷和治療具有重要意義。目前，較常用的檢測腫瘤細胞的增生過程及抗腫瘤藥物篩選方法如溴脫氧尿嘧啶免疫染色法(BrdU(5’-bromo-2’-deoxy-uridin)).微量培養四唑技術MTT(Microculture tetrazolium technique)、氚示蹤技術(3H-thymidine incorporation)，等。
這些方法雖被廣泛采用，但都有一定的局限性。如溴脫氧尿嘧啶免疫染色法無法確定原有的細胞數量，且需要抗體，價格昂貴；氚示蹤技術有放射性污染，對人體和環境有害；幾種方法操作程序都比較復雜，對技術要求較高。總的來說，這些方法耗時，工作量大，且操作者需要相當的實驗室經驗。
最近的一些分子生物學進展，使得利用細胞內分子探針技術標記細胞內DNA或蛋白質這一生物工具不斷發展而且得到快速應用。細胞內分子探針包括基因探針(一段DNA序列)和熒光分子探針(熒光染料分子)。分子探針與細胞內DNA或蛋白質結合有較高的穩定性，其熒光強度可持續時間長(數天至數月)。這些已被應用于體外和體內持續檢測生物過程(如基因表達，蛋白質-蛋白質相互間作用和淋巴細胞的生長分化等等)。
本發明以細胞內分子探針技術配合流式細胞儀的使用，可在體內體外示蹤腫瘤細胞的增生過程，并同時對大量潛在抗腫瘤藥物進行快速篩選，對各種不同的腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性進行‘高通量’(High-throughput)分析。與傳統的方法相比，本技術具有對腫瘤細胞生長和藥物療效進行動態觀察的優點，且無放射性、更準確、快捷、操作簡單、經濟。
發明內容
本發明涉及研發以流式細胞儀-細胞內分子探針為手段，動態觀察體外、實驗動物體內腫瘤細胞的生長繁殖，并對多種潛在抗腫瘤藥物進行快速篩選的簡單實用、高效的技術。
本發明的具體實施方式
之一，是用基因探針(一段DNA序列)通過轉基因技術插入(標記)腫瘤細胞，既重組細胞。
本發明的另一具體實施方式
，是用熒光分子探針標記腫瘤細胞內的DNA或蛋白質。
本發明的另一具體實施方式
，在體外(in vitro)將標記了熒光分子探針的至少一種腫瘤細胞系分別與待測抗腫瘤藥物培養；腫瘤細胞進行有絲分裂時，子細胞攜帶的熒光將減半。在設定的時間點由流式細胞儀收獲。用正向光衍射(forward scatter)比電子密度(side scatter)來確定熒光的強弱和峰值，并使用設定的程序對檢測結果進行分析。
本發明的另一具體實施方式
，由流式細胞儀收獲時，激光激發待測樣品的熒光標記物產生熒光，因其激發光的波長不同，不同的熒光標記物產生不同顏色的熒光。故不同的腫瘤細胞系可用不同顏色的熒光分子探針標記，之后數種腫瘤細胞可與至少一種待測抗腫瘤藥物分別培養。由于所標記的不同的腫瘤細胞系熒光顏色不同，可在單一試管內同時由流式細胞儀收所獲，進行多色熒光分析(可同時檢測4色)，從而使單一試管內的檢測指標成倍提高，形成高通量式測定模式。
本發明的另一具體實施方式
，是在體內(in vivo)將標記有基因探針的腫瘤細胞，既重組細胞接種到實驗動物體內。腫瘤細胞繁殖時，基因探針表達。給以待測抗腫瘤藥物治療。收獲時單個腫瘤細胞群被從組織中提取，由流式細胞儀收獲分析。并使用設定的程序對檢測結果進行半定量和定量分析。
本發明的另一具體實施方式
，是本選擇性流式細胞儀-腫瘤細胞內蛋白質或DNA分子探針技術，用于(但不限于)以下范圍體內體外腫瘤細胞的示蹤，抗腫瘤藥物的快速篩選。
三種不同的腫瘤細胞系用不同顏色的熒光分子探針標記之后，分別與一種待測抗腫瘤藥物培養(未給藥組作對照)。由于所標記的不同的腫瘤細胞系熒光顏色不同，可在單一試管內同時由流式細胞儀收所獲，用正向光衍射(forward scatter)比電子密度(side scatter)來確定熒光的強弱和峰值，并使用設定的程序對檢測結果進行多色熒光分析。結果顯示未給藥組三種腫瘤細胞系細胞攜帶熒光均隨培養時間而遞減，表明腫瘤細胞增殖進行有絲分裂，子細胞攜帶的熒光減半。而抗腫瘤藥物治療組相應的三種腫瘤細胞攜帶熒光并未隨培養時間而遞減，表明腫瘤細胞增殖受阻，腫瘤細胞對該種抗腫瘤藥物敏感性高。
具體實施例方式
細胞內分子探針包括自基因探針和熒光分子探針。
