專利名稱：腸道病毒71型抗體(IgM)診斷試劑盒(酶聯免疫法)的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種檢測腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒及其制備方法和應用。
背景技術：
腸道病毒EV71型感染是由人腸道病毒71型(EV71)引起的疾病的總稱，臨床上主要表現為手足口病，手足口病多在嬰幼兒中爆發流行，部分EV71感染患兒表現為皰疹性咽峽炎，重癥患者出現病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。引起手足口病的病原，最常見的是柯薩奇病毒A16和腸道病毒71型；由腸道病毒71型感染引起的疾病發生重癥感染的比例較大，病死率也較高，重癥病例病死率可達10% -25%，因此病原學診斷意義重大。腸道病毒71型(EV71)基因組為含有大約7. 5Kb的單股正鏈RNA，包括5’端非編碼區、3’端非編碼區和由P1、P2、P3所組成的多蛋白，共編碼11種蛋白，其中4個結構蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4，7 個非結構蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中 VP1、VP2、VP3 暴露于病毒外殼的表面，為EV71主要的抗原變異位置；VP4包埋在病毒外殼的內側與內部的RNA結合，其功能類似病毒外殼的錨，用以穩定病毒蛋白的結構。非結構蛋白2A為分裂初期先驅蛋白質，也與終止宿主細胞合成其本身所需蛋白有關；3C則參與大部分的蛋白裂解反應； 3D為RNA聚合酶，在病毒RNA復制時主導轉錄及復制反應；28、2(、3々、；^等四種蛋白則與病毒RNA的復制有關。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VPl是EV71病毒的主要中和決定因子，因此VPl蛋白被認為是最適合來建立ELISA方法的抗原。腸道病毒EV71的臨床診斷主要依據三個方面一是臨床表現，二是血清學證據， 三是病原學證據。由于腸道病毒EV71型感染臨床表現多，因此腸道病毒EV71的血清學檢測和病原學檢測是目前最主要的依據。EV71感染產生終生免疫保護，感染后可檢出IgM和 IgG抗體。IgM試劑是最適于臨床近期感染診斷的重要指標。EV71-IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，是一種科學、方便、經濟的EV-71感染的血清學檢測方法。腸道病毒71型抗體(IgM)的檢測已有相關文獻報道，基本上是以腸道病毒71型的病毒培養物為抗原作為包被抗原的間接ELISA，試劑盒在特異性、靈敏度和穩定性方面尚存諸多不足之處；并且，由于病毒培養成本高，效率低，無法大量供應市場。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服上述不足，提供一種臨床檢驗急需、操作簡便、 適合各醫療疾控部門使用的可檢測人血清或血漿中腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒及其制備方法和應用。本發明提供了一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒，其組分包括抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預包被的微孔板、辣根過氧化物酶標記的重組腸道病毒 71型抗原、陽性對照、陰性對照、標本稀釋液、濃縮洗滌液(20X)、底物液A、底物液B和終止液。本發明的技術方案是首先將血清樣本加入到微孔板中，樣本中的IgM抗體被預包被在微孔板上的抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體吸附(捕獲)，未結合的其他成分(包括特異的IgG抗體)將被洗滌除去，第二步，加入腸道病毒71型抗原酶標記物，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會與蠟根過氧化物酶標記的EV71重組抗原特異性的結合，洗去其他未結合物， 辣根過氧化物酶會和后續加入的底物反應。最終達到檢測EV71-IgM抗體的目的。本發明的另一個目的是提供了一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟1.抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預包被微孔板的制備1.1 包被0.05mol/L(0.05毫摩爾/升)，pH9. 6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖系統，加入適量抗人_IgM(u鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升)加入到微孔板中，37°C放置2小時， 室溫過夜，然后甩去孔內液體，拍干；1.2 洗滌0. 01mol/L PBS-T (0. 01毫摩爾/升磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖系統，0. 