專利名稱：呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條和試紙卡的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測微量呋喃唑酮代謝物(3-氨基-2-惡唑烷酮，AOZ)的器具，特別是涉及一種呋喃唑酮代謝物殘留分析的膠體金層析檢測試紙條和試紙卡。
二、技術背景呋喃唑酮(Furazolidone，FZ)，又名痢特靈，是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及某些原蟲和真菌具有抑制或殺滅效果，而且藥效穩(wěn)定，在畜禽和水產養(yǎng)殖中得到了廣泛的應用。但毒理學研究發(fā)現，呋喃唑酮及其代謝產物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)均有很強的毒副作用，可致癌、致突變，可引起溶血性貧血、血小板減少性紫癜、多發(fā)性神經炎等多種疾病。1995年歐盟首先禁止呋喃唑酮在畜禽和水產養(yǎng)殖中使用，隨后美國、日本、澳大利亞等國將呋喃唑酮列為禁用藥，我國農業(yè)部2002年3月頒布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》(農牧發(fā) 1號)中將呋喃唑酮列為禁用藥。呋喃唑酮是我國食品安全監(jiān)控的主要藥物之一。
盡管我國嚴禁呋喃唑酮用于畜牧、水產養(yǎng)殖業(yè)，但由于其藥效確切，價格低廉，目前在畜牧和水產養(yǎng)殖中違禁使用現象仍較嚴重。呋喃唑酮在食品動物中的殘留不僅直接危害食用者的身體健康，同時還嚴重制約我國動物性食品出口，造成了巨大的經濟損失。
由于呋喃唑酮在動物體內很快代謝為AOZ，AOZ與組織蛋白結合且在體內滯留時間長，被視為呋喃唑酮殘留的標示物。通過檢測母體藥物不能判定呋喃唑酮的實際殘留情況，因此檢測呋喃唑酮殘留的最佳方法是檢測其代謝物(AOZ)而并非母體藥物本身。
目前，用于AOZ殘留檢測的方法主要有理化分析法和酶聯免疫分析法(ELISA)等。理化分析法主要是高壓液相色譜(HPLC)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)等。理化分析法靈敏度高，結果準確，但是樣品需經一系列復雜的處理凈化，繁瑣費時，所需儀器設備價格昂貴，而且只有特定的專業(yè)技術人員才能操作，不能進行現場檢測，時效性差，難以推廣。ELISA法以競爭性酶聯免疫反應為檢測原理，反應顯色后用酶標儀測定OD值進行結果判定。縮短了檢測時間，可以定性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操作過程仍較復雜，而且國內現處在研發(fā)階段，進口國外產品價格昂貴，因而ELISA方法的應用受到了較大限制。
三、內容本發(fā)明的目的研制出特異、敏感、快速、簡便的呋喃唑酮代謝物(AOZ)殘留檢測試紙條和試紙卡。
本發(fā)明的技術方案是一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護膜，金標結合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護膜，金標結合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，金標結合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，金標結合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
所述的襯板為不吸水的韌性材料，樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜，吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙，韌性材料為硬質塑膠條、或不吸水硬紙條，包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜，所述的保護膜為不透明的膠膜。
所述的AOZ金標抗體為膠體金標記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，AOZ衍生物金標抗體為膠體金標記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體。
所述的偶聯AOZ或偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA。
所述的試紙條，在樣品墊、金標結合墊及吸水墊上覆蓋有保護膜，樣品墊、金標結合墊對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5cm處。
所述的塑料卡由底座和面蓋嵌合在一起構成，底座上有放試紙芯的固定槽以及與面蓋相結合的卡齒，面蓋有觀察窗和加樣孔以及與底座相結合的卡齒，觀察窗與試紙芯的包被膜相對應，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對應，在觀察窗旁邊分別印有T和C，T表示檢測線，在靠近加樣孔側，C表示對照線，在遠離加樣孔側。
本發(fā)明的檢測試紙條和試紙卡具有下列優(yōu)點①特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條和試紙卡以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標記對單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，試紙條和試紙卡具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到1～5ppb。
②簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，試紙條(卡)加入被檢樣品液后，在10分鐘內即可判定檢測結果。
③結果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙條和試紙卡均以顯示棕紅色線“|”和“| |”作為檢測結果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條棕紅色線“|”時，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯示兩條棕紅色線“| |”時，表示在被檢樣品中不含被檢物。結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判。
④節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條和試紙卡，比用儀器分析和進口ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條和試紙卡的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗，海關檢疫，衛(wèi)生檢疫，質量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟、社會效益。
四
圖1、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條俯視結構示意圖。
圖2、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條剖面結構示意圖。
圖3、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡俯視結構示意圖。