基因探針是一段DNA序列，編碼一個很容易被偵測到的蛋白或酶。它們可以人工引入到一個細胞內來監測基因的表達，以得到細胞定位或整體細胞生物傳感器的作用。包括(但不限于)綠色熒光蛋白基因green fluorescentprotein(GFP)，半乳糖激酶基因(β-galactosidase)，熒光素酶基因(luciferase)，等等。20多年前，Marlene DeLuca’s第一個成功的獲得表達螢火蟲熒光素酶基因(luc基因)的轉基因煙草，基因探針的生物發光的應用進入了一個新時代。基因探針的主要特點就在于光信號的高度可測性，高光子產生效率。因此應用基因探針的檢測極限可以達到10-18到10-21摩爾。基因探針的高度可偵測性使得它非常適合于微小化的生物分析裝置(如微矩陣，微流設備和高密度的微孔板)，以用于小量樣品體積的基因和蛋白的高通量篩選。
熒光分子探針來源于一系列生物熒光染料，包括(但不限于)藍色螢光氯甲基衍生物氨基-，羥-和difluoro hydroxycoumarinCMAC(7-amino-4-chloromethylcoumarin、CMHC(4-chloromethyl-7-hydroxy-coumarin)和CMF2HC(4-chloromethyl-6，8-difluoro-7-hydroxycoumarin)，綠色螢光氯甲基衍生物(CMFDA5-chloromethylfluorescein diacetate)、BODIFY(8-chloromethyl-4，4-difluoro-1，3，5，7-tetramethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)，橙色螢光CMTMR(5-(and-6)-((4-chloromethyl)benzoyl)amino)、吖啶Acridine(3，6-bis(Dimethylamino)、Bisbenzimide，和紅色螢光CMTPX，等。
熒光分子探針的特點是1)對活細胞內的DNA或蛋白質有很強的親和力。這些所選生物熒光染料分子一旦進入細胞內，迅速與細胞內的DNA或蛋白質結合，且有較高的穩定性。熒光分子探針能自由穿透細胞膜并存在于細胞內。一旦進入細胞內，即通過化學反應被變換成不能滲透細胞膜的反應產物。熒光分子探針試劑由最初不發熒光變為熒光分子探針經歷了兩次的細胞內化學反應。分子探針包含了一個與硫烴起反應的氯甲基團，在谷胱甘肽S-轉移酶作用下起反應。在多數細胞里，谷胱甘肽水平較高(~10mM)，并且谷胱甘肽轉移酶是普遍存在的。雖然分子探針首先與細胞內谷胱甘肽起反應，但產物是不發熒光的。第二步由細胞內酯酶起作用，其反應產物才具熒光性。
2)被熒光分子探針標記了的細胞在分裂時，熒光強度減半，將其熒光只傳給其子代(至少可傳4-8代)，而并不傳給與之相連的其他細胞。
3)熒光分子探針的熒光強度可持續時間長，至少4天至數月。而其他的可滲透入細胞內的染料則無此特性，包括被廣泛應用的鈣黃綠素(calcein AM)和BCECF-AM等，它們的熒光強度在生理溫度下僅能在活細胞中存在數小時。
本發明的具體實施方式
，是用分子探針標記腫瘤細胞。(1)將基因探針(特定的DNA序列)以基因載體(Vector)為載體，通過轉基因技術(Transgenic technique)插入到腫瘤細胞內的DNA；(2)將熒光分子探針(生物熒光染料分子)加入適合的試劑，通過細胞微量培養技術(Microculture technique)標記腫瘤細胞內的DNA或蛋白質。
本發明的另一具體實施方式
，在體外(in vitro)將標記了熒光分子探針的至少一種腫瘤細胞系分別放入96孔板培養基，與一種以上待測抗腫瘤藥物共同分別進行微量培養。腫瘤細胞進行有絲分裂時，子細胞攜帶的熒光減半。在設定的時間點由流式細胞儀收獲。此一部分實驗用于檢測不同的腫瘤細胞系對多種抗腫瘤藥物的敏感性。
本發明的另一具體實施方式
，是在體內(in vivo)將標記有分子探針的腫瘤細胞接種到實驗動物體內。腫瘤細胞生長時，子細胞攜帶的熒光將減半；給以待測抗腫瘤藥物治療。收獲時單個腫瘤細胞群被從組織中提取。在設定的時間點由流式細胞儀收獲。這一實施方式，可對腫瘤細胞在一個單獨動物體內的生長繁殖，及機體對治療干預的抗腫瘤藥物的反應進行實時監視(real-time monitoring)。