05 %的 Tween-20), pH7. 2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復洗滌一次，拍干。1.3 封閉0. 01mol/L PBS，10 %小牛血清，0. 25 %酪蛋白，0. 1 %硫柳汞鈉，pH7.2，按每孔力口入IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時，然后甩去孔內液體，拍干；1.4 干燥封閉后的微孔板，甩去孔內液體拍干后，放置于干燥室(相對濕度小于45% )過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環境。2.酶標抗原工作液的制備0. 01mol/L PBS，10 % 小牛血清，0. 25 % 酪蛋白，l/1000Proclin300，pH 7. 2 的 buffer中加入適量辣根過氧化物酶標記的重組腸道病毒71型VPl抗原，保存于2 8°C環
^Ml O3.陽性對照的制備取A45tl值彡2. 0的抗EV71_IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，用0. 01mol/L PBS, 20% BSA, pH 7. 2的buffer調整到A450值> 1.0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。4.陰性對照的制備取A450值< 0. 1的抗EV71_IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。5.底物液ANa2HPO4. 12H20 18g檸檬酸·H205g乙酸鈉9. 25g乙酸1. 2ml
Na2O25g 去離子水 IOOOml，pH5. 06.底物液B先用5mlDMS0 (二甲亞砜)溶解0. 25g TMB (3，3，5，5-四甲基聯苯胺)；取IOOOml 去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。7.終止液濃硫酸IOOml去離子水800ml8. 20X濃縮洗滌液Na2HPO4. 12H2058gNaH2PO48gNaCL160gTween-2010. Oml去離子水1000ml，調整pH7. 2本發明的又一個目的是提供了一種人血清中腸道病毒71型抗體(IgM)測定方法， 本發明的試劑盒在使用時可以按下列步驟操作1.取出試劑盒置室溫平衡30分鐘。將20X洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋。2.加樣品取出包被板，作好標記，留1孔空白對照，其余加入陰性對照3孔陽性對照2孔50ul/孔及待測標本50ul/孔于相應的反應板孔內，空白對照不加。將反應板輕輕震蕩混勻后，用封板膜封板，置37°C溫箱或水浴中反應30分鐘。3.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30 秒鐘。4.加酶標工作液每孔加入50ul酶標工作液，空白孔除外。5.溫育用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應30分鐘。6.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30 秒鐘。7.顯色每孔加入底物A、B液各50ul，震蕩混勻，用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應15分鐘8.終止每孔加入終止液50ul，輕輕震蕩混勻。9.測定設定酶標儀波長于450nm(建議雙波長450/630nm檢測)，測定各孔A450 值。注意在終止反應30分鐘內讀數。當使用單波長時，校準空白孔，設定酶標儀波長于 450nm，測定各孔A450值，當使用雙波長450/630nm檢測時，可以不設空白孔，直接測定各孔 A值。本發明具有如下特點1.采用捕獲兩步法進行檢測，血清不用二次稀釋簡化了操作過程，避免了間接法中的多種干擾因素，是檢測的靈敏度和特異性得到提高。2.操作方法簡單，實用性強，適合各級醫療單位和疾控中心使用。
具體實施例方式
實例1。抗人-IgM(u鏈)單克隆抗體預包被微孔板的制備1. 1 包被Na2CO3 1. 6gNaHCO3 2. 9g去離子水1000ml，調整PH9. 6，加入適量抗人-IgM (μ鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升) 加入到微孔板中，37°C放置2小時，室溫過夜，然后甩去孔內液體，拍干；1. 2 洗滌Na2HPO4. 12H20NaH2PO4NaCLTween-20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 0. 5ml干。
去離子水1000ml，
調整pH7. 2按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復洗滌-
-次，拍
1.3封閉
Na2HPO4 NaH2PO4 NaCL 牛血清去離子水硫柳汞鈉