圖4、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡剖面結構示意圖。
圖中，1襯板，2樣品墊，3金標物結合墊，4包被膜，5檢測線，6對照線，7吸水墊，8-1樣品浸入端保護膜，8-2手柄端保護膜，9標識線，10加樣孔，11觀察窗，12面板，13試紙芯固定槽，14底座。
五具體實施例方式要制成呋喃唑酮代謝物檢測試紙條和試紙卡，首先需要制備偶聯呋喃唑酮代謝物載體蛋白和呋喃唑酮代謝物衍生物載體蛋白，用于制備相應的檢測線和抗體；而且需要制備呋喃唑酮代謝物金標抗體和呋喃唑酮代謝物衍生物金標抗體，用于制備相應的金標抗體纖維棉；另外需要制備羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體，用于制備對照線。
1、呋喃唑酮代謝物(AOZ)與載體蛋白偶聯采用戊二醛法，將AOZ與載體蛋白BSA進行偶聯制備人工結合抗原AOZ-BSA。具體制備方法如下稱取BSA30mg溶于5ml pH7.4的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)中，攪拌下加入AOZ 5～6mg，緩慢滴加25％戊二醛溶液0.1ml，磁力攪拌反應4～6h。5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析72h，每天更換透析液2～3次。最后收集透析袋內的橙黃色溶液過葡聚糖凝膠層析柱(SephadexG-25)進一步提純，制得人工結合抗原AOZ-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結合抗原AOZ-OVA或AOZ-HSA。
2、AOZ衍生物與載體蛋白偶聯碳二亞胺法將AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)與載體蛋白BSA進行偶聯制備人工結合抗原CPAOZ-BSA。具體制備方法如下稱取BSA 100mg溶于6ml pH7.4的0.01mol/L PBS中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1ml，攪拌溶解；稱取CPAOZ 14mg溶于1.2ml二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌下加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)16.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)8.5mg，4℃下磁力攪拌反應過夜，5000r/min離心10min，取上清液并在磁力攪拌下逐滴加入上液中，4℃下密封攪拌反應4～6h，5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析袋，在4℃下用pH7.4的PBS透析72h，每天更換透析液2～3次。最后收集透析袋內的無色CPAOZ-BSA溶液，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
混合酸酐法冰浴條件下進行，將CPAOZ 8.2mg溶解在0.8ml DMF中，攪拌加入三丁胺30ul，反應30min，再加入氯甲酸異丁酯20μl反應1h，而后加入載體蛋白BSA溶液(BSA50mg溶于2ml pH為7.4的0.01mol/LPBS中)反應過夜，終止反應。收集反應物裝入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析3天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的反應物過SephadexG-25層析柱進一步提純，制得人工結合抗原CPAOZ-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
3、抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的制備單抗制備以50μg～100μg/只的AOZ-載體蛋白結合抗原免疫8周齡BALB/c小鼠3～4次，每次免疫間隔時間3～5周，最后一次超強免疫后3～4天，無菌取其脾細胞并與NS0骨髓瘤細胞雜交融合，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14天，用間接ELISA方法選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，而后擴大培養(yǎng)，建立雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆抗體可特異地與AOZ反應。以體內誘生法進行單抗制備，以辛酸-硫酸銨法提純單抗，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
多抗制備用AOZ-載體蛋白結合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200μg～500μg/次，背部皮下分4～6點注射。首免，用AOZ-載體蛋白結合抗原與等量弗氏完全佐劑(FCA)混合，充分乳化；加強免疫，用AOZ-載體蛋白結合抗原與等量弗氏不完全佐劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2～3周進行，連續(xù)免疫4～5次，每次間隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法測其定效價達到105以上時，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
4、抗AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體的制備參照抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法，以AOZ衍生物載體蛋白結合抗原替代AOZ載體蛋白結合抗原，制備抗AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體。
5、金標抗體和金標物結合墊的制備①AOZ金標抗體和金標物結合墊的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，即在沸騰的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鮮配制的1％檸檬酸三鈉8ml，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3調pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?∶2000的標記比將待標記的抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標記10min后，加入20％的PEG10000至終濃度為0.05％，4℃、1500～2000rpm離心20min，除去未結合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化的金標抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得AOZ膠體金標記抗體。將1∶100～500稀釋的膠體金標記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附于精制玻璃纖維棉中，4℃低溫真空干燥，制備AOZ金標物結合墊。
②AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊的制備參照AOZ金標抗體和金標物結合墊的制備方法，以AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體替代AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，制備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊。
6、羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體的制備以飽和硫酸銨法提取AOZ及其AOZ衍生物陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)。即取1份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS(pH7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm離心15min，棄上清，以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內用PBS(pH7.2)透析48h，中間換液3次，4℃、12000rpm離心15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以提取的小鼠血清(或兔血清)IgG按50～100μg/kg體重經皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA測定其血清效價達到1∶2000以上時，心臟或動脈采血，分離收集高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于膠體金層析檢測試紙條和試紙卡對照線的制備。
7、檢測試紙條和試紙卡檢測反應原理當快速檢測試紙條和試紙卡測試端加入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標物結合墊中的金標抗體一起向包被膜擴散，并最終滲入手柄端吸水濾紙。在擴散過程中，待測物可與金標抗體相結合，進而封閉金標抗體上待測物的抗原結合點，阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的檢測線結合，檢測線不能顯色，而羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與金標抗體結合，形成一條棕紅色對照線“|”，為陽性表示。反之樣品溶液中無待測物則不能阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的檢測線結合，顯示棕紅色檢測線“|”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也與金標抗體結合，顯示棕紅色對照線“|”，這樣形成兩條棕紅色線“| |”，為陰性表示。如果包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例一、AOZ檢測試紙條，參見圖1和圖2。圖中1為襯板，用硬質塑膠條制成；2為樣品墊，用玻璃纖維棉制成；3為金標物結合墊，根據上述具體實施方式
“5”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標記的抗AOZ單克隆抗體玻璃纖維棉；4為包被膜，采用硝酸纖維素膜；5為隱形檢測線，用AOZ-載體蛋白偶聯物在包被膜上印制成“|”，載體蛋白為牛血清白蛋白BSA；6為隱形對照線，用兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上印制成“|”，兩條線平行排列組合為“| |”；7為手柄端的吸水墊，用吸水濾紙制成。將2、3、4、7從右至左依次粘貼固定在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相搭接。8-1為覆蓋在樣品墊2和金標物結合墊3上面的樣品端白色保護膜，8-2為覆蓋在吸水墊7上面的手柄端其它顏色保護膜(如黃色)，9為測試樣品的帶箭頭標示線，即在樣品墊2與金標物結合墊3交界處對應的白色保護膜偏向樣品墊一側約0.5cm處印制的標示線，在標示線右側保護膜上印有箭頭及MAX字樣。
試紙條適于檢測的樣品及其檢測操作方法與結果判定檢測樣品可為組織樣、蛋樣、蜂蜜樣和奶樣。
檢測樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，稱取1g樣品加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測分析。
②奶樣取奶樣2ml在15℃條件下3000r/min離心5min，除去上層脂肪，取下層液，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測分析。
③蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測分析。
檢測操作方法將AOZ膠體金層析檢測試紙條樣品端插入待測樣品液中，插入深度不超過標記線，約10～20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，5～10分鐘觀察判定檢測結果。
結果判定①陽性如果在包被膜上顯示有一條棕紅色線“|”，表示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ；②陰性如果在包被膜上顯示有兩條棕紅色線“| |”，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中不含AOZ；③失效如果在包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例二、AOZ檢測試紙卡參見圖3、圖4。圖中1、2、3、4、5、6和7分別為襯板、樣品墊、金標物結合墊、包被膜、隱形檢測線、隱形對照線和吸水墊，其制備方法與實施例一相同，組成試紙芯；14為塑料制成的試紙卡底座，試紙芯固定在底座的固定槽13中；12為塑料制成的試紙卡面板，其上的加樣孔10與試紙芯的樣品墊相對應，是滴加待檢樣品的位置；在面板上的觀察窗11與試紙芯的包被膜相對應，是觀察判定結果的窗口，其旁邊印有T和C，分別與包被膜上的檢測線和對照線相對應。
檢測樣品及檢測樣品制備和實施例一相同。
檢測時，將試紙卡平放，從加樣孔滴加待測樣品液，5～10分鐘從觀察窗判定檢測結果。
結果判定如在包被膜上對應T的位置顯示有一條棕紅色線“|”時，表示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ；如在包被膜上對應T、C的位置顯示有兩條棕紅色線“| |”時，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中不含AOZ；如在包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例三、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ金標抗體和金標物結合墊；偶聯AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對照線“|”。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例一，不再重述。
實施例四、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ多克隆抗體替代AOZ單克隆抗體，制備AOZ金標抗體和金標物結合墊；偶聯AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對照線“|”。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例二，不再重述。