本發明的另一具體實施方式
，是在體內(in vivo)將標記有基因探針的腫瘤細胞接種到實驗動物體內。腫瘤細胞在體內生長。給以待測抗腫瘤藥物治療。收獲時腫瘤細胞群被從相關的組織(如肝、淋巴節等)中提取并培養，給以適當的刺激，會特異性的激活控制基因(基因探針)表達和蛋白合成的調控序列，再利用流式細胞儀技術進行檢測。這一實施方式，可對腫瘤細胞在單獨動物體內的生長、繁殖、轉移，及機體對治療干預的抗腫瘤藥物的反應進行實時監視(real-time monitoring)。
本發明的另一具體實施方式
，是收獲時，使用程序化、多價流式細胞儀-微載體收獲技術，在設定的程序下，根據的細胞的大小(正向光衍射比電子密度)，所標記的不同的腫瘤細胞系熒光分子探針顏色(發射波長)不同，在單一試管內順序收獲不同的腫瘤細胞系；至少包含2種以上的不同熒光分子探針標記的腫瘤細胞系。進行多色熒光分析(可同時檢測4色)，從而使單一試管內的檢測指標成倍提高，形成高通量式測定模式。
激光激發待測樣品的熒光標記物產生熒光，流式細胞儀接收熒光。因其激發光的波長不同，不同的熒光標記物產生不同顏色的熒光。由于有不同顏色(波長)的熒光分子探針，故不同的腫瘤細胞系可用不同顏色的熒光分子探針標記。之后數種標記了分子探針的腫瘤細胞可分別與一種或多種待測抗腫瘤藥物共同微量培養。由于所標記的不同的腫瘤細胞系熒光顏色不同，可在單一試管內同時由流式細胞儀收所獲，使用多種波長的熒光分子探針和多頻道流式細胞分析，進行多色熒光分析(如紅色、綠色、橙色及藍色熒光、)。在多重發光測試中，光信號是同時產生，測試是獨立進行，可以在一個反應試管里測試不同的發射光波。這種方法可以在一個反應試管里定量兩個以上分析物和測試兩個以上發光反應。由于可同時對數種腫瘤細胞系及多種待測抗腫瘤藥物進行微量培養，以及多種波長的熒光分子探針和多頻道流式細胞儀的使用，可同時觀測數種腫瘤細胞對藥物的敏感性，從而使檢測的樣本量大大提高，形成高通量式(High throughput)測定模式。分析測試僅需要非常短的時間，所以適用于大量的藥物篩選。
本發明創立以流式細胞儀-細胞內分子探針技術為基礎的腫瘤檢測及抗腫瘤藥物篩選系統，檢測腫瘤細胞在體外、實驗動物體內的增生、轉移，及對抗腫瘤藥物的反應；可同時觀測數種腫瘤細胞對一種或數種藥物的敏感性，形成高通量式(High throughput)測定模式。適用于多種腫瘤的實驗室研究及對大量抗腫瘤藥物進行快速篩選，可廣泛應用于科研和制藥產業。
權利要求
1.一種流式細胞儀-細胞內分子探針技術為基礎的抗腫瘤藥物篩選系統，其特征是一種細胞內分子探針標記腫瘤細胞的制備技術；一種程序化、多價流式細胞儀-細胞內分子探針分析技術；一種檢測腫瘤細胞在體外、實驗動物體內的增生過程的示蹤技術；一種對抗腫瘤藥物進行快速篩選的技術。
2.根據權利要求1所述的細胞內分子探針標記腫瘤細胞的制備技術，細胞內分子探針的特征是對活細胞內的DNA或蛋白質有很強的親和力；熒光強度可持續時間長；細胞在分裂時其子細胞熒光強度減半(可傳代4-8代)。自發熒光的DNA片段以質粒(Vector)為載體，通過轉基因技術插入到腫瘤細胞的DNA。自發熒光的DNA片段包括(但不限于)綠色熒光蛋白基因green fluorescent protein(GFP)，半乳糖激酶基因(β-galactosidase)，熒光素酶基因(luciferase)，等等.熒光分子探針(熒光染料分子)通過細胞微量培養技術(Microculture technique)標記腫瘤細胞內的DNA或蛋白質。熒光染料分子包括(但不限于)CMAC(7-amino-4-chloro methylcoumarin)、CMHC(4-chloromethyl-7-hydroxycoumarin)和CMF2HC(4-chloromethyl-6，8-difluoro-7-hydroxycoumarin)，綠色螢光氯甲基衍生物CMFDA(5-chloromethyl fluorescein diacetate)、BODIFY(8-chloromethyl-4，4-difluoro-1，3，5，7-tetramethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)，橙色螢光CMTMR(5-(and-6)-((4-chloromethyl)benzoyl)amino)、吖啶(3，6-bis(Dimethylamino)、Bisbenzimide，和紅色螢光CMTPX，等。