12H20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 100. Oml 1000ml,
Ig
調整pH7. 2，按每孔加入IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時，然后甩去孔內液體，拍干；1. 4 干燥封閉后的微孔板，甩去孔內液體拍干后，放置于干燥室(相對濕度小于45% )過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環境。
于2
實例2.酶標抗原工作液的制備
12H20
3. 72g 0. 4g 6. 8g 100. Oml 2. 5g IOOml Iml
900ml,
調整pH 7. 2，加入適量辣根過氧化物酶標記的重組腸道病; 8°C環境。 實例3.陽性對照的制備
Na2HPO4 NaH2PO4 NaCL 牛血清酪蛋白小牛血清 Proclin300 去離子水
71型VPl抗原，保存
7
取A45tl值彡2. 0的抗EV71_IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，用0. 01mol/L PBS, 20% BSA，pH 7. 2的buffer調整到A450值> 1. 0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。
0091]實例4.陰性對照的制備
0092]取A450值< 0. 1的抗EV71_IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。
0093]實例5.底物液A0094]Na2HPO412H2018g0095]檸檬酸.H205g0096]乙酸鈉9. 25g0097]乙酸1. 2ml0098]Na2O25g0099]去離子水1000ml,pH5.00100]實例6.底物液B0101]先用 5mlDMS0 ( 二甲亞砜)溶解0.2
去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。
0102]實例7.終止液
0103]^c H2SO4IOOml
0104]去離子水800ml
0105]實例8. 20X濃縮洗滌液
0106]Na2HPO4. 12H20 58g
0107]NaH2PO44g
0108]NaCL160g
0109]Tween-2010.0ml
0110]去離子水1000ml，調整pH7. 2
0111]實例9.
0112]9. 1用本發明的試劑盒與衛生部醫藥生物工程技術研究中心和中山大學達安基因股份有限公司研制生產的腸道病毒EV71逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒在寧波市疾病預防控制中心和河北省疾病預防控制中心平行檢測臨床血清650例(其中健康人員血清450 例，EV71急性期陽性血清192例，A16陽性血清18例)，具體結果如下表1貝爾公司生產的EV71_IgM試劑和PCR試劑的比較
實驗分組例數北京貝爾達安基因PCR試劑陽性陰性陽性陰性EV71急性期陽性血清19219201920CA16陽性血清18018018正常人群45004500450
9. 2用本發明的試劑盒與病毒病預防控制所國家麻疹實驗室研制的腸道病毒 EV71中和試驗試劑平行檢測臨床血清400例(其中健康人員血清50例，EV71急性期陽性血清230例，A16陽性血清20例)，表2貝爾公司生產的EV71_IgM試劑和中和試劑的比較
權利要求
1.一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒，其特征在于該試劑盒包括抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體預包被的微孔板、辣根過氧化物酶標記的重組腸道病毒71型抗原、陽性對照血清、陰性對照血清、濃縮洗滌液(20 X )、底物液A、底物液B和終止液。
2.根據權利要求1所述的一種腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫測定試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟2.1.抗人_IgM(y鏈)單克隆抗體預包被微孔板的制備2. 1. 1包被0. 05mol/L(0. 05毫摩爾/升)，pH9. 6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖系統，加入適量抗人-IgM(y鏈)單克隆抗體，混勻后按每孔IOOul (微升)加入到微孔板中，37°C放置2小時，室溫過夜，然后甩去孔內液體，拍干；2. 1. 2洗滌0. 01mol/L PBS-T (0.01毫摩爾/升磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖系統，0. 05 %的 Tween-20), pH7. 2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重復洗滌一次，拍干。2. 1. 3封閉0. 01mol/L PBS，10%小牛血清，0. 25%酪蛋白，0. 硫柳汞鈉，pH7. 