實施例五、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯物替代AOZ-載體蛋白偶聯物在包被膜上制備檢測線“|”，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為人血清白蛋白HSA。
檢測樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，按每克樣品加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過夜)，用1mol/LNaOH調pH至7.0～7.5；再加入5ml正己烷，混勻攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5mL含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15mol/L)稀釋，用于檢測分析。
②奶樣取奶樣2ml在15℃條件下3000r/min離心5min，除去上層脂肪，取下層液，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過夜)，用1mol/L NaOH調pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀釋，用于檢測分析。
③蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過夜)，用1mol/L NaOH調pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀釋，用于檢測分析。
其它包括檢測操作方法和結果判定等均同實施例一，不再重述。
實施例六、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯物替代AOZ-載體蛋白偶聯物在包被膜上制備檢測線“|”，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為人血清白蛋白HSA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對照線“|”。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。
實施例七、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯物替代AOZ-載體蛋白偶聯物在包被膜上制備檢測線“|”，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。
實施例八、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯物替代AOZ-載體蛋白偶聯物在包被膜上制備檢測線“|”，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對照線“|”，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。
權利要求
1.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護膜，其特征是金標結合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“||”。
2.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護膜，其特征是金標結合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“||”。
3.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，其特征是金標結合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“||”。
4.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，其特征是金標結合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“||”。
5.根據權利要求1～4中任一項所述的試紙條或試紙卡，其特征是所述的襯板為不吸水的韌性材料；所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或為尼龍膜，或為聚偏二氟乙烯膜，或為聚酯膜；所述的吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙；所述的韌性材料為硬質塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的包被膜為硝酸纖維素膜，或為純纖維素膜，或為羧化纖維素膜；所述的保護膜為不透明的膠膜。
6.根據權利要求1～4中任一項所述的試紙條或試紙卡，其特征是所述的AOZ金標抗體為膠體金標記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，AOZ衍生物金標抗體為膠體金標記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體，所述的偶聯AOZ或偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或為雞卵清白蛋白OVA，或為人血清白蛋白HSA。
7.根據權利要求1或2所述的試紙條，其特征是在樣品墊、金標結合墊及吸水墊上覆蓋有保護膜，樣品墊、金標結合墊對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5cm處。
8.根據權利要求3或4所述的試紙卡，其特征是所述的塑料卡由底座和面蓋嵌合在一起構成，底座上有放試紙芯的槽以及與面蓋相結合的卡齒，面蓋有觀察窗和加樣孔以及與底座相結合的卡齒，觀察窗與試紙芯的包被膜相對應，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對應，在觀察窗旁邊分別印有T和C，T表示檢測線，在靠近加樣孔側，C表示對照線，在遠離加樣孔側。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測試紙條和試紙卡。試紙條含有襯板、樣品墊、金標結合墊、纖維素膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護膜，金標結合墊為吸附呋喃唑酮代謝物AOZ金標抗體或AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用AOZ－載體蛋白偶聯物或AOZ衍生物－載體蛋白偶聯物印制的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為“丨丨”。將不帶保護膜的試紙芯放在特制的塑料卡中，即得到試紙卡，塑料卡的面板上設有加樣孔和結果顯示窗。本發(fā)明的試紙條和試紙卡具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速、直觀、準確的特點，適用范圍廣，成本低，易推廣應用。
文檔編號G01N33/52GK1948965SQ20061010696
公開日2007年4月18日 申請日期2006年9月1日 優(yōu)先權日2006年9月1日
發(fā)明者張改平, 楊艷艷, 高玉玲, 李學伍, 王自良, 趙東, 楊繼飛, 范國英 申請人:河南省農業(yè)科學院生物技術研究所
專業(yè)數控銑床產品供應商
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