3.根據權利要求1所述的一種程序化、多價流式細胞儀-微載體分析技術，其特征是可同時觀測數種腫瘤細胞對一種或數種藥物的敏感性，形成高通量式(High throughput)測定模式。測定一個試管內的單色標記的一種腫瘤細胞系，用正向光衍射比電子密度來確定熒光的強弱和峰值，檢測腫瘤細胞在體外增生過程；以及檢測不同的腫瘤細胞系對多種抗腫瘤藥物的敏感性。測定一個試管內多色標記的多種腫瘤細胞，用正向光衍射比電子密度來確定熒光的強弱和峰值，使用多種波長的熒光分子探針和多頻道流式細胞分析，進行多色熒光分析，并使用設定的程序和適當的對照(陰性、陽性和標準)，可對以上檢測結果進行半定量和定量分析。由于單一試管內的檢測指標成倍提高，而技術的復雜程度降低，用于同時檢測不同的腫瘤細胞系對一種以上抗腫瘤藥物的敏感性。
4.根據權利要求1所述的一種實驗動物體內腫瘤細胞增生過程的示蹤技術，其特征是可示蹤腫瘤細胞在活體內的增生過程；在體內檢測腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的反應。
5.根據權利要求1所述，腫瘤細胞系或腫瘤包括(但不限于)Jurkat細胞(人T單核細胞白血病細胞)、MCF-7細胞(乳腺癌細胞系)、KU-8細胞(男性陰莖癌細胞系)、U937細胞(單核細胞白血病細胞系)、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)、NCI-H929細胞(人多發性骨髓瘤癌癥細胞系)、IM-9細胞(人淋巴癌細胞系)、U937細胞(人組織細胞瘤細胞系)，Raji細胞(人B細胞瘤細胞系)，SW1116細胞(人大腸癌細胞系)、Hep2細胞(人鼻咽癌上皮細胞系)、MDR細胞(人胃癌細胞系)、SGC-7901細胞(人胃癌細胞系)、LSC-1細胞(人男性喉癌細胞系)、SGC-7901細胞(人胃癌細胞系)、MHCC97細胞(人肝癌細胞系)、5-FU細胞(人肝癌細胞系)、HepG2細胞(人肝癌細胞系)、A549細胞(人肺癌細胞系)、3T3細胞(小鼠成纖維瘤細胞系)。直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、非小細胞肺癌、肺癌、卵巢癌、大腸癌、鱗狀細胞癌、喉癌、胃癌、食道癌、單核細胞白血病細胞、單核細胞白血病細胞、男性陰莖癌細胞系、鼻咽癌、皮膚癌。
6.根據權利要求1所述的一種對抗腫瘤藥物進行篩選，抗腫瘤藥物(但不限于抗腫瘤藥物)包括各種中成藥、中藥復方湯劑、草藥及其提取物、化學合成藥、基因工程抗體、重組細胞因子、其他基因重組產物等。
7.根據權利要求1所述的可對腫瘤細胞生長和藥物療效進行動態觀察的技術。
全文摘要
本發明涉及使用流式細胞儀－細胞內分子探針技術在體外、實驗動物體內示蹤腫瘤細胞增生過程，同時對大量抗腫瘤藥物進行快速篩選。(1)將分子探針標記腫瘤細胞內DNA或蛋白質。(2)將標記分子探針的至少一種腫瘤細胞系分別培養，細胞分裂時子細胞攜帶的熒光將減半；加入待測抗腫瘤藥物。(3)將標記有分子探針的腫瘤細胞接種到動物體內，腫瘤細胞生長時子細胞攜帶的熒光將減半；給以待測抗腫瘤藥物治療。收獲時單個腫瘤細胞群被從組織中提取。(4)收獲時使用設定的程序定量分析腫瘤細胞的數量(熒光強度)。(5)流式細胞儀－腫瘤細胞內分子探針標記標記技術，用于(但不限于)以下范圍體內體外腫瘤細胞的示蹤，抗腫瘤藥物的快速篩選。
文檔編號G01N33/68GK1970788SQ200510016348
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月23日 優先權日2005年11月23日
發明者鄭芳, 林遠 申請人:鄭芳, 林遠
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