2，按每孔加入 IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小時，然后甩去孔內液體，拍干；2. 1. 4干燥封閉后的微孔板，甩去孔內液體拍干后，放置于干燥室(相對濕度小于45%)過夜，然后放入有干燥劑的鋁箔袋中封口，保存于2 8°C環境。2. 2.酶標抗原工作液的制備0. 01mol/L PBS，10%小牛血清，0. 25%酪蛋白，1/1000 Proclin300, pH 7. 2 的 buffer 中加入適量辣根過氧化物酶標記的重組腸道病毒71型VPl抗原，保存于2 8°C環境。2.3.陽性對照的制備取A45tl值彡2. 0的抗EV71-IgM陽性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，用 0. 01mol/L PBS, 20% BSA，pH 7. 2的buffer調整到A450值> 1. 0，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。2.4.陰性對照的制備取A450值< 0. 1的抗EV71-IgM陰性多份人血清混勻，用56°C水浴鍋加熱120分鐘，自然冷卻后，加入萬分之五的硫柳汞鈉，保存于2 8°C環境。2. 5.底物液A18g 5g9. 25g 1. 2ml 5g1000ml,pH5.012H20 ,H20Na2HPO4. 檸檬酸乙酸鈉乙酸 Na2O2 去離子水 2. 6.底物液B 先用 5mlDMS0 (.甲亞砜)溶解0. 25g TMB (3，3，5，5-四甲基聯苯胺)；取1000ml去離子水加入約Iml濃鹽酸，混勻后pH2. 5，將TMB溶液加入到鹽酸溶液中混勻。 2. 7.終止液濃硫酸IOOml去離子水800ml2.8. 20X濃縮洗滌液 Na2HPO4. 12H2058g NaH2PO4 8g NaCL 160g Tween-20 10. Oml去離子水1000ml，調整pH7. 2
3.—種人血清中腸道病毒71型抗體(IgM)測定方法，其特征在于該方法包括下列步驟操作3. 1.取出試劑盒置室溫平衡30分鐘。將20X洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋。 3. 2.加樣品取出包被板，作好標記，留1孔空白對照，其余加入陰性對照3孔陽性對照2孔50ul/孔及待測標本50ul/孔于相應的反應板孔內，空白對照不加。將反應板輕輕震蕩混勻后，用封板膜封板，置37°C溫箱或水浴中反應30分鐘。3. 3.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30秒鐘。3. 4.加酶標工作液每孔加入50ul酶標工作液，空白孔除外。3. 5.溫育用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應30分鐘。3. 6.洗板溫育后，將封板膜揭掉，吸干孔內液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30秒鐘。3. 7.顯色每孔加入底物A、B液各50ul，震蕩混勻，用封板膜封板后，置37°C溫箱或水浴中反應15分鐘3. 8.終止每孔加入終止液50ul，輕輕震蕩混勻。3. 9.測定設定酶標儀波長于450nm (建議雙波長450/630nm檢測)，測定各孔A450值。 注意在終止反應30分鐘內讀數。當使用單波長時，校準空白孔，設定酶標儀波長于450nm， 測定各孔A450值，當使用雙波長450/630nm檢測時，可以不設空白孔，直接測定各孔A值。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種檢測腸道病毒71型抗體(IgM)的酶聯免疫診斷試劑盒及其制備方法和應用。由腸道病毒71型引起手足口病，發生重癥感染的比例較大(病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫)，病死率也較高可達10％-25％，EV71-IgM抗體酶聯免疫診斷試劑盒，可用于EV71感染的診斷。EV71-IgM檢測已有相關文獻報道，多是EV71病毒培養物作為包被抗原的間接ELISA，特異性、靈敏度和穩定性方面尚存諸多不足；由于病毒培養成本高，效率低，無法大量供應市場。本發明克服上述不足，提供一種臨床檢驗急需、操作簡便、適合各醫療疾控部門使用的檢測人血清中EV71-IgM的試劑盒及其制備方法和應用。技術方案是首先將血清加入到微孔板中，其中的IgM抗體被預包被在微孔板上的抗μ鏈捕獲，未結合的其他成分被洗滌除去，第二步，加入酶標記物，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會與HRP標記的EV71重組抗原特異性的結合，洗滌后，HRP會和后續加入的底物反應。最終達到檢測EV71-IgM抗體的目的。
文檔編號G01N33/577GK102243232SQ20101017186
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者常延濱, 邵育曉 申請人:北京貝爾生物工程有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
